Author Produced

Gær som et chassis til udvikling af funktionelle assays til undersøgelse af humane P53

* These authors contributed equally
Cancer Research

Your institution must subscribe to JoVE's Cancer Research section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Præsenteret her er fire protokoller til at konstruere og udnytte gær Saccharomyces cerevisiae reporter stammer til at studere Human P53 transaktiverende potentiale, virkningerne af sine forskellige Cancer-associerede mutationer, co-udtrykte interagerende proteiner, og virkningerne af specifikke små molekyler.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Monti, P., Bosco, B., Gomes, S., Saraiva, L., Fronza, G., Inga, A. Yeast As a Chassis for Developing Functional Assays to Study Human P53. J. Vis. Exp. (150), e59071, doi:10.3791/59071 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Konstateringen af, at det velkendte pattedyr P53 protein kan fungere som en transkriptionsfaktor (TF) i gær S. cerevisiae har givet mulighed for udvikling af forskellige funktionelle analyser for at studere virkningerne af 1) bindingssted [dvs. respons element (re)] sekvens varianter på P53 transaktiveringsæregenhed eller 2) TP53 mutationer, co-udtrykte cofactors eller små molekyler på P53 transaktiveringaktivitet. Forskellige grundlæggende og translationelle forskningsprogrammer er blevet udviklet. Eksperimentelt, disse tilgange udnytter to store fordele ved gær model. På den ene side muliggør den nemme genom-redigering hurtig konstruktion af kvalitative eller kvantitative reporter-systemer ved at udnytte isogene stammer, der kun afviger på niveauet for en specifik P53-re for at undersøge sekvens specificiteten af P53-afhængige transaktiveringen. På den anden side giver tilgængeligheden af regulerede systemer for ektopisk P53 Expression mulighed for evaluering af transaktiveringen i en bred vifte af protein ekspression. Gennemgået i denne rapport er flittigt anvendte systemer, der er baseret på farve reporter gener, luciferase, og væksten af gær til at illustrere deres vigtigste metodologiske skridt og kritisk vurdere deres forudsigende effekt. Desuden kan den ekstreme alsidighed af disse tilgange let udnyttes til at studere forskellige TFs, herunder P63 og P73, som er andre medlemmer af TP53 gen familie.

Introduction

Transkription er en yderst kompleks proces, der involverer dynamisk, rumlig og tidsmæssig organisering af transkriptionsfaktorer (TFS) og cofaktorer for rekruttering og graduering af RNA-polymeraser på kromatin-regioner som respons på specifikke stimuli1 . De fleste TFS, herunder Human P53 tumor suppressor, genkende specifikke CIS-virkende elementer i form af DNA-sekvenser kaldet respons elementer (res), som består af enkelt (eller flere) unikke motiver ~ 6-10 nukleotider lang. Inden for disse motiver kan individuelle positioner vise forskellige grader af variation2, sædvanligvis opsummeret af positions vægt matricer (PWM) eller logoer3,4.

Gær S. cerevisiae er et egnet model system til at studere forskellige aspekter af humane proteiner gennem komplementering assays, Ektopisk udtryk, og funktionelle assays, selv når et orthologt gær gen ikke er til stede5, 6 , 7. på grund af den evolutionære bevaring af basale komponenter i transkriptional system8, mange humane TFS (når ectopically udtrykkes i gærceller) kan moduere ekspression af et reporter gen ved at handle gennem initiativtagere konstrueret til at indeholder passende REs. Transskription model system præsenteret her for human P53 er karakteriseret ved tre store variabler, hvis virkninger kan moduleres: 1) modalitet af udtryk og type af P53, 2) RE sekvens kontrollerende P53-afhængige transkriptionen, og 3) typen af reporter-genet (figur 1a).

Med hensyn til modalitet P53 udtryk, S. cerevisiae tillader valget af inducerbare, repressible, eller konstitutive initiativtagere9,10,11. Især den inducerbare GAL1 promotor tillader basal (ved hjælp af raffinose som en kulstofkilde) eller variabel (ved at ændre mængden af galactose i medierne) udtryk for en TF i gær. Faktisk repræsenterer det fint justerbare udtryk en kritisk udvikling for at studere ikke kun P53 sig selv, men også andre P53 familie proteiner12,13.

Med hensyn til den type REs, som styrer det P53-afhængige udtryk, tillader S. cerevisiae opførelse af forskellige reporter stammer, som besidder unikke forskelle i re af interesse i en ellers isogene baggrund. Dette mål er nået ved hjælp af en tilpasning af en særlig alsidig genomredigering tilgang udviklet i S. cerevisiae, kaldet Delitto Perfetto12,14,15,16.

Desuden kan forskellige reporter gener (dvs., URA3, HIS3 og ADE2) bruges til kvalitativt og kvantitativt at evaluere transkriptionelle aktiviteter af humane TFS i S. cerevisiae, hver med specifikke funktioner, der kan være skræddersyet til eksperimentelle behov17, 18,19,20,21. Ekspression af disse reporter gener giver henholdsvis uracil, histidin og adenin prototrophy. Den URA3 reporter tillader ikke vækst af celler i nærværelse af 5-FOA så godt, og dermed kan det være kontra valgt. ADE2 reporter-systemet har den fordel, at det ud over ernæringsmæssig udvælgelse gør det muligt at identificere gærceller, der udtrykker vildtype (dvs. funktionelle på ADE2 udtryk) eller mutant (dvs.ikke funktionel på ADE2 ) P53 fra koloni farven.

For eksempel, gær celler udtrykker ADE2 genet generere normalt størrelse hvide kolonier på plader, der indeholder begrænsende mængder af adenin (2.5-5.0 mg/L), mens dem, der dårligt eller ikke transskribere det vises på samme plade som mindre rød (eller pink) Kolonier. Dette skyldes ophobning af et mellemprodukt i adenin biosyntetisk pathway (dvs. P-ribosylamino-imidazol, som tidligere er blevet kaldt amino-imidazol ribotid eller luft), som omdannes til dannelse af et rødt pigment. Det kvalitative farve baserede ADE2 reporter-gen er siden blevet erstattet med den kvantitative Firefly photinus halvmøl (LUC1)12,22. For nylig er ADE2 reporter blevet kombineret med LacZ reporter i en let-til-score, semi-kvantitativ, dobbelt reporter assay, der kan udnyttes til at sub-klassificere P53 mutanter i henhold til deres resterende niveau af funktionalitet 23.

Fluorescerende reportere såsom EGFP (forbedret grønt fluorescerende protein) eller DsRed (Diskosoma Sp. rødt fluorescerende protein) er også blevet anvendt til den kvantitative evaluering af transaktiveringaktivitet, der er forbundet med alle mulige missense- mutationer i TP53 kodning sekvens24. Endelig har chancen for at kombinere justerbare initiativtagere til P53 allel-ekspression med isogene gærstammer, der er forskellige for re-og/eller reporter-genet, ført til udvikling af en data matrix, som genererer en raffineret klassificering af Cancer associerede og kimcelle mutant P53 alleler25,26,27.

De ovenfor beskrevne tilgange anvendes til at måle den transkriptionelle aktivitet af P53-proteinet. Men, udtrykket af vildtype P53 i gær S. cerevisiae28 og Schizosaccharomyces pombe29 kan forårsage vækstretardering, som har været forbundet med celle cyklus anholdelse28,30 eller celledød31. I begge tilfælde er gær væksthæmning udløst af High P53 Expression og er blevet korreleret med potentiel transkriptional graduering af endogene gær gener involveret i cellevækst. Understøtte denne hypotese, den tab-of-funktion mutant P53 R273H ikke forstyrre gærcelle vækst, når de udtrykkes på samme niveau som vild-type P5332. Omvendt forårsagede udtrykket i gær af den giftige mutant P53 V122A (kendt for højere transkriptional aktivitet sammenlignet med vildtype P53) en stærkere væksthæmmende effekt end vildtype P5332.

Desuden blev det påvist, at Human MDM2 var i stand til at hæmme den menneskelige P53 transkriptional aktivitet i gær, fremme dets allestedsnærværende og efterfølgende nedbrydning33. Derfor, evnen af human MDM2 og mdmx at hæmme P53-induceret gær væksthæmning blev demonstreret32,34. I en yderligere undersøgelse blev der etableret en sammenhæng mellem P53 transkriptional aktivitet og actin Expression niveauer, med identifikation af en formodet P53 RE opstrøms på ACT1 genet i gær32. Konsekvent blev actin Expression forstærket af Wild-type P53 og endnu mere af P53 V122A, men ikke af mutant P53 R273H. Derimod faldt actin Expression by P53 i samtidig tilstedeværelse af P53-hæmmere MDM2, MDMX eller pifithrin-α (en lille molekyle hæmmer af P53 transkriptionsaktivitet) i overensstemmelse med resultaterne baseret på gæren-vækst analysen. Vigtigere, disse resultater etableret en sammenhæng mellem P53-induceret væksthæmning og graden af dens aktivitet i gær, som også er blevet udnyttet til at identificere og studere små molekyler moduerende P53 funktioner28,34 , 35.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. opførelse af ADE2 eller LUC1 reporter gærstammer indeholdende en specifik re (yafm-re eller ylfm-re)

  1. Streak en yafm-iCore eller ylfm-iCore stamme12,14 (iCore = I, ISce-I endonuklease under GAL1 promotor; CO = tæller valgbar URA3; RE = reporter KanMX4 overdragelse af kanamycin resistens; Tabel 1) fra en 15% glycerol bestand opbevaret ved-80 °C på en YPDA agar plade (tabel 2). Lad det vokse i 2-3 dage ved 30 °C.
  2. Tag en gær koloni fra den friske plade (ikke mere end 3 uger gammel) og Placer den i en lille kolbe indeholdende 5 mL YPDA (tabel 2). Inkuber ved 30 °C natten over og ryster ved 150-200 rpm.
  3. Den næste dag, at fjerne alle spor af dextrose, pellet cellerne i 2 min ved 3.000 x g og kassere supernatanten ved inversion af røret.
    Bemærk: Udfør alle centrifugeringer i denne protokol ved stuetemperatur (RT).
  4. Celle pellet opslæmmes i 30-50 mL forvarmet CM (komplette medier), der indeholder galactose (tabel 2), og Inkuber i 4 timer ved 30 °c, idet den rystes ved 150-200 rpm (nødvendig for induktion af i-SCEI).
  5. Centrifuger cellerne i 2 min ved 3.000 x g og kassér supernatanten ved inversion af røret.
  6. Resuspension af celle pellet i 30-50 mL sterilt vand. Gentag trin 1,5.
  7. Opslæmmes celle pellet i 10 mL sterilt vand. Gentag trin 1,5.
  8. Resuspension af celle pellet i 5 mL steril LiAcTE (tabel 3), en ionisk løsning, der favoriserer DNA-optagelse. Gentag trin 1,5.
  9. Celle pellet opslæmmes i 250 μL steril LiAcTE, og cellerne overføres til et 1,5 mL rør. Gentag trin 1,5 og resuspender celle pellet i 300-500 μL steril LiAcTE.
  10. Under vasken, denaturere en 10 mg/mL opløsning af laks sperm DNA bærer i 10 min ved 100 °C og chill straks på isen for at opretholde det som enkeltstrenget DNA.
  11. I et separat 1,5 mL rør tilsættes 500 picomoler af det ønskede oligonukleotid (tabel 3), 5 μl af den kogte lakse sæbebærerdna, 300 ΜL steril LiAcTE-pind (tabel 3) og 50 μl af gærcelle suspensionen (fra trin 1,9).
  12. Vortex rørene for 10 s at blande og inkubere i 30 min ved 30 °C, omrystning ved 150-200 rpm. Placer 1,5 mL-rørene på siden for at favorisere rystelser.
  13. Varmechok gærcellerne i 15 min ved 42 °C i en varmeblok, og centrifuger derefter cellerne i 20 s ved 10.000 x g. Supernatanten fjernes, og cellerne opslæmmes i 1 mL sterilt vand.
  14. Spred 100 μL af cellesuspensionen på YPDA agar plade og Inkuber (på hovedet) i 1 dag ved 30 °C. For at sikre veladskilte kolonier opnås, også spredes 100 μL af en 1:10 fortynding.
  15. Den næste dag, replika plade ved hjælp af sterile fløjter på CM agar plade indeholdende dextrose og 5-FOA (tabel 2). Overvej en anden replika plade på en ny plade, hvis mange celler overføres (dvs. en vis vækst af URA3 celler).
  16. Tre dage senere, replika plade på ikke-selektive YPDA og YPDA indeholdende G418 (et aminoglycosid antibiotikum svarende til kanamycin) agar plader (tabel 2), mærkning hver plade for at lette deres efterfølgende sammenligning. Pladerne inkubates natten over ved 30 °C.
  17. Den næste dag, identificere kandidaten reporter stammer fra kolonier, der er G418-følsomme, men vokser på YPDA plader (f. eks, yLFM-eller yAFM-RE kolonier). Streak de identificerede kolonier (3-6 kolonier) på en ny YPDA plade for at opnå enkelt koloni isolater og lad dem vokse i 2 dage ved 30 °C.
  18. Patch enkelt gær kolonier på en YPDA plade for at isolere kolonierne til yderligere analyser. Efter 24 timer ved 30 °C, test dem ved replika plating på en YPGA agar plade (tabel 2), der forhindrer væksten af Petite mutanter (dvs. respiratoriske-mangelfulde mutanter). På samme tid, replika plade på en ny YPDA agar plade.
  19. Test de korrekte pletter (dvs. vækst på YPDA og YPGA agar plader; 1-3 kolonier) fra trin 1,18 for tilstedeværelsen af korrekt oligonukleotid integration af koloni PCR. Der samles en reaktionsblanding ved tilsætning af 5 μL 10x PCR-buffer (1,5 mM MgCl2), 2 μl 10 picomoler/μl primere (tabel 3), 4 μl 2,5 mm dntps, 0,25 μL 5 e/μl Taq-polymerase og vand til et endeligt volumen på 50 μl. Reaktionsblandingen multipliceres med antallet af gærkolonier, der skal screenes, og alikvot 50 μL i hvert PCR-rør. Ved hjælp af en pipette tilsættes en meget lille mængde gærceller fra YPDA-agar-pladen til en enkelt PCR-reaktionsblanding.
  20. Udfør PCR-reaktionen med følgende program: 94 °c i 8 min efterfulgt af 35 cyklusser af denaturering i 1 min ved 94 °c, primere udglødning for 1 min ved 55 °c, og forlængelse for 2 min ved 72 °c.
  21. Når reaktionen er afsluttet, skal du indlæse en alikvot af PCR-reaktionen (ca. en tiendedel af lydstyrken) på en agrose gel for at kontrollere den korrekte størrelse (~ 500 BP).
  22. Sekvens PCR-produktet efter rensning med et kommercielt sæt for at bekræfte integrationen af den ønskede RE-sekvens ved hjælp af de samme primere i trin 1,19.
  23. Efter valideringen af den korrekte sekvens, lav en 15% glycerol bestand af yAFM-RE eller yLFM-RE stammekultur (i YPDA) og opbevar det ved-80 °C.

2. evaluering af muligheden for P53 protein transaktiveringen ved hjælp af den kvalitative farve baserede ADE2 gær-analyse

  1. Gentag trin 1,1 og 1,2 ved hjælp af yAFM-RE-stammen (tabel 1).
  2. Dagen efter fortyndes cellekulturen (1:10) i 30-50 mL forvarmet YPDA og fortsætter med at inkubere ved 30 °C ved at ryste, indtil OD600Nm når 0,8-1,0 (~ 2 timer).
  3. Gentag trin 1.5-1.10.
  4. I et separat 1,5 mL rør tilsættes 300-500 ng af gær P53 (eller kontrol) ekspressions vektor (tabel 4), 5 μl af den kogte LAKSE sæddna-bærer, 300 ΜL steril LiAcTE-pind og 50 μl gærcelle suspension.
  5. Gentag trin 1,12 og 1,13, men resuspender celle pellet i 300 μL sterilt vand.
  6. Sprede 100 μL af cellesuspensionen på syntetiske selektive (for P53 Expression eller Control Vector) plader indeholdende dextrose som en kulstofkilde og høj mængde af adenin (tabel 2), derefter inkubere (på hovedet) ved 30 °c i 2-3 dage.
  7. Streak enkelt gær transformant kolonier (2-6 striber pr. plade) på en ny selektiv plade og lad dem vokse natten over ved 30 °C.
  8. Dagen efter, ved hjælp af sterile fløjl replika plade på nye selektive plader, der giver mulighed for vurdering af farven fænotype (dvs. plader, der indeholder dextrose som kulstofkilde, men begrænse mængden af adenin; Tabel 2). Pladerne inkubates på hovedet ved 30 °C i 3 dage. For at evaluere temperatur følsomheden af P53 protein, inkubatér ved tre forskellige temperaturer i 3 dage: 24 °C, 30 °C og 37 °C.
    Bemærk: den samme stribe kan være replika belagt flere gange.
  9. For at evaluere den P53 protein transaktiveringsevne, kontrollere den farve-baserede fænotype af gær kolonier og sammenligne P53 protein fænotype med hensyn til P53 vild-type og tomme vektor fænotyper.

3. evaluering af muligheden for P53 protein transaktiveringen ved hjælp af den kvantitative luminescens baseret LUC1 gæranalyse

  1. Omdanne gærceller med P53 (eller kontrol) udtryks vektorer (tabel 4) ved hjælp af den liac-baserede metode, der er beskrevet i protokol 2. Brug af yLFM-RE-stammen (tabel 1).
  2. Patch enkelt transformerende på en ny selektiv plade med den høje mængde af adenin indeholdende glucose som kulstofkilde og lad dem vokse ved 30 °C natten over. For hver Transformations type skal du lave 5-7 forskellige patches.
  3. Efter overnight vækst, resuspension en lille mængde gærceller ved hjælp af en steril tandstikker eller pipettespids fra pladen i syntetisk selektiv medium indeholdende dextrose eller raffinose som kulstofkilde (200 μL endelige volumen i en transparent 96 brønd plade, med en rund eller fladt bund). Hvis forsøget kræver inducerbart P53 udtryk, tilsættes galactose til raffinose mediet for at moduere induktions niveauet (tabel 2).
    Bemærk: disse celle suspensioner bør have en OD600Nm på omkring 0,4 og ikke højere end 1.
  4. Måle Absorbansen for hver brønd ved OD600Nm efter Inducerbart P53 udtryk (4-8 h ved 30 °c med 150-200 rpm omrystning) ved hjælp af en multi label plade læser. Sørg for, at celle Suspensionerne er homogene ved at blande hver brønd med en multikanalpipette.
  5. Overfør 10-20 μL cellesuspension fra den gennemsigtige 96 brønd plade til en hvid 384 (eller 96) brønd plade, og bland med samme volumen (10-20 μL) lysisbuffer. Inkubér i 10-15 min ved RT på en shaker (150-200 rpm) for at opnå permeabilisering af cellen til luciferasesubstratet.
  6. Tilsæt 10-20 μl Firefly der substrat og mål lysenheder (lu) med en multi-label plade læser.
  7. For at bestemme P53 protein transaktiveringsevne, normalisere LUs af hver brønd til den tilsvarende OD600Nm (relativ lys enhed, RLU). Beregn gennemsnitlig RLU og standardafvigelse fra 3-4 patches af gær transformant kolonier.
  8. Sammenlign data for P53-protein transaktiveringen med hensyn til P53 vildtype og Tom vektor, enten ved at fratrække de værdier, som er opnået med den tomme vektor, eller ved at dividere med de værdier, som er opnået med den tomme vektor (dvs. computer fold af induktion).
    Bemærk: P53 transaktiveringaktiviteten kan også evalueres ved hjælp af den samme eksperimentelle opsætning ved tilstedeværelse af P53-interagerende proteiner (dvs. MDM2 og MDMX) og/eller inklusive behandling af stoffer.

4. evaluering af P53-hæmning af protein vækst ved hjælp af gærphenotypic-analysen

  1. Omdanne gærceller med P53/MDM2/MDMX (eller kontrol) udtryks vektorer (tabel 4) ved hjælp af den liac-baserede metode, der er beskrevet i afsnit 2. Brug CG379 stammen (tabel 1), og spred gærtransformanter på minimale selektive plader (tabel 2).
  2. Vokse transformerede celler i minimal selektiv medium (tabel 2) til ca. 1 OD600Nm.
  3. Fortynd gærceller til 0,05 OD600Nm i det selektive induktions medium (tabel 2), og tilsæt eventuelt et valgt lille molekyle til den relevante koncentration (eller kun opløsningsmiddel) for at teste dets virkning ved genaktivering af mutant P53 eller ved at hæmme MDM2- /MDMX-P53 interaktioner.
  4. Inkubér cellerne ved 30 °C under kontinuerlig omrystning (200 rpm) i ca. 42 h (tid, der kræves af negativ kontrolgær for at nå Mid-log-fasen, ca. 0,45 OD600Nm).
  5. Spot 100 μL aliquoter af gærcelle kulturer på minimale selektive plader (tabel 2).
  6. Inkuber i 2 dage ved 30 °C.
  7. Mål gær vækst ved at tælle antallet af kolonier opnået i 100 μL kultur dråber (koloni danner enhed, CFU tæller). For eksempel beregne den muterede reaktiverende effekt af forbindelser i betragtning af væksten af vildtype P53 udtrykker gær som den maksimale mulige effekt (sat til 100%), mens væksten af celler, der udtrykker mutant P53 (men eksponeret for solvent Control) repræsenterer nulniveauet for reaktivering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Opførelse af ADE2 eller en LUC1 reporter gær stammer

Delitto perfettoapproach12,14,15,16 er blevet tilpasset for at muliggøre opførelsen af P53 Reporter gærstammer (figur 1b). Metoden anvender enkelt-eller dobbeltstrenget oligonukleotider, der i begge ender indeholder mindst 30 nukleotider homologe til den valgte Lokus for integration. Konkret svarer homologien til sekvenser, der flanderer integrations stedet for dobbelt markør-kassette ICORE, som indeholder KlURA3 og kanMX4 (reporter-genet, som giver resistens over for Geneticin, G418), som tidligere var placeret på den ønskede plads15,16. Denne kassette indeholder også gæren i-SCEI endonuklease-kodnings sekvensen under den inducerbare GAL1 -promotor og dens cognate-målside. Derfor er en switch i galactose-holdige medium lige før omdannelsen af gærceller med den ønskede sekvens resulterer i i-SceI udtryk og deraf følgende generation af en enkelt dobbelt-streng pause (DSB) på stedet for ICORE integration. Tilstedeværelsen af en DSB stimulerer i høj grad hyppigheden af målrettede hændelser med mere end 1.000 udskiftninger opnået med en enkelt transformation.

Ved afslutningen af målretnings-og udvælgelsesprocessen baseret på erhvervet resistens over for 5-FOA og følsomhed over for G418, bekræftes kandidat kloner af koloni PCR-baseret forstærkning af den modificerede Locus og sanger sekvensering for at verificere den korrekte integration af ønskede P53 RE (figur 1c). I slutningen af stammen byggeri protokol, der kan afsluttes i omkring en uge, et panel af isogene reporter gær stammer er opnået, der kan bruges til at evaluere, hvordan forskelle i sekvensen af REs påvirke transaktiveringskapacitet af P53 Protein.

Funktionelt heterogene mutant P53s

I humane tumorer påvirkes TP53 genet hovedsageligt af enkelte missense-mutationer, der generelt involverer seks store hotspotrester (R175, G245, R248, R249, R273 og R282), som ligger i det centrale DNA-bindende domæne (dbd) for det P53 protein. Men, mere end 2.000 enkelt P53 amino-acid substitutioner er blevet registreret, herunder nogle, der er sjældent observeret27. Mutant P53s kan klassificeres som DNA-kontakt eller strukturelle mutanter, afhængigt af virkningen af aminosyresubstitution på DNA-protein-kontakten (f. eks. R273H) eller proteinstrukturen (f. eks. R175H)36. Enkelt TP53 missense-mutationer påvirker P53 funktioner, genererer en bred vifte af funktionel mangfoldighed, som kan påvirke vigtige kliniske egenskaber såsom tumor aggressivitet, kemo resistens og metastatisk potentiale37, 38 , 39.

Konceptet om, at mutanter P53 er funktionelt heterogene, er klart dukket op i de sidste 15 år gennem en stor mængde eksperimentelle data i TP53 Mutations databaser (f. eks. < P53. fr//>)27. Forskellige funktionelle assays baseret på gær og/eller pattedyr reporter systemer er blevet udviklet, fremhæver de forskellige egenskaber af mutanter P53s (dvs. transaktiveringen, temperaturfølsomhed, dominerende-negative potentiale, indgreb i medlemmer af P53 familien og interaktioner med andre TFS)13,24,40,41,42,43,44. Den mest omfattende funktionelle undersøgelse undersøgte mere end 2.300 mutanter i en gær-baseret analyse ved at karakterisere deres transaktiveringaktivitet mod otte forskellige P53 REs24.

Dataene bekræftede, at næsten alle mutante P53s, der involverer hotspotrester, er tab af funktion (dvs. at de helt mistede transaktiverings aktiviteten). Omvendt er mutant P53s, der rammer andre positioner af det P53 protein og generelt findes ved moderat til lav frekvens i Cancer45 , partielle funktion mutanter, som bevarer en vis grad af transaktiveringaktivitet på P53 res13, 17. et eksempel på brug af ADE2 assay til at studere de beskrevne P53 proteiner funktionelle heterogenitet er præsenteret i figur 2a. Mens R175H er en tab-of-Function mutant, der producerer røde kolonier i alle testede tilstande, viste R282W en temperaturfølsomhed, som var mere tydelig ved hjælp af galactose-afhængige P53 udtryk (dvs. den røde sektor ved 37 °C i P21-5 ' RE stammen i plade, der indeholder lavere galactose, som bliver lyserød i den højere galactoseplade). Figur 2b præsenterer et resumé af resultaterne for et udvidet panel af P53 mutanter og reporter stammer.

Eksistensen af denne P53 funktionelle heterogenitet foranlediget udforskning af, om sådanne heterogenitet parallelt den heterogenitet observeret på det kliniske niveau hos personer med TP53 kimcelle mutationer. TP53 kimcelle mutationer ligger til grund for det molekylære grundlag for en gruppe kræft prædisponerede lidelser, herunder de mere alvorlige Li-Fraumeni (LFS) og Li-Fraumeni-lignende (LFL) syndromer, og de mindre alvorlige ikke-syndromiske prædispositioner med (FH) eller uden (ingen FH) slægtshistorie46.

Protokollen Fremhævede genotype-fænotype korrelationer ved at matche de gær assay-baserede transaktiveringsevner af alle TP53 kimcelle mutant alleler med tilsvarende kliniske data fra IARC-databasen < http://www-P53.IARC.fr/germline.html >. Tab-of-funktion P53 mutanter er blevet fundet i mere alvorlige kræft tilbøjelighed syndromer, mens partiel funktion P53 mutanter er fundet i mindre alvorlige Cancer tilbøjelighed betingelser. Dette indikerer, at P53 residualtransaktiverings evne påvirker klinisk fænotype hos patienter, der har arvet TP53 mutationer og udviklet kræft25,26.

Nukleotidsekvenserne variationer i res styrer P53 potentiale for Trans aktivering

Human P53 er en tetrameric (dimer af dimers) TF. Hver P53 dimer genkender en RE bestående af 10 nukleotider (RRRCWWGYYY, R = A eller G; W = A eller T; Y = C eller T)47,48. To sådanne halv-sites kan være enten støder op til eller fordelt fra hinanden med op til 13-20 nucleotides, der udgør en funktionel P53 re. Ikke desto mindre er P53 res med en spacer karakteriseret ved lavere P53 affinitet og Trans aktivering end P53 res uden et spacer49,50, i forskellige funktionelle assays fra forskellige systemer.

Det blev for nylig påvist, at halve steder kan rekruttere P53 tetramers, der er bundet hemispecifikt51, sammen med funktionelle assays og kromatin chromatinimmunpræcipitation undersøgelser, disse resultater indikerer, at P53 også kan handle på ikke-kanoniske res, bestående af halv-sites og tre-kvart lokaliteter48,52. Den kendsgerning, at den fulde konsensus P53 RE motiv er meget degenereret (RRRCWWGYYY)2 , viser desuden, at individuelle res i væsentlig grad kan afvige i sekvens og bindingsaffinitet. I betragtning af at hundredvis af P53 Target gener er blevet identificeret i det menneskelige genom41,48, næsten alle P53 res viste ikke-identiske sekvens mellem hinanden. Desuden har det været en hypotese, at REs med en distinkt DNA bindende affinitet er valgt i initiativtagerne til P53 Target gener involveret i celle cyklus anholdelse eller apoptose53.

Analysen i gær af mange varianter af P53 RE på en konstant genomisk placering fastslået virkningen af nukleotidvarianter, spacer og organisering af RE-halve sites på transaktiveringskapacitet49. Det førte endda til opdagelsen af polymorfe P53 res med de to alleler markant forskellig i reaktionsevne af en associeret promotor til P5314,54,55. For nylig er oplysninger, der stammer fra P53 RE sekvens funktioner og gær-baserede Trans aktiverings potentiale blevet kodet i P53 Retriever, en mønster søgning algoritme, som er i stand til at lokalisere og rang både kanonisk og ikke-kanoniske REs, i henhold til deres forventede transaktiveringspotentialer i hele det humane genom52.

Som et eksempel på at bruge analysen til at studere sekvens-specifikke P53 Trans aktiverings potentiale, præsenteret her er en sammenligning mellem Human Wild-type P53 og den evolutionære fjerne P53 protein fra Caenorhabditis elegans (figur 3). Disse resultater er en opfølgning af en nylig undersøgelse, hvor den evolutionære divergens af transaktiverende specificitet blandt P53 proteiner blev udforsket56. Isogene yLFM-RE reporter stammer blev udviklet som beskrevet i protokollen. Specifikt blev CEP-1 P53 RE afledt af ced13 genet57og fire varianter (v1-v4) sammenlignet (figur 3a). RE varianterne blev konstrueret til at undersøge virkningen af varierende længden af spaceren, der adskiller de to decameriske motiver (som i ced13, er af 28 nukleotider) og til at undersøge ændringer i nucleotider ledsage cwwg kerne motiv (som i ced13, er A/T rige; mens i den højeste affinitet Human P53 REs, er G/C rige)58. Resultaterne viser tydeligt, hvordan Cep1 og human P53 afviger i form af transaktiverende specificitet. Faktisk, mens Human P53-medieret transaktiveringen er stærkt hæmmet af tilstedeværelsen af et afstandsstykke (figur 3b), CEP-1 aktivitet hæmmes af fjernelsen af spacer (figur 3c). Desuden afskaffes CEP-1-medieret transaktiveringen, når RE ændres fra A/T-til G/C-Rich. Hverken Human P53 eller CEP-1 kan transaktivere fra en enkelt decamer afledt af ced13 RE.

Søgning efter små molekyle disruptorer af P53-MDM2/MDMX interaktioner og reaktivatorer af mutant P53 aktivitet

Den etablerede sammenhæng mellem den væksthæmmende effekt af human P53 og graden af dets aktivitet i gær førte til en forenklet screening analyse baseret på målinger af gærcelle vækst for at analysere virkningen af forstyrrende faktorer på P53 aktivitet (figur 4 ). Effektiviteten af gær fænotypisk assay til at screene for potentielle anticancermidler er blevet påvist i flere værker. Ved hjælp af gærceller, der medudtrykker P53 og dets hæmmere MDM2 og/eller MDMX, blev nye forstyrrende stoffer i disse interaktioner identificeret ved deres evne til at hæmme den negative effekt af MDMs på P53 og dermed genskabe vildtype P53-induceret gærvækst hæmning ( Figur 4a). Især denne analyse førte til opdagelsen af 1) pyranoxanthone 1 som den første P53-MDM2 interaktions hæmmer med en xanthone stilladset34 og 2) oxazoloisoindolinone hæmmere af P53-MDM2 interaktion59. Med denne analyse blev α-mangostin og gambogic også beskrevet for første gang som potentielle hæmmere af P53-MDM2-interaktionen30.

Senere, den samme analyse viste, at prenylation af chalkone forbedret deres evne til at forstyrre P53-MDM2 interaktion60. Interessant, denne gær assay også ført til opdagelsen af to hæmmere af P53-MDM2/MDMX interaktioner: den tryptophanol-afledte oxazolopiperidone lactam OXAZ-161 og tryptophanol-afledte oxazoloisoindolinone DIMP53-162.

Den reducerede virkning af tab-of-Function mutant P53 på gærcelle vækst er også blevet udforsket for at screene for mutant P53-reaktiverende lægemidler, karakteriseret ved evnen til at genskabe vildtype-lignende væksthæmmende aktivitet til mutant P53 (figur 4b). Med denne gær-analyse blev der identificeret en reaktivator af mutant P53 R280K, den enantiopure tryptophanol-afledte oxazoloisoindolinon SLMP53-163. Figur 4c,D viser repræsentative resultater opnået i gær med ekspression af P53 eller behandlinger med INHIBITOR af P53-MDM2 interaktion nutlin-3a eller med Genaktivatoren af P53 mutant Y220C PhiKan083.

Validering af den molekylære virkningsmekanisme af disse forbindelser som P53-aktiverende agenter samt deres antitumoraktivitet, både i humane tumorcellelinjer34,60,61,62,63 og dyremodeller62,63, attesterer til det store potentiale af gær fænotypiske assay i Drug Discovery.

Figure 1
Figur 1 : Funktioner af gær baseret P53 transaktiveringassays og workflow til opførelse af P53 Reporter gærstammer. A) let genommanipulation og kontrolleret ektopisk genekspression gør gær beslægtet med et "in vivo-testrør", hvor flere variabler, der er relevante for at undersøge P53 transaktiveringsfunktioner, undersøges nøje. Disse variabler omfatter niveauerne for ekspression af en vildtype eller mutant P53 protein, sekvensen af RE og typen af reporter-genet [kvalitativ/semi-kvantitativ (f. eks. ADE2 og LacZ) eller kvantitativ (f. eks. LUC1)]. Konsensus omsekvensen er stærkt degenereret (RE = RRRCWWGYYY-n-RRRCWWGYYY; R = purin; W = A/T; Y = pyrimidin; CWWG = kerne sekvens, n = 0-13 bps spacer). Antallet af uoverensstemmelser med hensyn til konsensus, kerne sekvensen og antallet af base pair Spacers vil påvirke transaktiveringaktiviteten. Dette panel er blevet ændret fra en tidligere publikation64. (B) ordningen med Delitto Perfetto-tilgangen til at introducere en ønsket P53 re opstrøms for den minimale promotor, der driver ADE2 -eller LUC1 reporter-genekspression. Protokollen blev tilpasset fra tidligere publikationer12,15,16. (C) eksempel på resultaterne af GÆR koloni PCR amplifikation af regionen omkring OLIGO re integration site. Billedet af elektroforese præsenterer forstærknings resultatet af to formodede positive kolonier (URA3 minus og G418 følsom) med den tilsvarende PCR negative kontrol ved siden af 1 kb DNA stigen (Promega). Det ~ 500 NT-bånd, der forventes ved hjælp af primere beskrevet i tabel 3 , kan sorteres for at bekræfte den korrekte promotor-redigering, som vist i electropherogram. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2 : P53 proteiner viser et re-specifikt og temperaturfølsomt transaktiverings potentiale. Wild-type P53 og de indikerede TP53 missense-mutationer blev testet ved hjælp af den kvalitative farve baserede reporter assay i gær og udnytte reporter stammer, der Harbor forskellige P53 res kontrollere ADE2 Gen ekspression. A) der vises et eksempel på koloni farven fænotype for P53 vildtype, R175H og R282W med Puma (BBC3) og P21-5 res ved 30 °c og 37 °c. Moderat (0,008% galactose) og høj (0,12% galactose) P53 ekspression sammenlignes. B) resultater opnået med et udvidet sæt af P53 mutanter og gær reporter stammer undersøgt for den P53-afhængige koloni farve fænotype ved tre temperaturer (24 °c, 30 °c og 37 °c). Resultater eksemplificere funktionelle heterogenitet af mutant P53 alleler og er opsummeret i et tabelformat. For eksempel er R175H en tab-of-Function mutant, mens G199H er vild-type P53-lignende. K139E og R282W bevarer delvis funktion og udviser henholdsvis kold følsomhed og varmefølsomhed. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3 : Human P53 og krediteret ortholog CEP-1 udviser stærkt divergerende transaktiveringsæregenhed. A) sekvenser af: Human P53 re konsensus sekvens, CEP-1 P53 re afledt af ced13 genet, og fire varianter (v1-v4), der blev testet i de funktionelle assays. B) transaktiveringen blev målt efter inducerende Human P53 Expression i 8 timer ved hjælp af tre forskellige kulstofkilder for at opnå et lavt, moderat og højt ekspression (0,008%, 0,032%, 0,12% galactose tilsat til selektivt medium indeholdende 2% raffinose). Resultaterne udtrykkes som gennemsnitlige relative lysenheder (RLU) og standardfejl på fire replikater. Reporter-aktivitet for celle transformerede med Tom udtryks vektor blev trukket ud. C) transaktiveringsæregenhed af Cep1 som målt i litra B). For begge proteiner var transaktiveringsniveauerne proportionale med mængden af galactose. De højere lysenheder målt ved menneskelig P53 udtrykkes kan afhænge af forskellige niveauer af protein mængder produceret, på grund af forskelle i protein længde og potentielt også i codon skik. De to proteiner er karakteriseret ved forskellige transaktiverende specificitet i forhold til de forskellige REs testet og denne egenskab påvirkes ikke af mulige forskelle i det relative protein beløb. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4 : Små molekyle aktivatorer af P53 identificeret ved hjælp af gær fænotypisk assay. A) gærceller, der medudtrykker Human Wild-type P53 og MDM2 eller MDMX, er blevet brugt til at søge efter inhibitorer af P53-MDM2-og P53-MDMX-interaktioner. I dette system, interaktion hæmmere genoprette P53-induceret gær væksthæmning i gærceller Co-udtrykke P53 og MDM2 eller MDMX. Denne fremgangsmåde har gjort det muligt at identificere hæmmere af P53-MDM2 interaktion og identifikation af dobbelte hæmmere af P53-MDM2 og P53-MDMX interaktioner. B) gærceller, der udtrykker Human mutant P53, er blevet brugt til at søge efter mutante P53 reaktivatorer og er i stand til at genskabe den vildtype lignende P53-induceret gærvækst hæmning i mutant P53-udtrykte gærceller. C) repræsentative billeder af plade spot analysen, der viser virkningen af vildtype P53 eller mutant Y220C på vækst i gærkoloni sammenlignet med den tomme vektor (se trin 4,5). D) kvantitative resultater af vækst analysen: 10 ΜM nutlin-3a genskaber P53-induceret gærvækst hæmning i celler, som samtidig udtrykker MDM2; 50 μM PhiKan083 genskaber vild-type-lignende P53-induceret gær væksthæmning til mutant P53 Y220C. Begge effekter er afbildet i forhold til gær væksthæmmende effekt af Wild-type P53, som blev sat som en. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Stamme navn og genotype Specifik anvendelse Protokolnummer
Yafm-ICORE: MATa leu2-3112 trp1-1 his3-11, 15 can1-100; ura3-1; ICORE::p Cyc1:: ADE2 Det anvendes til opførelse af Yafm-re stamme (MATa leu2-3112 trp1-1 his3-11, 15 can1-100; ura3-1; ICORE::p Cyc1:: ADE2), der udnyttes i den kvalitative, farve baserede ADE2 analyse. Protokoller 1, 2
Ylfm-ICORE: MATa leu2-3112 trp1-1 his3-11, 15 can1-100; ura3-1; ICORE::p Cyc1:: LUC1 Det anvendes til opførelse af Ylfm-re stammen (MATa leu2-3112 trp1-1 his3-11, 15 can1-100; ura3-1; RE::p Cyc1:: LUC1), der udnyttes i den kvantitative luminescens-baserede LUC1 assay. Protokoller 1, 3
CG379: MATa, ade5 his7-2 leu2-112 trp1-289aura3-52 [Kil-O] Det anvendes til fænotypisk vækst analyse. Protokol 4

Tabel 1: Gærstammer.

Medienavn og opskrift Specifik anvendelse Protokolnummer
Ypda (2% gær ekstrakt, 2% peptone, 2% dextrose, 200 mg/L adenin) + 2% agar YPDA uden agar steriliseres fortrinsvis ved filtrering. YPDA + agar steriliseres ved autoklave. Det er muligt at udelade dextrose fra opskriften og tilføje dextrose fra en 20% filter steriliseret opløsning i vand, inden pladerne hældes. Protokoller 1-4
Cm [0,17% gær nitrogen base uden AA og ammonium sulfat, 0,5% ammonium sulfat, 5% (volumen/volumen, v/v) ikke-essentiel aminosyre opløsning, 20 mg/l histidin, 20 mg/l tryptophan, 20 mg/l uracil, 30 mg/l lysin, 100 mg/l leucin, 200 mg/l adenin] + 2% galactose Mediet er steriliseret ved filtrering. Følgende sterile stamopløsninger tilberedes i vand (med undtagelse af uracil, der opløses i 0,1 M NaOH) ved filtrering: ikke-essentiel aminosyre opløsning (0,04% arginin, 0,04% methionin, 0,06% isoleucin, 0,1% phenylalanin, 0,2% glutaminsyre syre, 0,2% aspartinsyre, 0,3% valin, 0,4% threonine, 0,8% Serin), 1% histidin, 1% tryptophan, 1% uracil, 1% lysin, 1% leucin, 0,5% adenin, 20% galactose. Adenin stamopløsning må ikke opbevares i køleskab på grund af dannelsen og sedimentering af krystaller. Tryptophan stamopløsning skal opbevares i mørket. Protokol 1
Cm (se ovenfor) + 2% dextrose + 1g/L 5-FOA + 2% agar Mediet (indeholdende gær nitrogen base uden AA og ammoniumsulfat, ammoniumsulfat og agar) er steriliseret ved autoklave. De øvrige komponenter tilsættes efter autoklave ingen for at bevare varmelabile ingredienser; 5-FOA pulveret kan tilsættes direkte i medierne, når det er afkølet til omkring 55 °C. Protokol 1
Ypda + 400 μg/ml G418 + 2% agar G418 skal tilsættes efter autoklave Rens, når mediet er afkølet til ca. 55 °C. Hvis du starter fra pulver, en 50 mg/mL G418 stamopløsning kan tilberedes i vand og steriliseres ved filtrering. Protokol 1
YPGA [2% gær ekstrakt, 2% peptone, 2% glycerol (v/v), 200 mg/L adenin] + 2% agar Mediet er steriliseret ved autoklave iser. Protokol 1
Syntetisk selektiv plade: [0,17% gær nitrogen base uden AA og ammoniumsulfat, 0,5% ammoniumsulfat, 5% (v/v) ikke-essentiel aminosyre opløsning (0,04% arginin, 0,04% methionin, 0,06% isoleucin, 0,1% phenylalanin, 0,2% glutaminsyre, 0,2% aspartinsyre, 0,3% valin, 0,4% threonine, 0,8% Serin), 20 mg/L histidin, 20 mg/L uracile, 20 mg/L tryptophan (afhængigt af vektor markeringsmarkør), 30 mg/L lysin, 100 mg/mL leucin (afhængigt af vektor markeringsmarkør), 5 mg/L eller 200 mg/L adenin] + 2% dextrose + 2% agar Mediet (indeholdende gær nitrogen base uden AA og ammoniumsulfat, ammoniumsulfat og agar) er steriliseret ved autoklave. De øvrige komponenter tilsættes efter autoklave ingen for at bevare varmelabile ingredienser. Når du bruger pLS-og pLSG-baserede vektorer forberede plader uden leucin. Når du bruger pTS-og pTSG-baserede vektorer forberede plader uden tryptophan. Protokoller 2-3
Syntetiske selektive medier: [0,17% gær nitrogen base uden AA og ammoniumsulfat, 0,5% ammoniumsulfat, 5% (v/v) ikke-essentiel aminosyre opløsning (0,04% arginin, 0,04% methionin, 0,06% isoleucin, 0,1% phenylalanin, 0,2% glutaminsyre, 0,2% aspartinsyre, 0,3% valin, 0,4% threonine, 0,8% Serin), 20 mg/L histidin, 20 mg/L uracile, 20 mg/L tryptophan (afhængigt af vektor markeringsmarkør), 30 mg/L lysin, 100 mg/mL leucin (afhængigt af vektor markeringsmarkør), 200 mg/L adenin] + 2% dextrose eller raffinose + 0-2% galactose  Mediet er steriliseret ved filtrering. Ved brug af pLS-eller pTS-baserede vektorer i narkotikabehandling forberede medier uden leucin eller tryptophan, henholdsvis men indeholder 2% dextrose. Ved brug af pLSG-eller pTSG-baseret vektor i inducerbart P53 udtryk med eller uden narkotikabehandling forberede medier uden leucin eller tryptophan, henholdsvis men indeholder 2% raffinose og variabel mængde galactose at moduere P53 udtryk. Omfanget af P53 induktion kan også modueres ved at variere inkubationstiden. Protokol 3
Minimal selektive plader: 2% glucose, 0,7% gær nitrogen base (uden aminosyrer og ammoniumsulfat), 50 mg/l adenin, 50 mg/l uracil, 50 mg/l histidin, 50 mg/l tryptophan (afhængigt af vektor markeringsmarkør), 50 mg/l leucin (afhængigt af vektor markeringsmarkør), 2% agar Mediet er steriliseret ved autoclaving. Når du bruger pLS89-baserede vektorer forberede medium uden tryptophan. Brug pLS89-Tom vektor (ikke udtrykker noget protein) som negativ kontrol. Ved brug af pLS89-baserede og pGADT7-MDM2 vektorer (co-udtryk af P53 og MDM2), forberede medium uden leucin og tryptophan. Brug pLS89-Empty og pGADT7 (begge ikke udtrykker noget protein) som negative kontroller. Ved brug af pLS76-baserede vektorer forberede medium uden leucin. Brug pRS315 vektor (ikke udtrykker noget protein) som negativ kontrol. Protokol 4
Minimal selektiv medium: som minimal selektive plader, men uden agar Mediet er steriliseret ved filtrering. Protokol 4
Selektiv induktions medium: som minimal selektiv medium, men indeholder 2% galactose i stedet for glucose Mediet er steriliseret ved filtrering. Protokol 4

Tabel 2: Gærmedier.

Løsningsnavn og opskrift eller primer navn og sekvens Specifikke funktioner og brug Protokolnummer
Liac/te: 10 mm Tris-HCl, pH 8,0, med 1 mm EDTA og 0,1 m lithium acetat Følgende sterile stamopløsninger i vand fremstilles ved autoclaving: 1M lithium acetat pH 7,5, 1 M Tris-HCl/0,1 M EDTA pH 8,0 (TE buffer 10X). Protokoller 1-4
Peg/LiAc/te: 40% polyethylenglycol (peg) i 10 mm Tris-HCl, pH 8,0, med 1 mm EDTA og 0,1 M lithium acetat Følgende sterile stamopløsninger i vand fremstilles ved autoclaving: 1 M Lithiumacetat pH 7,5, 1 M Tris-HCl/0,1 M EDTA pH 8,0 (TE buffer 10X), 50% PEG (molekylvægt ~ 3350). Protokoller 1-4
Homology haler til RE oligonucleotides:
5 '-gcggaattgactttttcttgaataatacat-RE-gcagatccgccaggcgtgtatatagcgtgg-3 '
Leveres er sekvens af homologi haler, svarende til kromosomale sekvenser ledsage den integrerede iCore kassette; RE = RE sekvens. Protokol 1
Primers: Ade2 FW: 5 '-AAGTTGCCTAGTTTCATGAA-3 ';
Ade2 RV: 5 '-GGAGCCATTAACGTGGTCAT-3 ';
Luc1-RV: 5 '-CATAGCTTCTGCCAACCGAA-3 '
For yAFM-RE stamme (PCR og Sequencing) kombinere Ade2 FW med Ade2 RV primer. For yLFM-RE stamme (PCR og Sequencing) kombinere Ade2 FW med Luc1-RV primer. Protokol 1

Tabel 3: opløsninger og oligonukleotider.

Typer af vektorer Positive og negative kontroller Protokolnummer
P53 (eller kontrol) vektorer.
pLS-eller pLSG-baserede: P53 protein Expression under henholdsvis konstitutiv ADH1 Promoter eller galactose inducerbar GAL1 Promoter (LEU2 som markeringsmarkør).
pTS-eller pTSG-baserede: P53-protein ekspression under henholdsvis konstitutiv ADH1 promotor eller galactose inducerbar GAL1 Promoter (TRP1 som markeringsmarkør)
pLS-og pLSG-baserede: anvendes som positiv kontrol af pLS76 og pLSG-P53 vektorer (udtrykker henholdsvis vildtype P53); Brug som negativ kontrol pRS315 vektor (ikke udtrykker nogen protein).
pTS-og pTSG-baserede: anvendes som positiv kontrol af pTS76 og pTSG-P53 vektorer (som udtrykker henholdsvis vildtype P53); Brug som negativ kontrol pRS314 vektor (ikke udtrykker nogen protein).
Protokol 2, 3
P53 og MDM2 (eller kontrol) vektorer.
pLS89-baseret: vildtype P53 protein udtryk under galactose inducerbar GAL1 promotor (TRP1 som markeringsmarkør).
pLS76-baseret: mutant P53 protein ekspression under konstitutiv ADH1 Promoter (LEU2 som markeringsmarkør).
pGADT7-baseret: MDM2 protein ekspression under konstitutiv ADH1 Promoter (LEU2 som markeringsmarkør)
pLS89-baseret: brug som positiv kontrol af pLS89-P53 vektor (udtrykker vildtype P53); Brug som negativ kontrol pLS89-tom (ikke udtrykker noget protein).
pLS76-baseret: brug som positiv kontrol pLS76-mutant P53 vektor (udtrykker mutant P53); Brug som negativ kontrol pRS315 vektor (ikke udtrykker nogen protein).
pGADT7-baseret: brug som positiv kontrol af pGADT7-MDM2 vektor (udtrykker vildtype MDM2); Brug som negativ kontrol pGADT7 vektor (ikke udtrykker nogen protein).
Protokol 4

Tabel 4: gær udtryks vektorer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Gær-baserede assays har vist sig nyttigt at undersøge forskellige aspekter af P53 protein funktioner. Disse analyser er særligt følsomme for at evaluere P53 transaktiveringspotentiellet mod varianter af RE-målområder, herunder evaluering af funktionelle polymorfier. Brugen af farve reportere samt miniaturisering af luciferaseanalysen resulterer i omkostningseffektive og relativt skalerbare analyser. Også, væksthæmning test er potentielt modtagelig for at blive brugt i kemisk bibliotek screening, automatisere kvantificering af gærcelle levedygtighed gennem måling af absorbans. Mens begrænset permeabilitet på grund af cellevæggen og virkningen af ABC transportører er blevet betragtet som en begrænsning i at bruge gær til Drug screening, genetiske modifikationer til at forbedre optagelsen er blevet udviklet med succes22,65.

Sammenlignet med pattedyrscelle baserede assays, kan den gær-baserede P53 assay forbedre identifikationen af direkte hits, da P53 er isoleret fra den fantastiske kompleksitet af cofaktorer og signalering kaskade veje, der moduler sine funktioner i højere eukaryoter. Gær-baserede funktionelle assays har også været delvist vellykket i overvågningen af samspillet mellem P53 med protein cofaktorer (nemlig MDM2 og mdmx22,32,33,34) og virkningen af små molekyler (såsom Nutlin-3a) på disse interaktioner. Men den følsomhed og forudsigende effekt af gær-baserede assays til at undersøge krydstale mellem P53 og interagerende proteiner kan være noget begrænset, afhængigt af hvordan disse interaktioner in vivo afhænge af post-translationelle modifikationer og artsspecifikke signal kaskader.

De systemer, der beskrives her, kan let tilpasses andre TFs. Faktisk er gær funktionelle assays blevet udviklet til P53-relaterede P63 og P73 proteiner42,49 samt medlemmer af NF-κb familie66,67 [eller endda for nogle homeobox og grundlæggende Helix-loop-Helix (bhlh) TFS68,69]. Humane nukleare receptorer er også blevet udtrykt i gær og vist sig at fungere som ligand-afhængige, sekvens-specifikke TFs70. En begrænsende faktor er blevet identificeret i den svage kapacitet af nogle pattedyr transaktiverende domæne (TAD) til at interagere med gær basal transskription maskiner8, en mangel, der kan overvindes ved hjælp af chimeriske konstruktioner, herunder en aktiv heterolog tad68,69.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen interessekonflikt.

Acknowledgments

Vi takker EU (FEDER-fondene POCI/01/0145/FEDER/007728 gennem programa Operacional factores de Competitividade-konkurrence) og nationale fonde (FCT/MEC, Fundação para a Ciência e tecnologia og Ministério da Educação e Ciência) under Partnerskabsaftale PT2020 UID/QUI/50006/2019 og projekterne (3599-PPCDT) PTDC/DTP-FTO/1981/2014-POCI-01-0145-FEDER-016581. FCT-stipendiater: SFRH/BD/96189/2013 (S. Gomes). Dette arbejde blev støttet af Compagnia S. Paolo, Torino, Italien (projekt nr. 2017,0526) og Sundhedsministeriet (projekt 5x1000, 2015 og 2016; Aktuel forskning 2016). Vi takker kraftigt Dr. Teresa López-Arias Montenegro (universitetet i Trento, eksperimentelle videnskaber undervisning laboratorier) for hjælp med videooptagelse.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
L-Aspartic acid SIGMA 11189
QIAquick PCR Purification Kit QIAGEN 28104
L-Phenylalanine SIGMA 78019
Peptone BD Bacto 211677
Yeast ex+A2:C26tract BD Bacto 212750
Difco Yeast Nitrogen Base w/o Amino Acids and Ammonium Sulfate BDTM 233520
Lithium Acetate Dihydrate SIGMA 517992
Bacteriological Agar Type A Biokar Diagnostics A1010 HA
G418 disulfate salt SIGMA A1720
Ammonium Sulfate SIGMA A2939
L-Arginine Monohydro-chloride SIGMA A5131
Adenine Hemisulfate Salt SIGMA A9126
Passive Lysis Buffer 5x PROMEGA E1941
Bright-Glo Luciferase Assay System  PROMEGA E2620
5-FOA Zymo Research F9001
D-(+)-Galactose SIGMA G0750
L-Glutamic acid SIGMA G1251
Dextrose  SIGMA G7021
L-Histidine SIGMA H8125
L-Isoleucine SIGMA I2752
L-Lysine SIGMA L1262
L-Leucine SIGMA L8000
L-Methionine SIGMA M2893
PEG SIGMA P3640
D-(+)-Raffinose Pentahydrate SIGMA R0250
L-Serine SIGMA S4500
L-Tryptophan SIGMA T0271
L-Threonine SIGMA T8625
Uracil SIGMA U0750
L-Valine SIGMA V0500

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Spitz, F., Furlong, E. E. Transcription factors: from enhancer binding to developmental control. Nature Reviews Genetics. 13, (9), 613-626 (2012).
  2. Pan, Y., Tsai, C. J., Ma, B., Nussinov, R. Mechanisms of transcription factor selectivity. Trends in Genetics. 26, (2), 75-83 (2010).
  3. Das, M. K., Dai, H. K. A survey of DNA motif finding algorithms. BMC Bioinformatics. 8 Suppl 7, S21 (2007).
  4. Sebastian, A., Contreras-Moreira, B. The twilight zone of cis element alignments. Nucleic Acids Resesarch. 41, (3), 1438-1449 (2013).
  5. Iggo, R., et al. Validation of a yeast functional assay for p53 mutations using clonal sequencing. Journal of Pathology. 231, (4), 441-448 (2013).
  6. Kaeberlein, M., Burtner, C. R., Kennedy, B. K. Recent developments in yeast aging. PLoS Genetics. 3, (5), e84 (2007).
  7. Scharer, E., Iggo, R. Mammalian p53 can function as a transcription factor in yeast. Nucleic Acids Research. 20, (7), 1539-1545 (1992).
  8. Kennedy, B. K. Mammalian transcription factors in yeast: strangers in a familiar land. Nature Reviews Molecular Cellular Biology. 3, (1), 41-49 (2002).
  9. Belli, G., Gari, E., Piedrafita, L., Aldea, M., Herrero, E. An activator/repressor dual system allows tight tetracycline-regulated gene expression in budding yeast. Nucleic Acids Research. 26, (4), 942-947 (1998).
  10. Mumberg, D., Muller, R., Funk, M. Regulatable promoters of Saccharomyces cerevisiae: comparison of transcriptional activity and their use for heterologous expression. Nucleic Acids Research. 22, (25), 5767-5768 (1994).
  11. Weinhandl, K., Winkler, M., Glieder, A., Camattari, A. Carbon source dependent promoters in yeasts. Microbial Cell Factories. 13, 5 (2014).
  12. Inga, A., Storici, F., Darden, T. A., Resnick, M. A. Differential transactivation by the p53 transcription factor is highly dependent on p53 level and promoter target sequence. Molelcular and Cellular Biology. 22, (24), 8612-8625 (2002).
  13. Resnick, M. A., Inga, A. Functional mutants of the sequence-specific transcription factor p53 and implications for master genes of diversity. Proceeding of the National Academy of Science USA. 100, (17), 9934-9939 (2003).
  14. Tomso, D. J., et al. Functionally distinct polymorphic sequences in the human genome that are targets for p53 transactivation. Proceeding of the National Academy of Science USA. 102, (18), 6431-6436 (2005).
  15. Storici, F., Lewis, L. K., Resnick, M. A. In vivo site-directed mutagenesis using oligonucleotides. Nature Biotechnology. 19, (8), 773-776 (2001).
  16. Storici, F., Resnick, M. A. The delitto perfetto approach to in vivo site-directed mutagenesis and chromosome rearrangements with synthetic oligonucleotides in yeast. Methods in Enzymology. 409, 329-345 (2006).
  17. Campomenosi, P., et al. p53 mutants can often transactivate promoters containing a p21 but not Bax or PIG3 responsive elements. Oncogene. 20, (27), 3573-3579 (2001).
  18. Flaman, J. M., et al. A simple p53 functional assay for screening cell lines, blood, and tumors. Proceedings of the National Academy of Science USA. 92, (9), 3963-3967 (1995).
  19. Kovvali, G. K., Mehta, B., Epstein, C. B., Lutzker, S. G. Identification of partial loss of function p53 gene mutations utilizing a yeast-based functional assay. Nucleic Acids Research. 29, (5), E28 (2001).
  20. Shimada, A., et al. The transcriptional activities of p53 and its homologue p51/p63: similarities and differences. Cancer Research. 59, (12), 2781-2786 (1999).
  21. Sunahara, M., et al. Mutational analysis of p51A/TAp63gamma, a p53 homolog, in non-small cell lung cancer and breast. Oncogene. 18, (25), 3761-3765 (1999).
  22. Andreotti, V., et al. p53 transactivation and the impact of mutations, cofactors and small molecules using a simplified yeast-based screening system. PLoS ONE. 6, (6), e20643 (2011).
  23. Hekmat-Scafe, D. S., et al. Using yeast to determine the functional consequences of mutations in the human p53 tumor suppressor gene: An introductory course-based undergraduate research experience in molecular and cell biology. Biochemistry Molecular Biology Educaction. 45, (2), 161-178 (2017).
  24. Kato, S., et al. Understanding the function-structure and function-mutation relationships of p53 tumor suppressor protein by high-resolution missense mutation analysis. Proceedings of the National Academy of Science USA. 100, (14), 8424-8429 (2003).
  25. Monti, P., et al. Transcriptional functionality of germ line p53 mutants influences cancer phenotype. Clinical Cancer Research. 13, (13), 3789-3795 (2007).
  26. Monti, P., et al. Dominant-negative features of mutant TP53 in germline carriers have limited impact on cancer outcomes. Molecular Cancer Research. 9, (3), 271-279 (2011).
  27. Leroy, B., et al. The TP53 website: an integrative resource centre for the TP53 mutation database and TP53 mutant analysis. Nucleic Acids Research. 41, (Database issue), D962-D969 (2013).
  28. Nigro, J. M., Sikorski, R., Reed, S. I., Vogelstein, B. Human p53 and CDC2Hs genes combine to inhibit the proliferation of Saccharomyces cerevisiae. Molecular and Cellular Biology. 12, (3), 1357-1365 (1992).
  29. Bureik, M., Jungbluth, A., Drescher, R., Wagner, P. Human p53 restores DNA synthesis control in fission yeast. Biological Chemistry. 378, (11), 1361-1371 (1997).
  30. Leao, M., et al. Alpha-mangostin and gambogic acid as potential inhibitors of the p53-MDM2 interaction revealed by a yeast approach. Journal of Natural Products. 76, (4), 774-778 (2013).
  31. Hadj Amor, I. Y., et al. Human p53 induces cell death and downregulates thioredoxin expression in Saccharomyces cerevisiae. FEMS Yeast Research. 8, (8), 1254-1262 (2008).
  32. Leao, M., et al. Novel simplified yeast-based assays of regulators of p53-MDMX interaction and p53 transcriptional activity. FEBS J. 280, (24), 6498-6507 (2013).
  33. Di Ventura, B., Funaya, C., Antony, C., Knop, M., Serrano, L. Reconstitution of Mdm2-dependent post-translational modifications of p53 in yeast. PLoS ONE. 3, (1), e1507 (2008).
  34. Leao, M., et al. Discovery of a new small-molecule inhibitor of p53-MDM2 interaction using a yeast-based approach. Biochemichal Pharmacology. 85, (9), 1234-1245 (2013).
  35. Billant, O., Blondel, M., Voisset, C. p53, p63 and p73 in the wonderland of S. cerevisiae. Oncotarget. 8, (34), 57855-57869 (2017).
  36. Cho, Y., Gorina, S., Jeffrey, P. D., Pavletich, N. P. Crystal structure of a p53 tumor suppressor-DNA complex: understanding tumorigenic mutations. Science. 265, (5170), 346-355 (1994).
  37. Muller, P. A., Vousden, K. H., Norman, J. C. p53 and its mutants in tumor cell migration and invasion. Journal of Cellular Biology. 192, (2), 209-218 (2011).
  38. Oren, M., Rotter, V. Mutant p53 gain-of-function in cancer. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 2, (2), a001107 (2010).
  39. Walerych, D., Napoli, M., Collavin, L., Del Sal, G. The rebel angel: mutant p53 as the driving oncogene in breast cancer. Carcinogenesis. 33, (11), 2007-2017 (2012).
  40. Ciribilli, Y., et al. The coordinated p53 and estrogen receptor cis-regulation at an FLT1 promoter SNP is specific to genotoxic stress and estrogenic compound. PLoS ONE. 5, (4), e10236 (2010).
  41. Menendez, D., Inga, A., Resnick, M. A. Potentiating the p53 network. Discovery Medicine. 10, (50), 94-100 (2010).
  42. Monti, P., et al. Characterization of the p53 mutants ability to inhibit p73 beta transactivation using a yeast-based functional assay. Oncogene. 22, (34), 5252-5260 (2003).
  43. Monti, P., et al. Tumour p53 mutations exhibit promoter selective dominance over wild-type p53. Oncogene. 21, (11), 1641-1648 (2002).
  44. Shiraishi, K., et al. Isolation of temperature-sensitive p53 mutations from a comprehensive missense mutation library. Journal of Biological Chemistry. 279, (1), 348-355 (2004).
  45. Soussi, T. TP53 mutations in human cancer: database reassessment and prospects for the next decade. Advances in Cancer Research. 110, 107-139 (2011).
  46. Malkin, D. Li-Fraumeni Syndrome. Genes and Cancer. 2, 474-484 (2001).
  47. el-Deiry, W. S., Kern, S. E., Pietenpol, J. A., Kinzler, K. W., Vogelstein, B. Definition of a consensus binding site for p53. Nature Genetics. 1, (1), 45-49 (1992).
  48. Menendez, D., Inga, A., Resnick, M. A. The expanding universe of p53 targets. Nature Reviews in Cancer. 9, 724-737 (2009).
  49. Ciribilli, Y., et al. Transactivation specificity is conserved among p53 family proteins and depends on a response element sequence code. Nucleic Acids Research. 41, (18), 8637-8653 (2013).
  50. Smeenk, L., et al. Characterization of genome-wide p53-binding sites upon stress response. Nucleic Acids Research. 36, 3639-3654 (2008).
  51. Vyas, P., et al. Diverse p53/DNA binding modes expand the repertoire of p53 response elements. Proceeding of the National Academy of Science USA. 114, (40), 10624-10629 (2017).
  52. Tebaldi, T., et al. Whole-genome cartography of p53 response elements ranked on transactivation potential. BMC Genomics. 16, 464 (2015).
  53. Wang, T., et al. Species-specific endogenous retroviruses shape the transcriptional network of the human tumor suppressor protein p53. Proceedings of the National Academy of Science USA. 104, 18613-18618 (2007).
  54. Bond, G. L., et al. A single nucleotide polymorphism in the MDM2 promoter attenuates the p53 tumor suppressor pathway and accelerates tumor formation in humans. Cell. 119, (5), 591-602 (2004).
  55. Zeron-Medina, J., et al. A polymorphic p53 response element in KIT ligand influences cancer risk and has undergone natural selection. Cell. 155, (2), 410-422 (2013).
  56. Lion, M., et al. Evolution of p53 transactivation specificity through the lens of a yeast-based functional assay. PLoS ONE. 10, (2), e0116177 (2015).
  57. Schumacher, B., et al. C. elegans ced-13 can promote apoptosis and is induced in response to DNA damage. Cell Death and Differentiation. 12, (2), 153-161 (2005).
  58. Jordan, J. J., et al. Low-level p53 expression changes transactivation rules and reveals superactivating sequences. Proceeding of the National Academy of Science USA. 109, (36), 14387-14392 (2012).
  59. Soares, J., et al. Oxazoloisoindolinones with in vitro antitumor activity selectively activate a p53-pathway through potential inhibition of the p53-MDM2 interaction. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 66, 138-147 (2015).
  60. Leao, M., et al. Enhanced cytotoxicity of prenylated chalcone against tumour cells via disruption of the p53-MDM2 interaction. Life Sciences. 142, 60-65 (2015).
  61. Soares, J., et al. A tryptophanol-derived oxazolopiperidone lactam is cytotoxic against tumors via inhibition of p53 interaction with murine double minute proteins. Pharmacol Research. 95-96, 42-52 (2015).
  62. Soares, J., et al. DIMP53-1: a novel small-molecule dual inhibitor of p53-MDM2/X interactions with multifunctional p53-dependent anticancer properties. Molecular Oncology. 11, (6), 612-627 (2017).
  63. Soares, J., et al. Reactivation of wild-type and mutant p53 by tryptophanolderived oxazoloisoindolinone SLMP53-1, a novel anticancer small-molecule. Oncotarget. 7, (4), 4326-4343 (2016).
  64. Sharma, V., Monti, P., Fronza, G., Inga, A. Human transcription factors in yeast: the fruitful examples of P53 and NF-small ka, CyrillicB. FEMS Yeast Research. 16, (7), (2016).
  65. Stepanov, A., Nitiss, K. C., Neale, G., Nitiss, J. L. Enhancing drug accumulation in Saccharomyces cerevisiae by repression of pleiotropic drug resistance genes with chimeric transcription repressors. Molecular Pharmacology. 74, (2), 423-431 (2008).
  66. Sharma, V., et al. Quantitative Analysis of NF-kappaB Transactivation Specificity Using a Yeast-Based Functional Assay. PLoS ONE. 10, (7), e0130170 (2015).
  67. Epinat, J. C., et al. Reconstitution of the NF-kappa B system in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 13, (7), 599-612 (1997).
  68. Inga, A., Reamon-Buettner, S. M., Borlak, J., Resnick, M. A. Functional dissection of sequence-specific NKX2-5 DNA binding domain mutations associated with human heart septation defects using a yeast-based system. Human Molecular Genetics. 14, (14), 1965-1975 (2005).
  69. Reamon-Buettner, S. M., Ciribilli, Y., Inga, A., Borlak, J. A loss-of-function mutation in the binding domain of HAND1 predicts hypoplasia of the human hearts. Human Molecular Genetics. 17, (10), 1397-1405 (2008).
  70. Balmelli-Gallacchi, P., et al. A yeast-based bioassay for the determination of functional and non-functional estrogen receptors. Nucleic Acids Research. 27, (8), 1875-1881 (1999).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics