Author Produced

Jäst som chassi för att utveckla funktionella analyser för att studera humant p53

* These authors contributed equally
Cancer Research

Your institution must subscribe to JoVE's Cancer Research section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Presenteras här är fyra protokoll för att konstruera och exploatera jäst Saccharomyces cerevisiae reporter stammar att studera humant p53 transaktiveringspotential, effekterna av dess olika cancerrelaterade mutationer, Co-uttryckta samverkande proteiner, och effekterna av specifika små molekyler.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Monti, P., Bosco, B., Gomes, S., Saraiva, L., Fronza, G., Inga, A. Yeast As a Chassis for Developing Functional Assays to Study Human P53. J. Vis. Exp. (150), e59071, doi:10.3791/59071 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Konstaterandet att det välkända proteinet hos däggdjur p53 kan fungera som en transkriptionsfaktor (TF) i jästen S. cerevisiae har tillåtit utveckling av olika funktionella analyser för att studera effekterna av 1) bindnings plats [dvs., responselement (re)] sekvenvarianter på p53-transaktiveringselektivitet eller 2) TP53 -mutationer, Co-uttryckta kofaktorer eller små molekyler på p53-transaktiveringsaktivitet. Olika grundläggande och translationella forskningstillämpningar har utvecklats. Experimentellt, dessa metoder utnyttja två stora fördelar med jästen modell. Å ena sidan möjliggör enkel genom redigering snabb konstruktion av kvalitativa eller kvantitativa reporter system genom att utnyttja isogena stammar som endast skiljer sig åt på en specifik p53-RE för att undersöka sekvensspecificitet hos p53-beroende transaktivering. Å andra sidan tillåter tillgängligheten av reglerade system för utomkvedshavandeskap p53-uttryck utvärderingen av transaktivering i ett brett spektrum av proteinuttryck. Granskas i denna rapport är i stor utsträckning används system som bygger på färg reporter gener, luciferase, och tillväxten av jäst för att illustrera deras viktigaste metodologiska steg och att kritiskt bedöma deras prediktiva effekt. Dessutom kan den extrema mångsidigheten hos dessa metoder lätt utnyttjas för att studera olika TFs inklusive p63 och P73, som är andra medlemmar i TP53 Gene familj.

Introduction

Transkription är en mycket komplicerad process som involverar dynamisk, rumslig och tidsmässig organisering av transkriptionsfaktorer (TFs) och kofaktorer för rekrytering och modulering av RNA-polymeraser på kromatinregioner som svar på specifika stimuli1 . De flesta TFs, inklusive den humana p53-tumörsuppressor, känner igen specifika CIS-verkande element i form av DNA-sekvenser som kallas responselement (REs), som består av enstaka (eller flera) unika motiv ~ 6-10 nukleotider långa. Inom dessa motiv kan individuella positioner Visa olika grader av variabilitet2, vanligen sammanfattade efter positions vikts matriser (PWM) eller logotyper3,4.

Jästen S. cerevisiae är ett lämpligt modellsystem för att studera olika aspekter av mänskliga proteiner genom komplessionstester, ektopisk uttryck och funktionella analyser, även när en ortolog jästgen inte är närvarande5, 6 , 7. på grund av det evolutionära bevarandet av basala komponenter i transkriptionella systemet8, många mänskliga TFS (när ectopically uttrycks i jästceller) kan modulera uttrycket av en reporter gen genom att agera genom initiativtagare konstruerade för att innehåller lämpliga förnybara energikällor. Den transkription modellsystem som presenteras här för humant p53 kännetecknas av tre stora variabler vars effekter kan moduleras: 1) den modalitet uttryck och typ av p53, 2) den RE sekvens kontrollera p53-beroende transkription, och 3) vilken typ av reporter-genen (figur 1a).

När det gäller p53-uttryckets modalitet tillåter S. cerevisiae valet av inducerbara, repressibla eller konstitutiva initiativtagare9,10,11. I synnerhet tillåter den inducerbara GAL1 promotorn basal (med raffinos som kolkälla) eller variabel (genom att ändra mängden galaktos i Media) uttryck för en TF i jäst. I själva verket representerar det fint avstämda uttrycket en kritisk utveckling för att studera inte bara p53 självt utan även andra p53-familjproteiner12,13.

När det gäller den typ av förnybara energikällor som styr det p53-beroende uttrycket gör S. cerevisiae det möjligt att bygga olika reporter stammar som har unika skillnader i intresse för en annars ISOGEN bakgrund. Detta mål nås med hjälp av en anpassning av en särskilt mångsidig genom redigering metod som utvecklats i S. cerevisiae, kallad delitto Perfetto12,14,15,16.

Dessutom kan olika rapportörer (dvs. URA3, HIS3 och ADE2) användas för att kvalitativt och kvantitativt utvärdera transkriptionella aktiviteter av humant TFS i S. cerevisiae, var och en med specifika funktioner som kan skräddarsys efter experimentella behov17,18,19,20,21. Uttrycket av dessa rapportgener ger uracil, histidin, och adenin prototrophy, respektive. Den URA3 reporter tillåter inte tillväxten av celler i närvaro av 5-FOA också, och därmed kan det motväljas. Den ADE2 reporter systemet har fördelen att, förutom näringsmässiga urval, det gör det möjligt att identifiera jästceller som uttrycker vildtyp (dvs funktionella på ADE2 uttryck) eller mutant (dvsinte funktionella på ADE2 ) P53 från kolonens färg.

Till exempel, jästceller uttrycker ADE2 genen generera normalt stora vita kolonier på plattor som innehåller begränsande mängder av adenin (2.5-5.0 mg/L), medan de som dåligt eller inte transkribera det visas på samma platta som mindre röd (eller rosa) Kolonier. Detta beror på ackumulering av en intermediär i adenin biosyntetiska väg (dvs, P-ribosylamino-Imidazol, som tidigare har kallats amino-Imidazol ribotid eller luft), som omvandlas till ett rött pigment. Den kvalitativa färgbaserade ADE2 reporter genen har sedan ersatts med den kvantitativa Firefly Photinus mottfjärilar (LUC1)12,22. På senare tid har ADE2 reporter kombinerats med lacz reporter i en lätt-till-poäng, semi-kvantitativ, dubbel reporter test som kan utnyttjas för att underklassificera p53 mutanter enligt deras kvarvarande nivå av funktionalitet 23.

Fluorescerande reportrar som egfp (Enhanced Green fluorescerande protein) eller dsred (discosoma SP. Red fluorescerande protein) har också använts för kvantitativ utvärdering av transaktiveringsaktivitet förknippad med alla möjliga genom-mutationer i TP53 kodning sekvens24. Slutligen har möjligheten att kombinera avstämbara promotorer för p53-allel-uttryck med isogena jäststammar som skiljer sig för re-och/eller reporter-genen lett till utvecklingen av en datamatris som genererar en förfinad klassificering av cancerrelaterad och köns Cells muterade p53-alleler25,26,27.

De metoder som beskrivs ovan används för att mäta den transkriptionella aktiviteten hos proteinet p53. Emellertid kan uttrycket av vildtyp p53 i jästen S. cerevisiae28 och Schizosaccharomyces pombe29 orsaka tillväxthämning, som har förknippats med cellcykelarrest28,30 eller celldöd31. I båda fallen utlöses jästtillväxthämning av högt p53-uttryck och har korrelerats med potentiell transkriptionell modulering av endogena jästgener involverade i celltillväxt. Genom att stödja denna hypotes har förlusten av funktion Mutant p53 R273H inte interfererat med jästcellernas tillväxt när den uttrycks på liknande nivåer som vildtyp p5332. Omvänt orsakade uttrycket i jäst av det giftiga muterade p53 V122A (känt för högre transkriptionell aktivitet jämfört med vildtyp p53) en starkare tillväxthämmande effekt än av vildtyp p5332.

Dessutom visades att Human MDM2 kunde hämma den humana p53-transkriptionella aktiviteten i jäst, främja dess ubiquitination och efterföljande nedbrytning33. Följaktligen visades förmågan hos Human MDM2 och mdmx att hämma p53-inducerad jäst tillväxthämning32,34. I en ytterligare studie fastställdes ett samband mellan p53-transskriptionell aktivitet och aktin-uttrycksnivåer, med identifieringen av ett förmodat p53-medel uppströms på ÄRV1 -genen i jäst32. Konsekvent, aktin uttryck förstärktes av vildtyp p53 och ännu mer av p53 V122A, men inte av muterat p53 R273H. Omvänt minskade aktin-uttrycket av p53 i samtidig förekomst av p53-hämmare MDM2, mdmx eller pifithrin-α (en liten molekyl hämmare av p53-transkriptionell aktivitet), som överensstämde med resultat baserade på jästtillväxtanalysen. Viktigt, dessa resultat fastställde ett samband mellan p53-inducerad tillväxthämning och graden av dess aktivitet i jäst, som också har utnyttjats för att identifiera och studera små molekyler som modulerar p53-funktioner28,34 , 35.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. uppförande av ADE2 eller LUC1 reporter jäststammar som innehåller en specifik re (yafm-re eller ylfm-re)

  1. Strimma en yafm-iCore eller ylfm-iCore stam12,14 (iCore = I, ISCE-I endonuclease under GAL1 promotor; CO = räknare valbar URA3; RE = reporter KanMX4 Förlänande kanamycin motstånd; Tabell 1) från en 15% glycerolstock lagrad vid-80 ° c på en YPDA-agar-platta (tabell 2). Låt det växa för 2-3 dagar vid 30 ° c.
  2. Ta en jäst koloni från den färska plattan (inte mer än 3 veckor gammal) och placera den i en liten kolv som innehåller 5 mL YPDA (tabell 2). Inkubera vid 30 ° c över natten, skaka vid 150-200 rpm.
  3. Nästa dag, att ta bort alla spår av dextros, pellet cellerna för 2 min vid 3 000 x g och Kassera supernatanten genom inversion av röret.
    Anmärkning: utför alla centrifugationer i detta protokoll vid rumstemperatur (RT).
  4. Omsuspendera cellpelleten i 30-50 mL förvärmda CM (komplett Media) innehållande galaktos (tabell 2) och inkubera i 4 h vid 30 ° c, skaka vid 150-200 rpm (nödvändigt för induktion av i-SCEI).
  5. Centrifugera cellerna i 2 min vid 3 000 x g och Kassera supernatanten genom inversion av röret.
  6. Omsuspendera cellpelleten i 30-50 mL sterilt vatten. Upprepa steg 1,5.
  7. Omsuspendera cellpelleten i 10 mL sterilt vatten. Upprepa steg 1,5.
  8. Omsuspendera cellpelleten i 5 mL steril LiAcTE (tabell 3), en jonisk lösning som gynnar DNA-upptag. Upprepa steg 1,5.
  9. Omsuspendera cellpelleten i 250 μL steril LiAcTE och överför cellerna till ett 1,5 mL-rör. Upprepa steg 1,5 och Omsuspendera cellpelleten i 300-500 μL steril LiAcTE.
  10. Under tvättningar, denaturera en 10 mg/mL lösning av lax sperma DNA bärare för 10 min vid 100 ° c och kyla omedelbart på is för att bibehålla det som enkelsträngad DNA.
  11. I ett separat 1,5 mL-rör, tillsätt 500 picomoler av den önskade oligonukleotiden (tabell 3), 5 μl av den kokt lax sperma bärare DNA, 300 μl av steril LiAcTE PEG (tabell 3), och 50 μl av jästcell suspensionen (från steg 1,9).
  12. Vortex rören i 10 s för att blanda och inkubera i 30 min vid 30 ° c, skaka vid 150-200 rpm. Placera 1,5 mL-rören på sidan för att gynna skakningar.
  13. Värme chock jästceller för 15 min vid 42 ° c i en värmeblock, sedan Centrifugera cellerna för 20 s vid 10 000 x g. Avlägsna supernatanten och Omsuspendera cellerna i 1 mL sterilt vatten.
  14. Fördela 100 μL av cellsuspensionen på YPDA-agar-plattan och inkubera (upp och ned) i 1 dag vid 30 ° c. För att säkerställa att väl separerade kolonier erhålls, också sprida 100 μL av en 1:10 utspädning.
  15. Nästa dag, replik plattan med sterila sammet på cm agar plattan som innehåller dextros och 5-FOA (tabell 2). Överväg en andra replik plattan på en ny tallrik om många celler överförs (dvs, viss tillväxt av URA3 celler).
  16. Tre dagar senare, replika plattan på icke-selektiva YPDA och YPDA som innehåller G418 (ett aminoglykosid antibiotikum liknar kanamycin) agar plattor (tabell 2), märkning varje platta för att underlätta deras efterföljande jämförelse. Inkubera plattorna över natten vid 30 ° c.
  17. Nästa dag, identifiera kandidat reporter stammar från kolonier som är G418-känsliga men växer på YPDA plattor (t. ex., yLFM-eller yAFM-RE kolonier). Strimma de identifierade kolonierna (3-6 kolonier) på en ny YPDA-platta för att få enstaka koloniisolat och låt dem växa i 2 dagar vid 30 ° c.
  18. Patch enstaka jästkolonier på en YPDA-platta för att isolera kolonierna för ytterligare analyser. Efter 24 h vid 30 ° c, testa dem genom replika plätering på en YPGA agar plattan (tabell 2) som förhindrar tillväxt av Petite mutanter (dvs., respiratoriska-brist mutanter). På samma gång, replika plattan på en ny YPDA agar plattan.
  19. Testa rätt patchar (dvs. tillväxt på YPDA-och YPGA-agar-plattor; 1-3 kolonier) från steg 1,18 för förekomst av korrekt oligonukleotidintegration av kolonin PCR. Montera en reaktionsblandning genom att tillsätta 5 μL 10X PCR-buffert (1,5 mM MgCl2), 2 μl 10 picomoles/μl primers (tabell 3), 4 μl 2,5 mm dntps, 0,25 μl av 5 U/μl Taq polymeras och vatten till en slutlig volym på 50 μl. Multiplicera reaktions mixen för det antal jästkolonier som behöver screenas och alikvot 50 μL i varje PCR-rör. Tillsätt en liten mängd jästceller från YPDA-agarplattan till en enda PCR-reaktionsblandning med hjälp av en pipett.
  20. Utför PCR-reaktionen med följande program: 94 ° c i 8 min följt av 35 cykler av denaturering i 1 min vid 94 ° c, primers glödgning i 1 min vid 55 ° c och förlängning i 2 min vid 72 ° c.
  21. När reaktionen är avslutad, ladda en alikvot av PCR-reaktionen (ungefär en tiondel av volymen) på en aguppstod gel för att kontrollera rätt storlek (~ 500 BP).
  22. Sekvensera PCR-produkten efter rening med en kommersiell sats för att bekräfta integrationen av önskad RE-sekvens med samma primers i steg 1,19.
  23. Efter valideringen av rätt sekvens, gör en 15% glycerol lager av yAFM-RE eller yLFM-RE stamkultur (i YPDA) och förvara den vid-80 ° c.

2. utvärdering av p53 proteintransaktiveringsförmåga med hjälp av den kvalitativa färgbaserade ADE2 jästanalysen

  1. Upprepa steg 1,1 och 1,2 med yAFM-RE-stammen (tabell 1).
  2. Dagen efter, späd cellkulturen (1:10) i 30-50 mL förvärmda YPDA och fortsätt att Inkubera vid 30 ° c genom att skaka tills OD600Nm når 0,8-1,0 (~ 2 h).
  3. Upprepa steg 1.5-1.10.
  4. I ett separat 1,5 mL-rör, tillsätt 300-500 ng jäst p53 (eller kontroll) Expression Vector (tabell 4), 5 μl av kokt lax sperma DNA bärare, 300 μl av steril LiAcTE PEG, och 50 μl av jästcell suspension.
  5. Upprepa steg 1,12 och 1,13 men Omsuspendera cellpelleten i 300 μL sterilt vatten.
  6. Sprid 100 μL av cellsuspensionen på syntetiska selektiva (för p53-uttryck eller kontroll vektor) plattor som innehåller dextros som kolkälla och hög mängd adenin (tabell 2), och inkubera sedan (upp och ned) vid 30 ° c i 2-3 dagar.
  7. Streak Single jäst transformant kolonier (2-6 ränder per tallrik) på en ny selektiv plåt och låt dem växa över natten vid 30 ° c.
  8. Dagen efter, med hjälp av sterila sammet replika plattan på nya selektiva plattor som gör det möjligt för bedömning av färg fenotyp (dvs., plattor som innehåller dextros som kol källa men begränsa mängden av adenin; Tabell 2). Inkubera plattorna upp och ner vid 30 ° c i 3 dagar. Alternativt, för att utvärdera p53-proteiners temperatur känslighet, inkubera vid tre olika temperaturer under 3 dagar: 24 ° c, 30 ° c och 37 ° c.
    ANMÄRKNINGAR: samma streck kan vara replikpläterade flera gånger.
  9. För att utvärdera p53-proteintransaktiveringsförmågan, kontrollera den färgbaserade fenotypen hos jästkolonierna och jämför p53-proteinfenotypen med avseende på p53 Wild-Type och tomma vektorfenotyper.

3. utvärdering av p53 proteintransaktiveringsförmåga med hjälp av den kvantitativa Luminescens baserad LUC1 jästanalys

  1. Omvandla jästceller med p53 (eller kontroll) uttrycks vektorer (tabell 4) med hjälp av den liac-baserade metoden som beskrivs i protokoll 2. Använd yLFM-RE-stam (tabell 1).
  2. Patch enda transformanter på en ny selektiv tallrik med den höga mängden av adenin som innehåller glukos som kol källa och låt dem växa vid 30 ° c över natten. För varje typ av omvandling, gör 5-7 olika korrigeringsfiler.
  3. Efter tillväxt i natten, Omsuspendera en liten mängd jästceller med hjälp av en steril tandpetare eller pipettspetsen från plattan i syntetiskt selektivt medium som innehåller dextros eller raffinos som kol källa (200 μl slutlig volym i en genomskinlig 96 bra platta, med en rund eller platt botten). Om experimentet kräver inducerbart p53-uttryck, tillsätt galaktos till raffinos-mediet för att modulera induktions nivån (tabell 2).
    Anmärkning: dessa cellsuspensioner bör ha en OD600Nm på ca 0,4 och inte högre än 1.
  4. Mät absorbansen för varje brunn vid OD600Nm efter inducerbart p53-uttryck (4-8 h vid 30 ° c med 150-200 rpm skakning) med en fleretikettplattläsare. Se till att cell suspensionerna är homogena genom att blanda varje brunn med en multikanalpipett.
  5. Överför 10-20 μL cellsuspension från den genomskinliga 96-brunnen plattan till en vit 384 (eller 96) bra tallrik och blanda med en lika volym (10-20 μL) av lyseringsbufferten. Inkubera i 10-15 min vid RT på en shaker (150-200 rpm) för att uppnå permeabilisering av cellen till luciferas-substratet.
  6. Tillsätt 10-20 μl av Firefly luciferas-substrat och mät ljus enheterna (Lu) med en fleretikettplattläsare.
  7. För bestämning av p53-proteintransaktiveringsförmåga, normalisera LUs för varje brunn till motsvarande OD600Nm (relativ ljus enhet, RLU). Beräkna genomsnittliga RLU och standardavvikelse från 3-4 fläckar av jästtransformerande kolonier.
  8. Jämför p53-proteintransaktiveringsdata med avseende på p53-vildtyp och tom vektor, antingen genom att subtrahera de värden som erhålls med den tomma vektorn eller genom att dividera med de värden som erhålls med den tomma vektorn (dvs. dator veck i induktion).
    Anm.: aktiviteten av p53-transaktivering kan också utvärderas med hjälp av samma experimentella uppsättning i närvaro av p53-interagerande proteiner (dvs. MDM2 och MDMX) och/eller inklusive läkemedelsbehandling.

4. utvärdering av p53-proteintillväxthämning med hjälp av jästfenotypic-analysen

  1. Omvandla jästceller med p53/MDM2/MDMX (eller kontroll) uttryck vektorer (tabell 4) med hjälp av den liac-baserade metoden som beskrivs i avsnitt 2. Använd CG379 stammen (tabell 1) och sprid jästtransformanter på minimala selektiva plattor (tabell 2).
  2. Odla omvandlade celler i minimalt selektivt medium (tabell 2) till cirka 1 OD600Nm.
  3. Späd jästceller till 0,05 OD600Nm i det selektiva induktions mediet (tabell 2), och eventuellt, tillsätt en utvald liten molekyl till lämplig koncentration (eller endast spädningsvätska) för att testa dess effekt vid reaktivera muterat p53 eller genom att hämma MDM2- /MDMX-P53 interaktioner.
  4. Inkubera celler vid 30 ° c under kontinuerlig orbitalskakning (200 rpm) för cirka 42 h (tid som krävs av negativ kontrolljäst för att nå mitten av log fasen, ca 0,45 OD600Nm).
  5. Spot 100 μL alikvoter av jästcellkulturer på minimala selektiva plattor (tabell 2).
  6. Inkubera i 2 dagar vid 30 ° c.
  7. Mäta jäst tillväxt genom att räkna antalet kolonier som erhållits i 100 μL kultur droppar (kolonin bildar enhet, CFU räknas). Till exempel, beräkna muterade reaktiveringseffekten av föreningar med tanke på tillväxten av vildtyp p53 uttrycker jäst som maximal möjlig effekt (inställd på 100%), medan tillväxten av celler som uttrycker muterat p53 (men utsätts för lösningsmedels kontroll) representerar nollnivån för återaktivering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Byggandet av ADE2 or LUC1 reporter jäststammar

Dendelitto perfettoapproach12,14,15,16 har anpassats för att möjliggöra byggandet av p53 reporter jäststammar (figur 1b). Metoden sysselsätter en-eller dubbelsträngad oligonukleotides innehållande, i båda ändar, minst 30 nukleotider homolog till den valda Locus av integration. Specifikt, homologi motsvarar sekvenser flörta platsen för integration av dubbel markör kassett ICORE, som innehåller KlURA3 och kanMX4 (reporter gen som ger resistens mot geneticin, G418) tidigare placerad vid den önskade målplatsen15,16. Denna kassett innehåller också jäst i-SCEI Endonuklease kodning sekvens, under inducerbara GAL1 promotor och dess besläktat målwebbplats. Därför, en switch i galaktose-innehållande medium rätt innan omvandlingen av jästceller med önskad sekvens resulterar i i-SceI uttryck och därav generationen av en enda dubbel-strand Break (DSB) på platsen för ICORE integration. Närvaron av en DSB stimulerar mycket frekvensen av riktade händelser, med mer än 1 000 ersättare erhålls med en enda omvandling.

I slutet av målgrupps-och urvalsprocessen baserat på förvärvad resistens mot 5-FOA och känslighet för G418 bekräftas kandidat klonerna av kolonin PCR-baserad amplifiering av den modifierade Locus-och Sangersekvenseringen för att kontrollera att den korrekta integrationen av önskade p53 RE (figur 1c). I slutet av stammen konstruktions protokoll, som kan slutföras i ungefär en vecka, en panel av isogena reporter jäststammar erhålls som kan användas för att utvärdera hur skillnader i sekvensen av REs påverka transaktivering kapacitet av p53 Protein.

Funktionellt heterogena Mutant P53s

I mänskliga tumörer, den TP53 genen påverkas främst av enstaka genom mutationer som i allmänhet innebär sex stora hotspot rester (R175, G245, R248, R249, R273, och R282) ligger i den centrala DNA-bindande domän (DBD) av p53-proteinet. Däremot har mer än 2 000 enstaka p53-aminosyrasubstitutioner noterats, inklusive några som sällan observeras27. Mutant P53s kan klassificeras som DNA-kontakt eller strukturella mutanter, beroende på effekterna av aminosyran substitution på DNA-proteinkontakt (t. ex. R273H) eller proteinstruktur (t. ex. R175H)36. Single TP53 genom mutationer påverkar p53-funktioner, vilket genererar ett brett spektrum av funktionell mångfald, vilket kan påverka viktiga kliniska egenskaper såsom tumör aggressivitet, kemo-resistens, och metastaserande potential37, 38 , 39.

Konceptet att mutanter p53 är funktionellt heterogena har uppenbarligen vuxit fram under de senaste 15 åren genom en stor mängd experimentella data tillgängliga i TP53 Mutations databaser (t. ex. < p53. free. fr//>)27. Olika funktionella analyser baserade på jäst och/eller reporter system för däggdjur har utvecklats och belyser de olika egenskaperna hos mutanter P53s (dvs. transaktivering, temperatur känslighet, dominant-negativ potential, interferens med medlemmar i familjen p53 och interaktioner med andra TFS)13,24,40,41,42,43,44. Den mest omfattande funktionella Studien undersökte mer än 2 300 mutanter i en jästbaserad analys genom att karakterisera deras transaktiveringsaktivitet mot åtta olika p53 REs24.

Uppgifterna bekräftade att nästan alla muterade P53s med hotspot-rester är förlust av funktion (dvs., de helt förlorade transactivation aktivitet). Omvänt, Mutant P53s som slog andra positioner av proteinet p53 och återfinns i allmänhet vid måttlig till låg frekvens i cancer45 är partiella Mutants, som behåller en viss nivå av transaktiveringsaktivitet på p53 res13, 17. ett exempel på användning av ADE2 -analysen för att studera de beskrivna p53-proteinernas funktionella heterogenitet presenteras i figur 2A. I själva verket, medan R175H är en förlust av funktion Mutant producerar röda kolonier i alla testade tillstånd, visade R282W temperatur känslighet som var tydligare med hjälp av galaktos-beroende p53 uttryck (dvs den röda sektorn vid 37 ° c i P21-5 ' RE stam i platta som innehåller lägre galaktos, som blir rosa i den högre galaktose plattan). Figur 2b visar en sammanfattning av resultaten för en utökad panel av p53 mutanter och reporter stammar.

Förekomsten av denna p53 funktionella heterogenitet föranledde utforskning av huruvida sådana heterogenitet parallellt den heterogenitet observerats på den kliniska nivån hos patienter med TP53 köns cells mutationer. TP53 köns cells mutationer ligger bakom den molekylära grunden för en grupp av cancer predisposition störningar, inklusive de mer allvarliga Li-fraumeni (LFS) och Li-fraumeni-liknande (LFL) syndrom, och mindre allvarliga icke-syndromic anlag med (FH) eller utan (ingen FH) släkthistoria46.

I protokollet belystes genotyp-fenotyp korrelationer genom att matcha jästanalysbaserade transaktiveringförmågor hos alla TP53 köns cells Mutant-alleler med motsvarande kliniska data från IARC-databasen < http://www-p53.IARC.fr/germline.html >. Förlust av funktion p53 mutanter har hittats i mer allvarliga cancer benägenheter syndrom, medan partiell funktion p53 mutanter har hittats i mindre allvarliga cancer benägenheter villkor. Detta indikerar att den kvarvarande transaktiveringsförmågan hos p53 påverkar den kliniska fenotypen hos patienter som ärvde TP53 mutationer och utvecklade cancer25,26.

Nukleotidsekvenser variationer inom res styr p53 potential för transaktivering

Humant p53 är en tetrameriska (dimer av dimers) TF. Varje p53-dimer känner igen en RE bestående av 10 nukleotider (RRRCWWGYYY, R = A eller G; W = A eller T; Y = C eller T)47,48. Två sådana halv-platser kan vara antingen intill eller fördelade isär med upp till 13-20 nukleotider, som utgör en funktionell p53 RE. Trots detta kännetecknas p53 res med en spacer av lägre p53-affinitet och transaktivering än p53 res utan en spacer49,50, i olika funktionella analyser från olika system.

Det har nyligen visats att halva platser kan rekrytera p53-tetramer som binds till hemispecifikt51, tillsammans med funktionella analyser och kromatin immunoprecipitation studier, tyder dessa fynd på att p53 också kan agera på icke-Canonical res, omfattar halva platser och trekvarters anläggningar48,52. Dessutom är det faktum att det fullständiga samförståndet p53-motiv är mycket urarta (RRRCWWGYYY)2 prefigures möjligheten att enskilda förnybara energikällor väsentligen kan skilja sig i sekvens och bindningstillhörighet. Med tanke på att hundratals p53-målgener har identifierats i det humana genomet41,48, uppvisade nästan alla p53-res en icke-identisk sekvens mellan varandra. Dessutom har det varit en hypotes om att REs med en distinkt DNA-bindningstillhörighet väljs i initiativtagarna till de p53-målgener som deltar i cellcykelarrest eller apoptos53.

Analysen i jäst av många varianter av p53 RE vid en konstant genomisk plats etablerade effekten av nukleotid varianter, spacer och organisation av RE halv-platser på transactivation kapacitet49. Det ledde till och med upptäckten av polymorfa p53 res med de två alleler markant skiljer sig i lyhördhet en associerad promotor till p5314,54,55. Nyligen har information som härrör från p53-sekvens-funktioner och jästbaserad transaktiveringspotential kodats i p53 Retriever, en algoritm för mönstersökning som kan lokalisera och rangordna både kanoniska och icke-kanoniska REs, enligt deras förväntade transaktiveringspotentialer i hela människans arvsmassa52.

Som ett exempel på att använda analysen för att studera sekvensspecifik potential för transaktivering av p53, är en jämförelse mellan humant vildtyp p53 och det evolutionära proteinet p53 från Caenorhabditis elegans (figur 3). Dessa resultat är en uppföljning av en nyligen studie där den evolutionära divergensen av transaktiveringsspecificitet bland p53-proteiner utforskades56. Isogena yLFM-RE reporter stammar utvecklades enligt beskrivningen i protokollet. Specifikt, den CEP-1 p53 RE härrör från ced13 genen57, och fyra varianter (v1-v4) jämfördes (figur 3a). Den RE varianter var konstruerade för att undersöka effekterna av varierande längden på distansen som separerar de två decameric motiv (som i ced13, är av 28 nukleotider) och att undersöka förändringar i nukleotider flankera CWWG kärna motiv (som i ced13, är A/T rik; även i den högsta affiniteten mänskliga p53 REs, är G/C Rich)58. Resultaten visar tydligt hur Cep1 och humant p53 avviker i termer av transaktiveringsspecificitet. Faktum är att medan humant p53-medierad transaktivering hämmas starkt av närvaron av en spacer (figur 3b), är CEP-1 aktivitet hämmad genom avlägsnande av distansen (figur 3c). Vidare, CEP-1-medierad transaktivering avskaffas när RE ändras från A/T-till G/C-Rich. Varken humant p53 eller CEP-1 kan transaktivera från en enda decamer härledd från ced13 re.

Söka efter småmolekylära disruptorer av p53-MDM2/MDMX-interaktioner och reaktivatorer av muterat p53-aktivitet

Det etablerade sambandet mellan den tillväxthämmande effekten av humant p53 och graden av dess aktivitet i jäst ledde till ett förenklat screeningtest baserat på mätningar av jästcellernas tillväxt för att analysera effekterna av störande faktorer på p53-aktivitet (figur 4 ). Effektiviteten av jästen fenotypic analysen till skärm för potentiella cytostatika har visats i flera verk. Använda jästceller Co-uttrycker p53 och dess hämmare MDM2 och/eller MDMX, nya disruptorer av dessa interaktioner identifierades genom deras förmåga att hämma den negativa effekten av MDMs på p53, och därmed återupprätta vildtyp p53-inducerad jäst tillväxthämning ( Figur 4a). I synnerhet ledde denna analys till upptäckten av 1) pyranoxanthone 1 som den första p53-MDM2-interaktionshämmaren med en xanthone byggnadsställning34 och 2) oxazoloisoindolinon-hämmare av p53-MDM2-interaktionen59. Dessutom, med denna analys, beskrevs α-mangostin och gambogic Acid för första gången som potentiella hämmare av p53-MDM2-interaktionen30.

Senare visade samma analys att prenylering av chalkoner förbättrade sin förmåga att störa den p53-MDM2 interaktionen60. Intressant, denna jäst analysen ledde också till upptäckten av två hämmare av p53-MDM2/mdmx interaktioner: tryptophanol-derived oxazolopiperidon laktam oxaz-161 och tryptophanol-derived oxazoloisoindolinone DIMP53-162.

Den minskade effekten av förlust av funktion Mutant p53 på jästcellstillväxt har också undersökts för att avskärma för muterade p53-reaktiverande läkemedel, som kännetecknas av förmågan att återställa vildtyp-liknande tillväxthämmande aktivitet till muterat p53 (figur 4b). Med denna jästanalys identifierades en reaktivator av muterat p53 R280K, den enantiopure tryptophanol-härledda oxazoloisoindolinon SLMP53-163. Figur 4c,D visar representativa resultat erhållna i jäst med uttrycket av p53 eller behandlingar med hämmare av p53-MDM2-interaktionsnutlin-3A eller med reaktivare av p53 Mutant Y220C PhiKan083.

Validering av den molekylära verkningsmekanismen för dessa föreningar som p53-aktiverande medel samt deras antitumöraktivitet, både i humana tumör cellinjer34,60,61,62,63 och djurmodeller62,63, vittnar om den stora potentialen av jästen fenotypisk analys i Drug discovery.

Figure 1
Figur 1 : Dragen av jäst baserat p53 transactivation analyser och arbetsflöde för byggande av p53 reporter jäststammar. (A) enkelheten i genommanipulering och kontrollerat ektopiskt genuttryck gör jästen besläktad med ett "in vivo-provrör", där flera variabler som är relevanta för att undersöka funktioner för p53-transaktivering noggrant undersöks. Dessa variabler omfattar uttrycks nivåer för ett vildtyp-eller muterat p53-protein, sekvensen av den nya och typen av reporter gen [kvalitativ/semikvantitativ (t. ex. ADE2 och lacz) eller kvantitativ (t. ex. LUC1)]. Samförståndet RE sekvens är mycket degenererade (RE = RRRCWWGYYY-n-RRRCWWGYYY; R = purin; W = A/T; Y = pyrimidin; CWWG = KÄRNSEKVENS, n = 0-13 bps spacer). Antalet missmatchningar med avseende på konsensus, KÄRNSEKVENSEN och antal bas par distanser kommer att påverka transaktiveringsaktiviteten. Den här panelen har ändrats från en tidigare publikation64. (B) system av delitto Perfetto tillvägagångssätt för att införa en önskad p53 re uppströms den minimal promotorn som driver ADE2 eller LUC1 reporter genuttryck. Protokollet anpassades från tidigare publikationer12,15,16. C exempel på resultaten av JÄSTKOLONIN PCR-förstärkning av den region som omger OLIGO re-integrationsstället. Bilden av elektrofores presenterar amplifiering resultatet av två förmodade positiva kolonier (URA3 minus och G418 känsliga) med motsvarande PCR negativ kontroll bredvid 1 KB DNA Ladder (promega). Den ~ 500 NT band förväntas använda primers beskrivs i tabell 3 kan sekvenseras för att bekräfta korrekt promotor redigering, som visas i electropherogram. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2 : P53-proteiner uppvisar omspecifika och temperaturkänsliga transaktiveringspotential. Wild-Type p53 och de indikerade TP53 genom-mutationerna testades med den kvalitativa färgbaserade reportern-analysen i jäst och utnyttjar reporter stammar som hyser olika p53-Orer som kontrollerar ADE2 genuttrycket. (A) ett exempel på kolonins färgfenotyp för p53-typ, R175H och R282W med Puma (BBC3) och P21-5 ' res vid 30 ° c och 37 ° c visas. Måttlig (0,008% galaktos) och högt (0,12% galaktos) p53-uttryck jämförs. (B) resultat erhållna med en utökad uppsättning av p53 mutanter och jäst reporter stammar som undersökts för den p53-beroende kolonin färgfenotyp vid tre temperaturer (24 ° c, 30 ° c och 37 ° c). Resultaten exemplifiera funktionell heterogenitet av muterade p53-alleler och sammanfattas i ett tabellformat. Till exempel, R175H är en förlust-av-funktion Mutant, medan G199H är vildtyp p53-liknande. K139E och R282W behåller partiell funktion och uppvisar köld känslighet respektive värmekänslighet. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3 : Humant p53 och krediterad ortholog CEP-1 uppvisar mycket divergerade transaktiveringsspecificitet. (A) sekvenser av: humant p53 re konsensus sekvens, CEP-1 p53 re härrör från ced13 genen, och fyra varianter (v1-v4) som testades i funktionella analyser. (B) transaktivering mättes efter inducerande humant p53-uttryck för 8 h med hjälp av tre olika kolkällor för att uppnå lågt, måttligt och högt uttryck (0,008%, 0,032%, 0,12% galaktos tillsatt till selektivt medium innehållande 2% raffinose). Resultaten uttrycks som genomsnittliga relativa ljusenheter (RLU) och standardfel på fyra replikat. Reporter aktivitet för cell omvandlas med Tom Expression Vector var subtrauteras. C transaktiveringsspecificitet hos Cep1 mätt i B. För båda proteinerna var transaktiveringsnivåer proportionella mot mängden galaktos. De högre ljusenheter som mäts när humant p53 uttrycks kan vara beroende av olika nivåer av protein mängder som produceras, på grund av skillnaden i protein längd och potentiellt också i kodon användning. De två proteinerna kännetecknas av olika transaktiveringsspecificitet mot de olika REs-testade och denna egenskap påverkas inte av möjliga skillnader i relativ proteinmängd. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4 : Små molekyl aktivatorer av p53 som identifierats med hjälp av jästfenotypic-analysen. (A) jästceller som uttrycker samtidig användning av humant vildtyp p53 och MDM2 eller mdmx har använts för att söka efter hämmare av interaktionerna p53-MDM2 och p53-mdmx. I detta system, interaktions hämmare återställa p53-inducerad jäst tillväxthämning i jästceller Co-uttrycker p53 och MDM2 eller MDMX. Detta tillvägagångssätt har möjliggjort identifiering av hämmare av p53-MDM2 interaktion och identifiering av dubbla hämmare av p53-MDM2 och p53-MDMX interaktioner. B) jästceller som uttrycker humant muterat p53 har använts för att söka efter muterade p53-reaktivatorer och kan återställa den vildtyps-liknande p53-inducerad jästtillväxthämning i muterade p53-uttrycker jästceller. C) representativa bilder av plattan spot-analysen som visar effekterna av vildtyp p53 eller mutant Y220C på jästkolonins tillväxt jämfört med den tomma vektorn (se steg 4,5). D kvantitativa resultat av tillväxt analysen: 10 ΜM nutlin-3a återställer p53-inducerad jäst tillväxthämning i celler Co-uttrycker MDM2; 50 μM PhiKan083 återställer vildtyp-liknande p53-inducerad jäst tillväxthämning till muterat p53 Y220C. Båda effekterna är ritade i förhållande till jästen tillväxt hämmande effekt av vildtyp p53, som var inställd som en. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Stam namn och genotyp Specifik användning Protokollnummer
Yafm-ICORE: MATa leu2-3112 trp1-1 his3-11, 15 CAN1-100; ura3-1; ICORE::p Cyc1:: ADE2 Det används för konstruktionen av Yafm-re stam (MATa leu2-3112 trp1-1 his3-11, 15 CAN1-100; ura3-1; ICORE::p Cyc1:: ADE2) som utnyttjas i den kvalitativa, FÄRGBASERADE ADE2-analysen. Protokoll 1, 2
Ylfm-ICORE: MATa leu2-3112 trp1-1 his3-11, 15 CAN1-100; ura3-1; ICORE::p Cyc1:: LUC1 Det används för konstruktionen av Ylfm-re stam (MATa leu2-3112 trp1-1 his3-11, 15 CAN1-100; ura3-1; RE::p Cyc1:: LUC1) som utnyttjas i den kvantitativa luminescence-baserade LUC1-analysen. Protokoll 1, 3
CG379: MATa, ade5 his7-2 leu2-112 trp1-289aura3-52 [kil-O] Det används för fenotypisk Tillväxtanalys. Protokoll 4

Tabell 1: Jäststammar.

Mediernas namn och recept Specifik användning Protokollnummer
Ypda (2% jästextrakt, 2% pepton, 2% dextros, 200 mg/L adenin) + 2% agar YPDA utan agar steriliseras företrädesvis genom filtrering. YPDA + agar steriliseras genom autoklavering; Det är möjligt att utelämna dextros från receptet och tillsätt dextros från en 20% filter steriliserad lösning i vatten innan du häller plattorna. Protokoll 1-4
Cm [0,17% jäst kväve bas utan AA och ammoniumsulfat, 0,5% ammoniumsulfat, 5% (volym/volym, v/v) icke-essentiell aminosyra lösning, 20 mg/l histidin, 20 mg/l tryptofan, 20 mg/l uracil, 30 mg/l lysin, 100 mg/l leucin, 200 mg/l adenin] + 2% galaktos Mediet är steriliserat genom filtrering. Följande sterila lagerlösningar bereds i vatten (med undantag för uracil, som löses i 0,1 M NaOH) genom filtrering: icke-essentiell aminosyra lösning (0,04% arginin, 0,04% metionin, 0,06% isoleucin, 0,1% fenylalanin, 0,2% glutaminsyra syra, 0,2% asparaginsyra, 0,3% valitin, 0,4% Threonine, 0,8% Serine), 1% histidin, 1% tryptofan, 1% uracil, 1% lysin, 1% leucin, 0,5% adenin, 20% galaktos. Adenin stamlösning får inte förvaras i kylskåp på grund av bildandet och sedimentering av kristaller. Tryptofan stamlösning måste förvaras i mörker. Protokoll 1
Cm (se ovan) + 2% dextros + 1G/L 5-FOA + 2% agar Mediet (innehållande jäst kväve bas utan AA och ammoniumsulfat, ammoniumsulfat och agar) steriliseras genom autoklav. De andra komponenterna tillsätts efter autoklavering för att bevara värme-labila ingredienser; 5-FOA pulvret kan tillsättas direkt i mediet när det har svalnat till ca 55 ° c. Protokoll 1
Ypda + 400 μg/ml G418 + 2% agar G418 måste läggas till efter autoklavering när mediet har svalnat till ca 55 ° c. Om start från pulver, en 50 mg/mL G418 stamlösning kan förberedas i vatten och steriliseras genom filtrering. Protokoll 1
YPGA [2% jästextrakt, 2% pepton, 2% glycerol (v/v), 200 mg/L adenin] + 2% agar Mediet är steriliserat genom autoklav. Protokoll 1
Syntetisk selektiv plåt: [0,17% jäst kväve bas utan AA och ammoniumsulfat, 0,5% ammoniumsulfat, 5% (v/v) icke-essentiell aminosyra lösning (0,04% arginin, 0,04% metionin, 0,06% isoleucin, 0,1% fenylalanin, 0,2% glutaminsyra, 0,2% asparaginsyra, 0,3% valin, 0,4% Threonine, 0,8% serin), 20 mg/L histidin, 20 mg/L uracile, 20 mg/L tryptofan (beroende på markör för val av vektor), 30 mg/L lysin, 100 mg/mL leucin (beroende på valet av vektor markering), 5 mg/l eller 200 mg/L adenin] + 2% dextros + 2% agar Mediet (innehållande jäst kväve bas utan AA och ammoniumsulfat, ammoniumsulfat och agar) steriliseras genom autoklav. De andra komponenterna tillsätts efter autoklavering för att bevara värme-labila ingredienser. När du använder pLS-och pLSG-baserade vektorer förbereda plattor utan leucin. När du använder pTS-och pTSG-baserade vektorer förbereda plattor utan tryptofan. Protokoll 2-3
Syntetiska selektiva medier: [0,17% jäst kväve bas utan AA och ammoniumsulfat, 0,5% ammoniumsulfat, 5% (v/v) icke-essentiell aminosyra lösning (0,04% arginin, 0,04% metionin, 0,06% isoleucin, 0,1% fenylalanin, 0,2% glutaminsyra, 0,2% asparaginsyra, 0,3% valin, 0,4% Threonine, 0,8% serin), 20 mg/l histidin, 20 mg/l uracile, 20 mg/l tryptofan (beroende på val av vektor markör), 30 mg/l lysin, 100 mg/ml leucin (beroende på val av vektor markering), 200 mg/l adenin] + 2% dextros eller raffinos + 0-2% galaktos  Mediet steriliseras genom filtrering. När du använder pLS-eller pTS-baserade vektorer i läkemedelsbehandling förbereda media utan leucin eller tryptofan, respektive men som innehåller 2% dextros. Vid användning av plsg-eller ptsg-baserad vektor i inducerbart p53-uttryck med eller utan läkemedelsbehandling, Förbered media utan leucin eller tryptofan, men innehållande 2% raffinos och varierande mängd galaktos för att modulera p53-uttryck. Omfattningen av p53-induktion kan också moduleras genom att variera tiden för inkubering. Protokoll 3
Minimala selektiva plattor: 2% glukos, 0,7% jäst kväve bas (utan aminosyror och ammoniumsulfat), 50 mg/l adenin, 50 mg/l uracil, 50 mg/l histidin, 50 mg/l tryptofan (beroende på vektor markerings markör), 50 mg/l leucin (beroende på urvals markör för vektor), 2% agar Mediet är steriliserat genom autoklav. När du använder pLS89-baserade vektorer förbereda medium utan tryptofan. Använd pLS89-tom vektor (som inte uttrycker något protein) som negativ kontroll. Vid användning av pLS89-baserade och pGADT7-MDM2 vektorer (co-uttryck av p53 och MDM2), förbereda medium utan leucin och tryptofan. Använd pLS89-Empty och pGADT7 (båda inte uttrycker något protein) som negativa kontroller. När du använder pLS76-baserade vektorer förbereda medium utan leucin. Använd pRS315 vektor (inte uttrycker något protein) som negativ kontroll. Protokoll 4
Minimalt selektivt medium: som minimala selektiva plattor men utan agar Mediet är steriliserat genom filtrering. Protokoll 4
Selektivt induktions medium: som minimalt selektivt medium men innehållande 2% galaktos i stället för glukos Mediet är steriliserat genom filtrering. Protokoll 4

Tabell 2: Jästmedia.

Lösningens namn och recept eller primer namn och sekvens Specifika funktioner och användning Protokollnummer
Liac/te: 10 mm Tris-HCl, pH 8,0, med 1 mm EDTA och 0,1 m litiumacetat Följande sterila lagerlösningar i vatten bereds genom autoklav: 1M Litiumacetat pH 7,5, 1 M Tris-HCl/0,1 M EDTA pH 8,0 (TE buffert 10X). Protokoll 1-4
PEG/LiAc/te: 40% polyetylenglykol (PEG) i 10 mm Tris-HCl, pH 8,0, med 1 mm EDTA och 0,1 M litiumacetat Följande sterila lagerlösningar i vatten bereds genom autoklav: 1 M Litiumacetat pH 7,5, 1 M Tris-HCl/0,1 M EDTA pH 8,0 (TE buffert 10X), 50% PEG (molekylvikt ~ 3350). Protokoll 1-4
Homologi svansar för RE oligonukleotides:
5 '-gcggaattgactttttcttgaataatacat-RE-gcagatccgccaggcgtgtatatagcgtgg-3 '
Förutsatt är sekvensen av homologi svansar, som motsvarar de kromosomala sekvenser flanera den integrerade ICORE kassetten; RE = RE sekvens. Protokoll 1
Primers: Ade2 FW: 5 '-AAGTTGCCTAGTTTCATGAA-3 ';
Ade2 RV: 5 '-GGAGCCATTAACGTGGTCAT-3 ';
Luc1-RV: 5 '-CATAGCTTCTGCCAACCGAA-3 '
För yAFM-RE stam (PCR och sekvensering) kombinera Ade2 FW med Ade2 RV primer. För yLFM-RE stam (PCR och sekvensering) kombinera Ade2 FW med Luc1-RV primer. Protokoll 1

Tabell 3: lösningar och oligonukleotider.

Typer av vektorer Positiva och negativa kontroller Protokollnummer
P53 (eller kontroll) vektorer.
pLS-eller plsg-baserat: p53-proteinuttryck under konstitutiv ADH1 promotor eller galaktos inducerbar GAL1 promotor, respektive (LEU2 som markerings markör).
pTS-eller ptsg-baserat: p53-proteinuttryck under konstitutiv ADH1 promotor eller galaktos inducerbar GAL1 promotor, respektive (TRP1 som markerings markör)
pLS-och pLSG-baserade: Använd som positiv kontroll av pLS76 och de pLSG-p53 vektorer (uttrycker Wild typ p53), respektive; Använd som negativ kontroll pRS315 Vector (inte uttrycker något protein).
pTS-och pTSG-baserade: Använd som positiv kontroll pTS76 och pTSG-p53 vektorer (uttrycker Wild typ p53), respektive; Använd som negativ kontroll pRS314 Vector (inte uttrycker något protein).
Protokoll 2, 3
P53 och MDM2 (eller kontroll) vektorer.
pLS89-baserat: proteinuttryck av vildtyp p53 under galaktos inducerbara GAL1 promotor (TRP1 som markerings markör).
pLS76-baserat: muterat p53-proteinuttryck under konstitutiv ADH1 promotor (LEU2 som markerings markör).
pGADT7-baserade: MDM2 proteinuttryck under konstitutiv ADH1 promotor (LEU2 som markerings markör)
pLS89-baserad: Använd som positiv kontroll pLS89-p53-vektorn (uttrycker vild typ p53); Använd som negativ kontroll pLS89-tom (inte uttrycker något protein).
pLS76-baserad: Använd som positiv kontroll den pLS76-muterade p53-vektorn (uttryckt muterat p53); Använd som negativ kontroll pRS315 Vector (inte uttrycker något protein).
pGADT7-baserad: Använd som positiv kontroll pGADT7-MDM2 vektor (uttrycker Wild Type MDM2); Använd som negativ kontroll pGADT7 Vector (inte uttrycker något protein).
Protokoll 4

Tabell 4: vektorer för Jästuttryck.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Jästbaserade analyser har visat sig vara användbara för att undersöka olika aspekter av p53-proteinfunktioner. Dessa analyser är särskilt känsliga för utvärdering av p53-transaktiveringspotential mot varianter av RE-målplatser, inklusive utvärdering av funktionella polymorfismer. Användningen av färg reportrar samt miniatyrisering av luciferas-analysen resulterar i kostnadseffektiva och relativt skalbara analyser. Dessutom är tillväxthämmande test potentiellt mottagliga för att användas i kemisk biblioteks screening, automatisera kvantifieringen av jästcellernas lönsamhet genom mätning av absorbans. Även begränsad permeabilitet på grund av cellväggen och verkan av ABC transportörer har ansetts vara en begränsning i att använda jäst för läkemedels screening, genetiska modifieringar för att förbättra upptaget har framgångsrikt utvecklats22,65.

Jämfört med däggdjurs-cellbaserade analyser kan den jästbaserade p53-analysen förbättra identifieringen av direkta träffar, med tanke på att p53 isoleras från den fantastiska komplexiteten hos kofaktorer och signalkaskader som modulera dess funktioner i högre Eukaryoter. Jästbaserade funktionella analyser har också delvis lyckats övervaka interaktionen mellan p53 och proteinkofaktorer (nämligen MDM2 och mdmx22,32,33,34) och effekterna av små molekyler (t. ex. Nutlin-3a) på dessa interaktioner. Men känsligheten och prediktiva kraften i jäst-baserade analyser för att undersöka överhörning mellan p53 och samverkande proteiner kan vara något begränsad, beroende på hur dessa interaktioner in vivo beror på post-translationella modifieringar och artspecifika signalering kaskader.

De system som beskrivs här kan enkelt anpassas till andra TFs. I själva verket har jäst funktionella analyser utvecklats för p53-relaterade p63 och P73 proteiner42,49 samt medlemmar av NF-κb familjen66,67 [eller ens för vissa Hedgehog och grundläggande Helix-loop-Helix (bhlh) TFS68,69]. Mänskliga nukleära receptorer har också uttryckts i jäst och visat sig fungera som ligand-beroende, sekvens-specifika TFs70. En begränsande faktor har identifierats i den svaga kapaciteten hos vissa transaktiveringsdomäner för däggdjur (TAD) för att interagera med den grundläggande transkriptionsmaskinen för jäst8, en brist som kan övervinnas med hjälp av chimära konstruktioner, inklusive en aktiv heterologa TAD68,69.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna förklarar ingen intressekonflikt.

Acknowledgments

Vi tackar Europeiska unionen (FEDER Funds POCI/01/0145/FEDER/007728 genom programa Operacional factores de Competitividade-konkurrera) och nationella fonder (FCT/MEC, Fundação para a Ciência e Tecnologia och Ministério da Educação e Ciência) under Partnerskapsavtal PT2020 UID/QUI/50006/2019 och projekten (3599-PPCDT) PTDC/DTP-FTO/1981/2014-POCI-01-0145-FEDER-016581. FCT-stipendier: SFRH/BD/96189/2013 (S. Gomes). Detta arbete stöddes av Compagnia S. Paolo, Turin, Italien (projekt 2017,0526) och hälsoministeriet, (projekt 5x1000, 2015 och 2016; nuvarande forskning 2016). Vi tackar djupt Dr Teresa López-Arias Montenegro (universitetet i Trento, experimentell vetenskap undervisning laboratorier) för att få hjälp med videoinspelning.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
L-Aspartic acid SIGMA 11189
QIAquick PCR Purification Kit QIAGEN 28104
L-Phenylalanine SIGMA 78019
Peptone BD Bacto 211677
Yeast ex+A2:C26tract BD Bacto 212750
Difco Yeast Nitrogen Base w/o Amino Acids and Ammonium Sulfate BDTM 233520
Lithium Acetate Dihydrate SIGMA 517992
Bacteriological Agar Type A Biokar Diagnostics A1010 HA
G418 disulfate salt SIGMA A1720
Ammonium Sulfate SIGMA A2939
L-Arginine Monohydro-chloride SIGMA A5131
Adenine Hemisulfate Salt SIGMA A9126
Passive Lysis Buffer 5x PROMEGA E1941
Bright-Glo Luciferase Assay System  PROMEGA E2620
5-FOA Zymo Research F9001
D-(+)-Galactose SIGMA G0750
L-Glutamic acid SIGMA G1251
Dextrose  SIGMA G7021
L-Histidine SIGMA H8125
L-Isoleucine SIGMA I2752
L-Lysine SIGMA L1262
L-Leucine SIGMA L8000
L-Methionine SIGMA M2893
PEG SIGMA P3640
D-(+)-Raffinose Pentahydrate SIGMA R0250
L-Serine SIGMA S4500
L-Tryptophan SIGMA T0271
L-Threonine SIGMA T8625
Uracil SIGMA U0750
L-Valine SIGMA V0500

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Spitz, F., Furlong, E. E. Transcription factors: from enhancer binding to developmental control. Nature Reviews Genetics. 13, (9), 613-626 (2012).
  2. Pan, Y., Tsai, C. J., Ma, B., Nussinov, R. Mechanisms of transcription factor selectivity. Trends in Genetics. 26, (2), 75-83 (2010).
  3. Das, M. K., Dai, H. K. A survey of DNA motif finding algorithms. BMC Bioinformatics. 8 Suppl 7, S21 (2007).
  4. Sebastian, A., Contreras-Moreira, B. The twilight zone of cis element alignments. Nucleic Acids Resesarch. 41, (3), 1438-1449 (2013).
  5. Iggo, R., et al. Validation of a yeast functional assay for p53 mutations using clonal sequencing. Journal of Pathology. 231, (4), 441-448 (2013).
  6. Kaeberlein, M., Burtner, C. R., Kennedy, B. K. Recent developments in yeast aging. PLoS Genetics. 3, (5), e84 (2007).
  7. Scharer, E., Iggo, R. Mammalian p53 can function as a transcription factor in yeast. Nucleic Acids Research. 20, (7), 1539-1545 (1992).
  8. Kennedy, B. K. Mammalian transcription factors in yeast: strangers in a familiar land. Nature Reviews Molecular Cellular Biology. 3, (1), 41-49 (2002).
  9. Belli, G., Gari, E., Piedrafita, L., Aldea, M., Herrero, E. An activator/repressor dual system allows tight tetracycline-regulated gene expression in budding yeast. Nucleic Acids Research. 26, (4), 942-947 (1998).
  10. Mumberg, D., Muller, R., Funk, M. Regulatable promoters of Saccharomyces cerevisiae: comparison of transcriptional activity and their use for heterologous expression. Nucleic Acids Research. 22, (25), 5767-5768 (1994).
  11. Weinhandl, K., Winkler, M., Glieder, A., Camattari, A. Carbon source dependent promoters in yeasts. Microbial Cell Factories. 13, 5 (2014).
  12. Inga, A., Storici, F., Darden, T. A., Resnick, M. A. Differential transactivation by the p53 transcription factor is highly dependent on p53 level and promoter target sequence. Molelcular and Cellular Biology. 22, (24), 8612-8625 (2002).
  13. Resnick, M. A., Inga, A. Functional mutants of the sequence-specific transcription factor p53 and implications for master genes of diversity. Proceeding of the National Academy of Science USA. 100, (17), 9934-9939 (2003).
  14. Tomso, D. J., et al. Functionally distinct polymorphic sequences in the human genome that are targets for p53 transactivation. Proceeding of the National Academy of Science USA. 102, (18), 6431-6436 (2005).
  15. Storici, F., Lewis, L. K., Resnick, M. A. In vivo site-directed mutagenesis using oligonucleotides. Nature Biotechnology. 19, (8), 773-776 (2001).
  16. Storici, F., Resnick, M. A. The delitto perfetto approach to in vivo site-directed mutagenesis and chromosome rearrangements with synthetic oligonucleotides in yeast. Methods in Enzymology. 409, 329-345 (2006).
  17. Campomenosi, P., et al. p53 mutants can often transactivate promoters containing a p21 but not Bax or PIG3 responsive elements. Oncogene. 20, (27), 3573-3579 (2001).
  18. Flaman, J. M., et al. A simple p53 functional assay for screening cell lines, blood, and tumors. Proceedings of the National Academy of Science USA. 92, (9), 3963-3967 (1995).
  19. Kovvali, G. K., Mehta, B., Epstein, C. B., Lutzker, S. G. Identification of partial loss of function p53 gene mutations utilizing a yeast-based functional assay. Nucleic Acids Research. 29, (5), E28 (2001).
  20. Shimada, A., et al. The transcriptional activities of p53 and its homologue p51/p63: similarities and differences. Cancer Research. 59, (12), 2781-2786 (1999).
  21. Sunahara, M., et al. Mutational analysis of p51A/TAp63gamma, a p53 homolog, in non-small cell lung cancer and breast. Oncogene. 18, (25), 3761-3765 (1999).
  22. Andreotti, V., et al. p53 transactivation and the impact of mutations, cofactors and small molecules using a simplified yeast-based screening system. PLoS ONE. 6, (6), e20643 (2011).
  23. Hekmat-Scafe, D. S., et al. Using yeast to determine the functional consequences of mutations in the human p53 tumor suppressor gene: An introductory course-based undergraduate research experience in molecular and cell biology. Biochemistry Molecular Biology Educaction. 45, (2), 161-178 (2017).
  24. Kato, S., et al. Understanding the function-structure and function-mutation relationships of p53 tumor suppressor protein by high-resolution missense mutation analysis. Proceedings of the National Academy of Science USA. 100, (14), 8424-8429 (2003).
  25. Monti, P., et al. Transcriptional functionality of germ line p53 mutants influences cancer phenotype. Clinical Cancer Research. 13, (13), 3789-3795 (2007).
  26. Monti, P., et al. Dominant-negative features of mutant TP53 in germline carriers have limited impact on cancer outcomes. Molecular Cancer Research. 9, (3), 271-279 (2011).
  27. Leroy, B., et al. The TP53 website: an integrative resource centre for the TP53 mutation database and TP53 mutant analysis. Nucleic Acids Research. 41, (Database issue), D962-D969 (2013).
  28. Nigro, J. M., Sikorski, R., Reed, S. I., Vogelstein, B. Human p53 and CDC2Hs genes combine to inhibit the proliferation of Saccharomyces cerevisiae. Molecular and Cellular Biology. 12, (3), 1357-1365 (1992).
  29. Bureik, M., Jungbluth, A., Drescher, R., Wagner, P. Human p53 restores DNA synthesis control in fission yeast. Biological Chemistry. 378, (11), 1361-1371 (1997).
  30. Leao, M., et al. Alpha-mangostin and gambogic acid as potential inhibitors of the p53-MDM2 interaction revealed by a yeast approach. Journal of Natural Products. 76, (4), 774-778 (2013).
  31. Hadj Amor, I. Y., et al. Human p53 induces cell death and downregulates thioredoxin expression in Saccharomyces cerevisiae. FEMS Yeast Research. 8, (8), 1254-1262 (2008).
  32. Leao, M., et al. Novel simplified yeast-based assays of regulators of p53-MDMX interaction and p53 transcriptional activity. FEBS J. 280, (24), 6498-6507 (2013).
  33. Di Ventura, B., Funaya, C., Antony, C., Knop, M., Serrano, L. Reconstitution of Mdm2-dependent post-translational modifications of p53 in yeast. PLoS ONE. 3, (1), e1507 (2008).
  34. Leao, M., et al. Discovery of a new small-molecule inhibitor of p53-MDM2 interaction using a yeast-based approach. Biochemichal Pharmacology. 85, (9), 1234-1245 (2013).
  35. Billant, O., Blondel, M., Voisset, C. p53, p63 and p73 in the wonderland of S. cerevisiae. Oncotarget. 8, (34), 57855-57869 (2017).
  36. Cho, Y., Gorina, S., Jeffrey, P. D., Pavletich, N. P. Crystal structure of a p53 tumor suppressor-DNA complex: understanding tumorigenic mutations. Science. 265, (5170), 346-355 (1994).
  37. Muller, P. A., Vousden, K. H., Norman, J. C. p53 and its mutants in tumor cell migration and invasion. Journal of Cellular Biology. 192, (2), 209-218 (2011).
  38. Oren, M., Rotter, V. Mutant p53 gain-of-function in cancer. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 2, (2), a001107 (2010).
  39. Walerych, D., Napoli, M., Collavin, L., Del Sal, G. The rebel angel: mutant p53 as the driving oncogene in breast cancer. Carcinogenesis. 33, (11), 2007-2017 (2012).
  40. Ciribilli, Y., et al. The coordinated p53 and estrogen receptor cis-regulation at an FLT1 promoter SNP is specific to genotoxic stress and estrogenic compound. PLoS ONE. 5, (4), e10236 (2010).
  41. Menendez, D., Inga, A., Resnick, M. A. Potentiating the p53 network. Discovery Medicine. 10, (50), 94-100 (2010).
  42. Monti, P., et al. Characterization of the p53 mutants ability to inhibit p73 beta transactivation using a yeast-based functional assay. Oncogene. 22, (34), 5252-5260 (2003).
  43. Monti, P., et al. Tumour p53 mutations exhibit promoter selective dominance over wild-type p53. Oncogene. 21, (11), 1641-1648 (2002).
  44. Shiraishi, K., et al. Isolation of temperature-sensitive p53 mutations from a comprehensive missense mutation library. Journal of Biological Chemistry. 279, (1), 348-355 (2004).
  45. Soussi, T. TP53 mutations in human cancer: database reassessment and prospects for the next decade. Advances in Cancer Research. 110, 107-139 (2011).
  46. Malkin, D. Li-Fraumeni Syndrome. Genes and Cancer. 2, 474-484 (2001).
  47. el-Deiry, W. S., Kern, S. E., Pietenpol, J. A., Kinzler, K. W., Vogelstein, B. Definition of a consensus binding site for p53. Nature Genetics. 1, (1), 45-49 (1992).
  48. Menendez, D., Inga, A., Resnick, M. A. The expanding universe of p53 targets. Nature Reviews in Cancer. 9, 724-737 (2009).
  49. Ciribilli, Y., et al. Transactivation specificity is conserved among p53 family proteins and depends on a response element sequence code. Nucleic Acids Research. 41, (18), 8637-8653 (2013).
  50. Smeenk, L., et al. Characterization of genome-wide p53-binding sites upon stress response. Nucleic Acids Research. 36, 3639-3654 (2008).
  51. Vyas, P., et al. Diverse p53/DNA binding modes expand the repertoire of p53 response elements. Proceeding of the National Academy of Science USA. 114, (40), 10624-10629 (2017).
  52. Tebaldi, T., et al. Whole-genome cartography of p53 response elements ranked on transactivation potential. BMC Genomics. 16, 464 (2015).
  53. Wang, T., et al. Species-specific endogenous retroviruses shape the transcriptional network of the human tumor suppressor protein p53. Proceedings of the National Academy of Science USA. 104, 18613-18618 (2007).
  54. Bond, G. L., et al. A single nucleotide polymorphism in the MDM2 promoter attenuates the p53 tumor suppressor pathway and accelerates tumor formation in humans. Cell. 119, (5), 591-602 (2004).
  55. Zeron-Medina, J., et al. A polymorphic p53 response element in KIT ligand influences cancer risk and has undergone natural selection. Cell. 155, (2), 410-422 (2013).
  56. Lion, M., et al. Evolution of p53 transactivation specificity through the lens of a yeast-based functional assay. PLoS ONE. 10, (2), e0116177 (2015).
  57. Schumacher, B., et al. C. elegans ced-13 can promote apoptosis and is induced in response to DNA damage. Cell Death and Differentiation. 12, (2), 153-161 (2005).
  58. Jordan, J. J., et al. Low-level p53 expression changes transactivation rules and reveals superactivating sequences. Proceeding of the National Academy of Science USA. 109, (36), 14387-14392 (2012).
  59. Soares, J., et al. Oxazoloisoindolinones with in vitro antitumor activity selectively activate a p53-pathway through potential inhibition of the p53-MDM2 interaction. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 66, 138-147 (2015).
  60. Leao, M., et al. Enhanced cytotoxicity of prenylated chalcone against tumour cells via disruption of the p53-MDM2 interaction. Life Sciences. 142, 60-65 (2015).
  61. Soares, J., et al. A tryptophanol-derived oxazolopiperidone lactam is cytotoxic against tumors via inhibition of p53 interaction with murine double minute proteins. Pharmacol Research. 95-96, 42-52 (2015).
  62. Soares, J., et al. DIMP53-1: a novel small-molecule dual inhibitor of p53-MDM2/X interactions with multifunctional p53-dependent anticancer properties. Molecular Oncology. 11, (6), 612-627 (2017).
  63. Soares, J., et al. Reactivation of wild-type and mutant p53 by tryptophanolderived oxazoloisoindolinone SLMP53-1, a novel anticancer small-molecule. Oncotarget. 7, (4), 4326-4343 (2016).
  64. Sharma, V., Monti, P., Fronza, G., Inga, A. Human transcription factors in yeast: the fruitful examples of P53 and NF-small ka, CyrillicB. FEMS Yeast Research. 16, (7), (2016).
  65. Stepanov, A., Nitiss, K. C., Neale, G., Nitiss, J. L. Enhancing drug accumulation in Saccharomyces cerevisiae by repression of pleiotropic drug resistance genes with chimeric transcription repressors. Molecular Pharmacology. 74, (2), 423-431 (2008).
  66. Sharma, V., et al. Quantitative Analysis of NF-kappaB Transactivation Specificity Using a Yeast-Based Functional Assay. PLoS ONE. 10, (7), e0130170 (2015).
  67. Epinat, J. C., et al. Reconstitution of the NF-kappa B system in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 13, (7), 599-612 (1997).
  68. Inga, A., Reamon-Buettner, S. M., Borlak, J., Resnick, M. A. Functional dissection of sequence-specific NKX2-5 DNA binding domain mutations associated with human heart septation defects using a yeast-based system. Human Molecular Genetics. 14, (14), 1965-1975 (2005).
  69. Reamon-Buettner, S. M., Ciribilli, Y., Inga, A., Borlak, J. A loss-of-function mutation in the binding domain of HAND1 predicts hypoplasia of the human hearts. Human Molecular Genetics. 17, (10), 1397-1405 (2008).
  70. Balmelli-Gallacchi, P., et al. A yeast-based bioassay for the determination of functional and non-functional estrogen receptors. Nucleic Acids Research. 27, (8), 1875-1881 (1999).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics