Presenteras här är fyra protokoll för att konstruera och exploatera jäst Saccharomyces cerevisiae reporter stammar att studera humant p53 transaktiveringspotential, effekterna av dess olika cancerrelaterade mutationer, Co-uttryckta samverkande proteiner, och effekterna av specifika små molekyler.
Konstaterandet att det välkända proteinet hos däggdjur p53 kan fungera som en transkriptionsfaktor (TF) i jästen S. cerevisiae har tillåtit utveckling av olika funktionella analyser för att studera effekterna av 1) bindnings plats [dvs., responselement (re)] sekvenvarianter på p53-transaktiveringselektivitet eller 2) TP53 -mutationer, Co-uttryckta kofaktorer eller små molekyler på p53-transaktiveringsaktivitet. Olika grundläggande och translationella forskningstillämpningar har utvecklats. Experimentellt, dessa metoder utnyttja två stora fördelar med jästen modell. Å ena sidan möjliggör enkel genom redigering snabb konstruktion av kvalitativa eller kvantitativa reporter system genom att utnyttja isogena stammar som endast skiljer sig åt på en specifik p53-RE för att undersöka sekvensspecificitet hos p53-beroende transaktivering. Å andra sidan tillåter tillgängligheten av reglerade system för utomkvedshavandeskap p53-uttryck utvärderingen av transaktivering i ett brett spektrum av proteinuttryck. Granskas i denna rapport är i stor utsträckning används system som bygger på färg reporter gener, luciferase, och tillväxten av jäst för att illustrera deras viktigaste metodologiska steg och att kritiskt bedöma deras prediktiva effekt. Dessutom kan den extrema mångsidigheten hos dessa metoder lätt utnyttjas för att studera olika TFs inklusive p63 och P73, som är andra medlemmar i TP53 Gene familj.
Transkription är en mycket komplicerad process som involverar dynamisk, rumslig och tidsmässig organisering av transkriptionsfaktorer (TFs) och kofaktorer för rekrytering och modulering av RNA-polymeraser på kromatinregioner som svar på specifika stimuli1 . De flesta TFs, inklusive den humana p53-tumörsuppressor, känner igen specifika CIS-verkande element i form av DNA-sekvenser som kallas responselement (REs), som består av enstaka (eller flera) unika motiv ~ 6-10 nukleotider långa. Inom dessa motiv kan individuella positioner Visa olika grader av variabilitet2, vanligen sammanfattade efter positions vikts matriser (PWM) eller logotyper3,4.
Jästen S. cerevisiae är ett lämpligt modellsystem för att studera olika aspekter av mänskliga proteiner genom komplessionstester, ektopisk uttryck och funktionella analyser, även när en ortolog jästgen inte är närvarande5, 6 , 7. på grund av det evolutionära bevarandet av basala komponenter i transkriptionella systemet8, många mänskliga TFS (när ectopically uttrycks i jästceller) kan modulera uttrycket av en reporter gen genom att agera genom initiativtagare konstruerade för att innehåller lämpliga förnybara energikällor. Den transkription modellsystem som presenteras här för humant p53 kännetecknas av tre stora variabler vars effekter kan moduleras: 1) den modalitet uttryck och typ av p53, 2) den RE sekvens kontrollera p53-beroende transkription, och 3) vilken typ av reporter-genen (figur 1a).
När det gäller p53-uttryckets modalitet tillåter S. cerevisiae valet av inducerbara, repressibla eller konstitutiva initiativtagare9,10,11. I synnerhet tillåter den inducerbara GAL1 promotorn basal (med raffinos som kolkälla) eller variabel (genom att ändra mängden galaktos i Media) uttryck för en TF i jäst. I själva verket representerar det fint avstämda uttrycket en kritisk utveckling för att studera inte bara p53 självt utan även andra p53-familjproteiner12,13.
När det gäller den typ av förnybara energikällor som styr det p53-beroende uttrycket gör S. cerevisiae det möjligt att bygga olika reporter stammar som har unika skillnader i intresse för en annars ISOGEN bakgrund. Detta mål nås med hjälp av en anpassning av en särskilt mångsidig genom redigering metod som utvecklats i S. cerevisiae, kallad delitto Perfetto12,14,15,16.
Dessutom kan olika rapportörer (dvs. URA3, HIS3 och ADE2) användas för att kvalitativt och kvantitativt utvärdera transkriptionella aktiviteter av humant TFS i S. cerevisiae, var och en med specifika funktioner som kan skräddarsys efter experimentella behov17,18,19,20,21. Uttrycket av dessa rapportgener ger uracil, histidin, och adenin prototrophy, respektive. Den URA3 reporter tillåter inte tillväxten av celler i närvaro av 5-FOA också, och därmed kan det motväljas. Den ADE2 reporter systemet har fördelen att, förutom näringsmässiga urval, det gör det möjligt att identifiera jästceller som uttrycker vildtyp (dvs funktionella på ADE2 uttryck) eller mutant (dvsinte funktionella på ADE2 ) P53 från kolonens färg.
Till exempel, jästceller uttrycker ADE2 genen generera normalt stora vita kolonier på plattor som innehåller begränsande mängder av adenin (2.5-5.0 mg/L), medan de som dåligt eller inte transkribera det visas på samma platta som mindre röd (eller rosa) Kolonier. Detta beror på ackumulering av en intermediär i adenin biosyntetiska väg (dvs, P-ribosylamino-Imidazol, som tidigare har kallats amino-Imidazol ribotid eller luft), som omvandlas till ett rött pigment. Den kvalitativa färgbaserade ADE2 reporter genen har sedan ersatts med den kvantitativa Firefly Photinus mottfjärilar (LUC1)12,22. På senare tid har ADE2 reporter kombinerats med lacz reporter i en lätt-till-poäng, semi-kvantitativ, dubbel reporter test som kan utnyttjas för att underklassificera p53 mutanter enligt deras kvarvarande nivå av funktionalitet 23.
Fluorescerande reportrar som egfp (Enhanced Green fluorescerande protein) eller dsred (discosoma SP. Red fluorescerande protein) har också använts för kvantitativ utvärdering av transaktiveringsaktivitet förknippad med alla möjliga genom-mutationer i TP53 kodning sekvens24. Slutligen har möjligheten att kombinera avstämbara promotorer för p53-allel-uttryck med isogena jäststammar som skiljer sig för re-och/eller reporter-genen lett till utvecklingen av en datamatris som genererar en förfinad klassificering av cancerrelaterad och köns Cells muterade p53-alleler25,26,27.
De metoder som beskrivs ovan används för att mäta den transkriptionella aktiviteten hos proteinet p53. Emellertid kan uttrycket av vildtyp p53 i jästen S. cerevisiae28 och Schizosaccharomyces pombe29 orsaka tillväxthämning, som har förknippats med cellcykelarrest28,30 eller celldöd31. I båda fallen utlöses jästtillväxthämning av högt p53-uttryck och har korrelerats med potentiell transkriptionell modulering av endogena jästgener involverade i celltillväxt. Genom att stödja denna hypotes har förlusten av funktion Mutant p53 R273H inte interfererat med jästcellernas tillväxt när den uttrycks på liknande nivåer som vildtyp p5332. Omvänt orsakade uttrycket i jäst av det giftiga muterade p53 V122A (känt för högre transkriptionell aktivitet jämfört med vildtyp p53) en starkare tillväxthämmande effekt än av vildtyp p5332.
Dessutom visades att Human MDM2 kunde hämma den humana p53-transkriptionella aktiviteten i jäst, främja dess ubiquitination och efterföljande nedbrytning33. Följaktligen visades förmågan hos Human MDM2 och mdmx att hämma p53-inducerad jäst tillväxthämning32,34. I en ytterligare studie fastställdes ett samband mellan p53-transskriptionell aktivitet och aktin-uttrycksnivåer, med identifieringen av ett förmodat p53-medel uppströms på ÄRV1 -genen i jäst32. Konsekvent, aktin uttryck förstärktes av vildtyp p53 och ännu mer av p53 V122A, men inte av muterat p53 R273H. Omvänt minskade aktin-uttrycket av p53 i samtidig förekomst av p53-hämmare MDM2, mdmx eller pifithrin-α (en liten molekyl hämmare av p53-transkriptionell aktivitet), som överensstämde med resultat baserade på jästtillväxtanalysen. Viktigt, dessa resultat fastställde ett samband mellan p53-inducerad tillväxthämning och graden av dess aktivitet i jäst, som också har utnyttjats för att identifiera och studera små molekyler som modulerar p53-funktioner28,34 , 35.
Jästbaserade analyser har visat sig vara användbara för att undersöka olika aspekter av p53-proteinfunktioner. Dessa analyser är särskilt känsliga för utvärdering av p53-transaktiveringspotential mot varianter av RE-målplatser, inklusive utvärdering av funktionella polymorfismer. Användningen av färg reportrar samt miniatyrisering av luciferas-analysen resulterar i kostnadseffektiva och relativt skalbara analyser. Dessutom är tillväxthämmande test potentiellt mottagliga för att användas i kemisk bibliot…
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar Europeiska unionen (FEDER Funds POCI/01/0145/FEDER/007728 genom programa Operacional factores de Competitividade-konkurrera) och nationella fonder (FCT/MEC, Fundação para a Ciência e Tecnologia och Ministério da Educação e Ciência) under Partnerskapsavtal PT2020 UID/QUI/50006/2019 och projekten (3599-PPCDT) PTDC/DTP-FTO/1981/2014-POCI-01-0145-FEDER-016581. FCT-stipendier: SFRH/BD/96189/2013 (S. Gomes). Detta arbete stöddes av Compagnia S. Paolo, Turin, Italien (projekt 2017,0526) och hälsoministeriet, (projekt 5×1000, 2015 och 2016; nuvarande forskning 2016). Vi tackar djupt Dr Teresa López-Arias Montenegro (universitetet i Trento, experimentell vetenskap undervisning laboratorier) för att få hjälp med videoinspelning.
L-Aspartic acid | SIGMA | 11189 | |
QIAquick PCR Purification Kit | QIAGEN | 28104 | |
L-Phenylalanine | SIGMA | 78019 | |
Peptone | BD Bacto | 211677 | |
Yeast ex+A2:C26tract | BD Bacto | 212750 | |
Difco Yeast Nitrogen Base w/o Amino Acids and Ammonium Sulfate | BDTM | 233520 | |
Lithium Acetate Dihydrate | SIGMA | 517992 | |
Bacteriological Agar Type A | Biokar Diagnostics | A1010 HA | |
G418 disulfate salt | SIGMA | A1720 | |
Ammonium Sulfate | SIGMA | A2939 | |
L-Arginine Monohydro-chloride | SIGMA | A5131 | |
Adenine Hemisulfate Salt | SIGMA | A9126 | |
Passive Lysis Buffer 5x | PROMEGA | E1941 | |
Bright-Glo Luciferase Assay System | PROMEGA | E2620 | |
5-FOA | Zymo Research | F9001 | |
D-(+)-Galactose | SIGMA | G0750 | |
L-Glutamic acid | SIGMA | G1251 | |
Dextrose | SIGMA | G7021 | |
L-Histidine | SIGMA | H8125 | |
L-Isoleucine | SIGMA | I2752 | |
L-Lysine | SIGMA | L1262 | |
L-Leucine | SIGMA | L8000 | |
L-Methionine | SIGMA | M2893 | |
PEG | SIGMA | P3640 | |
D-(+)-Raffinose Pentahydrate | SIGMA | R0250 | |
L-Serine | SIGMA | S4500 | |
L-Tryptophan | SIGMA | T0271 | |
L-Threonine | SIGMA | T8625 | |
Uracil | SIGMA | U0750 | |
L-Valine | SIGMA | V0500 |