Microelectrode Impalement विधि एक Cannulated मध्य सेरेब्रल धमनी से झिल्ली क्षमता रिकॉर्ड करने के लिए

Medicine

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Summary

इस आलेख का प्राथमिक लक्ष्य माइक्रोइलेक्ट्रोड इम्पेमेंट विधि का उपयोग करके मध्य मस्तिष्क धमनी से झिल्ली की क्षमता (V) को रिकॉर्ड करने का विवरण प्रदान करना है। कैनाक्यूटेड मध्य सेरेब्रल धमनी मायोजेनिक टोन हासिल करने के लिए साम्य ित है, और पोत की दीवार उच्च प्रतिरोध microelectrodes का उपयोग कर impaled है।

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Reed, J. T., Sontakke, S. P., Pabbidi, M. R. Microelectrode Impalement Method to Record Membrane Potential from a Cannulated Middle Cerebral Artery. J. Vis. Exp. (149), e59072, doi:10.3791/59072 (2019).

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Abstract

संवहनी चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं की झिल्ली क्षमता (वीमी) वाहिका टोन निर्धारित करता है और इस प्रकार एक अंग के लिए रक्त प्रवाह. आयन चैनलों और इलेक्ट्रोजेनिक पंपों की अभिव्यक्ति और समारोह में परिवर्तन जो रोग की स्थिति में Vm को विनियमित करते हैं, संभवतः Vm, संवहनी टोन, और रक्त प्रवाह को बदल सकते हैं। इस प्रकार, इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी की बुनियादी समझ और स्वस्थ और रोगग्रस्त राज्यों में ट को सही ढंग से रिकॉर्ड करने के लिए आवश्यक विधियाँ आवश्यक हैं। इस विधि से विभिन्न औषधीय अभिकर्ताओं का उपयोगकरके Vm को पुनर्स्थापित करने में नियमन की अनुमति होगी। हालांकि वहाँ कई तरीके हैं, इसके फायदे और नुकसान के साथ प्रत्येक, इस लेख ऐसे microelectrode impalement विधि का उपयोग कर मध्य मस्तिष्क धमनी के रूप में cannulated प्रतिरोध वाहिकाओं से वीमीटर रिकॉर्ड करने के लिए प्रोटोकॉल प्रदान करता है. मध्य मस्तिष्क धमनियों एक मायोग्राफ कक्ष में myogenic टोन हासिल करने के लिए अनुमति दी जाती है, और पोत की दीवार उच्च प्रतिरोध microelectrodes का उपयोग कर impaled है. Vm संकेत एक इलेक्ट्रोमीटर के माध्यम से एकत्र किया जाता है, डिजीटल, और विश्लेषण किया. इस विधि कोशिकाओं को नुकसान पहुँचाए बिना और झिल्ली प्रतिरोध को बदलने के बिना एक पोत की दीवार के वीमीटर का एक सटीक पढ़ने प्रदान करता है.

Introduction

किसी कोशिका की झिल्ली विभव (ट) प्लाज्मा झिल्ली के पार आयनिक आवेश के सापेक्ष अंतर तथा इन आयनों के लिए झिल्ली की सापेक्ष पारगम्यता को संदर्भित करता है। ट आयनों के विभेदक वितरण द्वारा उत्पन्न होता है और आयन चैनलों और पम्पों द्वारा इसका रखरखाव किया जाता है। आयन चैनल जैसे के+, ना+और क्लमके चैनल आराम करने वाले वी. एम. में काफी योगदान देते हैं . संवहनी चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं (VSMCs) कश्मीर के चार से अधिक विभिन्न प्रकार के व्यक्त+ चैनल1, वोल्टेज gated Ca 2 के दो प्रकारके चैनल (VGCC)2, सीएल के दो से अधिक प्रकार के चैनल3, 4 , 5, स्टोर संचालित Ca2 + चैनल6, खिंचाव सक्रिय धन चैनल7,8, और इलेक्ट्रोजेनिक सोडियम-पोटेशियम ATPase पंप9 उनके प्लाज्मा झिल्ली में, जिनमें से सभी हो सकता है Vmके विनियमन में शामिल .

वीएसएमसी का टट ल् ल्यूमेन दाब पर निर्भर करता है। गैर-दाबित वाहिकाओं में, Vm -50 से -65 एमवी तक भिन्न होता है, तथापि, दाबित धमनी खंडों में, वीएम की रेंज -37 से -47 एमवी10तक होती है। इंट्रावास्कुलर दबाव की ऊंचाई के कारण वीएसएमसी11को अस्थिर कर देता है , वीजीसीसी खोलने के लिए सीमा को कम करता है , और मायोजेनिक टोन12के विकास में योगदान देने वाले कैल्शियम की आमद को बढ़ाता है। इसके विपरीत, निष्क्रिय या गैर दबाव वाले जहाजों में, उच्च कश्मीर+ चैनल गतिविधि के कारण झिल्ली hyperpolarization, खोलने से VGCC को रोकने जाएगा, सीमित कैल्शियम प्रवेश और intracellular कैल्शियम में कमी में जिसके परिणामस्वरूप, कम करने के लिए योगदान संवहनी टोन13| अतः लुमेन दाब में परिवर्तन के कारण टच, संवहनी स्वर विकास में एक आवश्यक भूमिका निभाताप्रतीत होता है तथा वीजीसीसी तथाके ़ दोनों चैनल ट के विनियमन में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं।

Vm पोत प्रकार और प्रजातियों के बीच भिन्न होता है। वी है -54 - 1.3 एमवी गिनी पिग में बेहतर mesenteric धमनी स्ट्रिप्स14, -45 - चूहा मध्यम मस्तिष्क धमनियों में 60 mmHg लुमेन दबाव12, और -35 ] चूहे पैरेन्काइम धमनियों में 40 मिमीएचजी लुमेन दबाव15. आराम वीमीटर unstretched चूहे लसीका मांसपेशी में दर्ज की गई है -48 - 2 mV16. सेरेब्रल वीएसएमसी का वीमी परिधीय धमनियों की तुलना में अधिक नकारात्मक होता है। इसकी तुलना में, बिल्ली के मध्य मस्तिष्क ीय धमनियों में लगभग -70एमवी का वी होने की सूचना मिली थी, जबकि मध्याह्न और कोरोनरी धमनियों में क्रमशः -49 और -58 एमवी , क्रमश:17,18थे। संवहनी बिस्तरों में वी में अंतर आयन चैनलों और इलेक्ट्रोजेनिक सोडियम-पोटेशियम पंपों की अभिव्यक्ति और कार्य में अंतर को प्रतिबिंबित कर सकता है।

वृद्धि और टमें कमी क्रमशः झिल्ली depolarization और hyperpolarization के रूप में संदर्भित कर रहे हैं। वीएम में ये परिवर्तन कई शारीरिक प्रक्रियाओं में एक केंद्रीय भूमिका निभाते हैं, जिसमें आयन-चैनल गैटिंग, सेल सिग्नलिंग, मांसपेशी संकुचन, और कार्रवाई क्षमता का प्रसार शामिल है। एक निश्चित दबाव पर, कई अंतर्जात और सिंथेटिक वासोडिलेटर यौगिकों जो K+ चैनलों को सक्रिय करते हैं, झिल्ली hyperpolarization का कारण बनता है, जिसके परिणामस्वरूप वासोडिलेशन1,13. इसके विपरीत, निरंतर झिल्ली depolarization एगोनिस्ट प्रेरित या रिसेप्टर मध्यस्थता vasoconstriction19में महत्वपूर्ण है. Vm एक महत्वपूर्ण चर है कि न केवल VGCC13 के माध्यम से Ca2 + प्रवाह को नियंत्रित करता है, लेकिन यह भी आंतरिक दुकानों से Ca 2+ की रिहाई को प्रभावित करती है20,21 और Ca 2+- संवेदनशीलता की संकुचन तंत्र22|

जबकि विभिन्न सेल प्रकारों से Vm को रिकॉर्ड करने के लिए कई विधियाँ हैं, कनपरिकलित वाहिकाओं के माइक्रोइलेक्ट्रोलेड इम्पेमेंट विधि से एकत्र किए गए डेटा अलग-अलग VSMCs से प्राप्त आंकड़ों की तुलना में अधिक शारीरिक प्रतीत होते हैं। जब अलग VSMC से वर्तमान क्लैम्प तरीकों का उपयोग कर दर्ज की गई, वीवी एस एम एस24में स्वत: क्षणिक hyperpolarizations के रूप में देखा जाता है. पृथक वीएसएमसी सिंकिशियम में नहीं हैं, और श्रृंखला प्रतिरोध में परिवर्तन टके दोलनात्मक व्यवहार में योगदान दे सकते हैं। दूसरी ओर, जब वीबरकरार जहाजों से दर्ज किया जाता है, तो दोलनव्यवहार व्यवहार नहीं देखा जाता है, शायद वीएसएमसी के बीच सेल-सेल संपर्क के कारण जो धमनी में सिंकिटियम में होते हैं और पूरे पोत में एक स्थिर वी के लिए अभिमनित होते हैं। 24इस प्रकार मानक माइक्रोइलेक्ट्रोड इम्पेमेंट तकनीक का उपयोग करके दाबित वाहिकाओं से ट का माप अपेक्षाकृत शारीरिक स्थितियों के निकट होता है।

cannulated जहाजों से वीएम रिकॉर्डिंग महत्वपूर्ण जानकारी प्रदान कर सकता है, के बाद से VSMCs के वी एम एसकि syncytium में हैं संवहनी टोन और रक्त प्रवाह के प्रमुख निर्धारकों में से एक है, और वीएम के मॉडुलन एक तरह से फैलाने के लिए प्रदान कर सकता है या रक्त वाहिकाओं को संकुचित करें। इस प्रकार, टको रिकॉर्ड करने में शामिल पद्धति को समझना आवश्यक है। यह आलेख एक microelectrode impalement विधि का उपयोग कर cannulated मध्य मस्तिष्क धमनियों (एमसीए) से वीमीटर की इंट्रासेल्यूलर रिकॉर्डिंग का वर्णन करता है। इस प्रोटोकॉल में यह वर्णन किया जाएगा कि एमसीए, माइक्रोइलेक्ट्रोड तैयार करने, इलेक्ट्रोमीटर की स्थापना कैसे की जाए और टको रिकॉर्ड करने के लिए इम्पेलिएमेंट विधि को कैसे निष्पादित किया जाए। साथ ही, प्रतिनिधि डेटा, सामान्य समस्याओं जो इस विधि और संभावित समस्याओं का उपयोग करते समय सामना किया गया चर्चा है।

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Protocol

नर चूहों UMMC, जो मूल्यांकन और प्रयोगशाला पशु देखभाल (AAALAC) के प्रत्यायन के लिए एसोसिएशन द्वारा अनुमोदित है में पशु देखभाल सुविधा में रखे गए थे. जानवरों के अध्ययन के दौरान भोजन और पानी के लिए स्वतंत्र उपयोग किया था. पशुओं को नियंत्रित वातावरण में 24 डिग्री 2 डिग्री सेल्सियस, आर्द्रता स्तर 60-80% और 12 एच प्रकाश/अंधेरे चक्रों के साथ नियंत्रित वातावरण में रखा गया था। सभी प्रोटोकॉल UMMC के पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया.

1. उपकरण की तैयारी

  1. एक दोहरी चैनल अंतर विद्युतमापी एम्पलीफायर प्लेस (सामग्री की मेजदेखें) पोत कक्ष के करीब और वांछित स्थान पर.
  2. एम्पलीफायर चैनल A या B के आउटपुट को एक BNC-BNC केबल के साथ अंकाइज़र के चैनल इनपुट से कनेक्ट करें.
  3. माइक्रोमैनिप्युलेटर में जांच माउंट करें और इसे माइक्रोस्कोप और मायोग्राफ के पास रखें। रिकॉर्डिंग सेटअप एक कंपन मुक्त मेज पर स्थापित किया जाना चाहिए.
  4. knobs प्लेस और पदों है कि यह मैनुअल में वर्णित के रूप में इस प्रयोग के लिए विन्यस्त में एम्पलीफायर के मोर्चे पर स्विच.
  5. एक उपयुक्त इलेक्ट्रोड के साथ के माध्यम से एम्पलीफायर के सर्किट जमीन के लिए स्नान जमीन कनेक्ट. इसी प्रकार, यह सुनिश्चित करें कि पिंजरे को एम्पलीफायर के चेसिस के लिए आधारित है।

2. Microelectrodes और विधानसभा की तैयारी

  1. बोरोसिलिकेट कांच के माइक्रोइलेक्ट्रोइड्स का उपयोग करें (सामग्री की सारणी देखें) और कांच की नोक को खींचकर 8-10 मिमी टेपर, का व्यास,1 डिग्री उ और 80-120 उ] का प्रतिरोध जब 3 एम केसीएल से भरा होता है।
    1. निम्न लिखित सेटिंग्स का उपयोग कर एक छोटी क्रमिक टेपर प्राप्त करने के लिए एक मानक खींचने का उपयोग करें: गर्मी $ 650; वेग - 20; पुल $ 25; समय - 250 और पाश दो बार उच्च प्रतिरोध और छोटे सुझावों के लिए. सेटिंग्स साधन-विशिष्ट हैं के रूप में सामग्री की तालिका देखें।
      नोट: टिप व्यास और lt;1 $m जब impaled सेल को कम से कम नुकसान का कारण होगा.
  2. एक microfiber सिरिंज का उपयोग कर 3 एम KCl के साथ microelectrode भरें (सामग्री की तालिका देखें).
    1. धीरे धीरे microelectrode में 3 एम केसीएल इंजेक्शन जबकि microelectrode में microelectrode के प्लंजर खींच तरल पदार्थ को भरने के लिए और microelectrode अंदर हवा के बुलबुले के गठन को रोकने के लिए अंतरिक्ष की अनुमति देने के लिए.
    2. पूर्ण जब तक microelectrode भरें और सुनिश्चित करें कि वहाँ कोई हवा बुलबुले यह microelectrode धारक में रखने से पहले कर रहे हैं. बुलबुले मौजूद हैं, तो धीरे बुलबुले को दूर करने के लिए एक उंगली के साथ microelectrode नल।
  3. देखभाल व्यायाम, मजबूती से ऊब छेद के माध्यम से धारक में इलेक्ट्रोड टांग धक्का. यदि अतिरिक्त तरल पदार्थ मौजूद है, यह एक ऊतक के साथ हटा दें.
  4. एम्पलीफायर जांच करने के लिए इलेक्ट्रोड धारक विधानसभा कनेक्ट. एक इलेक्ट्रोड परीक्षण आचरण, इनपुट ऑफसेट समायोजित, शून्य सेटिंग की पुष्टि करें और एम्पलीफायर मैनुअल के अनुसार जांच इनपुट रिसाव की जांच.
  5. सारणी 1में दर्शाए गए इलेक्ट्रोड परीक्षण का उपयोग करके इलेक्ट्रोड प्रतिरोध को मापें।
  6. ध्यान दें कि एक कार्य इलेक्ट्रोड चैनल आउटपुट पर 1 mV/M] की एक सकारात्मक डीसी वोल्टेज पारी प्रदर्शित करता है. दूसरी ओर, यदि चैनल आउटपुट और मीटर पर एक बड़ी वोल्टेज प्रकट होता है, तो यह एक अवरुद्ध या टूटइलेक्ट्रो को इंगित करता है।
  7. रिकॉर्डिंग सॉफ़्टवेयर खोलें, फ़ाइल को एक नाम असाइन करें और इसे किसी भंडारण सॉफ़्टवेयर में भावी विश्लेषण के लिए सहेजें.

3. अलगाव और मध्य सेरेब्रल धमनी के कैनुलेशन

  1. अभिकर्मकों की तैयारी.
    1. सारणी 2में वर्णित सामान्य एवं निम्न कैल्शियम शारीरिक लवण घोल (पीएसएस) तैयार कीजिये.
  2. मायोग्राफ तैयार करें।
    1. इसे मलबे से मुक्त रखने के लिए कई बार आसुत जल के साथ मायोग्राफ चैम्बर (सामग्री की तालिकादेखें) को कुल्ला करें। सामान्य पीएसएस के 5 एमएल के साथ कक्ष लोड करें।
    2. एक 5-10 एमएल सिरिंज का उपयोग कर फ़िल्टर किए गए सामान्य पीएसएस के साथ दोनों ग्लास cannulas भरें। ध्यान से किसी भी हवा बुलबुले शुरू करने के बिना पूरे cannula और संलग्न ट्यूबिंग भरें।
    3. एक आधा गाँठ प्रत्येक कुंद forceps का उपयोग कर के साथ दो monofilament नायलॉन टांके (10-0, 0.02 मिमी) तैयार करें।
    4. एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत विच्छेदन संदंश का उपयोग कर टिप से थोड़ा दूर दोनों cannulas पर आंशिक रूप से बंद सीवन समुद्री मील रखें. बाद में इन समुद्री मील से फिसल जाएगा और सावधानी से बर्तन को सुरक्षित करने के लिए cannulated धमनी समाप्त होता है पर बंधे.
  3. मध्य मस्तिष्क धमनी को अलग और छानना।
    1. एक स्प्रग Dawley चूहे में गहरी संज्ञाहरण प्रेरित 2-4% साँस isoflurane का उपयोग करके.
    2. गहरे संज्ञाहरण के तहत गिलोटिन का उपयोग करके चूहे को नष्ट करें।
    3. ध्यान से एक हड्डी कटर और एक कैंची का उपयोग कर खोपड़ी को हटा दें।
    4. खोपड़ी से मस्तिष्क निकालें और बर्फ पर कम कैल्शियम पीएसएस के 5 एमएल में जगह है।
    5. वसंत कैंची और संदंश का उपयोग कर मस्तिष्क से 100-200 डिग्री मीटर के एक आंतरिक व्यास के साथ चूहे मध्य मस्तिष्क धमनी (एमसीए) के एक unbranched खंड की पहचान और विच्छेदन।
    6. ठीक बलप्स का उपयोग कर ग्लास cannulas पर एमसीए माउंट और सामान्य पीएसएस युक्त मायोग्राफ में टांके कस द्वारा सुरक्षित.
    7. डिस्टल कैनुला को बंद करें ताकि एमसीए के भीतर कोई प्रवाह न हो।
    8. एक में लाइन दबाव ट्रांसड्यूसर के साथ नजर रखी जाएगी जो intraluminal दबाव के नियंत्रण के लिए अनुमति देने के लिए पीएसएस पकड़े एक जलाशय के लिए अंतर्वाह पिपेट कनेक्ट करें।
    9. एक चार्ज-युग्मित डिवाइस कैमरे का उपयोग कर cannulated एमसीए कल्पना (सामग्री की मेजदेखें) एक उल्टे माइक्रोस्कोप और एक इमेजिंग सॉफ्टवेयर पर घुड़सवार.
    10. एमसीए की अक्षीय लंबाई को अनुमानित लंबाई पर सेट करें जहां इसे न तो कठोर और न ही फ्लेसीड दिखाई देना चाहिए।
    11. 2 (95%) के साथ स्नान समाधान बराबर और सीओ2 (5%) 37 डिग्री सेल्सियस पर पर्याप्त ऑक्सीजन, तापमान प्रदान करने के लिए और 7.4 पर पीएच बनाए रखने के लिए।
  4. इम्पेल (सेल प्लाज्मा झिल्ली को कम करना) संवहनी चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं को।
    1. जमीन इलेक्ट्रोड कनेक्ट और यह मायोग्राफ के पीएसएस में डूबे रहते हैं।
    2. पोत कक्ष रोशन और स्नान समाधान में microelectrode की नोक कल्पना करने के लिए माइक्रोस्कोप के माध्यम से देखो.
      नोट: वैकल्पिक रूप से, एक एक इमेजिंग सॉफ्टवेयर वाले कंप्यूटर पर एमसीए और microelectrode कल्पना कर सकते हैं.
    3. रक्त वाहिका की बाहरी दीवार के करीब microelectrode की नोक ले जाने के लिए micromanipulator के नियंत्रण का उपयोग करें. micromanipulator और microelectrode की नोक ऊतक के संबंध में एक स्थिर स्थिति में होना चाहिए.
      नोट: प्रयोगों की शुरुआत से पहले, पुष्टि करें कि झिल्ली वोल्टेज स्थिर हो गया है. मापा वोल्टेज अस्थिर है, तो इलेक्ट्रोड और सेल के बीच कनेक्शन सील नहीं है, एक रिसाव का संकेत.
    4. रिकॉर्डिंग प्रारंभ करें.
    5. धीरे धीरे पोत की ओर microelectrode की नोक ले जाएँ, पाठ्यक्रम या micromanipulator के ठीक नियंत्रण का उपयोग कर पोत के केंद्र के लिए लक्ष्य.
      नोट: कभी कभी, रिकॉर्डिंग में एक छोटा सा विक्षेप देखा जा सकता है जब microelectrode टिप एक मांसपेशी फाइबर झिल्ली संपर्क.
    6. जब टिप पोत के करीब निकटता में आता है, एक तेजी से गति में आगे इलेक्ट्रोड अग्रिम micromanipulator का उपयोग करने के लिए मांसपेशियों की झिल्ली impale.
    7. इस बिंदु पर, एक दर्ज किया जा रहा है Vm में परिवर्तन देख शुरू कर सकते हैं. माइक्रोइलेक्ट्रोड कोशिका की झिल्ली को इम्पेल करने पर माइक्रोमैनिप्युलेटर को स्पर्श न करें।
      नोट: अभिलेखन तथा संदर्भ इलेक्ट्रोड के बीच वोल्टता में अंतर 0 उV से -40 उ.प्र. तथा -75 उद के बीच अंतरसंवहनी दाब अथवा अन्य उत्तेजक अथवा निरोधात्मक उद्दीपकों के स्तर पर घटता है। ये रीडिंग वर्तमान कोशिका के पारमेम्ब्रेन विभवांतर की विशेषता को अभिरूपित करती हैं।
    8. सटीक माप प्राप्त करने के लिए VSMCs को नुकसान पहुँचाए बिना पोत के विभिन्न क्षेत्रों में एक ही पोत पर कई impalements प्रदर्शन करते हैं।
    9. रिकॉर्डिंग के बाद, एक तेजी से आंदोलन में microelectrode को दूर करने के लिए manipulator का उपयोग करें.
    10. रिकॉर्डिंग बंद करो और आगे के विश्लेषण के लिए डेटा फ़ाइलों को बचाने के.

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Representative Results

प्रस्तुत विधि मज़बूती से cannulated जहाजों में वीमीटर रिकॉर्ड करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। मस्तिष्क से एमसीए को अलग करने के तरीके का वर्णन करने वाली एक संक्षिप्त प्रक्रिया चित्र 1कमें प्रस्तुत की गई है। खोपड़ी से मस्तिष्क को अलग करने के बाद, एमसीए को अलग कर दिया गया था और कम कैल्शियम पीएसएस युक्त एक पेट्री डिश में रखा गया था। कनेक्टीव ऊतक है कि संलग्न किया गया था का हिस्सा भी अलगाव के दौरान एमसीए को नुकसान को रोकने के लिए वसंत कैंची और forceps का उपयोग कर एमसीए के साथ विच्छेदन किया गया था. ध्यान से, संयोजी ऊतक भी हटा दिया गया था, और विच्छेदन एमसीए मायोग्राफ को स्थानांतरित करने के लिए तैयार था. एमसीए cannulas पर रखा गया था और मायोग्राफ में cannulas के दोनों सिरों पर सीवन समुद्री मील का उपयोग कर बंधे. चित्र 1खमें एक विशिष्ट सूक्ष्मविद्युत प्ररूप विधि सेटअप का योजनाबद्ध निरूपण दर्शाया गया है। 3 एम केसीएल से भरा एक माइक्रोइलेक्ट्रोड जांच में एक धारक के माध्यम से इलेक्ट्रोमीटर से जुड़ा हुआ था। इलेक्ट्रोमीटर का चैनल आउटपुट एक BNC-BNC केबल का उपयोग कर एक digitizer के एक एनालॉग इनपुट चैनल से जुड़ा था. डिजिटाइज़र आउटपुट आगे रिकॉर्डिंग सॉफ्टवेयर में संकेत कल्पना करने के लिए एक आस्टसीलस्कप से जुड़ा हुआ था. जमीन एक AgCl गोली तार है कि इलेक्ट्रोमीटर के चेसिस से मायोग्राफ में स्नान समाधान के लिए बढ़ाया गया था का उपयोग कर स्थापित किया गया है. अंत में, कंप्यूटर मॉनिटर पर रिकॉर्डिंग सॉफ़्टवेयर में डिजिटल ट्रैंश विज़ुअलाइज़ किए गए.

एमसीए तो ताजा तैयार गर्म पीएसएस में incubated था और 60 mmHg करने के लिए दबाव डाला गया था. केवल उन जहाजों का उपयोग किया गया जो गेन टोन का उपयोग वीएम रिकॉर्डिंग के लिए करते थे। पोत महत्वपूर्ण स्वर प्राप्त करने के बाद, microelectrode पोत की दीवार में उन्नत किया गया था. धमनी के धमनी व्यास और इम्पेलेशन को वीडियो माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके देखा गया था। जब ऋणात्मक मूल्यों में तीव्र विक्षेप होता है, तो दोष को सफल माना जाता है, ट $30 े के लिए स्थिर होता है, और वोल्टता चित्र 212,15में दर्शाए अनुसार इलेक्ट्रोड को हटाने पर 0 उV तक अचानक लौट तीज होती है। हमारे परिणामों का सुझाव है कि, एक एमसीए है कि 60 mmHg करने के लिए दबाव डाला है में, वीहै $ -43.2 - 2.9 mV.

एक सफल impalement और वीएम स्थिरीकरण के बाद, दवाओं है कि वीमीटर परिवर्तन स्नान में perfused थे और वीएम में परिवर्तन दर्ज किए गए थे. हम 20 एमएम KCl का इस्तेमाल किया depolarize और 20 डिग्री एम NS1619, एक सिंथेटिक बड़े चालकता पोटेशियम चैनल सलामी बल्लेबाज, झिल्ली hyperpolarize करने के लिए. हमारे परिणामों से पता चलता है कि केसीएल के साथ कक्ष के भ्रम ने झिल्ली को 5ण्8 र् 0ण्18 मी.वी. दूसरी ओर, NS1619 के साथ भ्रम ने झिल्ली को $3.8 से 0.4 mV तक बढ़ा दिया।

Figure 1
चित्र 1: मध्यम मस्तिष्क धमनियों के अलगाव और microelectrode impalement विधि का उपयोग कर झिल्ली क्षमता की रिकॉर्डिंग का एकउदाहरण. (ए) वसंत कैंची का उपयोग करते हुए, डॉटेड लाइनों के साथ मस्तिष्क या संयोजी ऊतक को काट दें। स्थानांतरण और दो गिलास cannulas के बीच एमसीए माउंट और पीएसएस से भरा मायोग्राफ कक्ष में टांके का उपयोग कर इसे सुरक्षित। () 3 एम केसीएल से भरा एक माइक्रोइलेक्ट्रोड धारक में डाला जाता है और जांच से जुड़ा होता है। एक BNC केबल के माध्यम से जांच से और digitizer करने के लिए transmembrane संभावित यात्रा में परिवर्तन (BNC केबल इलेक्ट्रोमीटर के चैनल उत्पादन से जुड़ा हुआ है और एक digitizer के एक एनालॉग इनपुट करने के लिए). डिजीटल क्षमता मॉनिटर पर रिकॉर्डिंग सॉफ्टवेयर में देखा जाता है. जमीन मायोग्राफ में स्नान समाधान करने के लिए इलेक्ट्रोमीटर से जुड़े एक AgCl गोली तार का उपयोग कर स्थापित किया गया है। एमसीए - मध्य मस्तिष्क धमनी; पीएसएस - शारीरिक नमक समाधान; AgCl - चांदी क्लोराइड. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: कैन्निटेड मध्य मस्तिष्क धमनियों से microelectrode impalement विधि का उपयोग कर झिल्ली क्षमता की रिकॉर्डिंग. Vmके प्रतिनिधि ट्रेस | यदि इलेक्ट्रोड प्रविष्टि पर ऋणात्मक मानों के लिए आकस्मिक विक्षेप है, तो दोष को सफल माना जाता है, ट $30 s के लिए स्थिर है, और इलेक्ट्रोड को हटाने पर वोल्टता अचानक 0 mV पर वापस आ जाती है। X-अक्ष समय का प्रतिनिधित्व करते हैं, और Y-अक्ष झिल्ली क्षमता का प्रतिनिधित्व करता है. डॉटेड लाइन पोत के impalement से पहले समायोजित आधार रेखा का प्रतिनिधित्व करता है। सेकसी सेकंड. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3: जब जहाजों को वाहिकासक्रिय एजेंटों के संपर्क में आने पर माइक्रोइलेक्ट्रोड इम्पेलेमेंट विधि का उपयोग करके झिल्ली की क्षमता में परिवर्तन ों की रिकॉर्डिंग। वीएम से पहले और vasoactive एजेंटों के संपर्क में आने के बाद cannulated मध्यम मस्तिष्क धमनियों से microelectrode impalement विधि का उपयोग कर दर्ज किया गया था. नमूना ट्रेस का प्रतिनिधित्व करता है () 20 एमएम केसीएल के जवाब में depolarization और (बी) 20 डिग्री एम NS1619 के जवाब में hyperpolarization एक बड़ी चालकता पोटेशियम चैनल एगोनिस्ट. (ग) केसीएल तथा एन एस 1619 के अनुप्रयोग से पहले और बाद में चमें परिवर्तनों का सारांश छड़ ग्राफ। डॉटेड रेखा आराम टका प्रतिनिधित्व करती है। कोष्ठक में संख्या अध्ययन में इस्तेमाल किया जहाजों की संख्या का प्रतिनिधित्व करता है. ध्यान दें कि वीएम के रूप में जल्द ही आधार रेखा तक पहुँच के रूप में दवा बाहर धोया जाता है. त्रुटि पट्टी माध्य की मानक त्रुटि का प्रतिनिधित्व करती है. सेकसी सेकंड. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

इलेक्ट्रोमीटर की सेटिंग्स इलेक्ट्रोड प्रतिरोध को मापने के लिए
मीटर इनपुट चैनल A या B
स्थिति टॉगल अंदर
मीटर रेंज टॉगल करने के लिए 200 एमवी
इलेक्ट्रोड स्नान में
मोड इलेक्ट्रोड परीक्षण के लिए संचालित करें
मीटर संकेत 1 एम वी/

तालिका 1: इलेक्ट्रोमीटर की सेटिंग्स इलेक्ट्रोड प्रतिरोध को मापने के लिए.

रसायन कम कैल्शियम पीएसएस एम एम सामान्य पीएसएस एम एम कंपनी कैटलॉग
1 Nacl 119.00 119.00 सिग्मा S7653
केसीएल 4.70 4.70 सिग्मा पी 4504
3 एमजीएसओ4 1.17 1.17 सिग्मा एम 7506
4 CaCl2 0.05 1.60 सिग्मा C3881
5 HEPES 5.00 5.00 सिग्मा H7006
6 ग्लूकोज १०.०० १०.०० सिग्मा जी7021
7 नाह2पीओ4 1.18 1.18 सिग्मा S0751
8 नाHको3 18.00 18.00 सिग्मा S5761
पीएच: 7.4 पीएच: 7.4

तालिका 2: कम कैल्शियम और सामान्य शारीरिक नमक समाधान की तैयारी में इस्तेमाल अभिकर्मकों.

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Discussion

यह आलेख एक cannulated पोत तैयारी से Vm रिकॉर्ड करने के लिए एक तेज microelectrode impalement विधि का उपयोग करने के लिए कैसे पर आवश्यक चरण प्रदान करता है। इस विधि को व्यापक रूप से प्रयोग किया जाता है, और वीएम की उच्च गुणवत्ता, लगातार रिकॉर्डिंग प्रदान करता है जो प्रयोगात्मक प्रश्नों की एक विस्तृत श्रृंखला का उत्तर देते हैं।

विधि की सफलता सुनिश्चित करने के लिए कुछ महत्वपूर्ण विचार और समस्या निवारण चरण यहाँ वर्णित हैं. माइक्रोइलेक्ट्रोड की गुणवत्ता (इसके तीखेपन और प्रतिरोध) और सेलुलर प्रक्रिया यह प्रवेश करता है, जो टकी स्थिरता और सटीकता को प्रभावित करता है। संकेत लगातार drifts या एम्पलीफायर की रिकॉर्डिंग रेंज के ऊपर या नीचे है, तो यह इलेक्ट्रोड अवरुद्ध है कि सबसे अधिक संभावना है, या टिप टूट गया है। यदि impalement केवल आंशिक है, अपर्याप्त, या नुकसान सेल, दर्ज की गई क्षमता वापस चढ़ जाता है 0 mV एक अस्थिर संकेत या कोई संकेत में जिसके परिणामस्वरूप. कुछ मामलों में, सेल की सामग्री भी बहुत उच्च प्रतिरोध इलेक्ट्रोड ब्लॉक कर सकते हैं. इन सभी समस्याओं को केवल एक नया एक के साथ इलेक्ट्रोड की जगह से दूर किया जा सकता है.

सफल impalement के लिए, एक यह सुनिश्चित करना चाहिए कि कोशिका झिल्ली की कुल प्रतिरोध unaltered है, और मापा झिल्ली क्षमता इलेक्ट्रोड और झिल्ली के बीच कोई लीक के साथ स्थिर है. यह महत्वपूर्ण है कि इलेक्ट्रोड एक स्थिर micromanipulator द्वारा सेल की ओर उन्नत है. जब सेल के कुछ micrometers के भीतर करने के लिए उन्नत, टिप क्षमता का पता चला वोल्टेज में एक मामूली विक्षेप में जिसके परिणामस्वरूप बदल जाएगा. इलेक्ट्रोड या कोशिका झिल्ली की खींच की नोक को नुकसान पहुंचाने से बचने के लिए, इलेक्ट्रोड की तेजी से प्रगति की आवश्यकता है। सफल impalement झिल्ली क्षमता में एक तेजी से गिरावट के बाद झिल्ली के आराम क्षमता के आसपास एक स्थिरीकरण द्वारा विशेषता है. यदि संभावित पढ़ने में उतार-चढ़ाव होता है, तो यह संभव है कि इलेक्ट्रोड की नोक ने झिल्ली को बाधित किया है जिससे कोशिका में सोडियम लीक हो जाता है और कोशिका से बाहर निकलने के लिए पोटेशियम होता है, जिसके परिणामस्वरूप प्रगतिशील विध्रुवण हो जाता है। इस विधि में एक और समस्या यह है कि जंक्शन क्षमता और इलेक्ट्रोड टिप क्षमता Vm रिकॉर्डिंग करने के लिए एक अनावश्यक कलाकृति जोड़ सकते हैं. जंक्शन क्षमता तब होती है जब भिन्न कंडक्टर संपर्क में आते हैं। दो अलग-अलग प्रकार की संधि क्षमताएं, द्रव-धातु और द्रव-तरल होते हैं। तरल धातु जंक्शनों का गठन कर रहे हैं जब जांच की नोक micropipette में इलेक्ट्रोलाइट संपर्क. तरल-तरल संधि, जिन्हें द्रव संधि विभव भी कहा जाता है, तब होते हैं जब अलग-अलग सांद्रता के दो समाधान संपर्क में आते हैं। विलयनों के बीच आयनों का विसरण विभव के विकास में योगदान देता है। इसके अलावा, तरल के साथ बातचीत कांच इलेक्ट्रोड टिप के गुण टिप क्षमता उत्पन्न कर सकते हैं। जंक्शन के साथ ही टिप क्षमता को कम करने के लिए, स्नान में मापा क्षमता zeroing अवांछित पूर्वाग्रह को कम कर सकता है. नपुंसकता के दौरान, कोई इस संभावना से इंकार नहीं कर सकता कि एंडोथेलियल, चिकनी मांसपेशियों के बजाय, वीएम को कुछ प्रयोगों में अनजाने में नमूना दिया जा सकता है। तथापि, अध्ययनों से पता चलता है कि एंडोथेलियम और वीएसएमसी परतें विद्युत रूप से छोटे धमनी ओंचियों में युग्मित होती हैं और समान वी अनुक्रियाओं23का प्रदर्शन करती हैं।

अंततः, इस प्रक्रिया में तीन कदम सफल रिकॉर्डिंग प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण हैं. सबसे पहले, जहाजों को उचित रूप से तैयार किया जाना चाहिए, यह सुनिश्चित करना कि वे इस प्रक्रिया में क्षतिग्रस्त नहीं हैं। दूसरा, microelectrodes सही बिजली के गुणों के लिए खींच लिया जाना चाहिए. अंत में, टिप को तोड़ने के बिना झिल्ली के तेजी से impalement सटीक परिणाम के लिए महत्वपूर्ण है. अन्वेषक electrophysiology समझना चाहिए, कैसे व्यवहार्य microelectrodes बनाने के लिए, और कैसे स्थापित करने के लिए और एक electrometer का उपयोग करें.

इसके महत्व के बावजूद, इस विधि की विभिन्न सीमाएं हैं। सबसे पहले, सभी उपकरणों की खरीद के लिए कुल लागत उच्च है ($30-40,000). दूसरा, इन सभी प्रयोगों के लिए नए जहाजों की आवश्यकता है; इसलिए एक जानवर प्रत्येक प्रयोग के लिए ethanized है, कुल लागत को जोड़ने. तीसरा, मस्तिष्क धमनियों के विच्छेदन, जहाजों के cannulation थकाऊ, महंगा है और एक सीखने की अवस्था है. चौथा, microelectrodes की तैयारी, impalement, और रिकॉर्डिंग Vm इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी की एक पूरी तरह से समझ की आवश्यकता है. अंत में, प्रयोगशाला में इस स्थापित स्थापित करने के लिए समर्पित कर्मचारियों, समय और प्रयास की आवश्यकता है.

Vm एक आवश्यक इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल गुण है जो संवहनी टोन को निर्धारित करता है और इस प्रकार किसी अंग में रक्त प्रवाह को निर्धारित करता है। वीएम कई vasoactive रसायनों है कि न्यूरॉन्स, endothelium और रक्त घटकों से जारी कर रहे हैं द्वारा बदला जा सकता है. जबकि वाहिकासंकीर्णक झिल्ली को विध्रुवित करते हैं, विस्फारक झिल्ली को अतिध्रुवित करते हैं। के+ चैनल, वीजीसीसी, सोडियम पोटेशियम ATPasse, Ca2 + ATPase, सीएलचैनल, स्टोर संचालित और खिंचाव चैनलों सहित कई प्रोटीन वीएमको विनियमित . रोग की स्थिति में इन प्रोटीन में से किसी में परिवर्तन संभवतः वीमीटर और इस तरह संवहनी टोन और रक्त प्रवाह को बदल सकता है. माइक्रोइलेक्ट्रोड इम्पेमेंट विधि vasoconstrictors और dilators के जवाब में आराम के साथ-साथ Vm में परिवर्तन रिकॉर्ड करने के लिए उपयोगी है। इसलिए, इस विधि का उपयोग रोग से जुड़े सामान्य और परिवर्तित वीएम को समझने के लिए मज़बूती से किया जा सकता है, और वीएम,संवहनी टोन और रक्त प्रवाह को व्यवस्थित करने के लिए डिज़ाइन किए गए औषधीय एजेंटों के विकास में उपयोगी हो सकता है।

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Disclosures

लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

इस काम के भाग में UMMC से Intramural समर्थन अनुसंधान कार्यक्रम (IRSP) से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था, AHA वैज्ञानिक विकास अनुदान (13SDG14000006) मल्लिकार्जुन आर Pabbidi को सम्मानित किया.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dissection instruments
Aneshetic Vaporiser Parkland scientific V3000PK
Dissection microscope Nikon Instruments Inc., NY Eclipse Ti-S
Kleine Guillotine Type 7575 Harvard Apparatus, MA 73-198
Littauer Bone Cutter Fine science tools 16152-15
Moria MC40 Ultra Fine Forceps Fine science tools 11370-40
Surgical scissors Sharp-Blunt Fine science tools 14008-14
Suture Harvard Apparatus 72-3287
Vannas Spring Scissors Fine science tools 15018-10
Electrophysiology Instruments
Charge-coupled device camera Qimaging, , BC Retiga 2000R
Differential electrometer amplifier WPI FD223A
In-line pressure transducer Harvard Apparatus, MA MA1 72-4496
Micromanipulator Thor labs PCS-5400
Microelectrodes Warner Instruments LLC, CT G200-6,
Micro Fil (Microfiber syringe) WPI MF28G67-5
Microelectrode holder WPI MEH1SF
Myograph Living Systems Instrumentation, VT CH-1-SH
Puller Sutter Instrument, San Rafael, CA P-97
Vibration-free table TMC 3435-14
Softwares
Clampex 10 Molecular devices
p Clamp 10 Molecular devices
Imaging software Nikon, NY NIS-elements
Chemicals
NaCl Sigma S7653
KCl Sigma P4504
MgSO4 Sigma M7506
CaCl2 Sigma C3881
HEPES Sigma H7006
Glucose Sigma G7021
NaH2PO4 Sigma S0751
NaHCO3 Sigma S5761

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References

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