Effetto dell'anticorpo Anti-c-fms sulla formazione degli osteoclasti e la proliferazione dei precursori degli osteoclasti In Vitro

Immunology and Infection

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Summary

Questo protocollo comprende dissezione delle ossa lunghe murine e isolamento del midollo osseo, per generare i macrofagi del midollo osseo e producono gli osteoclasti usando fattore (M-CSF) e attivatore del ricevitore del legante di fattore nucleare Kappa-B (RANKL) di stimolazione della Colonia del macrofago o fattore di necrosi tumorale alfa (TNF-α) e loro arresto dall'anticorpo anti-c-fms, ricevitore di M-CSF.

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Marahleh, A., Kitaura, H., Ishida, M., Shima, K., Kishikawa, A., Ogawa, S., Shen, W. R., Qi, J., Ohori, F., Noguchi, T., Nara, Y., Mizoguchi, I. Effect of Anti-c-fms Antibody on Osteoclast Formation and Proliferation of Osteoclast Precursor In Vitro. J. Vis. Exp. (145), e59089, doi:10.3791/59089 (2019).

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Abstract

Rimodellamento osseo è un processo complesso e coinvolge periodi di deposizione e di riassorbimento. Riassorbimento dell'osso è un processo mediante il quale osso è ripartito dagli osteoclasti in risposta a stimoli diversi. Precursori degli osteoclasti differenziano in osteoclasti multinuclear in risposta al fattore (M-CSF) e attivatore del ricevitore del legante di fattore nucleare Kappa-B (RANKL) di stimolazione della Colonia del macrofago. In circostanze patologiche, il profilo di citochina è diverso e coinvolge una miscela di citochine infiammatorie. Fattore di necrosi tumorale alfa (TNF-α) è una delle più importanti citochine come si trova in grandi quantità nelle aree coinvolte con osteolysis infiammatorio. Lo scopo del presente protocollo è quello di fornire un metodo mediante il quale midollo osseo murino è isolato per generare osteoclasti attraverso induzione con M-CSF e RANKL o TNF-α, che verrà successivamente inibita aumentando le dosi dell'anticorpo anti-c-fms, il recettore per M-CSF. Questo esperimento evidenzia il valore terapeutico dell'anticorpo anti-c-fms in malattie di riassorbimento infiammatorio dell'osso.

Introduction

Gli osteoclasti sono cellule altamente specializzate, e si differenziano da cellule staminali ematopoietiche attraverso la fusione di più precursori degli osteoclasti. Essi sono essenziali per il rimodellamento del tessuto osseo sano e contribuire al riassorbimento osseo patologico associato a malattie osteolitiche infiammatorie come l'artrite reumatoide e la malattia parodontale1.

Funzione di osteoclastogenesi e degli osteoclasti sono mediati da due fattori chiave; fattore (M-CSF) e attivatore del ricevitore del legante di fattore nucleare kappa-B (RANKL) di stimolazione della Colonia del macrofago. Sia M-CSF e RANKL sono importanti per la differenziazione di osteoclasto2. Un altro fattore che è stato indicato per indurre la formazione di osteoclasti da macrofagi del midollo osseo in vitro è il fattore di necrosi tumorale alfa (TNF-α)3,4,5. TNF-α formazione mediata degli osteoclasti è stato indicato per essere critico per osteolisi in malattie ossee distruttive come artrite reumatoide6, malattia parodontale7e8di osteoporosi postmenopausale.

C-fms è il recettore di membrana di M-CSF e media la sua azione. Il ruolo di c-fms è ben documentato nella letteratura come è stato dimostrato che la somministrazione di un anticorpo contro c-fms (anticorpo anti-c-fms) completamente arrestato osteoclastogenesis in un modello di artrite come pure in TNF-α ha indotto le erosioni dell'osso mentre osteoclastogenesis lontano dall'articolazione infiammata era ancora robusto9. La somministrazione dell'anticorpo anti-c-fms ha inibito osteoclasto formazione e riassorbimento osseo indotto dal lipopolysaccharide (LPS) in mouse calvariae10 pure come LPS indotta periodontitis modello11. Inoltre, l'anticorpo anti-c-fms ha inibito il riassorbimento della radice indotta da stress meccanico durante di movimento ortodontico del dente12, come pure il movimento ortodontico del dente e riassorbimento osseo associato di movimento ortodontico del dente13.

M-CSF è stato segnalato per avere altre funzioni che sono essenziali per la risposta immunitaria. L'assenza di M-CSF in topi op/op con polmonite batterica portare all'aumento della carica batterica e la diffusione batterica al fegato con necrosi epatica14. Pertanto, M-CSF è importante per la risposta immunologica nella protezione dall'infezione.

Questo studio dimostra l'effetto dell'anticorpo anti-c-fms su M-CSF e RANKL o TNF-α ha indotto la formazione degli osteoclasti in vitro e M-CSF ha indotto la proliferazione dei precursori degli osteoclasti. Questo protocollo viene illustrato l'isolamento delle cellule del midollo osseo murino da ossa lunghe e i passaggi per generare i macrofagi di midollo osseo (BMM) che sono considerati come precursori degli osteoclasti e per indurre la differenziazione delle BMM in osteoclasti multinuclear da due Metodi; RANKL o TNF-α. Il protocollo confronta anche l'arresto di osteoclastogenesi in entrambi i metodi usando l'anticorpo anti-c-fms.

Il processo mediante il quale midollo osseo viene estratta e successivamente utilizzato per generare precursori degli osteoclasti è affidabile nella produzione di grandi quantità di culture osteoclast puro che possono essere utilizzate in molteplici applicazioni a valle come test anti-droga. L'uso di RANKL o TNF-α per indurre il osteoclastogenesi in questo protocollo distingue osteoclastogenesi come un processo fisiologico (RANKL) da osteoclastogenesis come un processo patologico (TNF-α), che a sua volta prevede due procedure alternative per guidare la decisione di cui uno è superiore in termini di reagenti da utilizzare in applicazioni a valle. Questo protocollo fornisce inoltre un metodo mediante il quale possiamo determinare un'adeguata concentrazione di anticorpo anti-c-fms che può essere tranquillamente utilizzato per gli studi successivi coinvolti nel riassorbimento dell'osso e malattie osteolitiche.

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Protocol

Tutte le procedure di animale e cura degli animali sono state eseguite secondo norme e regolamenti di Università di Tohoku.

1. manipolazione e dissezione murino Hindlimb

  1. Prima della dissezione, riempire un piatto con circa 50 mL di α-MEM a seconda delle dimensioni del contenitore e collocarlo sul ghiaccio. Questo servirà come un contenitore di raccolta fino al completamento della dissezione di tutte le ossa. Per questo e i successivi esperimenti, utilizzare α-MEM contenente 10% siero bovino fetale (FBS), 100 UI/mL di penicillina G e 100 μg/mL di streptomicina.
  2. Eutanasia del mouse C57Bl/6J per inalazione di una dose eccessiva di 5% isoflurane.
  3. Difficoltà il mouse in posizione supina con perni trafitto le palme e piedi e spruzzo accuratamente con etanolo al 70%.
  4. Fare un'incisione della pelle utilizzando forbici chirurgiche sterili e pinzette a livello dell'anca ed estenderlo fino ai piedi, esponendo i muscoli.
  5. Tagliare il tendine allegando il muscolo quadricipite ed il tendine di associare il muscolo bicipite femorale fino all'osso. Togliere i muscoli esponendo le articolazioni di anca e di ginocchio. Individuazione di questi tendini faciliterà liberando entrambi i muscoli da loro allegati senza lasciare tag dei tessuti molli. Non tagliare l'osso.
  6. Posizionare la forbice tra la testa del femore e spazio articolare e tagliati in essa liberando il femore ma mantenendo intatto l'osso. Ciò consentirà il distacco delle ossa senza il rischio di esporre il midollo osseo.
  7. Allo stesso modo tagliare via i muscoli allegare alla tibia. Tagliare la tibia gratis dal relativo collegamento all'articolazione della caviglia mantenendo intatto per evitare la contaminazione dell'osso.
  8. Raschiare eventuali tessuti molli rimanenti dal femore e tibia utilizzando le forbici lame e kimwipe e metterlo in un piatto con α-MEM posizionato su ghiaccio.

2. murino Hindlimb del midollo osseo isolamento

  1. Riempire una siringa ago 30g con α-MEM.
  2. Scollegare la tibia e femore dall'articolazione del ginocchio.
  3. Tagliare le estremità delle ossa lunghe da entrambi i lati con le forbici.
  4. Tenere l'osso dall'albero con una pinzetta, inserire l'ago nello spazio del midollo dell'osso e lentamente svuotare il contenuto del midollo in una piastra di coltura di 6 cm. L'osso apparirà bianca, che indica l'estrazione di tutto il contenuto del midollo osseo. Ripetere per tutte le ossa.
  5. Ceppo il midollo osseo estrarre utilizzando un colino di cella di 40 μm in nylon in una provetta conica per centrifuga da 50 mL e centrifugare a 300 x g per 5 min.
  6. Eliminare il supernatante, lavare con 5 mL di α-MEM e centrifugare a 300 x g per 5 min lavaggio ripetere per un totale di 2 volte.
  7. Risospendere il pellet in 10 mL di α-MEM ed eseguire un conteggio delle cellule usando un emocitometro come segue:
    1. Fai una diluizione di 1:1 di sospensione cellulare aggiungendo 10 µ l di sospensione cellulare a 10 μL di 0,4% trypan blu in una provetta da 1,5 mL e dispensare una volta.
    2. Coprire l'emocitometro camera con una diapositiva e trasferire la sospensione di tintura l'emocitometro. È importante non sovraccaricare o sovra la camera e consentire la sospensione fino a riempire la camera per azione capillare.
    3. Posto l'emocitometro su una fase di microscopio. Utilizzando obiettivo 10x, concentrarsi sulla Piazza del centro. Contare tutte le celle vincolate da 3 linee. Per assicurarsi che le celle non vengono conteggiate due volte, contare gli angoli superiori e destro di ogni quadrato. Le cellule morte apparirà blu scuro, questi sono esclusi dal conteggio.
  8. A seconda dell'applicazione a valle, le cellule del seme in un vaso di coltura appropriato. Per questo particolare esperimento, seguire la sezione 3.

3. generazione di BMM

  1. Semi 1 x 107 cellule/10 mL in un 10cm cultura piatto e aggiungere M-CSF 100 ng/mL. La concentrazione finale di M-CSF è 100 ng/mL di terreno di coltura. Incubare la coltura a 37 ° C, 5% CO2 per 3 giorni.
  2. Dopo 3 giorni, rimuovere il terreno di coltura, lavare le cellule vigorosamente con 10 mL di tampone fosfato salino (PBS) due volte per rimuovere le cellule non-aderenti, aggiungere 5 mL di tripsina EDTA 0.02% temperatura ambiente in PBS e incubare a 37 ° C, 5% CO2 per 5 min.
  3. Staccare le cellule pipettando approfondita. Assicurarsi che le celle siano state staccate osservando la cultura sotto un microscopio (le cellule dovrebbero apparire arrotondato e galleggiante in media). Se le cellule rimangono attaccate, ripetere accuratamente il pipettaggio per staccarli. Quando le cellule sono state staccate, aggiungere 5 mL di α-MEM per inattivare la reazione.
  4. Raccogliere le cellule in una provetta conica da 50 mL e centrifugare a 300 x g per 5 min, scartare il surnatante e lavare con 5 mL di α-MEM.
  5. Centrifugare a 300 x g per 5 min e risospendere il pellet in 10 mL di α-MEM.
  6. Eseguire un conteggio delle cellule come precedentemente descritto al punto 2.7.1.
  7. Semi 1 x 106 cellule/10 mL in un 10cm cultura piatto e aggiungere M-CSF 100 ng/mL. La concentrazione finale di M-CSF è 100 ng/mL di terreno di coltura. Incubare la coltura a 37 ° C, 5% CO2 per 3 giorni.

4. generazione di osteoclasti da BMM come precursori degli osteoclasti

  1. Dopo 3 giorni, raccogliere le cellule allegate che rappresentano BMM come precursori degli osteoclasti, seguendo passaggi 3.2-3.7.
  2. BMM seme a 5 x 104 cellule/200 μL di α-MEM in un piatto ben 96. Aggiungere RANKL per una concentrazione finale di 50 ng/mL o TNF-α per una concentrazione finale di 100 ng/mL. Aggiungi M-CSF per una concentrazione finale di 100 ng/mL in ciascun pozzetto.
  3. Aggiunta dell'anticorpo anti-c-fms (concentrazioni finali di 0, 1, 10, 100, 1000 ng/mL) ad ogni pozzetto.
  4. Incubare a 37 ° C, 5% CO2 per 4 giorni. Cambiare supporto ogni altro giorno per 4 giorni.

5. macchia di fosfatasi acida tartrato-resistente (TRAP)

  1. Dopo 4 giorni di incubazione, aspirare delicatamente il terreno di coltura di ciascun pozzetto. Lavare ogni bene una volta con 200 μL di PBS 1X temperatura ambiente.
  2. Aggiungere 200 μL di formalina al 10% ad ogni pozzetto per la fissazione e incubare per 1 h a temperatura ambiente. La formalina di aspirare e lavare ogni pozzetto 3 volte con acqua deionizzata.
  3. Aggiungere 200 μL di 0,2% Triton X-100 in PBS a ciascuno per permeabilizzazione ed incubare per 1 h a temperatura ambiente. il X-100 Triton di aspirare e lavare ogni pozzetto 3 volte con acqua deionizzata.
  4. Aggiungere 200 μL di soluzione di macchia di trappola ad ogni pozzetto. Visualizzare la macchia sotto il microscopio. Ci vorranno da 10-30 min per la macchia a svilupparsi correttamente.
  5. Aspirare la macchia e lavare ciascun pozzetto con acqua deionizzata 3 volte ed asciugare all'aria. Conservare a temperatura ambiente per utilizzare in ulteriore osservazione.

6. analisi di proliferazione

  1. BMM seme come precursori degli osteoclasti a 5 x 103 celle/200 μL di α-MEM in un piatto ben 96. Aggiungi M-CSF per una concentrazione finale di 100 ng/mL in ciascun pozzetto.
  2. Aggiunta dell'anticorpo anti-c-fms (concentrazioni finali di 0, 1, 10, 100, 1.000 ng/mL) e incubare a 37 ° C, 5% CO2 per 3 giorni senza cambiamento medio.
  3. Dopo 3 giorni, lavare le cellule con PBS 1X. Aggiungere 100 μL di α-MEM in ciascun pozzetto.
  4. Aggiungere 10 μL di soluzione di kit di conteggio delle cellule e incubare a 37 ° C, 5% CO2 per 2 h e determinare l'assorbanza di ciascun pozzetto a 450 nm utilizzando un lettore di micropiastre.

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Representative Results

Lo scopo del presente protocollo è di valutare l'effetto dell'anticorpo anti-c-fms sulla formazione degli osteoclasti in presenza di RANKL o TNF-α e di determinare l'effetto di M-CSF sulla proliferazione dei precursori degli osteoclasti. In questo protocollo, abbiamo fornito un affidabile processo mediante il quale vengono generate grandi quantità di culture osteoclast puro. Abbiamo anche fornito un modo per testare l'anticorpo anti-c-fms concentrazione adatto per inibire la formazione di osteoclasti sotto differenti condizioni di coltura.

La formazione degli osteoclasti in M-cultura CSF + RANKL con anticorpo anti-c-fms è illustrato nella Figura 1. A 1, 10 ng/mL di un anticorpo anti-c-fms, non c'era nessuna diminuzione significativa del numero degli osteoclasti rispetto al controllo (0 ng/mL). Mentre a 100, 1.000 dell'anticorpo di anti-c-fms ng, c'era una diminuzione significativa del numero degli osteoclasti rispetto al controllo. La formazione degli osteoclasti nella cultura di M-CSF + TNF-α con l'anticorpo anti-c-fms è illustrata nella Figura 2. A 1 ng/mL di un anticorpo anti-c-fms, non c'era nessuna diminuzione significativa del numero degli osteoclasti rispetto al controllo (0 ng/mL). Mentre a 10, 100, 1.000 ng/mL di un anticorpo anti-c-fms, c'era una diminuzione significativa del numero degli osteoclasti rispetto al controllo.

Cultura di precursori degli osteoclasti con anticorpo M-CSF + anti-c-fms è illustrato nella Figura 3. A 1, 10, 100 ng/mL, non c'era nessuna diminuzione significativa nel numero dei precursori degli osteoclasti rispetto al controllo (0 ng/mL), mentre a 1.000 ng/mL, c'era una diminuzione significativa del numero dei precursori degli osteoclasti rispetto al controllo. Questo indica che una concentrazione alta quanto 1.000 ng/mL è necessaria per inibire significativamente la proliferazione dei precursori degli osteoclasti.

Questi risultati forniscono informazioni circa la natura robusta di RANKL nella produzione di osteoclasti mentre una concentrazione di 50 ng/mL di RANKL è stata usata, e una concentrazione di 100 ng/mL di TNF-α è stato necessario per ottenere lo stesso numero degli osteoclasti. Entrambi questi metodi sono adatti per la generazione degli osteoclasti, ma la cui decisione è superiore dipende dall'applicazione a valle nel contesto dei reagenti da utilizzare successivamente. Come indicano i risultati, utilizzando RANKL non è l'equivalente dell'utilizzo di TNF-α per generare gli osteoclasti.

In questo protocollo, abbiamo utilizzato l'anticorpo anti-c-fms per inibire osteoclastogenesis e guardando i risultati, troviamo che una concentrazione di 100 ng/mL di anticorpo anti-c-fms è stato necessarie per produrre una diminuzione significativa nel numero degli osteoclasti in pozzi RANKL. Una concentrazione di 1.000 ng/mL di anticorpo anti-c-fms era necessaria per inibire la proliferazione dei precursori degli osteoclasti in analisi di proliferazione MCSF, mentre una concentrazione di solo 10 ng/mL di anticorpo anti-c-fms era necessario per produrre una diminuzione significativa in osteoclasti numero di pozzi di TNF-α.

Figure 1
Figura 1: effetto dell'anticorpo anti-c-fms su formazione indotta da RANKL osteoclasto. Osservazione al microscopio dei precursori degli osteoclasti che sono stati trattati con M-CSF, RANKL e vari dose di anticorpo anti-c-fms (0, 1, 10, 100 e 1.000 ng/mL) per 4 giorni. Le cellule erano fissi e macchiate con trappola di colorazione. Numero delle cellule positive-trappola coltivate con M-CSF, RANKL e varie concentrazioni di anticorpi anti-c-fms (0, 1, 10, 100 e 1.000 ng/mL) per 4 giorni. Le cellule erano fissi e macchiate con trappola di colorazione. Il numero delle cellule positive-trappola è stato valutato. Risultati sono stati espressi come media ± S.D. di quattro culture. Le differenze statistiche sono state rilevate tramite test di Scheffe (n = 4; * p < 0.01). Scala bar = 200 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: effetto dell'anticorpo anti-c-fms su formazione di osteoclasti indotta da TNF-α. Osservazione al microscopio dei precursori degli osteoclasti che sono stati trattati con M-CSF, TNF-α e vari dose di anticorpo anti-c-fms (0, 1, 10, 100 e 1.000 ng/mL) per 4 giorni. Le cellule erano fissi e macchiate con trappola di colorazione. Numero delle cellule positive-trappola coltivate con M-CSF, TNF-α e le varie concentrazioni di anticorpi anti-c-fms (0, 1, 10, 100 e 1.000 ng/mL) per 4 giorni. Le cellule erano fissi e macchiate con trappola di colorazione. Il numero delle cellule positive-trappola è stato valutato. Risultati sono stati espressi come meanv ± S.D. di quattro culture. Le differenze statistiche sono state rilevate tramite test di Scheffe (n = 4; * p < 0.01). Scala bar = 200 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: effetto dell'anticorpo anti-c-fms sulla proliferazione dei precursori degli osteoclasti. Cellula attuabilità dei precursori degli osteoclasti che sono stati trattati con M-CSF e vari dose di anticorpo anti-c-fms (0, 1, 10, 100 e 1.000 ng/mL) per 3 giorni. Cellula contando kit-8 è stata usata per misurare la redditività. I dati sono presentati come una percentuale per confrontare l'attività relativa dei pozzetti contenenti M-CSF + anti-c-fms contro i pozzetti contenenti M-CSF da sola ed espressi come media ± S.D. di quattro culture. Le differenze statistiche sono state rilevate tramite test di Scheffe (n = 4; * p < 0.01). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

In questo studio, abbiamo studiato l'effetto dell'anticorpo anti-c-fms sulla formazione degli osteoclasti RANKL-indotta, formazione di osteoclasti indotta da TNF-α e la proliferazione dei precursori degli osteoclasti M-CSF-indotto. Abbiamo trovato che la quantità effettiva di anticorpo anti-c-fms per l'inibizione dell'osteoclastogenesi tra formazione di osteoclasti RANKL-indotta, TNF-α indotto da osteoclasto formazione e M-CSF-indotto di proliferazione dei precursori degli osteoclasti è diversa.

RANKL media osteoclastogenesis in presenza di M-CSF in vitro e topi RANK-null esperienza osteopetrosis severo dovuto il guasto degli osteoclasti di sviluppare15, così RANKL è una citochina obbligatoria per osteoclastogenesis e ha un importante ruolo regolatore dell'omeostasi dell'osso. Pertanto, se la formazione di osteoclasti RANKL-indotta può essere controllato, la diminuzione nell'osso massa può essere controllato. Tuttavia, in caso di eccessiva soppressione, omeostasi dell'osso non verrà mantenuto. In questo esperimento, indichiamo che l'anticorpo anti-c-fms deve essere al alta concentrazione 100 ng/mL per essere in grado di diminuire la formazione di osteoclasti indotta da RANKL.

TNF-α formazione mediata degli osteoclasti è stato indicato per essere critico per osteolisi in distruttiva dell'osso malattie come l'artrite reumatoide6, malattia parodontale7e osteoporosi postmenopausale8 e qui vi mostriamo quello anti-c-fms anticorpo facilmente può inibire la formazione di osteoclasti mediata da TNF-α a bassa concentrazione di 10 ng/mL. Il risultato suggerisce che una bassa concentrazione di anticorpi anti-c-fms potrebbe essere di valore terapeutico per ridurre il processo di osteoclastogenesi in condizioni patologiche, ma avrebbe un effetto minimo sulle osteoclastogenesis in condizioni normali.

M-CSF è un fattore chiave per la formazione degli osteoclasti come i topi op/op che mancano Csf1 il gene che codifica per spettacolo di M-CSF un fenotipo osteopetrotic a causa della completa mancanza di osteoclasti16. M-CSF promuove anche la sopravvivenza dell'osteoclasto precursori2. Livelli di M-CSF sono aumentati nel siero dei pazienti con l'artrite reumatoide che hanno grave spondilite anchilosante17 e nel liquido sinoviale intorno protesi articolari sciolti18. TNF-α aumenta il numero di osteoclasto precursori in vivo a seguito di indurre l'espressione genica in cellule stromal9di M-CSF. Alla luce di questi dati possiamo concludere che M-CSF è un importante mediatore di infiammazione a causa dell'impatto di TNF-α sulle cellule stromale che provoca un aumento della produzione di M-CSF da queste cellule.

È stato segnalato che M-CSF svolge un ruolo importante nella risposta immunitaria ospite quali funzioni antimicrobiche dei fagociti mononucleari fegato e polmone durante la polmonite14. Pertanto, in caso di eccessiva soppressione di M-CSF, c'è una possibilità che farà diminuire la risposta immunitaria. In questo esperimento, abbiamo mostrato che un'altissima concentrazione di anticorpi anti-c-fms (1.000 ng/mL) era necessario inibire sopravvivenza precursori degli osteoclasti e la proliferazione mediata da M-CSF. Questi risultati presi di fianco a fianco indicano che gli anticorpi anti-c-fms potrebbero funzionare come un terapeutico per arrestare osteoclastogenesi in TNF-α indotto da malattie osteolitiche a bassa concentrazione, allo stesso tempo da che questa concentrazione risparmieremo formazione degli osteoclasti indotta RANKL e M-CSF, che consentirà per l'osso che ritocca per verificarsi.

Fasi critiche nel protocollo devono essere eseguite con attenzione per garantire il successo dell'esperimento. All'inizio del protocollo durante la dissezione, è importante evitare di tagliare l'osso per evitare la contaminazione del midollo osseo. Nel processo di estrazione del midollo osseo, per garantire che tutti del midollo osseo sono stati estratti, la procedura di lavaggio deve essere ripetuta al bisogno fino a quando sono stati estratti tutti del midollo osseo, che fornirà un alto rendimento delle celle. Questo protocollo può essere utilizzato in molteplici applicazioni a valle, come reagente test, e fornisce inoltre un modo attraverso il quale la concentrazione di anticorpi anti-c-fms può essere testata evitando falsa interpretazione dei risultati. Come abbiamo mostrato, la concentrazione di anticorpi anti-c-fms che era necessaria per inibire la formazione di osteoclasti non è uguale tra i metodi di cui gli osteoclasti sono stati ottenuti (RANKL o TNF-α), hanno così eventuali risultati ottenuti per quanto riguarda la concentrazione di anti-c-fms per essere attentamente esaminati in futuro esperimenti.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Acknowledgments

Questo lavoro è stato sostenuto in parte da un KAKENHI JSPS concedere della Japan Society per la promozione della scienza (n. 16K 11776 a H. K., n. 17K 17306 a K. S., n. 16K 20637 a K.k., n. 16K 20636 a S., n. 18K 09862 dei. M.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anti-c-Fms antibody AFS98, a rat monoclonal, antimurine, c-Fms antibody (IgG2a)
TNF-α Recombinant murine TNF-α prepared in our laboratory. TNF-α cDNA fragment cloned by RT-PCR and cloned into a pGEX-6P-I (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) to generate a GST-fusion protein. GST-TNF-α was expressed in Escherichia coli BL21 cells cells (Stratagene, La Jolla, CA). The cells were lysed under nondenaturing conditions and GST-TNF-α was purified over a glutathione-Sepharose column. GST was cleaved off by PreScission Protease (Amersham Biosciences) by manufacturer’s directions and was removed by a glutathione-Sepharose column.
RANKL PEPROTECH 315-11 Recombinant Murine sRANK Ligand, Source: E. coli
M-CSF Recombinant human M-CSF. 1/10 vol of CMG14–12 cell line culture supernatant at 5x106 cells in a 10 cm suspension culture dish.
α-MEM Wako with L-Glutamine and phenol red
Fetal Bovine Serum Biowest s1820-500 Fetal Bovine Serum French Origin
Culture dish Corning 100 mm x 20 mm style dish
96-well plate Thermofischer Scientific Nun clon Delta surface
Cell counting kit-8 Dojindo, Kumamoto, Japan
Microplate reader Sunrise REMOTE; Tekan Japan, Kawasaki, Japan
Cell strainer Corning 40 μm Nylon
Centrifuge tube Corning 50 mL CentriStar cap
Triton X-100 Wako Polyoxyethylene (10) Octyphenyl ether

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References

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