Adsorbimento di spora come un sistema di visualizzazione Nonrecombinant per gli enzimi e gli antigeni

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Questo protocollo è centrato sull'uso delle spore batteriche come strumento nanobiotecnologica "dal vivo" di adsorbire molecole eterologhe con varie attività biologiche. I metodi per misurare l'efficienza di adsorbimento sono anche mostrati.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Isticato, R., Ricca, E., Baccigalupi, L. Spore Adsorption as a Nonrecombinant Display System for Enzymes and Antigens. J. Vis. Exp. (145), e59102, doi:10.3791/59102 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

La spora batterica è una cellula metabolicamente quiescente, costituita da una serie di strati protettivi che circondano un citoplasma disidratato. Questa struttura molto particolare rende la spora estremamente stabili e resistenti e ha suggerito l'uso della spora come una piattaforma per mostrare le molecole eterologhe. Finora, una varietà di antigeni ed enzimi sono state visualizzate su spore di Bacillus subtilis e di poche altre specie, inizialmente da un approccio ricombinante e, quindi, da un semplice ed efficace metodo di nonrecombinant. Il sistema di visualizzazione nonrecombinant è basato sull'adsorbimento di molecole eterologhe sulla superficie spora, evitando la costruzione di ceppi ricombinanti e il rilascio di batteri geneticamente modificati nell'ambiente diretto. Molecole adsorbite sono stabilizzati e protetti dall'interazione con le spore, che limita la rapida degradazione degli antigeni e la perdita di attività enzimatica in condizioni sfavorevoli. Una volta utilizzato, spora-adsorbito enzimi possono essere raccolti facilmente con una minima riduzione di attività e riutilizzati per reazione ulteriori giri. In questa carta è indicato come di adsorbire molecole modello a purificata spore di Bacillus subtilis, come valutare l'efficienza di adsorbimento e come raccogliere le spore usate per riciclarle per nuove reazioni.

Introduction

Sistemi di visualizzazione sono finalizzati a presentare molecole biologicamente attive sulla superficie dei microrganismi e trovare applicazioni in vari campi, da industriale a biotecnologie mediche e ambientali. Oltre alle cellule di varie gram-negativo e - positivo specie3,4,5,6,7, fagi1,2 e sono state anche le spore batteriche proposto come sistemi di visualizzazione da due approcci8,9.

Per la sua peculiare struttura, vale a dire un citoplasma disidratato, circondato da una serie di strati protettivi10, la spora offre diversi vantaggi rispetto dei fagi e basate sulle cellule display sistemi8,9. Un primo vantaggio deriva dalla estrema robustezza e stabilità delle spore alle condizioni che sarebbero deleterie per tutte le altre cellule10,11. Spora-visualizzati gli antigeni e gli enzimi sono stabili dopo prolungato stoccaggio a temperatura ambiente12 e protetto dal degrado a basso pH e alte temperature13. Un secondo vantaggio delle spore è la sicurezza di molte specie di spore. B. subtilis, b. clausii, b. coagulanse numerose altre specie sono utilizzati in tutto il mondo come i probiotici e sono stati sul mercato per uso umano o animale per decenni14,15. Questo record di sicurezza eccezionale è un requisito generale ovvio per un sistema di visualizzazione della superficie ed è di particolare rilevanza quando il sistema è inteso per uso umano o animale16. Un terzo, importante vantaggio di un sistema di visualizzazione basati su spore è che non ha limitazioni per la dimensione della molecola che deve essere esposto. Nei sistemi basati su fagi, una grossa proteina eterologa può influenzare la struttura del capside, mentre nei sistemi basati su cellulare, possono influenzare la struttura della membrana o limite/possono compromettere la traslocazione di membrana passo17. Gli strati protettivi che circonda la spora sono composti da più di 70 diverse proteine10 e sono abbastanza flessibili da accettare grandi proteine straniere senza evidenti difetti strutturali o compromissione funzionale8. Inoltre, con due sistemi di visualizzazione basati su spore, la traslocazione di membrana della proteina eterologa non è richiesto8,9. Infatti, le proteine eterologhe sono sia prodotta nel citoplasma della cellula madre e assemblate su spore che si sta formando nel citoplasma stesso o adsorbito la spora matura8,9.

Visualizzazione di spora inizialmente è stata ottenuta attraverso lo sviluppo di un sistema genetico per la superficie di spora18l'ingegnere. Questo sistema genetico è stato basato su i) la costruzione di una fusione genica tra il gene che codifica per una proteina del cappotto di spora (usata come vettore) e del gene che codifica per la proteina essere visualizzati - la presenza dei segnali trascrizionali e traslazionali dell'endogena gene controllerà l'espressione della fusione e ii) integrazione del gene chimerico sul cromosoma di b. subtilis per garantire stabilità genetica. Una varietà di antigeni ed enzimi sono stati esposti da questo approccio ricombinante, utilizzando varie proteine di superficie spore come vettori e che mira a vari potenziali applicazioni, che vanno dal vaccino mucoso biocatalizzatore, biosensori, bioremediation, o Bioanalytical strumento8,13.

Più recentemente, un approccio diverso del display spora è stato sviluppato19. Questo secondo sistema è nonrecombinant e si basa sull'adsorbimento di molecole sulla superficie spora9spontanea ed estremamente stretto. Antigeni19,20 ed enzimi13,21 sono state visualizzate in modo efficiente e hanno rivelato che questo metodo è molto più efficiente rispetto a quello ricombinante. Questo approccio nonrecombinant permette la visualizzazione di proteine in forma nativa20 e può essere utilizzato anche con autoclavato, spore morte19. Il meccanismo molecolare di adsorbimento non è stato completamente chiarito ancora. La carica negativa e l'idrofobicità della spora sono stati proposti come proprietà rilevanti per l'adsorbimento13,19,22. Recentemente, è stato indicato che una modello proteina, la proteina autofluorescent rosso (mRFP) del corallo Discosoma, quando adsorbiti alla spora, era in grado di infiltrarsi attraverso gli strati superficiali di localizzazione nel cappotto interno23. Se si è rivelato vero per altre proteine, la localizzazione interna delle proteine eterologhe potrebbe spiegare loro maggiore stabilità quando adsorbito a spore23.

In uno studio recente, due enzimi che catalizza due passaggi successivi del pathway di degradazione xilano in modo indipendente sono stati visualizzati su spore di Bacillus subtilis e, quando incubati insieme, erano in grado di eseguire entrambi degradazione passi21. Spore raccolti dopo la reazione erano ancora attive e in grado di continuare la degradazione di xilano sull'aggiunta di substrato fresco21. Anche se la seconda reazione21è stata osservata una perdita di circa il 15% del prodotto finale, la riutilizzabilità degli enzimi adsorbiti per reazioni singole, così come multi-step, è un ulteriore vantaggio importante del sistema di visualizzazione di spora.

Pan et al.24 segnalato un approccio aggiuntivo per visualizzare le proteine eterologhe sulla superficie spora: proteine eterologhe (una proteina endoglucanase e una beta-galattosidasi uno) prodotte nella cellula madre durante la sporulazione erano spontaneamente racchiuso nel cappotto spora che forma, senza la necessità di un vettore. Questo sistema di visualizzazione aggiuntive spora è una combinazione dei due approcci descritti finora. Infatti, è ricombinante poiché le proteine eterologhe sono state progettate per essere espressa nella cellula madre durante la sporulazione, mentre loro assemblaggio all'interno il cappotto è stato spontaneo e, quindi, nonrecombinant24. Tuttavia, l'efficienza del display di questo approccio supplementare rimane per essere testato e confrontato con gli altri due approcci utilizzando le stesse proteine eterologhe.

Il presente protocollo esclude i processi di produzione di spore e purificazione, che sono stati descritti ampiamente altrove24. Esso comprende la reazione di adsorbimento, la valutazione dell'efficienza di adsorbimento da microscopia di fluorescenza e macchiare del puntino, e il riciclaggio degli enzimi adsorbiti per reazione ulteriori giri.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. reazione adsorbimento

  1. Incubare 2, 5 e 10 µ g di mRFP con 2 x 109 di b. subtilis spore purificate di selvaggio-tipo a 200 µ l di binding buffer, citrato di sodio di 50 mM, pH 4,0 (16,7 mM sodio citrato diidrato; acido citrico 33,3 mM) per 1 h a 25 ° C in un agitatore oscillante (Figura 1) .
  2. Centrifugare le miscele di associazione (13.000 x g per 10 min) per frazionare pellet (P2, P5 e P10) e surnatanti (S2, S5 e S10). Memorizzare i surnatanti per la valutazione indiretta dell'efficienza di adsorbimento descritto al punto 3.2.
  3. Lavare il pellet 2 x con 200 µ l di binding buffer e risospendere in 100 µ l di binding buffer e utilizzarlo per l'analisi successiva.
    Nota: La reazione di associazione avviene preferenzialmente a un valore di pH inferiore al punto isoelettrico della proteina; in genere, 1,5 M tampone fosfato salino (PBS), pH 4.0, o citrato di sodio di 50 mM, pH 4.0, vengono utilizzati.

2. diretta valutazione dell'efficienza di adsorbimento

  1. Estrazione delle proteine di superficie e l'analisi western blot
    1. Prendere 50 µ l di risospensione adsorbito mRFP spore (P2, P5 e P10 di passaggio 1.3) e aggiungere 50 µ l di sodio dodecil solfato (SDS): 2x-ditiotreitolo (DTT) (0.1 M Tris-HCl, pH 6.8; 2% SDS; 0,1 M DTT) per solubilizzare le proteine di superficie spora.
    2. Utilizzare il mRFP libero, purificata ed estratti delle stesse quantità di spore che non sono adsorbite alla proteina come controlli positivi e negativi, rispettivamente.
    3. Dopo 45 min di incubazione a 65 ° C, centrifugare (13.000 x g per 10 min) le miscele e analizzare 10 µ l di proteine estratte (surnatante) mediante western blot con anticorpo monoclonale anti-suo anticorpo riconoscendo il suo tag presenti al N-terminale di mRFP ( Figura 2A).
  2. Osservazioni di microscopia fluorescente
    Nota: Utilizzando proteine eterologhe fluorescenti o esecuzione di un'analisi di immunofluorescenza, è possibile localizzare e quantificare le molecole adsorbite da microscopia di fluorescenza.
    1. Prendere 5 µ l di risospensione le spore adsorbito dal passaggio 1.3 e 95 µ l di PBS 1X, pH 4.0, ottenere ~ 1 x 106 spore / µ l.
    2. Posto 5 µ l di sospensione su un vetrino da microscopio, coprire con un vetrino coprioggetto precedentemente trattato con poli-l-lisina per 30 s e osservarlo con un microscopio a fluorescenza.
    3. Per ogni campo, salvare l'immagine di microscopia di contrasto di fase e l'immagine di microscopia di fluorescenza (Figura 2B).
      Nota: In alternativa, spore fluorescente possono essere analizzate mediante citofluorimetria. Risospendere un totale di 106 spore adsorbito o non-adsorbito con la proteina eterologa in 1 mL di PBS 1X, pH 4.0 e analizza la sospensione utilizzando un citometro a flusso (Figura 2C).
  3. Analisi dei dati utilizzando ImageJ
    1. Aprire le immagini di microscopia di fluorescenza con software ImageJ (http://rsbweb.nih.gov/ij/) e verificare che tutte le immagini sono in formato 8-bit (immagine | Tipo | 8-bit).
    2. Se necessario, regolare il contrasto (immagine | Regolare | Luminosità contrasto) e verificare che la scala dell'immagine è PIXEL (immagine | Impostare la scala).
    3. Dal menu Analizza, selezionare Set di misure. Assicurarsi di avere la zonae Densità integrata Significa grigio valore selezionato.
    4. Disegnare una linea attorno la spora di interesse utilizzando uno degli strumenti di disegno/selezione (cioè, cerchio, poligono, o a mano libera) (Figura 3).
    5. Selezionare la misura dal menu Analizza (o premi cmd + M). Verrà visualizzata una finestra di popup con una pila di valori per questo primo spora (Figura 3).
    6. Ripetere questi due passaggi per almeno 50 altre spore nel campo di vista scelto da misurare.
    7. Selezionare diverse regioni senza eventuali spore (che non hanno nessuna fluorescenza) e ripetere la misurazione; Questo sarà lo sfondo.
      Nota: La dimensione non è importante. Questi valori di fluorescenza di fondo corrispondente utilizzerà per sottrarre manualmente sullo sfondo.
    8. Selezionare tutti i dati nella finestra risultati e copiare i risultati in un foglio di calcolo.
    9. Calcolare la media della Densità integrata e della zona delle spore selezionate e dei valori di fluorescenza di fondo e utilizzarli per ottenere il corretta fluorescenza totale per cella (CTCF) utilizzando la formula: CTCF = Integrated Media Densità - (Area media x media fluorescenza di fondo).
      Nota: In alternativa, se tutte le spore appaiono ben separate, è possibile analizzare tutte le spore del campo dell'immagine utilizzando la funzione di Analizzare particelle, seguendo le istruzioni di ImageJ. Per evitare che il software legge una fluorescenza specifica o aggregati di spore, la dimensione delle particelle deve essere impostato a pixelˆ2 = 50-200 (Figura 4).

3. indiretta valutazione dell'efficienza di adsorbimento

  1. Preparare diluizioni seriali per la proteina purificata.
    1. Preparare una prima provetta da 1,5 mL contenente 250 µ l di purificato mRFP ad una concentrazione finale di 0,5 ng / µ l, utilizzando il buffer di associazione. Questo volume è sufficiente per caricare due corsie.
    2. Eseguire sei duplice diluizioni seriali di 250 µ l (volume finale) ciascuno, utilizzando il buffer di associazione.
  2. Preparare la duplice diluizioni seriali per gli esempi di supernatanti contenente la frazione non associato mRFP della reazione di adsorbimento (S2, S5 e S10 dal punto 1.2).
    1. Mettere 100 µ l di ogni surnatante in una provetta da 1,5 mL e aggiungere 100 µ l di tampone di associazione. Eseguire sei duplice diluizioni seriali di 200 µ l (volume finale) ciascuno, utilizzando il buffer di associazione.
  3. Tagliare una nitrocellulosa membrana (0,45 µm cut-off), 9 x 10 cm in dimensione, per coprire l'area di 5 (numero di campioni) x 6 punti (numero di diluizioni). La membrana non si estenda oltre il bordo della guarnizione dell'apparato di dot blot.
  4. Posizionare la membrana ha nell'apparato di dot blot. Rimuovere eventuali bolle d'aria intrappolate tra la membrana e la guarnizione. Coprire la parte non utilizzata dell'apparato con nastro o paraffina film per impedire l'aria si muove attraverso quei pozzi.
  5. Montare l'apparecchiatura di macchia del puntino come descritto dal produttore.
  6. Se un vuoto viene utilizzato durante il montaggio, reidratare la membrana con 100 µ l di 1X PBS per pozzetto per garantire l'uniforme associazione dell'antigene ed evitare aloni o un segnale debole di individuazione.
  7. Rimuovere delicatamente il buffer dai pozzi di vuoto. Non appena la soluzione tampone drena da tutti i pozzetti, fermare la pompa del vuoto e scollegarlo.
  8. Caricare lo standard a due corsie più esterne e i campioni al centro (Figura 5). Riempire i pozzetti con 100 µ l di ciascuna diluizione. Lo stesso volume usato per ciascun pozzetto dovrebbe garantire una filtrazione omogenea di tutti i pozzetti.
  9. Accendere la pompa del vuoto per 2 min, fermarlo e poi, lasciare il campione attraverso la membrana del filtro da flusso di gravità.
  10. Lavare tutti i pozzetti con 100 µ l di 1X PBS e lasciare che la pompa del vuoto funzionare per un altro 5 min dopo il tampone di lavaggio è stato completamente svuotata dall'apparecchio.
  11. Con il vuoto, allentare le viti e aprire con cautela l'apparato di macchia del puntino.
  12. Disattivare il vuoto, prendere la membrana ed elaborare seguendo un protocollo occidentale della macchia.
  13. Eseguire un'analisi densitometrica del filtro, utilizzando il software appropriato, ad esempio ImageJ.
    1. Misurare la densità integrata di ciascun punto strutturarle con un cerchio della stessa area e utilizzando il comando Analyze/misura .
    2. Apportare una correzione di sfondo dell'immagine, disegnare un cerchio in un'area vuota e misura della sua densità integrato o utilizzando il comando di Processo/Sottrai sfondo .
    3. Correlare la densità dei punti standard integrata con la quantità di proteina caricata e ottenere una linea di calibrazione (R2 valori per la calibrazione curve dovrebbero essere sopra 0.95).
    4. Utilizzare la curva di taratura per estrapolare la concentrazione di mRFP di ogni punto del campione.
    5. Calcolare la concentrazione del mRFP restanti nelle frazioni non associate.
      Nota: Per garantire la corretta chiusura dell'apparato di dot blot e, quindi, al soggetto la membrana ad una pressione uniforme, serrare le viti seguendo uno schema incrociato in diagonale e, quindi, aprire la pompa a vuoto per stringere le viti più fortemente.

4. raccolta di spore e riutilizzare

  1. Per il riciclaggio della spora adsorbita, eseguire due reazioni di adsorbimento di 2.0 x 109 purificato spore con 10 µ g di purificato GH10-XA xilanasi o 10 µ g di β purificata di GH3-XT-xylosidase, come descritto nei passaggi 1.1-1.3 (Figura 6A).
  2. Raccogliere il pellet contenente le spore di enzima-adsorbito, li risospendere in 50 µ l di buffer ottimale per il dosaggio di reazione enzimatica (tampone sodio fosfato 50 mM a pH 6,5; 2,48689 g/L Na2HPO4, 4,88991 g/L NaH2PO4), e mescolarli insieme per ottenere una miscela di 100 µ l di spore adsorbente GH10-XA o GH3-XT.
  3. Aggiungere il substrato (5 mg/mL 4-O-methyl-d-glucuronod-xylan [MGX]) e lasciare che le reazioni enzima avvengono per 16 h a 65 ° C.
  4. Centrifugare la miscela di reazione (per 15 min a 13.000 x g) e conservare il supernatante contenente il prodotto di reazione enzima.
  5. Risospendere il pellet in 100 µ l di tampone di fosfato di sodio fresco 50 mM a pH 6.5 in presenza di un nuovo substrato (MGX) (Figura 6B).
    Nota: Per assorbire più di un enzima, è la possibilità di assorbire entrambi insieme o uno per uno in modo indipendente. Quest'ultima possibilità facilita l'analisi quantitativa dell'efficienza di adsorbimento e dell'attività di ogni enzima, che permette un equilibrio stechiometrico di ogni enzima necessario per le reazioni.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Adsorbimento di successo può essere valutata mediante western blotting. Al momento la reazione, la miscela è frazionata mediante centrifugazione e lavata, e la frazione di pellet (Figura 1) viene utilizzata per estrarre le proteine di superficie. L'estratto è frazionato mediante elettroforesi su gel di poliacrilammide in SDS (pagina), elettrotrasferiti ad una membrana di polivinilidene fluoruro (PVDF) e ha reagito contro gli anticorpi primari e secondari. La presenza di proteine della dimensione prevista, solo nella corsia caricata con un Estratto delle spore adsorbiti, è indicativa di una reazione di adsorbimento successo (Figura 2A).

L'efficienza della reazione di adsorbimento può essere valutata con metodi diretti e indiretti. La valutazione diretta dell'efficienza adsorbimento dipende la proteina eterologa che è stata utilizzata e può essere eseguita da microscopia di fluorescenza (Figura 2B) e citofluorimetria (Figura 2C) della frazione di pellet dopo il frazionamento della reazione di adsorbimento. Una quantificazione dei segnali fluorescenti presenti su Spore può essere eseguita utilizzando il software ImageJ (Figura 3 e Figura 4). Un'analisi indiretta dell'efficienza di adsorbimento può essere eseguita da un dot blotting analisi (Figura 5A) della frazione surnatante contenente la proteina non associata (Figura 1). Un'analisi densitometrica della proteina non associata (Figura 5B) permetterà agli scienziati di calcolare indirettamente la quantità di proteina adsorbita su spore.

Due reazioni successive possono essere catalizzate da una miscela di spore visualizzati da uno dei due enzimi specifici (Figura 6A). Il viene adsorbito possono essere raccolti con un passaggio semplice centrifugazione, lavato e incubati con il substrato fresco per un nuovo ciclo di reazione (Figura 6B).

Figure 1
Figura 1:schema generale dell'esperimento adsorbimento. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2 : Analisi dell'efficienza del display mRFP diretta. (A) Western blot con l'anticorpo specifico mRFP. C + = libero mRFP purificata; C - = un estratto proteico da spore non adsorbiti alla proteina; P2/P5/P10 = proteine estratte da spore di Bacillus subtilis adsorbite con 2, 5 e 10 mg di mRFP, rispettivamente. (B) microscopia di immunofluorescenza delle spore adsorbite. Immunoreactions sono state eseguite con un anticorpo primario riconoscendo la proteina adsorbita e con un fluorescente anticorpo secondario coniugato con isotiocianato di fluorescina (FITC). Il pannello di sinistra mostra la fluorescenza rossa mRFP intrinseca, che il pannello di destra mostra la fluorescenza verde di anticorpo secondario coniugato FITC. (C) analisi citofluorimetrica delle spore adsorbite. Le spore hanno reagito con gli anticorpi specifici mRFP e con anticorpi secondari coniugati FITC e, quindi, sono state analizzate tramite citofluorimetria. L'analisi è stata effettuata sulla popolazione intera spora (10.000 eventi, a). Nel pannello di sinistra, non-adsorbito spore sono mostrate in spore nere, mRFP-adsorbito in rosso. Il pannello di destra mostra il tracciato a puntino in avanti e laterale dispersione (FSC-SSC). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: manuale quantificazione del segnale fluorescente di ImageJ. Un'immagine del microscopio di fluorescenza delle spore, adsorbito con il mRFP proteina fluorescente rosso, analizzato con software ImageJ. Un cerchio giallo è stato disegnato intorno una spora per ottenere dati densitometrici (immagine ingrandita). La casella popup mostra i risultati dell'analisi densitometrica della spora selezionata. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: quantificazione simultanea del segnale fluorescente di ImageJ. (A) casella Popup ottenuti quando si seleziona Analizzare particelle. Un valore di intervallo di 50-200 pixel ^ 2 deve essere impostato per spore23. (B) segmentazione dell'immagine della Figura 3A dopo usando Analizzare particelle (a sinistra) e i risultati di analisi densitometrica relativo (a destra). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
Figura 5: Dot blotting analisi densitometrica. (A) Dot blotting con diluizioni seriali del mRFP purificato in duplicato (Std1 e Std2) e il surnatante (S10, S5 e S2) della reazione adsorbimento eseguito con 10, 5 e 2 µ g di mRFP, rispettivamente23. (B) il punto macchiare del pannello A viene utilizzato per l'analisi densitometrica. I cerchi indicano l'area utilizzata per quantificare la densità dei segnali. Il pannello a destra riporta un esempio di risultati ottenuti con l'analisi densitometrica. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 6
Figura 6: conversione del xilano di spore riutilizzabili. (A) schema generale di degradazione xilano. (B) spore visualizzando la xilanasi o gli enzimi β-xylosidase, quando mescolati insieme, catalizzano la degradazione in due fasi di xilano. Dopo la reazione, il campione è frazionato mediante centrifugazione. Il supernatante contiene il prodotto di reazione, mentre il pellet contiene enzimi associati a spore che possono essere riutilizzati con l'aggiunta di substrato fresco. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Questo protocollo di adsorbimento di spora è molto semplice e diretto. La reazione è strettamente legata al pH del tampone di reazione e l'efficienza di adsorbimento è ottima a valori di pH acido (pH 5.0 o inferiore). Alle condizioni di pH neutro, l'efficienza di adsorbimento è bassa, e a valori di pH alcalini, adsorbimento non può verificarsi. Adsorbimento ottima si ottiene utilizzando un volume di 200 µ l in tubi da 1,5 mL (o mantenere un rapporto simile) su un agitatore a dondolo.

Adsorbimento è molto stretto, e lavaggi con un buffer presso lo stesso pH del tampone di reazione non causano alcun rilascio delle proteine adsorbite. Lavaggi con tamponi alcalini possono provocare un minimo (generalmente meno di 15%26) rilascio della proteina adsorbita.

La valutazione indiretta dell'efficienza di adsorbimento di macchiare del puntino è affidabile se diverse diluizioni di proteina purificata e non associata vengono analizzate e l'analisi densitometrica viene eseguita correttamente. Nessuna prova di degradazione delle proteine eterologhe è stato segnalato25. La valutazione diretta dell'efficienza di adsorbimento dipende notevolmente la proteina che viene adsorbita. Se la proteina è autofluorescent o fluorescente etichettati, un'analisi di ImageJ-assistita fornisce una determinazione quantitativa della fluorescenza e degli importi delle molecole fluorescenti presenti su Spora. Se la proteina ha un'attività enzimatica, un dosaggio enzimatico specifico potrebbe fornire un'indicazione della quantità di proteina presente sulle spore. Tuttavia, è noto che l'attività enzimatica connesso con le spore può essere aumentata di un effetto di stabilizzazione a causa dell'interazione con la spora13. Se la proteina adsorbita non è fluorescente e non ha un'attività enzimatica, l'efficienza di adsorbimento può essere valutato mediante dot blotting su spore estorte sotto condizioni drastiche.

Una raccolta di spore usate può essere fatto da una procedura molto semplice. Una fase di lavaggio con il tampone di reazione può essere importante per rimuovere i sottoprodotti di reazione, mentre l'aggiunta del substrato fresco è essenziale per iniziare una nuova reazione21.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Acknowledgments

Questo lavoro è stato supportato da "Finanziamento di Ricerca di Ateneo" di L. Baccigalupi, titolo del progetto "SP-LAY: spore batteriche come piattaforma live per la visualizzazione di proteine".

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.1% Poly-L-lysine solution Sigma P8920
0.45 µm Nitrocellulose Blotting Membrane Sartorius M_Blotting_Membranes
100× objective UPlanF1  Olympus microscope equipment
Bacillus subtilis strain NCIB3610 Bacillus Genetic Stock Center 3A1
BD ACCURI C6 PLUS BD flow cytometer
BX51 Olympus Fluorescent microscope
Clarity Biorad 1705060
DP70 digital camera a Olympus microscope equipment
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, FITC Thermo fisher F-2754
Goat Anti-Rabbit IgG H&L (HRP)  Abcam ab6721
Monoclonal Anti-polyHistidine−Peroxidase antibody Sigma A7058-1VL used to detect adsorbed proteins presenting a 6xhistidine-tag at C- or N- terminal 
SecureSlip glass coverslip Sigma S1815-1PAK
Superwhite Uncharged Microscope Slides VWR 75836-190
U-CA Magnification Changer  Olympus microscope equipment

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Felici, F., et al. Peptide and protein display on the surface of filamentous bacteriophage. Biotechnology Annual Review. 1, 149-183 (1995).
  2. Cortese, R., et al. Identification of biologically active peptides using random libraries displayed on phage. Current Opinion in Biotechnology. 6, 73-80 (1995).
  3. Sousa, C., Cebolla, A., de Lorenzo, V. Enhanced metalloadsorption of bacterial cells displaying poly-His peptides. Nature Biotechnology. 14, 1017-1020 (1996).
  4. Richins, R., Kaneva, I., Mulchandani, A., Chen, W. Biodegradation of organophosphorus pesticides by surface-expressed organophosphorus hydrolase. Nature Biotechnology. 15, 984-987 (1997).
  5. Wu, J. Y., et al. Expression of immunogenic epitopes of hepatitis B surface antigen with hybrid flagellin proteins by a vaccine strain of Salmonella. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 86, 4726-4730 (1989).
  6. Newton, S. M., Jacob, C. O., Stocker, B. A. Immune response to cholera toxin epitope inserted in Salmonella flagellin. Science. 244, 70-72 (1989).
  7. Fischetti, V. A., Medaglini, D., Pozzi, G. Gram-positive commensal bacteria for mucosal vaccine delivery. Current Opinion in Biotechnology. 7, 659-666 (1996).
  8. Isticato, R., Ricca, E. Spore surface display. Microbiology Spectrum. 2, (5), (2014).
  9. Ricca, E., et al. Mucosal vaccine delivery by non-recombinant spores of Bacillus subtilis. Microbial Cell Factories. 13, 115 (2014).
  10. McKenney, P. T., Driks, A., Eichenberger, P. The Bacillus subtilis assembly and functions of the multilayered coat. Nature Reviews Microbiology. 11, 33-44 (2013).
  11. Knecht, L. D., Pasini, P., Daunert, S. Bacterial spores as platforms for bioanalytical and biomedical applications. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 400, 977-989 (2011).
  12. Isticato, R., Cangiano, G., De Felice, M., Ricca, E. Display of molecules on the spore surface. Bacterial Spore Formers: Probiotics and Emerging Applications. Ricca, E., Henriques, A. O., Cutting, S. M. Horizon Bionsciences. Norfolk, UK. 193-200 (2004).
  13. Sirec, T., et al. Adsorption of β-galactosidase of Alicyclobacillus acidocaldaricus wild type and mutant spores of Bacillus subtilis. Microbial Cell Factories. 11, 100 (2012).
  14. Cutting, S. M. Bacillus probiotics. Food Microbiology. 28, 214-220 (2011).
  15. Baccigalupi, L., Ricca, E., Ghelardi, E. Non-LAB Probiotics: Spore Formers. Probiotics and Prebiotics: Current Research and Future Trends. Venema, K., Do Carmo, A. P. Caister Academic Press. 93-103 (2014).
  16. Cutting, S. M., Hong, H. A., Baccigalupi, L., Ricca, E. Oral Vaccine Delivery by Recombinant Spore Probiotics. International Reviews of Immunology. 28, 487-505 (2009).
  17. Lee, S. Y., Choi, J. H., Xu, Z. Microbial cell-surface display. Trends in Biotechnology. 21, 45-52 (2003).
  18. Isticato, R., et al. Surface display of recombinant proteins on Bacillus subtilis spores. Journal of Bacteriology. 183, 6294-6301 (2001).
  19. Huang, J. M., et al. Mucosal delivery of antigens using adsorption to bacterial spores. Vaccine. 28, 1021-1030 (2010).
  20. Isticato, R., et al. Non-recombinant display of the B subunit of the heat labile toxin of Escherichia coli wild type and mutant spores of Bacillus subtilis. Microbial Cell Factories. 12, 98 (2013).
  21. Mattossovich, R., et al. Conversion of xylan by recyclable spores of Bacillus subtilis thermophilic enzymes. Microbial Cell Factories. 16, 218 (2017).
  22. Pesce, G., et al. Surface charge and hydrodynamic coefficient measurements of Bacillus subtilis by optical tweezers. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 116, 568-575 (2014).
  23. Donadio, G., et al. Localization of a red fluorescence protein adsorbed on wild type and mutant spores of Bacillus subtilis. Microbial Cell Factories. 15, 153 (2016).
  24. Pan, J. G., Choi, S. K., Jung, H. C., Kim, E. J. Display of native proteins on Bacillus subtilis spores. FEMS Microbiology Letters. 358, 209-217 (2014).
  25. Cutting, S., Vander Horn, P. B. Genetic analysis. Molecular Biological Methods for Bacillus. Harwood, C., Cutting, S. John Wiley & Sons. Chichester, UK. (1990).
  26. Lanzilli, M., et al. Display of the peroxiredoxin Bcp1 of Sulfolobus solfataricus probiotic spores of Bacillus megaterium. New Biotechnology. 46, 38 (2018).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics