Rilevamento di epitopi sensibili alla neutralizzazione in antigeni visualizzati su vaccini basati su particelle simili a virus (VLP) utilizzando un test di cattura

Nel mio laboratorio, sviluppiamo sistemi di produzione per vettori virali e particelle simili a virus, o vaccini basati su VLP. Il test di cattura VLP consente il rilevamento molto sensibile degli antigeni bersaglio visualizzati sui VLP. In questo test, utilizziamo anticorpi ampiamente neutralizzanti diretti contro gli epitopi di neutralizzazione per dimostrare l’esposizione di questi epitopi sulla superficie VLP.

Questa è un’importante valutazione della qualità per i candidati vaccini, poiché solo i VLP che mostrano epitopi sensibili alla neutralizzazione saranno in grado di suscitare una risposta anticorpale neutralizzante nei vaccinati. Inizia sospendendo le perline magnetiche tubando su e giù o mescolando su un rotatore a 50 RPM per almeno cinque minuti. Nel frattempo, preparare la soluzione anticorpale contenente i bNAB.

Utilizzare 10 microgrammi di ogni bNAB in 200 microlitri di legame anticorpale e tampone di lavaggio per reazione. Per ogni reazione, trasferire 50 microlitri della soluzione di perline magnetiche in un tubo di reazione da 1,5 millilitri, quindi posizionare i tubi sul rack di separazione magnetica. Attendere che le perline si raccolgano sulla palla del tubo per assicurarsi che tutte le perline siano raccolte, quindi rimuovere il surnatante.

Rimuovere il magnete e sospendere le perline in 200 microlitri della soluzione bNAB precedentemente preparata. Incubare per 30 minuti a tre ore mentre si mescola su un rotatore a 50 RPM a temperatura ambiente. Dopo l’incubazione, posizionare i tubi di reazione nel rack di separazione magnetica, attendere e rimuovere il surnatante.

Rimuovere i tubi dal magnete e lavare le perline sospendendo nuovamente in 200 microlitri di legame anticorpale e tampone di lavaggio. Ripetere il lavaggio con legante anticorpale e tampone di lavaggio, rimuovendo il più possibile il tampone di lavaggio al termine. Aggiungere i campioni ai bNAB con perline.

Se il volume del campione aggiunto è inferiore a un millilitro, aggiungere PBS per regolare il volume del campione a un millilitro, quindi sospendere nuovamente le perline mediante pipettaggio delicato. Incubare i campioni e le perline per 2,5 ore su un rotatore a temperatura ambiente, assicurandosi che le perline rimangano in sospensione e che la soluzione venga accuratamente miscelata durante l’incubazione. Posizionare i tubi sul magnete e rimuovere il surnatante, quindi lavare le perle magnetiche sospendendole in 200 microlitri di tampone di lavaggio.

Sospendere le perline in 100 microlitri di tampone di lavaggio e trasferire la sospensione in un tubo di reazione pulito e resistente al calore. Posizionare il tubo sul rack di separazione magnetica e rimuovere completamente il surnatante. Per preparare campioni STS-PAGE denaturati, sospendere le perline in 20-80 microlitri del tampone Laemmli e incubare a 95 gradi Celsius per cinque minuti.

Procedere direttamente con SDS-PAGE, posizionando i tubi su un rack magnetico per separare le perline dalla soluzione. In alternativa, conservare i campioni a meno 20 gradi Celsius. Un risultato rappresentativo dei VLP catturati per la prima volta da surnatante di coltura cellulare senza cellule e pellet VLP utilizzando bNAB, e successivamente sottoposti ad analisi Western blot per rilevare proteine core virali, è mostrato qui.

Le perle utilizzate per il test di cattura sono state rivestite con tre diversi bNAB diretti contro gli epitopi di neutralizzazione delle glicoproteine dell’involucro e anticorpi isotipici che fungono da controlli negativi. Utilizzando perline rivestite con anticorpi isotopici, nessuna proteina Gag è stata rilevabile in campioni VLP contenenti VLP calvi, cioè VLP Env-negativi o VLP che mostrano Env, dimostrando che il legame aspecifico dei VLP alle perline rivestite con anticorpi umani non ha mediato la cattura VLP. Anche i VLP calvi non erano legati da perline rivestite di bNAB e, di conseguenza, nessuna proteina Gag era rilevabile nell’analisi Western blot.

Al contrario, tutti e tre i bNAB hanno catturato VLP che mostravano proteine Env, pertanto, le proteine Gag sono state prontamente rilevate, dimostrando la presenza di epitopi di neutralizzazione nelle Env-glicoproteine visualizzate sui VLP. Cruciale per il successo del test: una miscelazione accurata di VLP con perline rivestite di anticorpi. Ciò si ottiene al meglio utilizzando volumi superiori a 500 microlitri in rotazione.

In alternativa, i VLP catturati possono essere eluiti in condizioni non riducenti. Ciò consente l’analisi di VLP utilizzando la microscopia immunoelettronica o lo studio degli antigeni visualizzati utilizzando PAGE nativo.