Yüksek işlem hacmi Siderophore filtreleme dışında çevre örnekleri: bitki doku, toplu topraklar ve rizosferde topraklar

* These authors contributed equally
Environment

Your institution must subscribe to JoVE's Environment section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

Biz mikro besin bioavailability ve ciro karasal sistemlerinde katkıda bulunan siderophore olası çevresel örneklerin hızlı tarama için bir iletişim kuralı mevcut.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Lewis, R. W., Islam, A. A., Dilla-Ermita, C. J., Hulbert, S. H., Sullivan, T. S. High-throughput Siderophore Screening from Environmental Samples: Plant Tissues, Bulk Soils, and Rhizosphere Soils. J. Vis. Exp. (144), e59137, doi:10.3791/59137 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Siderophores (düşük moleküler ağırlığı metal bileşikleri Şelat) demir (Fe) biyojeokimyasal topraklarda patojen rekabet, bitki büyüme promosyon ve çapraz-Krallık sinyal Bisiklete binme üzerinden arasında değişen çeşitli ekolojik fenomen önemlidir. Ayrıca, siderophores da bioleaching ve bioweathering metal taşıyıcı mineral ve madenler ticari ilgi vardır. Kantitatif değerlendirilmesi siderophore üretim yapılan karmaşık bir hızlı, uygun maliyetli ve güçlü araç ekolojik etkileri de dahil olmak üzere, roman siderophore mikroplar üreten siderophore aktivitesinin önemli yönlerini tanımlayan anahtardır. Burada sunulan Yöntem inceliğini microbiome topluluklarda toprak veya bitki doku gibi çevre örnekleri siderophore etkinliğini değerlendirmek için geliştirilmiştir. Örnekleri homojenize ve (olmadan Fe) değiştirilmiş bir M9 ortamda seyreltilmiş ve zenginleştirme kültürler 3 gün boyunca inkübe. Siderophore üretim bir roman 96-şey Mikroplaka CAS (Krom azurol sülfonat) kullanarak 24, 48 ve 72 saat (s) örneklerinde değerlendirildi-Fe agar tahlil, siderophore değerlendirilmesi, geleneksel olarak ve zaman alıcı sıkıcı kolorimetrik yöntemi bir uyarlaması bireysel ekili mikrobiyal yalıtır üzerinde gerçekleştirilen aktivitedir. Biz Lewjain, Madsen ve PI561725 ve iç Pacific Northwest yaygın olarak yetiştirilen PI561727 de dahil olmak üzere 4 farklı genotip/satır buğday (Triticum soğanı L.), bizim yöntem uygulanır. Siderophore üretim açıkça genotip buğday ve bitki dokularında gözlenen belirli türleri tarafından etkilenebilir. Biz başarıyla bizim hızla bitki genotip etkisi siderophore üretim, karasal ve sucul ekosistemler önemli bir işlev için ekran için kullanılan yöntem. Biz birçok teknik çoğaltır, çok güvenilir istatistiksel farklar toprak ve bitki doku içinde verimli üretti. Önemlisi, sonuçlar önerilen yöntem hızla güvenilirlik, özellikleri ve işlevsel genleri belirlemek daha sonra iş için korunmuş gibi topluluklar sağlar bir şekilde yüksek derecesi ile karmaşık örnekleri üretimde siderophore incelemek için kullanılan gösterir.

Introduction

Siderophores önemli biomolecules öncelikle demir şelasyon bioavailability, ancak ek amaçlı olarak karasal ve sucul ekosistemler, mikrobiyal bitki-ana bilgisayarlara sinyal algılama mikrobiyal çekirdek arasında değişen geniş bir dizi daha yer vardır, bitki büyüme promosyon, işbirliği ve rekabet içinde karmaşık mikrobiyal topluluklar1,2. Siderophores genel olarak sınıflandırılabilir etkin sitelere ve yapısal özellikleri, göre dört temel türleri oluşturma: karboksilat, hydroxamate, catecholate ve karışık tip3,4. Birçok mikroorganizmalar siderophores1daha da geniş bir çeşitlilik alımını sağlamak için membran reseptörleri birden fazla türü siderophore5 ve karmaşık topluluklar, organizmalar biosynthesize büyük bir çoğunluğu excreting yeteneğine sahip, 6. Son çalışma topluluk düzeyinde ve hatta arası Krallık iletişim ve biyojeokimyasal transferler7,8,9,10 siderophores özellikle önemli olduğunu gösterir ,11.

Krom azurol Sülfonat (CAS) şelat bir ajan olarak 30 yıldan fazla demir (Fe) bağlamak için böyle bir şekilde ligandlar (yani siderophores) eklenmesi CAS-Fe kompleks bir kolayca tanımlanabilen renk değişikliği ortamda oluşturma ayrışma sonuçlanabilir kullanılmıştır 12. ne zaman CAS Fe ile ilişkili, boya koyu mavi bir renk görüntülenir ve CAS-Fe karmaşık ayrışıp, orta renk Fe13kayıt atmak için kullanılan ligand türüne göre değişir. Schwyn ve Neilands tarafından 1987 yılında kurulan ilk, sıvı tabanlı orta mikrobiyal hedefleri14, büyüme alışkanlıkları ve sınırlamalarını15yanı sıra metaller Fe, yanı sıra çeşitli değiştirme karşılamak için birçok şekilde modifiye edilmiştir dahil olmak üzere Alüminyum, manganez, kobalt, nikel kadmiyum, Lityum, çinko16, bakır17ve hatta arsenik18.

Birçok insan patojenleri de bitki büyüme teşvik mikroorganizmalar (PGPM) olarak tespit edilmiştir siderophore üreten organizmalar3,19,20ve önemli rizosferde ve sık sık test endophytic PGPM siderophore-üretim4için olumlu. Geleneksel Fe tabanlı sıvı yöntemi microtiter siderophore üretim21ekimi yalıtır test edilmesi için adapte edilmiştir. Ancak, bu teknikler mikrobiyal toplum önemini bir bütün (microbiome) olarak, işbirliği ve potansiyel, düzenleme, toprak ve bitki sistemleri22siderophore üretim tanımak için başarısız. Bu nedenle, biz bir yüksek-den geçerek toplum düzeyinde değerlendirmesine dayalı geleneksel CAS tahlil, ama çoğaltma, ölçüm, güvenilirlik ve tekrarlanabilirlik bir Mikroplaka kolaylığı ile belirli bir ortamda üretiminden siderophore geliştirdik tahlil.

Bu çalışmada, siderophore üretim algılamak için bir düşük maliyetli, yüksek üretilen iş CAS-Fe tahlil karmaşık örnekleri (yani, toprak ve bitki dokusu homogenates) üretiminden siderophore zenginleştirme değerlendirmek için sunulmuştur. Tahıl, ateş ve dört ayrı buğday (Triticum soğanı L.) genotip dokulardan kök ile birlikte elde edilen toplu, gevşek bağlı ve sıkı bir şekilde bağlı rizosferde toprak (açısından nasıl toprak kök dizinine bağlı): Lewjain, Madsen, PI561725, ve PI561727. Buğday genotip temel farklılıklarla topluluklar üreten siderophore seçimi ve işe alımı farklılıklar neden olabilir ki onaylanmadığına karar. Özel ilgi ile alüminyum ALMT1 (alüminyum-harekete geçirmek Malate ışınlama 1) sahiptir çünkü alüminyum hoşgörülü olduğunu, PI561725 isogenic çizgi ile ilişkili mikrobiyal topluluklar arasındaki farkı karşılaştırılır gene, almt123,24,25,26alüminyum duyarlı şeklinde sahip hassas PI561727 isogenic hattı. Çalışma baş amacı kantitatif kültürler gelecekte yapılacak çalışmalar için koruma sırasında siderophore üretim siderophore zenginleştirme kültürlerde karmaşık örnek türleri değerlendirirken, bir basit, hızlı yöntem geliştirmekti.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Not: Yer alan sitenin: Washington State Üniversitesi, bitki patoloji çiftlik (46 ° 46'38.0 "N 117 ° 04'57.4" W). Tohumlar mekanik bir çiftlik 19 Ekim 2017 üzerinde kullanarak ekili. Her buğday genotip kök sistemi örtüşen önlemek için headrows içinde yaklaşık 1 metre arayla yerleştirilmişti. Bitki ve toprak örnekleri 9 Ağustos 2018, ne zaman bitkiler hasat için hazırdılar üzerinde toplanmıştır. Örnekleri üç dört buğday genotip çoğaltır toplanan: PI561727, PI561725, Madsen, Lewjain.

1. değiştirilmiş M9 orta hazırlanması

  1. Kullanım Na2PO4∙7H2O (12,8 g/200 mL), KH2PO4 (0.3 g/200 mL), M9 tuz solüsyonu hazırlamak için NaCl (0.5 g/200 mL) ve NH4Cl (1 g/20 mL) reaktifler.
  2. MgSO4∙7H2O 18 g 0,75 M MgSO4∙7H2O. hazırlamak için 100 mL Çift Kişilik deiyonize su (GKD2O) kullanın
  3. 1 M CaCl2∙2H2O CaCl2∙2H2O 14.7 g GKD2O. 100 mL ile ekleyerek yapmak
  4. Arabellek çözüm borular 6,048 g GKD2O karıştırma ile 156 mL içine çözülerek hazırlayın. PH 6.8 ile 5 M NaOH için ayarlayın.
  5. GKD2O. 100 mL 20 g glikoz çözülerek % 20 glikoz (dekstroz monohidrat) hazırlamak
  6. Çözümler ve ayrı ayrı basınçlı kap tüm ama glikoz hazırlayın. Filtre sterilize M9 ortama eklenmesinden sonra ısıyla (0,22 µm) için glikoz çözüm.
  7. Değiştirilmiş M9 orta borular arabellek çözüm, 40 mL M9 tuz çözeltisi, 20 μL CaCl2·2H2O çözüm 156 mL, MgSO4·7H2O 266 μL ve 4 mL % 20 glikoz çözümleri birlikte Biyogüvenlik karıştırarak hazırlayın dolap, kullanma steril tekniği.
  8. Değiştirilmiş M9 korunması için konteyner mühür, UV koruyun ve 4 ° C'de yerleştirmek için alüminyum folyo ile kapatın

2. ca-Fe-Agar orta hazırlanması

  1. Asit yıkama 100 mM HCl/100 mm HNO3 en az 2 h CAS tahlil dosyasında önce tüm cam.
  2. Laboratuvar notu kumla dolu bir alüminyum pişirme pan hazırlamak ve alüminyum folyo ile kapatın. Otoklav 30 dk ve kenara için 121 ° C'de.
  3. 20 mL GKD2için O 0.0365 g ekleyerek HDTMA (hexadecyltrimethylammonium bromür) hazırlamak ve 37 ° C solubilization tanıtmak için çözüm yerleştirin.
  4. 10 mM HCl hazırlamak ve 1 mM FeCl3·6H2O 10 mM HCl solvent kullanarak oluşturmak. CA'ların 0.0302 g GKD2O için 25 mL olan steril manyetik heyecan çubuk hafifçe karıştırarak ekleyin. Sonra yavaşça (koyu kırmızımsı siyah renk çözüm dönüşür) karıştırmaya devam ederken 1 mm FeCl3·6H2O (10 mM HCl) CA çözüm 25 ml 5 mL ekleyin.
  5. Yavaş yavaş HDTMA çözüm 20 mL yavaşça, (Bu bir koyu mavi çözüm verir) Fe-CAS çözüm içine karıştırarak ekleyin.
  6. Arabellek çözüm borular 15.12 g GKD2O, nazik karıştırma ile 375 mL içine çözülerek hazırlayın. PH 6.8 ile 5 M NaOH için ayarlayın. Birim için 450 mL getirmek için su ekleyin. Özel 5 g ekleyin. Otoklav boruları arabellek çözüm ve CAS-Fe çözüm, 121 ° c 30 dk için.
  7. Dikkatle her biri autoclaved sonra CAS-Fe çözüm tamamını Biyogüvenlik kabini borular arabellekte tamamını ekleyin.
  8. Yer karışık bir su banyosu 50 ° C'de çözümde
    Not: Her tahlil önce CAS-Fe-Agar ortamında tüm reaktifler 50 ° C sonuçlara yağış katılaşmış orta CAS-Fe karmaşık ve soğutma sonuçlar uzun süreli depolama olarak taze hazırlayın.
  9. Biyogüvenlik kabini steril kum ve ısı ile 50 ° c steril reaktif tekne yeri CAS-Fe-Agar tekne, daha sonra açık, düz dipli, steril 96-şey Mikroplaka her kuyuya için hızlı bir şekilde aliquot 100 µL aktarın.

3. Pyoverdine/EDTA standart hazırlama

  1. Pyoverdine hazırlık
    1. 800 mikron pyoverdine standart hazırlamak (süksinik asit, 2-Hidroksi glutaramide ve pyoverdine-succinaminde formları karışımı Malzemeler tablobakınız), önceden hazırlanmış değiştirilmiş M9 orta.
    2. Bu çözümde 400, 200, 100, 50, 25, 12,5 ve 6.25 mikron çözümleri oranında seyreltin.
  2. EDTA standart hazırlama
    1. 0.594 g disodyum ethylenediaminetetraacetic asit ekleyin (EDTA: C10H14N2Na2O8.2H2O), 3200 mikron EDTA standart hazırlamak için önceden hazırlanmış değiştirilmiş M9 orta 500 ml.
    2. Bu çözüm 1600, seyreltik 800, 400, 200, 100, 50, 25, 12,5 ve 6.25 mikron çözümleri.
  3. Standart eğri üretimi
    1. Her konsantrasyon pyoverdine ve CAS-Fe Agar orta 100 μL içeren bir 96-şey Mikroplaka kuyu ayırmak için EDTA 100 μL ekleyin. Her konsantrasyon yinelenen teknik çoğaltmalar olun. Ayrıca, boş wells sadece M9 ile eklemek (EDTA veya pyoverdine).
    2. Mikroplaka Okuyucu kullanarak, absorbans ölçmek (420, nm ve 665 nm) 22 ° C ve kullanım absorbans ölçümleri standart eğriler oluşturmak için 1, 6 ve 24 h kuluçka sonra.
      Not: 420 nm ölçülerini absorbans absorbans pyoverdine veya EDTA içeren wells gelen boşlukları çıkarma. İçin 665 nm, pyoverdine veya boşlukları absorbans kuyulardan içeren EDTA absorbans çıkarma. Sonra günlük10(µM pyoverdine veya EDTA) karşı absorbans ölçümleri geriledi. Örnek sonuçlarını yorumlama kolaylığı, absorbans x ekseni kullanın ve10(µM pyoverdine veya EDTA) y ekseni oturum.

4. çevre örnekleri toplanması: toprak ve bitki dokularında

  1. Örnekleme donanımları (kürek ve makas) 0.22 µm filtre GKD%270 etanol tarafından takip O ile yıkama ve çapraz bulaşma örnekleme öncesi ve steril tekniği korumak ve azaltmak için örnekleri arasında kağıt havlu ile silin.
  2. Dan tesisleri alanında bitki doku (tahıl ve sürgünler) tüketim ve yer onları içinde istenen toprak ve kök örnekleri köklerinden sökülürken kolaylaştırmak için yeterli ateş anız bırakarak bir etiketli plastik saklama çantası.
  3. Bir küçük kök topu yaklaşık 15 cm derin ve 23 cm genişliğinde kazı ve numune hazırlama laboratuvar ortamında için ayrı, etiketli plastik torbaya koyun. McPherson ve ark.27yöntemleri için benzer bir adımdır.
  4. Tüm örnekleri (tahıl, sürgünler, toplu toprak ve kök topları ayrı torbalarda) doğrudan buza koyun ve örnekleri siderophore üretim tahlil için işleninceye kadar 4 ° C'de tutmak.
  5. İlişkili kök toprak örnekleri toplu, gevşek bağlı rizosferde toprak ve sıkı bir şekilde bağlı rizosferde toprak ayırmak.
    1. Kök topları çanta dışında al. Kök topu topraktan kapalı yavaşça salla. Toprak off sarsıldı toprak ile birlikte sol çantada "toplu" toprak oluşur.
    2. Bir lastik tokmak daha fazla toprak kök topun kaldırmak için kullanın. Bu gevşek bağlı rizosferde topraktır.
    3. Sıkı bir şekilde bağlı rizosferde toprak kökleri ile sıkı bir şekilde bağlı örnek alarak ve onları bir santrifüj tüpü koyarak oluşturmak. GKD2O ve girdap 30 mL ekleyin Bu 2-3 dakika. Kökleri sıkıca bağlı rizosferde toprak Bulamaç seyreltme almak için kaldırın.

5. siderophore zenginleştirme kültürler ve CAS-Fe siderophore üretim tahlil hazırlanması

Not: Tüm cam asit deneyleri başlamadan önce yıkanmış olması gerekir.

  1. Toprak numune hazırlama (için her üç toprak örnek türü)
    1. Toprak örnekleri örnek torba içinde karıştırma ve toprak çanta açmadan mümkün olduğu kadar çevirerek lunaparkçı.
      Not: Bu doğal toprak kayma değişkenliği azaltmak yardımcı olur ve normal toprak örnekleme prosedürleri ile hizalar. Diğer yöntemleri çevre örnekleri, uygun ve bağlı olarak deneysel tasarım homojenize için yararlı.
    2. Her örnek oldu iyice karışık, aliquot ve her toprak 2.0 g 20 mL değiştirilmiş M9 orta askıya sonra 10-3 20 mL steril 50 mL santrifüj tüpü havalandırma izin vermek için bir steril köpük fiş ile toplam hacmiyle oranında seyreltin.
    3. Sıkı bir şekilde bağlı rizosferde örnekleri, rizosferde toprak Bulamaç 2 mL değiştirilmiş M9 orta 20 mL ekleyin, sonra 20 mL steril 50 mL santrifüj tüpü havalandırma izin vermek için bir steril köpük fiş ile toplam hacmiyle 10-3 oranında seyreltin.
  2. Doku örneği (kök, ateş ve tahıl) hazırlık
    1. Yüzey örnek % 70 etanol ile sterilize. Bir blender yüksek üzerinde 30 saniye kullanarak değiştirilmiş M9 orta 20 ml taze doku 2.0 g macerate. Örnek bir steril 50 mL santrifüj tüpü, daha sonra 20 mL steril 50 mL santrifüj tüpü havalandırma izin vermek için bir steril köpük fiş ile toplam hacmiyle 10-3 oranında seyreltin.
  3. Siderophore üretim Fe sınırlama ile zenginleştirme
    1. 50 mL santrifüj tüpleri, oda sıcaklığında kuluçkaya ve 160 rpm'de sallamak.

6. CAS-Fe agar deneyleri siderophore üretim çevre örneklerinde algılanması için

  1. 24, 48 ve zenginleştirme kültür başlatılması sonra 72 h 1 mL subsamples steril tekniği ve santrifüj de 10.000 x g 1 min 2 mL santrifüj tüpleri için hücreleri pelletize kullanmayı zenginleştirme tüpler kaldırın.
  2. Ayrılmış süpernatant toplamak. Steril tekniği kullanarak, CA-Fe-Agar 100 μL çözüm yinelenen veya Mikroplaka nüsha süpernatant ile 100 μL ekleyin. Ayrıca steril M9 orta 100 µL (boşluk olarak) ekleyin. 28 ° C'de plaka kuluçkaya
  3. Kalan süpernatant ve Pelet (microtiter plakasına eklenmez) her örnek için kendi, steril 2 mL santrifüj tüpüne askıya alma. Steril gliserol 400 μL örnek süpernatant her tüpün içine ekleyin ve gliserol hisse oluşturmak için Pelet resuspend. Stok daha sonraki analizler için-80 ° C'de dondurmak.
    Not: Bu adım gliserol stokları göre herhangi bir tercih edilen şirket içi iletişim kuralı oluşturmak için değiştirilebilir.
  4. 6, 24, 48 ve 420 nm dalga boyu, 72 h absorbans ölçmek.
  5. Standart eğrileri pyoverdine veya EDTA oluşturulan örnek absorbans ölçümleri açısından pyoverdine eşdeğerleri yorumlamak için kullanın.
    Not: EDTA ile karşılaştırıldığında üstün standart Pyoverdine tespit edilmiştir (infra vide), EDTA çalışmada sonuçlar yorumlamak için kullanılan değildi bu yüzden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Bir pyoverdine karışımı uzarlar Pseudomonas fluorescens tarafından standart olarak yorumlamak ve absorbans ölçmek için kullanılan (420, nm) açısından µM. pyoverdine eşdeğerleri örnekleri Şekil 1 absorbans (420 arasındaki ilişkiyi gösterir Nm) ve pyoverdine (günlük10 derişim µM olarak) konsantrasyon başlayarak. Çünkü pyoverdine ve R2 ile ulaşılabilir olduğundan sergilenen büyük absorbans ölçümleri yapıldı örnekleri (Şekil 2) alt EDTA yeterli bir standart sağlamadı. Başlangıç sırasında iş CAS-Fe tahlil siderophore algılama ölçülen absorbans 630 bir yöntem olarak kullanarak nm, çok benzer bir yöntemle ilgili bir çalışmada (CA-Fe-Agar karışık oldu 1:1 200 µL sütun içinde Mikroplaka oluşturmak için değiştirilmiş M9 ile), bu gözlenmiştir tepe absorbans 665 yapıldı nm, ama bu 420 nm örnekleri (Şekil 3) tarafından indüklenen absorbans değişimler açısından daha tekrarlanabilir.

72 h Fe eksikliği zenginleştirme ve siderophore etkinliği, kuluçka (ek Şekil 1) sonra 48 h stabilize etmek için ortaya çıktı sonra Siderophore üretim tüm doku türleri zenginleştirme kültürlerde gözlendi. Böylece, 72 h zenginleştirme siderophore etkinliği, genotip ve örnek türü etkisi siderophore yalıtım (Şekil 4) belirlemek için 48 saat kuluçka değerlendirildi. Toplu toprak örnekleri faaliyete Siderophore nispeten düşük ve yaptım değil sergi farklılıklar arasında hangi toplu toprak oldu buğday genotip örnek (4A rakam). Enrichments PI561725 genotip izole gevşek bağlı toprak gevşek bağlı topraktan Madsen ve PI561727, ama Lewjain (Şekil 4B) ile karşılaştırıldığında daha büyük siderophore üretim sergiledi. Siderophore üretim enrichments sıkı bir şekilde bağlı topraktan ağır genotip (Şekil 4 c) tarafından etkilenmiştir değil.

Tahıl doku kültürleri zenginleştirme nispeten düşük siderophore üretim genotip (Şekil 4 d) ne olursa olsun vermiştir. Diğer genotip daha önemli ölçüde daha düşük siderophore üretim enrichments Lewjain ateş doku vardı ve PI561725 ateş doku kültürleri daha değişken siderophore üretim (Şekil 4E) sonuçlandı. Siderophore etkinliği % 200'den fazla kök doku zenginleştirme kültürlerde ve tüm diğer genotip ile (Şekil 4F) göre PI561725 daha oldu.

Figure 1
Şekil 1. 420 absorbans nm ve 655 nm gerilediği pyoverdine log10 konsantrasyon karşı. (A)absorbans 420 nm gerilediği µM pyoverdine günlük10 konsantrasyon karşı. Polinom eğrisi uygun absorbans pyoverdine eşdeğerleri açısından yorumlamak için açıklayıcı bir denklem elde edilir. (B) absorbans 665 nm gerilediği karşı günlük10 µM. R2 pyoverdine Pearson korelasyon katsayısının karesini bölgedir ve monte Eğrinin denklemi açıklar. Puan 6 h kuluçka 28 ° C'de sonra absorbans ölçümleri 800, 400, 200, 100, 50, 25, 12,5 ve 6.25 µM pyoverdine kopyası vardır Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Şekil 2. 420 absorbans nm ve 655 nm gerilediği EDTA log10 konsantrasyon karşı. (A)absorbans 420 nm gerilediği µM EDTA günlük10 konsantrasyon karşı. Polinom eğrisi uygun absorbans pyoverdine eşdeğerleri açısından yorumlamak için açıklayıcı bir denklem elde edilir. (B) absorbans 665 nm gerilediği karşı günlük EDTA10 konsantrasyon µM. R2 Pearson korelasyon katsayısının karesini, ve monte Eğrinin denklemi açıklar. 1600, 3200, absorbans ölçülerde kopyası noktalarıdır 800, 400, 200, 100, 50, 25, 12,5 ve 6.25 µM EDTA sonra 6 h kuluçka 28 ° C ve hata çubukları. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3. Absorbans inceden inceye gözden geçirmek--dan 11: CA-Fe-Agar 200 µL sütunları içeren Mikroplaka Wells 315−1000 nm ve M9 değiştirilebilir veya M9 orta üreten siderophore ile örnekleri. Plaka 28 ° C'de absorbans Mikroplaka Okuyucu ölçme önce 72 saat inkübe. Absorbans taramaları göster: örnek yok (siyah çizgiler) içeren üç boşlukları vermiştir sıkıca kümelenmiş eğrileri ile bir zirve 665 nm. Absorbans tarar Haritayı eğrileri daha fazla değişkenlik, ama daha tutarlı 420 absorbans ile vermiştir örnekleri (gri çizgiler) üreten siderophore içeren üç boşlukları nm karşılaştırıldığında ile 665 nm. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 4
Şekil 4. Siderophore zenginleştirme kültürler karşılıkları Pyoverdine. Siderophore zenginleştirme kültürler karşılıkları Pyoverdine gevşek olarak bağlı,(a)ile toplu (B) ilişkili ve (C) sıkı bir şekilde toprak, bağlı ve buğday doku homogenates içinde (D) tahıl (E) vuruyor ve (F) kökler. Siderophore zenginleştirme kültürler subsamples bir Mikroplaka aktarma ve 28 ° C'de kuluçka önce 72 saat inkübe Siderophore üretim değerlendirildi, kuluçka krom azurol S. genotip/hatları ile 48 saat sonra Lew Lewjain, Mad = Madsen, 725 = PI561725 ve 727 = PI561727 =. Yıldız işareti temsil önemi Alpha 0.008 (sonra Bonferroni düzeltmesi) =. Barlar standart sapma vardır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 4
Ek resim 1. Pyoverdine eşdeğerleri zaman içinde. Pyoverdine eşdeğerleri siderophore zenginleştirme kültürlerin 24, 48 ve 72 h, kuluçka krom azurol S. Sderophore zenginleştirme kültürlerle ilgili gevşek bağlı(a)ile toplu (B) ve (C) sıkı bir şekilde bağlı toprak, sonra değerlendirildi ve Buğday (D) doku homogenates içinde sürgün tahıl (E) ve (F) kökleri. Siderophore zenginleştirme kültürler subsamples bir Mikroplaka aktarma ve 28 ° C'de kuluçka önce 72 saat inkübe ve subsampled her timepoint siderophore üretim değerlendirmek için. Genotip/çizgilerdir Lew Lewjain, Mad = Madsen, 725 = PI561725 ve 727 = PI561727 =. Siderophore üretim 24, 48 ve 72 h, kuluçka sonra değerlendirilmesi. Barlar standart sapma vardır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bu eser birincil sonucu kantitatif siderophore üretim/etkinlik çevre örnek ölçme sırasında mikroplar üreten siderophore için hızla zenginleştirmek için kullanılabilir yeni bir metodoloji yapımıdır. Metodoloji hızlı, basit ve düşük maliyetlidir ve ne kadar karmaşık ve yeni örnek türleri aktivitesinden siderophore algılamak için kullanılabilir sonuçlar gösterir (e.g., toprak ve bitki dokusu). Protokol aynı zamanda sonuçlar gliserol stokları zenginleştirme kültürlerin üretiminde hangi kolayca zaman içinde mikrobiyal toplum yapısı ve fonksiyonu vardiyalı çalışmaları sırasında Fe eksikliği DNA veya RNA aracılığıyla karşılamak için alınabilir teknikleri dayalı . Bu kinetik ekolojik çalışmalar faaliyete siderophore incelerken ilgi de muhtemelen olabilir yarar--dan bu yöntem. Sonuçlar da pyoverdine eşdeğerleri (pyoverdines ortam28 ve tıp29açısından önemli siderophores olan) kantitatif değerlendirilmesi siderophore üretim, iyi bir yöntem sağlar gösterir. O absorbans önemli bir bulgudur ölçülerde 665 nm 420 gözlenen ile karşılaştırıldığında siderophore etkinliğini belirlemek için yetersiz nm (Şekil 1). Belirli önemini bulgu o absorbans 665 yapıldı nm kümelenmiş pyoverdine konsantrasyonları geniş bir aralığında (Pyoverdine µM 50-800 µM, günlük10(µM pyoverdine) = 0.18-0,76 =), bu dalga boyu (Şekil bir algılama tavana düşündüren 1B). bu pyoverdine üstün bir standart EDTA ile karşılaştırıldığında iken, ön çalışma EDTA ile gerçekleştirilen veya diğer düşük maliyetli şelatörlerin metodoloji sağlamak için önce hakim önerdim o da pahalı, olduğunu belirtmek gerekir pyoverdine standartlar oluşturma.

Yakın ilgi gerektiren birkaç kritik adım boyunca Protokolü vardır. İlk olarak, metal, özellikle de düşük konsantrasyonlarda gerekli çalışmayı seviyorum Fe metal içermeyen cam ve diğer mallar mümkün olan her yerde korumak önemlidir. İkinci olarak, kültürler Fe sınırlama siderophore üretim için zenginleştirilmiş çünkü çevre kirletici etkisini azaltmak için iş akışı boyunca aseptik koşullar korumak önemlidir. Son olarak, CAS-Fe-agar hazırlanması ve dikkatli detaylara gerektirir olarak mümkün olduğunca yakından açıklanan yüklemeye hazırlıklı olmalısınız. CAS-Fe-agar çözüm sıcak tutulur ancak hızlı bir şekilde kullanılmaz, örneğin, CA-Fe çökelti. Ayrıca, CAS-Fe-Agar aktarım sırasında Mikroplaka için sıcak tutmak için önemlidir. Bu ısıtmalı kullanarak, steril kum ve hızlı bir şekilde bir Biyogüvenlik kabini Mikroplaka orta aktarılması sağlanır.

Metodoloji bir sınırlama bazı bitkiler de siderophores (phytosiderophores); üretmek çünkü Bunlar bitki doku homogenates kültürleri zenginleştirme etkinliğinde ölçülen siderophore katkıda bulunabilir. Ayrıca, alanı çoğaltır, daha fazla çoğaltma gelecek çalışmalarda yararlı olabilir düşündüren gelen sonuçlara nispeten yüksek değişkenlik vardı. Başka bir tekniği bu süre yüksek üretilen iş, toplama örnek Mikroplaka yöntemidir ve hazırlık zaman alıcı kısıtlamasıdır. Yine de, çünkü tek bir Mikroplaka (standartlar dahil olmak üzere) 96 örnekleri için kullanılabilir, zaman ve maliyet girdileri vardır çok daha düşük varolan teknikleri ile karşılaştırıldığında. Öncelikle mevcut diğer yöntemler Petri yemekler30' u, CA-Fe tahlil edâ dayandığından bu doğal olarak daha az zaman ve maliyet Mikroplaka hazırlamak için verimli olan. Ayrıca, CAS-Fe-Agar orta kullanarak önerilen yöntem yağış12' ye çözündürüldükten CAS-Fe kompleksleri olduğundan, ayrıca 96-şey biçimine adapte olmak üstün sıvı tabanlı yöntemleri var.

PI561725 ve PI561727 arasındaki en önemli fark ALMT1 vs.almt1, varlığı sırasıyla, verilen bu bildirilen bulgular açısından sonuçları ALMT1 olası sonuçları seçimine varlığı öneririz. biçilen yolu ile zenginleştirme kültürler olarak siderophore üretimi için büyük bir potansiyele sahip mikrobiyal topluluklar bitki ve toprak. Geleceğin iş daha da ALMT1 varlığı özellikle gelişmiş siderophore etkinliği için seçerse özellikle açıklamak çoğaltır, daha çok sayıda kullanarak fenomen araştırmak gerekir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar hiçbir ifşa etmek çıkar çatışması var.

Acknowledgments

Yazarlar Kalyani Muhunthan Laboratuvar yordamları, Lee Opdahl genotip buğday hasat için Washington State Concord üzüm Araştırma Konseyi ve Washington State Üniversitesi Merkezi tarım sürdürülmesi için yardım için teşekkür etmek istiyorum ve Doğal kaynakların bir BIOAg için bu çalışmalarına destek vermek. Ek finansman USDA/NIFA kapağı projesi 1014527 yoluyla tarafından sağlandı.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agarose Apex LF451320014
Aluminum Baking Pan
Aluminum Foil
Ammonium chloride, granular Fiesher Scientific 152315A
Autoclave and Sterilizer Thermo Scientific
Calcium chloride dihydrate Fiesher Scientific 171428
CAS (Chrome Azurol S) Chem-Impex Int'l Inc) 000331-27168
Dextrose Monohydrate (glucose), crystalline powder Fiesher Scientific 1521754
EDTA, disodium salt, dihydrate, Crystal J.T.Baker JI2476
Glycerol, Anhydrous Baker Analyzed C22634
HDTMA (Cetyltrimethylammomonium Bromide Reagent World FZ0941
Hydrochloride acid ACROS Organic B0756767
Infinite M200 PRO plate reader TECAN
Iron (III) chloride hexahydrate, 99% ACROS Organic A0342179
Laboratory Fume Hood Thermo Scientific
Laboratory Incubator VWR Scientific
Magnesium Sulfate Fiesher Scientific 27855
Niric Acid, (69-70)% J.T.Baker 72287
PIPES buffer, 98.5% ACROS Organic A0338723
Potassium phosphate, dibaisc,powder J.T.Baker J48594
Pyoverdine SIGMA-ALDRICH 078M4094V
Sand
SI-600R Shaker Lab Companion
Sodium chloride, granular Fiesher Scientific 136539
Sodium hydroxide, pellets J.T.Baker G48K53
Sodium phosphate, dibasic heptahydrate, 99% ACROS Organic A0371705

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Butaite, E., Baumgartner, M., Wyder, S., Kummerli, R. Siderophore cheating and cheating resistance shape competition for iron in soil and freshwater Pseudomonas communities. Nature Communications. 8, (2017).
  2. Ghirardi, S., et al. Identification of Traits Shared by Rhizosphere-Competent Strains of Fluorescent Pseudomonads. Microbial Ecology. 64, (3), 725-737 (2012).
  3. Hider, R. C., Kong, X. L. Chemistry and biology of siderophores. Natural Product Reports. 27, (5), 637-657 (2010).
  4. Saha, M., et al. Microbial siderophores and their potential applications: a review. Environmental Science and Pollution Research. 23, (5), 3984-3999 (2016).
  5. Bhattacharyya, P. N., Jha, D. K. Plant growth-promoting rhizobacteria (PGPR): emergence in agriculture. World Journal of Microbiology, Biotechnology. 28, (4), 1327-1350 (2012).
  6. Lewis, R. W., Islam, A., Opdahl, L., Davenport, J. R., Sullivan, T. S. Phylogenetics, Siderophore Production, and Iron Scavenging Potential of Root Zone Soil Bacteria Isolated from 'Concord' Grape Vineyards. Microbial Ecology. Accepted (2018).
  7. Li, S. S., et al. The opportunistic human fungal pathogen Candida albicans promotes the growth and proliferation of commensal Escherichia coli through an iron-responsive pathway. Microbiological Research. 207, 232-239 (2018).
  8. Lorenz, N., Shin, J. Y., Jung, K. Activity, Abundance, and Localization of Quorum Sensing Receptors in Vibrio harveyi. Frontiers in Microbiology. 8, (2017).
  9. O'Brien, S., Fothergill, J. L. The role of multispecies social interactions in shaping Pseudomonas aeruginosa pathogenicity in the cystic fibrosis lung. Fems Microbiology Letters. 364, (15), (2017).
  10. Ozkaya, O., Balbontin, R., Gordo, I., Xavier, K. B. Cheating on Cheaters Stabilizes Cooperation in Pseudomonas aeruginosa. Current Biology. 28, (13), (2018).
  11. Popat, R., et al. Environmental modification via a quorum sensing molecule influences the social landscape of siderophore production. Proceedings of the Royal Society B-Biological Sciences. 284, (1852), (2017).
  12. Schwyn, B., Neilands, J. B. Universal chemical assay for the detection and determination of siderophores. Analytical Biochemistry. 160, (1), 47-56 (1987).
  13. Sullivan, T. S., Ramkissoon, S., Garrison, V. H., Ramsubhag, A., Thies, J. E. Siderophore production of African dust microorganisms over Trinidad and Tobago. Aerobiologia. 28, (3), 391-401 (2012).
  14. Buyer, J. S., DeLorenzo, V., Neilands, J. B. Production of the siderophore aerobactin by a halophilic Pseudomonad. Applied and Environmental Microbiology. 57, (8), 2246-2250 (1991).
  15. Perez-Miranda, S., Cabirol, N., George-Tellez, R., Zamudio-Rivera, L., Fernandez, F. O-CAS, a fast and universal method for siderophore detection. Journal of Microbiological Methods. 70, (1), 127-131 (2007).
  16. Nakouti, I., Hobbs, G. A new approach to studying ion uptake by actinomycetes. Journal of Basic Microbiology. 53, (11), 913-916 (2013).
  17. Wang, L. J., et al. Diisonitrile Natural Product SF2768 Functions As a Chalkophore That Mediates Copper Acquisition in Streptomyces thioluteus. Acs Chemical Biology. 12, (12), 3067-3075 (2017).
  18. Retamal-Morales, G., et al. Detection of arsenic-binding siderophores in arsenic-tolerating Actinobacteria by a modified CAS assay. Ecotoxicology and Environmental Safety. 157, 176-181 (2018).
  19. Desai, A., Archana, G. Role of Siderophores in Crop Improvement. (2011).
  20. Dertz, E. A., Raymond, K. N. Comprehensive coordination chemistry II. Que, L., Tolman, W. B. 8, Elsevier, Ltd. (2003).
  21. Arora, N. K., Verma, M. Modified microplate method for rapid and efficient estimation of siderophore produced by bacteria. 3 Biotech. 7, 9 (2017).
  22. Bandyopadhyay, P., Bhuyan, S. K., Yadava, P. K., Varma, A., Tuteja, N. Emergence of plant and rhizospheric microbiota as stable interactomes. Protoplasma. 254, (2), 617-626 (2017).
  23. Lakshmanan, V., Castaneda, R., Rudrappa, T., Bais, H. P. Root transcriptome analysis of Arabidopsis thaliana exposed to beneficial Bacillus subtilis FB17 rhizobacteria revealed genes for bacterial recruitment and plant defense independent of malate efflux. Planta. 238, (4), 657-668 (2013).
  24. Sasaki, T., et al. A wheat gene encoding an aluminum-activated malate transporter. The Plant Journal. 37, (5), 645-653 (2004).
  25. Mahoney, A. K., Yin, C., Hulbert, S. H. Community Structure, Species Variation, and Potential Functions of Rhizosphere-Associated Bacteria of Different Winter Wheat (Triticum aestivum) Cultivars. Frontiers in Plant Science. 8, (132), (2017).
  26. Rayburn, A. L., Wetzel, J., Baligar, V. Mitotic analysis of sticky chromosomes in aluminum tolerant and susceptible wheat lines grown in soils of differing aluminum saturation. Euphytica. 127, (2), 193-199 (2002).
  27. McPherson, M. R., Wang, P., Marsh, E. L., Mitchell, R. B., Schachtman, D. P. Isolation and Analysis of Microbial Communities in Soil, Rhizosphere, and Roots in Perennial Grass Experiments. Journal of Visualized Experiments. (137), 57932 (2018).
  28. Mirleau, P., et al. Fitness in soil and rhizosphere of Pseudomonas fluorescens C7R12 compared with a C7R12 mutant affected in pyoverdine synthesis and uptake. FEMS Microbiology Ecology. 34, (1), 35-44 (2000).
  29. Visca, P., Imperi, F., Lamont, I. L. Pyoverdine siderophores: from biogenesis to biosignificance. Trends in Microbiology. 15, (1), 22-30 (2007).
  30. Louden, B. C., Haarmann, D., Lynne, A. M. Use of Blue Agar CAS Assay for Siderophore Detection. Journal of Microbiology, Biology Education. 12, (1), 51-53 (2011).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics