종양 유래 엑 소 솜을 정량화 하는 나노 플라즈마-강화 된 산란 및 저 배율 현미경 이미징 사용

Bioengineering
 

Summary

질병 및 악성 세포에 대 한 엑 소 좀 유래 바이오 마커의 임상 번역은 신속 하 고 정확한 정량 방법의 결여에 의해 방해 된다. 이 보고서는 작은 부피의 혈 청 또는 혈장 샘플에서 특정 엑 소 좀을 정량화 하는 저 배율 어두운 영역 현미경 이미지의 사용을 설명 합니다.

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Wan, M., Amrollahi, P., Sun, D., Lyon, C., Hu, T. Y. Using Nanoplasmon-Enhanced Scattering and Low-Magnification Microscope Imaging to Quantify Tumor-Derived Exosomes. J. Vis. Exp. (147), e59177, doi:10.3791/59177 (2019).

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Abstract

감염 되거나 악성 세포는 빈번 하 게 더 많은 엑 소 솜을 분 비 하 고, 순환 중에 질병 관련 된 외 염색체의 상승 된 수준으로 이끌어 냅니다. 이 외 상 염색체는 질병 진단을 위한 생물 표지 자 역할을 하 고 질병 진행 및 처리 응답을 감시 하기 위하여 잠재력을가지고 있습니다. 그러나, 대부분의 엑 소 좀 분석 절차에는 약간의 분리 및 정제 단계가 필요 하며,이는 일반적으로 시간 소모적이 고 노동 집약적 이며, 따라서 임상 설정에서 제한 된 유용성 이다. 이 보고서는 별도의 분리 및 정제 단계를 거치지 않고 엑 소 솜의 외부 막에 대 한 특정 바이오 마커를 분석 하는 신속한 절차를 설명 합니다. 이 방법에서는 엑 소 좀 특이 적 항 체에 의해 슬라이드의 표면에 포획 된 후, 질병에 특이 적인 나노 입자-공액 항 체 프로브와 하이브리드 화 된다. 혼성 화 후, 대상 엑 소 좀의 풍요로 움은 결합 된 나노 입자의 저 배율 어두운 전계 현미경 (LMDFM) 이미지를 분석 하 여 결정 한다. 이 접근법은 질병에 연결 된 멤브레인 관련 엑 소 좀 바이오 마커를 분석 하기 위한 연구 및 임상 사용을 위해 용이 하 게 채택 될 수 있다.

Introduction

엑 소 솜은 대부분의 세포 유형에 서 방출 되 고 다양 한 질병과 관련 된 병 리 생리학적 과정을 포함 하 여 세포 간 통신에 핵심적인 역할을 하며,이는 특정 조직 또는 세포 유형에 집 될 수 있기 때문에, 다양 한 핵 산을 함유 , 단백질 및 지질은 그들의 기원의 세포를 반영 하 고 그들의 수령인 세포1,2,4에 대 한 규제 효과를 발휘할 수 있습니다. 엑 소 솜은 종종 질병 상태에서 상승 된 수준에서 분 비 되며, 인접 하 고 먼 세포와 상호 작용할 수 있고, 타 액, 소변, 췌 장 및 담 즙을 포함 한 대부분의 체액 뿐만 아니라 순환 중에 상대적으로 높은 농도로 발견 됩니다 주스 및 기관지 폐 포 세척 액체5,6,7,9,11 인체 체액에서의이 풍부 하 고 안정성은 정보 풍부한 특성과 결합 하 여 질병 진단과 치료 모니터링을 위한 이상적인 바이오 마커를 만듭니다.

여기에는 종양 관련 돌연변이 대립 유전자를 포함 한 질병 생물 표지 자 역할을 할 수 있는 종양 특이 적 또는 선택적인 인자를 포함 하는 종양 유래 엑 소 솜 (TDEs)이 포함 됩니다. TDEs는 종양 발달 및 전이를 촉진 하 고, 항 종양 반응12를 조절 하기 위해 종양 미세 환경의 리 모델링에 참여할 수 있다. 증가 된 TDE 분 비는 대부분의 암의 일반적인 표현 형이 고 저 산소 증, 산 성 pH 및 염증을 포함 하는 종양 미세 환경의 여러 특징은 엑 소 좀 분 비를 촉진 하는 것으로 알려져 있다. 놀랍게도, 엑 소 솜을 분 비 하는 세포의 수를 감안할 때, 총 엑 소 좀 수준의 증가는 그 자체가 암 바이오 마커로 서 기능 할 수 있다. 예를 들어, 최근 연구에의 하면 담 즙 즙의 총 EV 농도가 100% 정확도7인 일반 담 관 협 착 증 환자에서 악성 및 비 악성을 판별 하는 것으로 나타났습니다. 비슷한 결과 다른 체액을 사용 하 여 연구 발견 되었습니다., 플라즈마를 포함 하 여. 그러나, 대상 변화에 대 한 잠재력 및 다른 혼동 요인으로 인해, 질병 바이오 마커로 서의 엑 소 솜을 조사 하는 대부분의 연구는 선택적으로 총 엑 소 좀 대신 TDEs와 연관 된 바이오 마커의 검출에 초점을 맞추고 있다 숫자.

엑 소 좀 바이오 마커를 임상 실습으로 번역 하는 것은, 그러나 대부분의 보고 된 엑 소 좀 분석 접근법은 시간 소모적이 고 노동 집약적 인 분리 절차 13을 필요로 하기 때문에 도전적으로 남아 있습니다. 현재 인기 있는 엑 소 좀 분리 방법에는 초 원심 분리, 밀도 구배, 크기 배제, 공 침 법, 선호도 포착 및 미세 유체 분리 접근법이 포함 됩니다. 초 원심 분리는 "금 표준" 방법 이며,이 절차는 많은 시간을 소모 하 고 엑 소 좀의 손상 및 엑 소 좀 막 군집을 초래 하 고, 엑 시에 오염 되는 몇 가지 샘플을 생산 합니다. 단백질, 지질 단백질 및 후속 분석에 영향을 미칠 수 있는 다른 요인14. 대부분의 엑 소 좀은 초 원심 분리를 포함 한 일부 분리 방법은 마이크로 소포 (100~1000nm) 및 사 멸 몸체 (100~5000 nm)에서 엑 상 상 (30~150nm)을 분리할 수 없으며, 다른 메커니즘을 통해 발생 하 고 다른 기능을가지고 있기 때문에 크기 이들 그룹 들 사이에 중첩 되 고, 엑 소 좀 인구의 다양성은15이다. 엑 소 좀의 복구를 개선 하 여 엑 소 좀 회복을 향상 시키고, 엑 소 좀의 손상 및 오염을 감소 시키면서, 이러한 방법에 기반한 어떠한 분석도 그들을 렌더링 하기 위해 최적화 될 필요가 있더라도 새로운 접근법이 필요 합니다. 임상 설정에서 응용 프로그램에 대 한 번역에 적합 합니다.

몇몇 최근의 연구는 체액에서 직접 엑 소 솜을 포착 하 고 분석 하기 위해 통합 된 플랫폼을 채택 하는 것을 제안 했습니다. 이러한 방법에는 미세 유체, 동 전기적, 친화성 포획 및 엑 소 좀 분리를 위한 다양 한 방법, 그리고 전기 화학, 표면 플 렉 소 공명 및 포착 된 외 상 염색체를 검출 하는 다른 방법이 사용 됩니다. 이러한 접근법의 대부분은 복잡성, 비용, 낮은 처리량 또는 기타 문제로 인해 임상 설정에서 얼마나 실현 가능한 지는 분명 하지 않습니다.

우리는 소량의 시료만을 필요로 하는 TDEs와 같은 질병 관련 외 상 염색체를 포함 하 여 총 엑 소 솜 및 특정 엑 사의 일부 특수형의 민감하고 특이 적 정량화에 사용할 수 있는 신속 하 고 저렴 한 분석을 개발 했습니다. 임상 환경에 적합 한 간소화 된 워크플로우를 채택 합니다. 이러한 분석에서, 슬라이드는 엑 소 좀에 특이 적으로 또는 질병 특이 적인 마커 중 어느 하나를 결합 하는 항 체로 코팅 되어 작은 부피의 혈장 또는 혈 청 시료에 존재 하는 표적 외 상 염색체를 직접적으로 포착 하기 위하여 표면에 웰에 도포 된 슬라이드. 포획 된 엑 소 솜은 그 후 이러한 엑 상 염색체에 대 한 관심 바이오 마커를 인식 하는 항 체 공액 나노 입자와 하이브리드 화 되며,이는 일반적인 엑 소 좀 마커 이거나 관심 있는 엑 소 좀에 특이 적인 인자 일 수 있다. 이러한 샘플 웰의 이미지는 어두운 전계 현미경 (dfm)을 이용 하 여 포착 하 고 분석 하 여 각각의 샘플에서 포착 된 관심의 외 각에 결합 된 나노 입자 로부터 산란 된 빛을 측정 하 여도6,16,17. 특히, 낮은 배율의 DFM (LMDFM)으로 전체 샘플을 제대로 이미징 하면 사용자가 후속 이미지 분석을 위해 캡처할 필드를 직접 선택 해야 하는 경우 고배율 DFM 분석에서 발생 하는 선택 바이어스를 피할 수 있습니다. LMDFM 이미지 분석은 스크래치 및 샘플 파편을 포함 하 여 표면 불규칙에서 광산 산란 아티팩트를 적용 하지만,이 배경은 우리가 NIH 이미지 분석 프로그램에서 실행 하기 위해 개발 한 간단한 소음 감소 알고리즘을 사용 하 여 감소 될 수 있다, Https://imagej.nih.gov/ij/. 이 알고리즘은 먼저 샘플 웰의 경계를 감지 하는 데 사용 되는 입력 등고선 임계값을 적용 하 여 후속 분석을 위해 이미지의 영역을 정의 합니다. 이 윤곽 영역에 의해 정의 된 영역은 이미지의 적색, 청색 및 녹색 채널에 존재 하는 별개의 신호로 분할 되 고 청색 채널은 적색 채널에서 감산 되어 나노 로드의 표면 아티팩트 및 고르지 않은 조명 으로부터 발생 하는 신호를 제거 합니다. 신호.

본 문서는 혈장 또는 혈 청 샘플에서 전체 또는 특정 엑 소 좀 레벨을 신속 하 게 정량화 하기 위해이 분석 법을 사용 하는 방법을 설명 합니다.

Protocol

1. 나노 입자 프로브의 제조

참고:이 분석은 작용 화 된 금 나노로 Ds (AuNRs;에 공유 결합 되는 25 nm 직경 x 71 nm 길이)를 사용 하 고 DFM 시 적색 (641 nm 피크) 산란 신호를 생성 하는 표면 플 라 즈 몬 공명 피크를 갖는다 조명.

  1. 40 µ l의 aunr-av (2.56 x 1011 입자)를 세 7.0 200 번 세척 하 고 8500 흡 인 (450°c에서 10 분간)을 원심 분리 하 여 흡입 한 후, 최종 원심 분리 및 흡 인 단계를 거쳐 aunr-av 펠 렛이 현 탁 되 게 하였다 40 µ L PBS에서.
  2. 이 AuNR-AV 서 스 펜 션을 10 µ L 데 닐 화 항 체 (0.5 Mg/ml)의 엑 소 좀의 표면 상의 항 원에 특이 적으로 혼합 하 고 150 µ L의 PBS를 사용 하 여 4 ° c에서 2 시간 동안 혼합 하 여 뉴 트 라 비 딘-비오 틴 결합이 완료 될 수 있도록 한다.
  3. 얻어진 항 체 컨 쥬 게이 오 스 (Aunrs-IgG)를 3 회 원심 분리 하 여 흡 인 (6500의 경우 4°c에서 10 분간) 하 고,이를 200 µ l PBS에서 일시 중단 하 고 사용 하기 전까지 4°c에서 보관 한다.
    참고: 멸 균 기술과 짧은 보관 시간을 사용 하 여 AuNR-IgG의 오염과 열화를 방지 해야 합니다. 그것은 그들의 접합의 24 시간 안에 항 체 공액 AuNRs를 사용 하는 것이 가장 좋습니다.

2. EV 캡쳐 슬라이드의 준비

  1. 선택 된 엑 소 좀 포획 항 체를 PBS에 0.025 밀리 그램/mL로 희석 하 고이를 멀티 웰 단백질 A/G 슬라이드에 1 µ L/웰을 첨가 한 후가 습 챔버에서 1 시간 동안 37 ° c에서이 슬라이드를 배양 하 고 고 정화 된 단백질 A/G에 결합 된 포획 항 체를 허용 한다 슬라이드입니다.
  2. 결합 되지 않은 항 체를 제거 하기 위하여 우물을 흡 인 하 고, µ의 1의 첨가 및 흡 인에 의하여 우물을 3 번 세척 한 후에, 1 µ의 차단 완충 액 ( 물질의 표참조)로 각각 잘 로드 하 고,가 습 챔버에서 b에 37 ° c에서 2 시간 동안 슬라이드를 배양 나머지 단백질 결합 부위를 잠급니다.
  3. 차단 버퍼를 제거 하기 위해 우물을 흡입, PBS의 1 µ L/우물의 추가 및 포부에 의해 세 번 우물을 세척 하 고, 즉시 엑 소 좀 캡처 및 분석을 위해 차단 된 슬라이드를 사용 합니다.

3. 표준 곡선 준비

  1. 특정 한 엑 소 좀의 절대 또는 상대적 풍부도를 정확 하 게 정량화 하기 위해, 사용자는 관심 있는 엑 소 좀 표면 바이오 마커를 균일 하 게 표현 하는 순수한 엑 소 좀 모집단과 함께 표준 곡선을 생성 해야 한다. 본 연구는 췌장암 단계 및 예 후6과의 관계를 보고 한 전이 관련 막 단백질, Ephrin A2 수용 체를 발현 하는 엑 소 솜의 풍부 함을 분석 한다.
    참고: 인간 췌 장 암 세포 주 PANC-1 및이의 외 상 염색체는이 단백질을 발현 하는 것으로 알려져 있고이 세포 주 로부터 단 리 된 엑 소 좀은 복잡 한 엑 시에이 단백질을 발현 하는 엑 소 솜의 수를 정량화 하는 표준 곡선을 생성 하는데 사용 되었다 샘플.
  2. 배양 세포는 무 혈 청 배양 배지에 48 시간 37에서 세포 내 엑 소 좀 축적을 가능 하 게 하 여, 현 탁 배양을 원심 분리 하거나 또는 부착 세포 배양 물 로부터 배양 배지를 직접 흡 인 하 여 배양 상층 액를 분리 하였다.
  3. 수집 된 배지를 2000 x g 에서 30 분간 원심 분리 하 여 이물질을 제거 하 고 상층 액을 회수 한다.
  4. 적절 한 용량의 0.45 µm 저 단백질 결합 필터 유닛을 통해 명확히 된 배양 상층 액을 여과 한다 (예컨대 250 mL 폴 리피 설 폰 진공 여과 장치).
  5. 3200 x g 에서 원심 분리 하 여 얻어진 여 액을 10만 공칭 분자량 제한 필터 시스템을 사용 하 여 250 µ l 최종 부피로 농축 한다. 이 필터에서 보존 된 볼륨을 수집한 다음, 200 µ L PBS로 필터를 세척 하 고이 세척 부피를 수집 된 엑 소 좀 샘플 부피와 결합 하십시오.
  6. 이 샘플을 45 분 동안 21000 x g 에서 원심 분리 하 고 침전 된 물질을 수집 하지 않도록 주의 하면서 상층 액을 조심 스럽게 복구 하십시오.
  7. 회수 된 상층 액을 10만 x g 에서 3 시간 동안 원심 분리 하 여 엑 소 솜을 침전 시켰다. 상 청 액을 멀리 흡입 하 고 100 µ L PBS에서 엑 소 좀 펠 릿을 수집 합니다.
  8. 얻어진 엑 소 좀 현 탁 액을 4°c에서 24 시간 내에 또는-80 ° c에서 장기간 보관 하는 경우에 저장 한다.
    주: 동결 융해 주기를 반복 하는 엑 소 좀 샘플을 적용 하지 마십시오.
  9. 엑 소 좀의 직접 측정에 의해 혼합 후 엑 소 좀의 분 취를 정량화 (예를 들어, 나노 입자 추적 분석 또는 조정 가능한 저항 맥 박 감지에 의해, 또는 마이크로 bicin전북에의 한이 물의 단백질 농도를 측정 하 여 산 성 분석 법, 또는이에 상응 하는 방법으로 서 엑 소 좀 양을 근사 하는 것) (16).
  10. 엑 소 좀 서 스 펜 션의 일련 희석 액을 생성 하 여 나노 입자 신호를 입력 엑 소 좀 수 또는 단백질 함량에 비교할 수 있도록 한다.
  11. 각각의 엑 소 좀 표준의 1 µ L을 분석 플레이트 상에 서 각각의 복제 웰에 전달 한다.
    주: 표준 곡선은 나노 입자 신호와 엑 소 좀 농도 사이의 상관관계 선의 기울기를 계산 하기 위해 사용 될 수 있으며 (1) 실험 시료에서 표적 엑 소 솜의 상대적인 농도를 확인 하 여 분석 성능을 평가 하 고 (2).

4. 인간 혈장 또는 혈 청 샘플 처리

  1. 엑 소 좀 분석에 필요할 때까지 표준 방법으로 혈장 또는 혈 청 샘플을 수집 하 고-80 ° c에서 보관 하십시오. 실내 온도 물 목욕에서 샘플을 빠르게 해 동. 반복적으로 해 동 된 샘플을 반전으로 혼합 하 여 균질 한 현 탁 액을 촉진 합니다.
    참고: 혈 청 및 혈장 샘플의 결과는 응고 반응 중에 엑 소의 현저한 방출이 있기 때문에 동등 하지 않을 수 있습니다.
  2. 혈장 또는 혈 청 샘플을 15 분 동안 500 x g에서 원심 분리 하 여 단백질 응집 체 및 기타 이물질을 침전 시킵니다. 혈장 또는 혈 청 샘플의 취 액을 신선한 튜브로 전달 하 고 PBS를 추가 하 여 1:1 희석을 생성 합니다. 희석 된 샘플을 적절 하 게 부드러운 볼 텍 싱 또는 반전으로 섞으 세요. 각 혈장 또는 혈 청 현 탁 액의 1 µ L을 분석 판에 각각의 복제 우물에 전달 하십시오.

5. 엑 소 좀 캡처 및 감지

  1. 샘플 당 8 개의 복제를 사용 하 여 1 µ의 엑 소 좀 샘플로 차단 된 EV 캡쳐 슬라이드의 웰을 로드 하 고,가 습 챔버에서 4°c에서 밤새 슬라이드를 배양 한다. 모든 샘플 웰을 흡 기 한 다음 웰을 세척 하 고 로드 된 엑 소 좀 샘플에서 결합 되지 않은 엑 소 솜 및 기타 오염 물질을 제거 하기 위해 1 µ L/우물을 추가 합니다.
  2. 이전에 준비한 AuNR-IgG 현 탁 액의 1 µ L/웰을 사용 하 여 샘플 웰을 로드 하 고,가 습 챔버에서 37 ° c에서 2 시간 동안 슬라이드를 배양 한다. 나노 입자 용액을 흡 인 하 고 믹서를 사용 하 여 10 분 동안 0.01%의 트윈-20 (PBST)으로 보충 된 PBS에서 슬라이드를 세척 한 다음 회전 믹서를 사용 하 여 10 분 동안 모든 샘플 웰을 증류수로 세척 하 고 후속 LMDFM 이미지를 위해 공기 건조 합니다.
    참고: 분석 간 변형 계수 (Cv)는 동일한 샘플의 8 개 복제에서 평가 됩니다. Cv > 20%를 나타내는 샘플은 정보를 제공 하지 않는 것으로 간주 되며 충분 한 샘플이 있는 경우 반복 해야 합니다.

6. DFM 이미지 캡처

  1. 엑 소 좀에 대 한 이미지 캡처 어두운 필드 콘덴서 (1.2 < NA < 1.4)를 장착 한 현미경에 부착 된 디지털 카메라를 사용 하 여 일관 된 조명에서 정량화 하 고 1/220의 노출 시간을 채용한 4x 대물 렌즈.
  2. 이미지 캡처 소프트웨어를 엽니다.
    참고: 우리는 아래에 설명 된 프로토콜에 대 한 NIS-요소 현미경 이미징 소프트웨어 ( 재료 표참조)를 사용 하지만, 그 이미지 캡처 매개 변수와 일치 할 수 있는 다른 소프트웨어를 사용 하는 것이 가능 하다. NIS-요소 뷰어 이미징 소프트웨어는 분석, 시각화 및 보관 도구가 포함 된 이미지 파일 및 데이터 세트를 볼 수 있는 무료 독립형 프로그램입니다. 아래 매개 변수는 자동 초점이 있는 현미경과 여러 이미지를 자동적으로 캡처하고 하나의 이미지로 스티치 할 수 있는 자동화 된 단계 이기도 합니다.
  3. 현미경 단계에서 슬라이드를 거꾸로 놓고 슬라이드 위치를 조정한 후 콘덴서 렌즈가 슬라이드에 접촉 하는 슬라이드 뒤쪽에 소량의 침 지 오일을 바릅니다.
  4. 소프트웨어 인터페이스에서 live 버튼을 클릭 하 고 높은 농도 표준에 대해 노출 시간을 조정 하 여 이미지가 포화 상태가 되지 않도록 합니다.
  5. 가져오기 탭에서 큰 이미지 스캔 창을 열고 다음과 같이 소프트웨어 인터페이스 매개 변수를 설정 합니다. 매크로 이미지 광학 conf = 현재; 목표: 2 배, 스캐닝 광학 Conf = 현재 목표: 2 배; 스티치 오버랩 = 20%; 스 티 칭 경유 = 최적 경로.
  6. 큰 이미지 만들기, 스테이지 이동 중 활성 셔터 닫기, 각 캡처 전에 20ms, 시작 시 수동으로 포커스를 선택 하 고 20 필드 마다 단계별 초점을 사용합니다. 이러한 설정은 스캔 한 이미지와 함께 저장 됩니다.
  7. 현미경 단계를 이동 하 여 대상 스캔 필드의 왼쪽 상단 오른쪽 하단 한계 를 정의 합니다. 초점을 조정 하 여 모니터에서 선명한 이미지를 얻고 초점을 맞춘 이미지의 조명 불규칙성을 최소화 하기 위해 필요에 따라 콘덴서 설정 및 환경 조명을 조정 합니다.
  8. 소프트웨어에서 이미지 출력 파일의 이름을 지정 합니다. 스캔 버튼을 클릭 하 여 현미경이 전체 슬라이드의 스티치 이미지를 스캔 하 고 생성 하 고 저장 하도록 합니다.
  9. 사용 중인 이미지 캡처 소프트웨어로 저장 된 이미지를 열고 ImageJ의 DSM 플러그인에 대 한 후속 분석을 위해 1/8 규모로 저장 하십시오.

7. DFM 이미지 분석

  1. ImageJ 프로그램 (https://imagej.nih.gov/ij/)을 다운로드 합니다. Https://imagej.net/Plugins#Installing_plugins_manually에 나열 된 지침을 사용 하 여 ImageJ에 DSM 알고리즘 플러그인을 설치 합니다.
  2. ImageJ 소프트웨어를 열고 DSM 알고리즘 내에서 다음 입력 된 매개 변수를 설정 합니다. 윤곽 임계값 (Ct) = 253.020, 유형 = 빨간색, 가운데 눈금 = 0.8, 낮음/높음 (Ht) 정량화 한계 = 0/62.
  3. ImageJ와 섹션 6.8에서 저장 된 이미지를 엽 니. 플러그인 탭에서 DSM 스캔 버튼을 선택한 다음 열린 이미지에 따라 열과 행의 수를 정의 하십시오. 이 프로그램은 검출 영역을 인식 하 고 자동으로 영역에 따라 나노 입자의 산란 강도를 분석 할 수 있다. Dsm 검사 창 내에서 다음 입력 매개 변수를 설정 합니다. 크기 조정 백분율 = 25, 스폿 지름 (픽셀 단위) = 190-200, 지름 범위 = 32, DSM 구성-낮음 한계 = 0, 상한 = 62, 인접 거리 = 100, 빼기 바이어스 = 0.
    주: 나노 입자의 분산 강도의 결과는 슬라이드의 결합 된 엑 소 솜의 양을 반영 합니다.

Representative Results

멀티 웰 단백질 A/G 코팅 슬라이드 (도 1a)는 항 EphA2 항 체로 기능화 하였으며, 그 후 췌장암 환자의 혈 청 샘플 로부터 EphA2 양성 엑 소 좀을 포착 하기 위해 사용 된 후 (1 µ l/웰)과 인큐베이션 항-CD9 항 체 (도 1b)를 사용한 금 나노 노로 드 접합. 이들 나노 입자 로부터 산란 된 빛의 DFM 이미지는 각 웰에서의 EphA-2 포지티브 엑 소 좀을 정량 하기 위해 ImageJ 소프트웨어에서의 DSM 플러그인을 사용 하 여 분석 하였다. DSM 알고리즘은 자동으로 샘플의 경계를 정의 하 고, 아티팩트에서 노이즈를 필터링 하 고, 각 웰에서 산란 된 신호를 계산 하 고,이 정보를 출력 합니다 (그림 2). DSM 알고리즘은 샘플에 존재 하는 스크래치 나 이물질 로부터 광산 산란 아티팩트를 강하게 감쇠 하 고, 나노 입자 검출의 민감도와 재현성을 향상 시키며, 높은 처리량을 위해 슬라이드 이미지의 배치를 자동으로 처리할 수 있습니다. 사용. 이 알고리즘은 ImageJ 명령과 매개 변수를 사용 하 여 이미지 배경을 빼고 각 웰에서 산란 신호를 계산 하 고 데이터 및 이미지 파일을 출력 합니다 (그림 3). 관심 영역은 ImageJ 매크로 프로그램의 윤곽 임계 함수를 사용 하 여 캡처 이미지의 고 강도 잘 경계에 의해 정의 된다. 이미지 분석은 predefined 윤곽 임계값과 이미지 매개 변수를 사용 하 여 각 웰에 대 한 나노 입자 산란 강도를 계산 합니다.

이전 작업에서 보고 된 바와 같이 (리 앙 외6), 판 c-1 세포 배양 물 로부터 단 리 된 엑 소 솜은 투과 전자 현미경 및 웨스턴 블랏이 특징으로 크기 범위, 형태학 및 단백질 마커를 나타내 었 다 고 순도 엑 소 좀 샘플과 일치 하는 발현. 우리의 이전 작업과 동일한 절차를 통해 제조 된 PANC-1 엑 소 솜이 여기에 사용 되어 엑 조 좀 정량화를 위한 nPES 분석을 검증 했습니다. 이 분석 법은 EphA2 항 체를 사용 하 여 총 엑 소 좀 인구 로부터 많은 외 용 체를 포착 하 고 일반 엑 소 좀 단백질에 대항하는 항 체가 포획 된 외 상 염색체를 검출 CD9. 0.24에서 1.2 µ의 단백질 농도로 순차적으로 희석 된 PANC-1 엑 소 좀 샘플을 사용 하 여 얻어진 결과는 복제 웰에서 양호한 재현성을 나타내 었 다 (도 4a) 및 분산형 응답과 강력한 선형 상관관계 엑 소 좀 단백질 농도 (도 4b).

이 방법의 잠재적인 적용을 입증 하기 위해, 췌장암 환자 로부터 혈 청 샘플을 분석 하 여 암 관련 바이오 마커 EphA2를 발현 하는 혈 청 엑 소 솜의 풍부 함을 검출 하 고, 항 EphA2 항 체를 사용 하 여 항-CD9 항 체와 컨 쥬 게이 팅 된 혈 청 및 나노 입자 로부터 표적 외 상 염색체를 직접 포착 하 여 결합 된 엑 소 솜을 검출 한다. 이 분석은 췌 장 암 환자에 게 서 혈 청 샘플이 그들의 통제 보다는 더 높은 수준의 EphA2 + 엑 소 솜 (그림 5)을 significantly 것을 밝혔다.

Figure 1
도 1: 엑 소 좀 정량화 방식. (A)이 검정에 사용 되는 다중 웰 단백질 A/G 슬라이드 (192 웰)의 개략도. (B) 표적 엑 소 솜은 혈 청 및 혈장을 포함 하는 샘플 로부터 직접 포획 되며, 슬라이드에 결합 된 포획 항 체 (예컨대 항 EphA2 항 체)에 대 한 표면 고 정화에 의해, 다음 검출과 함께 컨 쥬 게이 션 된 금 나노를 인큐베이션 한다 DFM 이미지 분석에 의해 분석 하기 전에 항 체 (예: 항 CD9 항 체). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 2
그림 2: LMDFM 이미지에 DSM 알고리즘을 적용 하 여 엑 소 좀 정량화. 낮은 배율 이미지는 스크래치에서 발생할 수 있는 배경 신호 및 신호 아티팩트를 제거 하는 DSM 알고리즘으로 처리 되며, 공 극, 이물질 및 고르지 않은 샘플 조명은 골드 나노 로드 신호의 강력한 감지를 가능 하 게 합니다. 엑 소 좀 농도와 상관. 이 그림은 태양, d. 외. 낮은 배율의 나노 입자 광 산란을 정량화 하는 노이즈 감소 방법의 어두운 필드 현미경 원거리 이미지에 적용 되었습니다. 분석 화학. 12001-12005 (2016) 88 저작권 (2016) 미국 화학 학회. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 3
그림 3: DSM 알고리즘 명령 및 출력의 개략도. 표시 된 단계는 ImageJ에서 기본 명령을 사용 하 고 모든 입력 매개 변수는 그래픽 사용자 인터페이스를 통해 실험의 요구 사항에 따라 선택 됩니다. 이 그림은 태양, d. 외. 낮은 배율의 나노 입자 광 산란을 정량화 하는 노이즈 감소 방법의 어두운 필드 현미경 원거리 이미지에 적용 되었습니다. 분석 화학. 12001-12005 (2016) 88 저작권 (2016) 미국 화학 학회. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 4
그림 4: nPES의 LMDFM 이미지 및 DSM 출력 데이터 (A) npes 분석의 lmdfm 이미지는 panc-1 엑 소 솜의 농도 구배를 분석 하 고 (B)이 슬라이드에서의 광 신호와 외 각 농도의 선형 상관관계 (왼쪽에서 오른쪽으로: 0.24, 0.356, 0.53, 0.80, 1.20 µ µ l 각 열에 대해 각각). 데이터는 평균 ± SE, n=6으로 제시 되 고, 각 농도의 복제에 대 한 Pearson 상관 계수 r2 = 0.99 및 변동 계수가 0.2 <. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 5
그림 5: EphA2+ 엑 소 솜의 LMDFM 신호는 췌장암이 있거나 없는 환자에 게 서 혈 청이 다릅니다. EphA2 포획 항 체를 이용 하 여 nPES에 의해 분석 된 혈 청 샘플 (암-관련) 및 항 CD9 검출 항 체 (일반 엑 소 좀 마커)와 함께 환자 들의 혈 청 샘플에서 EphA2 + 엑 소 솜의 농도에 현저한 차이를 나타내 었 고 췌 장 암 (n=7/그룹) 없이. 결과는 평균 ± SE로 표시 됩니다. * *p = 0.002 (양면) 이 그림은 [Sun]에서 수정 되었습니다. 낮은 배율의 어두운 영역 현미경 원거리 이미지에서 나노 입자 광 산란을 정량화 하는 노이즈 감소 방법. 분석 화학. 88, 2016 12001-12005). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Discussion

외 산 염은 성숙한 방출 하기 위하여 플라스마 막과 융합을 겪는 다 수의 내 산 소포를 포함 하는 다량의 내 산 소의 전문화 한 부분 집합을 생산 하는 외부의 내 시경 막의 통제 된 invaginations에서 생깁니다 세포 외 공간에 상 염색체. 이 생물 발생 통로 때문에, 엑 소 솜은 자궁내 막과 결합 하는 막 분 획과 관련 된 멤브레인 바인딩 요소 뿐만 아니라 다양 한 종류의 사이토 솔 릭 성분을 포함 하 고, 따라서 단백질, DNA의 화물를 함유 할 수 있습니다 및 기원20의 세포의 표현 형을 반영할 수 있는 다양 한 RNA 아 류 (Mrnas, 마이크로 리 나 스, 긴 비 부호화 rnas). 엑 소 솜은 대부분의 세포 유형이 아닌 대부분의 경우 분 비 되기 때문에 질병 또는 악성 세포 로부터 분 비가 증가 하 고 대부분의 체액에 축적 될 수 있으므로, 엑 소 솜은 유망한 최소한의 것으로 서 포괄적이 고 체계적인 조사의 대상이 됩니다 침략 적 수단은 특정 질병 상태를 검출 하 고 치료21에 대 한 그들의 반응을 감시 하는 것을 의미 합니다.

대부분의 현재 엑 소 좀 분석에 요구 되는 엑 소 좀의 분리는 장기간의 노동 집약적인 절차 이며, 잠재적인 의학적 관련성을 가진 엑 소 좀 관련 바이오 마커의 임상 번역을 제한 합니다. 대부분의 일반적인 분리 방법 (초 원심 분리, 크기 배제, 침전 등)은 종종 크기 범위의 중복으로 인해 마이크로 소포 (100~1000nm) 및 사 멸 몸체 (100~5000nm)에서 엑 소 솜 (30-1100nm)을 충분히 구별 하지 못하고 물리적 성질 또는 엑 소 좀 무결성15를 손상 시킬 수 있다. 새로운 접근법은 더 빠른 엑 소 좀 분석을 허용 할 수 있는 개발 중에 있지만 임상 설정에서 이러한 플랫폼을 많이 구현 하는 것이 얼마나 실현 가능한 지는 명확 하지 않습니다.

이 보고서에서는 저 배율 어두운 시야 현미경 이미지를 사용 하 여 나노 입자 기반의 고 처리량 엑 소 좀 정량화를 허용 하는 새로운 접근법을 제시 합니다. 이 방법은 엑 소 좀 정제, 고가의 전용 장비, 또는 새로운 기술 전문 지식을 필요로 하지 않으며, 따라서 대부분의 연구 및 임상 설정에서 빠른 번역에 의무가 해야 합니다. 우리의 분석 법은 강력한 선형 상관관계 (R2 = 0.99)가 존재 하기 때문에 분석 결과가 표준 곡선과 비교 될 때 특정 바이오 마커를 담지 하는 대상 엑 소 좀의 농도를 정밀 하 게 정량 하기 위해 적용 될 수 있습니다. 광학 반응과 엑 소 좀 농도 사이. 이 접근법의 실제 잠재력을 보여주기 위해, 우리는 환자 로부터 얻어진 혈 청 샘플에서 췌장암과 관련 된 엑 소 좀 바이오 마커의 농도를 정량화 하기 위해이 방법을 채용한 데이터를 제공 하 고 있다 췌장암.

LMDFM에서, 전체 샘플 웰은 사용자가 후속 이미지 분석을 위해 캡처할 샘플 필드를 직접 선택 해야 하지만, 표면에서 빛 산란 아티팩트가 적용 되는 고배율 DFM 분석에서 발견 되는 선택 바이어스를 피하기 위해 이미징 됩니다. 얼룩, 스크래치 및 샘플 파편을 포함 합니다. 이 배경은 NIH 이미지 분석 프로그램, ImageJ에서 실행 되는 우리의 DSM 잡음 감소 알고리즘을 사용 하 여 대상 엑 소 좀 파생 신호를 검출 하기 위해 감소 될 수 있지만, 주의의 동적 범위를 줄일 수 있는 이러한 아티팩트를 도입 방지 하기 위해 여전히 취해야 합니다 분석 법.

이 분석에 사용 된 재료:

1 µ L/well을 보유 한 멀티 웰 슈퍼 프로 틴 A/G 슬라이드는 Arrayit 코퍼레이션 (AGMSM192BC)에서 구입 했습니다. 나노 입자는 Nanopartz (C12 -650-50-1, 6.4 x12/mL) 로부터 얻어진 것 이다. DFM 이미지는 일관 된 조명과 1/220의 노출 시간으로 Nikon Ti 이클립스 현미경에 부착 된 Nikon DiR2 디지털 카메라로 촬영 되었습니다. 본 연구에서 사용 된 PANC-1 세포 주는 미국 형 배양 컬렉션에서 구입 하였다.

Disclosures

저자는 경쟁 하는 재정적인 이익이 없다는 것을 선언 합니다.

Acknowledgments

이 작품은 주로 NIH (U01CA214254, R01HD090927, R01AI122932, R01AI113725 및 R21Al126361)에 의해 제공 되는 연구 기금에 의해 지원 되었다, 애리조나 생물 의학 연구 위원회 (ABRC) 젊은 조사원 상.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Eppendorf Repeater stream Fisher Scientific 05-401-040
Eppendorf Research plus Eppendorf 3120000011 0.1 – 2.5 µL, dark gray
Functionalized Gold Nanorods Nanopartz C12-25-650-TN-DIH-50-1 In vitro neutravidin polymer functionalization
HulaMixer Sample Mixer Thermo Fisher Scientific 15920D
Incu-shaker 10L Benchmark Scientific H1010
Inverted Research Microscope Nikon Ti-DH With Dark field condenser, DS-Ri2 camera, and Ti-SH-U universal holder, and motorized stage
NIS-Elements Nikon Microscope imaging software
Phosphate Buffered Saline (1X) GE Healthcare Life Sciences SH30256.02 HyClone
Protein A/G Treated Glass Substrate Slides Arrayit Corp. AGMSM192BC Premium microarray substrate
Q500 Sonicator Qsonica, LLC Q500-110 With standard probe (#4220)
Superblock blocking buffer Thermo Scientific
TWEEN 20 Sigma Life Sciences 9005-64-5

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References

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