Neuartige menschlichen epitheliale Enteroid Modellcharakter für die nekrotisierende Enterokolitis

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Enteroids entstehen als neuartige Modell in der Studie der menschlichen Krankheit. Das Protokoll beschreibt, wie eine Enteroid Modell der menschlichen nekrotisierenden Enterokolitis mit Lipopolysaccharid (LPS) Behandlung von Enteroids generiert aus neonatalen Gewebe zu simulieren. Gesammelte Enteroids zeigen entzündliche Veränderungen, wie Sie die in menschlichen nekrotisierenden Enterokolitis gesehen.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Ares, G. J., Buonpane, C., Yuan, C., Wood, D., Hunter, C. J. A Novel Human Epithelial Enteroid Model of Necrotizing Enterocolitis. J. Vis. Exp. (146), e59194, doi:10.3791/59194 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Nekrotisierende Enterokolitis ist (NEC) eine verheerende Erkrankung des Neugeborenen. Es zeichnet sich durch mehrere pathophysiologische Veränderungen in der menschlichen Darmepithel, führt zu erhöhte intestinale Permeabilität, Rückgabe beeinträchtigt, und erhöhte Zelltod. Zwar gibt es zahlreiche Tiermodelle der NEC, möglicherweise als Reaktion auf Verletzungen und therapeutische Interventionen sehr variabel zwischen den Arten. Darüber hinaus ist es ethisch schwierigen Krankheit Pathophysiologie oder neuartige Therapeutika direkt am Menschen, besonders Kinder zu studieren. Daher ist es äußerst wünschenswert, ein neuartiges Modell von NEC mit menschlichem Gewebe zu entwickeln. Enteroids sind 3-dimensionale Organellen von intestinalen Epithelzellen abgeleitet. Sie sind ideal für die Untersuchung von komplexen physiologischen Wechselwirkungen, Zelle signalisieren und Wirt-Pathogen-Verteidigung. In diesem Manuskript beschreiben wir ein Protokoll, dass Kulturen menschlichen Enteroids nach intestinale Stammzellen von Patienten, die eine Darmresektion zu isolieren. Die Krypta Zellen sind kultiviert, in Medien, die Wachstumsfaktoren, die die Differenzierung in die verschiedenen Zelle Arten aus der menschlichen intestinalen Epithel zu fördern. Diese Zellen wachsen in einer synthetischen, kollagene Mischung von Proteinen, die als ein Gerüst, imitiert die extrazelluläre Basalmembran dienen. So entstehen Enteroids apikalen basolateralen Polarität. Die gleichzeitige Gabe von Lipopolysaccharid (LPS) in den Medien verursacht eine entzündliche Reaktion in den Enteroids, führt zu histologischen, genetische und Protein Ausdruck Änderungen ähnlich denen im menschlichen NEC. Ein experimentelles Modell von NEC mit menschlichem Gewebe kann eine genauere Plattform für Droge und Behandlung vor der Studien am Menschen, bieten, wenn wir uns bemühen, eine Heilung für diese Krankheit zu identifizieren.

Introduction

Menschliche Enteroids sind eine Ex Vivo 3-dimensionale Kultursystem aus Stammzellen isoliert vom Darm Krypten von menschlichen Darm Gewebeproben erzeugt. Dieses bahnbrechende Modell wurde von Hans Clevers Et Al. erstmals in 2007 nach der Entdeckung der Lgr5 + Stammzellen in den Krypten des Dünndarms in Mäuse1. Ihrer Arbeit den Grundstein für die Gründung einer Ex Vivo intestinalen epithelialen Kultur mehrere Zelltypen, die ohne genetische oder physiologische Veränderungen2passagiert werden könnte. Seit dieser Entdeckung wurden Enteroids als ein neuartiges Modell zur normalen Verdauungs-Physiologie und Pathophysiologie von Darmerkrankungen wie die entzündlichen Darmerkrankungen, Wirt-Pathogen Interaktionen und regenerative Medizin2zu studieren.

Die Verwendung von Enteroids als Ex Vivo Modell für die Untersuchung der Darm Pathophysiologie hat mehrere Vorteile gegenüber alternativen Techniken. Seit mehreren Jahrzehnten wurden Tiermodelle und verewigt Darm Krebs-abgeleitete Zellinien zur intestinalen Physiologie3,4,5zu studieren. Einzellige Kulturen repräsentieren nicht die Vielfalt der Zelltypen im normalen Darmepithel, dadurch fehlt Übersprechen von Zelle zu Zelle und Segment-Spezifität in Protein-Expression, Signalisierung und Pathogen-induzierte Krankheit6. Stammzellen in Enteroids differenzieren in die Major Epithelzelle Typen z. B. Enterozyten, Paneth-Zellen, Becherzellen, Enteroendocrine Zellen und mehr3. Sie weisen Polarität, epithelialen Transport-Funktionen durchführen und Darm Segment Spezifität6ermöglichen. Da Enteroids mehrere Zelltypen des menschlichen Darmepithel zusammenfassen können, sind sie in der Lage, diese anerkannten Einschränkung von Krebs Zelle-basierten Systemen zu überwinden. Im Laufe der Zeit Derivate von Zelllinien sind subcloned und weiterentwickelt werden, um größere Vielfalt in Protein-Expression und Lokalisation3aufweisen. Im Gegenteil, können Enteroids ohne genetische oder physiologische Veränderungen2passagiert werden. Obwohl zahlreiche Tiermodelle für NEC vorhanden sind, möglicherweise als Reaktion auf Verletzungen und therapeutische Interventionen sehr variabel zwischen den Arten. Aufgrund dieser Beschränkungen Scheitern Therapeutika abgeleitet aus Tiermodellen 90 % der Zeit als in Studien am Menschen aufgrund unterschiedlicher Toxizität oder Wirksamkeit3getestet. Enteroids dienen als vielversprechende präklinischen Modellen, die diese Mängel überwinden können, führt zu einem besseren Verständnis der komplexen Pathophysiologie Darm und damit erfolgreiche und kostengünstige therapeutische Innovationen. Es gibt auch neuere Erkenntnisse, die das Alter des Gewebes, die eine Enteroid entsteht aus biologisch wichtigen7bleibt. Dies ist ein besonders wichtiges Detail für unser Modell, da Enteroids von Neugeborenen Gewebe, dadurch Erhalt physiologische Relevanz für Patienten mit NEC generiert werden.

Das Enteroids-Dienstprogramm als Modelle für menschliche Krankheiten expandiert weiter in der Hoffnung, Kuren, schwere und durchdringende Bedingungen. Nekrotisierende Enterokolitis (NEC) ist eine verheerende Darm Erkrankung des Neugeborenen gekennzeichnet durch intestinale Nekrose und führt häufig zur Perforation der Darmwand, Sepsis und Tod8. Aufgrund der komplexen und multifaktorielle Pathophysiologie der NEC hat der genaue Mechanismus der Krankheit noch nicht vollständig geklärt; jedoch hat deutlich erhöhte intestinale Permeabilität in der Krankheit Prozess8verwickelt. Da die Studie von NEC und potenzielle Therapeutika ist ethisch anspruchsvollen am Menschen, besonders Kinder, es ist höchst wünschenswert, eine biologisch relevante Enteroid Modell von NEC mit menschlichen Neugeborenen Gewebe zu nutzen. Bisher haben Enteroids nur eine begrenzte Rolle in der Studie von NEC. Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung von Enteroids abgeleitet vom menschlichen Darm Gewebeproben als Roman ex Vivo Modell für die Untersuchung von nekrotisierende Enterokolitis.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Institutionelle Review Board Genehmigung war (IRB #2013-15152) für die Sammlung von Gewebeproben von Patienten mit Darmresektion an Ann und Robert H. Lurie Children es Hospital of Chicago, Chicago, IL. Alle Protokolle wurden in Übereinstimmung mit den institutionellen und nationalen Richtlinien und Vorschriften für menschliches Wohlergehen durchgeführt. Schriftliche Zustimmung der Eltern fundierter war erforderlich und vor der Probenentnahme in allen Fällen erhalten.

(1) Reagenz Vorbereitung

  1. Gesamte Gewebe Sammlung Nährmedien Stammlösung vorbereiten: 1 L der Dulbeccos geändert Eagle Medium (DMEM), 110 mL des fetalen Bovine Serum (FBS) 11 mL Penicillin-Streptomycin (Endkonzentration 1 %) und 1,1 mL Filter sterilisiert Insulin (Endkonzentration 0.1 %). Shop-Stammlösung bei 4 ° C.
  2. Bereiten Sie Chelating Puffer #1: 30 mL von Nährmedien (wie unter 1.1 beschrieben), 600 µL 0,5 M Ethylenediaminetetraacetic Säure (EDTA) (Endkonzentration 10 mM), 300 µL Gentamicin (Endkonzentration 1 %) und 60 µL Amphotericin B (Endkonzentration 0,2 %). Shop-Stammlösung bei 4 ° C.
  3. Bereiten Sie Chelating Puffer #2: 30 mL von Nährmedien (wie unter 1.1 beschrieben), 300 µL 0,5 M EDTA (Endkonzentration 5mM), 300 µL Gentamicin (Endkonzentration 1 %) und 60 µL Amphotericin B (Endkonzentration 0,2 %). Shop-Stammlösung bei 4 ° C.
  4. Bereiten Sie menschliche Minigut Medien: 41,4 mL DMEM/F-12, 5 mL des FBS (letzten 10 %), 500 µL von Penicillin-Streptomycin (Endkonzentration 1 %), 500 µL von L-Glutamin (Endkonzentration 1 %), 500 µL Gentamicin (Endkonzentration 1 %), 100 µL Amphotericin B (Finale Konzentration von 0,2 %), 500 µL 1 M N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane Sulfonsäure (HEPES) (Endkonzentration 10 mM), 500 µL 100 X n-2 ergänzen und 1 mL 50 X B-27 ergänzen minus Vitamin A für ein Gesamtvolumen von 50 mL. Shop-Stammlösung bei-20 ° C.
  5. Bereiten Sie menschliche Minigut Media Complete: 10 mL der menschlichen Minigut Medien (vorbereitet in 1.4), 10 µL von 100 µg/mL Wnt3a (Endkonzentration 100 ng/mL), 10 µL von 100 µg/mL Birne (Endkonzentration 100 ng/mL), 10 µL von 1 mg/mL und R-Spondin (Endkonzentration 1 µg/mL) , 10 µL von 500 µg/mL Epidermal Growth Factor (EGF) (Endkonzentration 50 ng/mL), 10 µL 1 M N-Acetylcystein (Endkonzentration 1 mM), 10 µL 10 mM Y-27632 (Endkonzentration 10 µM), 10 µL von 500 µM A-83 (Endkonzentration 500 nM), 10 µL 10 mM SB202190 (final Konzentration 10 µM), 100 µL 1 M Nicotinamid (Endkonzentration 10 mM) und 1 µL 100 µM [Leu] 15-Gastrin 1 (Endkonzentration 10 nM). Gesamtvolumen 10 mL. Shop-Stammlösung bei 4 ° C.
    Hinweis: Lösungen müssen innerhalb von 48 h verwendet werden.

2. Krypta Isolierung und Beschichtung von ganzen Gewebe

  1. Zeitpunkt der Erfassung in der operativen Suite legen Sie die menschliche kleine Darmgewebe Probe in kalten Dulbecco Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (DPBS). Waschen Sie die Probe in kalten DPBS bis frei von Stuhl und Blut. Speichern Sie Probe bei 4 ° C bis bereit zur Krypta Isolierung in RPMI 1640 Medium.
    Hinweis: Gewebe kann nicht mehr als 24 Stunden gelagert werden.
    1. Stellen Sie sicher, dass das Präparat frei von Stuhl und Blut. Mit zarten sezierenden Schere, entfernen Sie alle überschüssige fetten oder chirurgische Clips/Heftklammern etc.. Wiegen Sie die Probe.
      Hinweis: Ziel für ein Stück ca. 0,75 bis 2,5 g.
  2. Das Exemplar in 0,5 cm lange Stücke schneiden und legen in 30 mL chelatisierenden Puffer #1 (wie in Schritt 1.2 vorbereitet).
    1. Schütteln Sie bei niedriger Geschwindigkeit für 15 min bei 4 ° C.
    2. Gewebe durch 100 µm Zelle Sieb filtern und Durchströmung zu verwerfen.
  3. 30 mL chelatisierenden Puffer #2 fügen Sie das Gewebe hinzu (wie in Schritt 1.3 vorbereitet).
    1. Schütteln Sie bei niedriger Geschwindigkeit für 15 min bei 4 ° C.
    2. Gewebe durch ein 100 µm Zelle Sieb filtern und Durchströmung zu verwerfen.
  4. Tauen Sie 500 mL der Basalmembran Matrix auf Eis für Schritt 2,8.
  5. 10 mL kalte DMEM in einem 50 mL konische Röhrchen Gewebe hinzu und schütteln Sie kräftig von Hand für 10 s.
    1. Durch ein 100 µm Zelle Sieb filtern und Durchströmung (Markierung Nr. 1) zu sammeln. Halten Sie Schlauch #1 auf dem Eis.
    2. Ein weiterer 10 mL kalte DMEM in einem separaten 50 mL konische Röhrchen Gewebe hinzu und schütteln Sie kräftig von Hand für 10 s.
    3. Durch ein 100 µm Zelle Sieb filtern und Durchströmung (Label #2) zu sammeln.
    4. Wiederholen Sie zwei weitere Male, bis es vier konische Röhren mit Durchströmung (beschriftete Röhrchen #1-4 gibt).
  6. Filter Schlauch #1 Lösung durch eine 100 µm Zelle Sieb und Transfer Durchströmung in 15 mL konische Röhrchen (Markierung Nr. 1). Wiederholen Sie für #2-4.
    1. Zentrifuge 15 mL Tuben #1-4 200 X g für 15 min bei 4 ° C.
  7. In der Laminar-Flow-Haube des Überstands von Röhren #1-4 entfernen und entsorgen. Nicht zu stören die Wolke des Gewebes unmittelbar oberhalb der Pellet, auch wenn das bedeutet, dass einige überstand hinterlässt.
    1. Vermischen Sie durch langsam Pipettieren das Pellet mit den übrig gebliebenen Überstand in Tuben #1-4.
    2. Übertragen Sie die Mischung aus Röhren #1-4, in einem einzigen 2 mL konische Rohr.
    3. Zentrifugieren Sie das konische Rohr bei 200 X g für 20 min bei 4 ° C.
  8. Entfernen Sie den Überstand zu und wieder auszusetzen Sie das Pellet in 500 µL der Basalmembran Matrix.
    Hinweis:
    halten Sie die Basalmembran Matrix auf dem Eis jederzeit und schnell arbeiten, für die nächsten Schritte. Dieses Produkt polymerisiert sehr schnell bei Raumtemperatur.
    1. Gelten Sie 50 µL der Probe/Keller Membran Matrix Aussetzung zum Zentrum eines Brunnens in einer 24-Well-Platte. Dies sollte kuppelförmigen erscheinen.
      Hinweis: Verwendung von gekühlten Pipettenspitzen hilft bei reibungsloser Transfer der Suspension, Polymerisation zu minimieren.
    2. Wiederholen Sie die 9-Mal, insgesamt 10 Bohrungen zu füllen.
  9. Legen Sie die 24-Well-Platte in 37 ° C, 5 % CO2 Inkubator für 30 min zur Polymerisation zu ermöglichen.
  10. Jedes gut fügen Sie 500 µL des menschlichen Minigut Medien vollständig (wie in Schritt 1.5 vorbereitet hinzu). Ersetzen Sie alle 2 Tage.
  11. Sammeln Sie Enteroids nach 5-10 Tagen, wenn angehende visualisiert wird. Siehe Schritte 4 und 5 für Anweisungen.

(3) Induktion von experimentellen NEC

  1. 500 µL des menschlichen Minigut Medien vollständig (wie in Schritt 1.5 vorbereitet) in jede Vertiefung fügen Sie 10 µL von 5 mg/mL Lipopolysaccharid (LPS hinzu) am Tag 0. Ersetzen Sie alle 2 Tage bis zur Abholung.

4. Vorbereitung für die Einbettung von Paraffin

  1. Entfernen Sie vorsichtig die Medien.
    1. Fügen Sie 1 mL PBS und pipette vorsichtig nach oben und unten um die Basalmembran Matrix mit Sorgfalt nicht zu lösen Sie die Enteroids aufzulösen.
    2. Zentrifugieren Sie PBS/Enteroid Mischung bei < 300 X g für 5 min zu Pellets und PBS zu entfernen.
  2. Fügen Sie 4 % Paraformaldehyd, bei Raumtemperatur 1 Stunde zu beheben.
  3. Zentrifugieren bei < 300 X g für 5 min pellet, und entfernen PBS.
    1. Sanft mit 1 mL PBS waschen und Zentrifugieren bei < 300 X g für 5 min pellet, und entfernen PBS.
    2. Wiederholen Sie Schritt 4.3.1.
  4. Schmelzen Sie ein ausreichendes Volumen an das Gewebe Verarbeitung Gel (rund 300 µL) indem man die gewünschte Menge in einem konischen Rohr und Erwärmung in einem Trockenbad Inkubator bei 65 ° C für 3-10 min bis Flüssigkeit.
    1. Fügen Sie das Gewebe Verarbeitung Gel zum Pellet und mischen Sie vorsichtig.
    2. Legen Sie auf einem Deckgläschen einen kleinen Klonen Ring.
    3. Pipette das Gewebe Verarbeitung von Gel und Enteroid Mischung zu klonen ringförmig auf einem Deckgläschen montiert.
  5. Lassen Sie das Gewebe Verarbeitung Gel-Enteroid-Gemisch, bei 4 ° C für 1 h zu festigen.
    1. Tauchen Sie den Klonen Ring mit erstarrten Gemisch zu 70 % Ethanol in Vorbereitung für das Paraffin einbetten.

5. Enteroid Sammlung für RNA und Proteingewinnung

  1. Entfernen Sie vorsichtig menschlichen Minigut Medien komplett aus jedem Brunnen ab.
  2. Fügen Sie 1 mL PBS und pipette vorsichtig nach oben und unten um die Basalmembran Matrix auflösen. Achten Sie darauf, dass Sie nicht die Enteroids zu distanzieren.
    1. Legen Sie PBS/Enteroid Mischung in ein steril 2 mL konische Rohr.
    2. Zentrifugieren bei < 300 X g für 5 min zu Pellets.
    3. Entfernen Sie vorsichtig die PBS, kümmert sich nicht um die Enteroids zu entfernen.
  3. Wiederholen Sie Schritt Serie 5.2 zwei weitere Male.
  4. Im-80 ° C bis bereit für Protein/RNA-Extraktion oder Einfrieren.
  5. Durchführen Sie gen Ausdruck und Protein isoliert von der Enteroids mit etablierten qRT-PCR und Western Blotting-Techniken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Unmittelbar nach der Beschichtung erscheinen die frisch isolierten Darm Krypten als längliche Stangen. Innerhalb von Stunden nimmt die Enteroid auf ein rundes aussehen (Abbildung 1(ein). In den nächsten Tagen startet die Enteroids Kugeln bilden, wie in Abbildung 1bzu sehen. Angehende sollte zwischen 5 bis 10 Tagen (Abbildung 1c) und Enteroid Sammlung sollte zu diesem Zeitpunkt auftreten.

Die wachsende Enteroids zeigen auch Polarität, enthält ein zentrales Lumen, einem apikalen Rand und einer basolateralen Domäne (Abbildung 2). Enteroids zeigen auch strukturelle Integrität, vertreten durch eine robuste Aktin-Zytoskelett (Abbildung 3). Nach einigen Tagen in der Kultur der LPS behandelt Enteroids erleben Sie mehr Apoptose und haben eine niedrigere Rendite als die Kontrollgruppe (Abbildung 4). Wie in menschlichen NEC und murinen Modellen von NEC9gesehen, fand ein erhöhten Ausdruck von Toll-Like Rezeptor 4 (TLR4) LPS behandelt Enteroids im Vergleich zu Kontrollen (Abbildung 5).

Figure 1
Abbildung 1: Gruft Kultur und menschlichen Enteroid Bildung von ganzen Gewebe. (einen) Tag 0 Krypta Kultur mit Runde, flache Aussehen. (b) Tag 4 Enteroids mit Sphäroid Bildung. (c) Tag 7 Enteroids mit angehenden (schwarzer Pfeil). Skalieren von Balken = 50 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. 

Figure 2
Abbildung 2 : Histologischen Erscheinungsbild eines Enteroid. Haemotoxylin und Eosin Färbung. Die Enteroid zeigt ein zentrales Lumen und Ausstellungen Polarität mit einer apikalen und basolateralen Domäne. Die Haemotoxylin (lila) stellt den Kern, während der Eosin (rosa) cytosolische Komponenten darstellt. Maßstabsleiste = 20 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3 : Enteroid-Aktin-Zytoskelett. Immunoflorescence Schliffbild von einer Enteroids. Die Enteroid zeigt strukturelle Integrität, wie gezeigt durch die prominente Aktin-Cystoskeleton (Magenta). Kerne gebeizt mit DAPI (blau), Skala bar = 100 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 4
Abbildung 4: Menschliche Enteroid Kultur Ertrag sinkt mit LPS Behandlung. Tag 5-Enteroids in der Kultur, aus der gleichen ganze Gewebeprobe gewachsen. (ein) behandelt Enteroids mit Steuerung Nährmedien. Zeigen Sie robustes Wachstum. (b) Enteroids mit LPS in Kulturmedien behandelt. Nur wenige Überlebende Enteroids. Maßstabsleiste = 200 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 5
Abbildung 5: Erhöht TLR4 Ausdruck in experimentellen NEC Enteroids. (ein) qRT-PCR zeigte erhöhte TLR4 mRNA Ausdruck in Enteroids ausgesetzt, LPS (p = 0,03). (b), Western-Blot Analyse zeigt erhöhte TLR4 Ausdruck in experimentellen menschlichen Enteroid NEC (p = 0,02). Repräsentative western-Blot dargestellt. Werte sind Mittel ± SEM von 3 Proben pro Gruppe. * p < 0,05 von der Student t -Test. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Dieser Roman ex Vivo menschlichen Darm Enteroid Modell dient als eine nützliche Methode für die Studie der Darmbarriere Dysfunktion bei nekrotisierende Enterokolitis (NEC). Die Enteroid Verarbeitungsmethoden, die hier vorgestellt wurden von der früheren Arbeit von DRS. Misty Good, Michael Helmrath und Jason Wertheim10,11,12angepasst.

Details rund um das ganze Gewebe Sammlung und Timing der Krypta Isolation sind wichtige Schritte in diesem Protokoll. Gewebe muss sofort zum Zeitpunkt der operativen Resektion erfasst und verarbeitet zur Krypta Isolierung, sobald das Gewebe im Labor eintrifft. Wir ausgewählte Gewebe von Patienten weniger als 3 Monate alt für dieses Modell. Verzögerte Verarbeitung kann innerhalb von 24 h nach der ganzen Gewebe Entnahme auftreten, wenn nötig. Darüber hinaus beeinflusst die Qualität der menschlichen Gewebeprobe stark den Ertrag der Krypta Isolation. Gesunden Dünndarm ohne zugrunde liegende Pathologie und jüngeren Patienten (< 2 Monate alt) sind gefunden worden, um die besten Ergebnisse erzielen. Darüber hinaus sollte das gesammelte Gewebe aus der gesündesten Gegend, in der Regel an den distalen Enden des resezierten Exemplar gewählt werden. Mit einem größeren Stück Darm verbessert nicht die Krypta Isolation mit der beschriebenen Lösung Bände im obigen Protokoll. Darm Segmente ca. 1-2 cm in der Länge, mit einem Gewicht von 0,75 bis 2,5 g sind optimal. Die Induktion der experimentellen NEC über LPS Exposition wurde von etablierten Kultur und Tier Zellmodelle modelliert. Die etablierten Arbeiten von Hackam Et Al. zeigten die entscheidende Rolle des TLR4 (LPS-Rezeptor) NEC Entwicklung9,13,14,15. LPS Aktivierung des TLR4 stimuliert proinflammatorischen Zytokinen, eine Reduzierung der Barriereintegrität und Aktivierung des subepithelialen Leukozyten, die die Signalisierung Veranstaltungen beteiligt menschlichen NEC zu charakterisieren. TLR4 hat verwickelt als Schlüsselmolekül bei der Förderung von Entzündung7 und Tiere, die fehlende funktionelle TLR4 sind Schutz vor der Entwicklung von NEC15unter Beweis gestellt haben. Zirkulierenden sind LPS erhöhte bei Patienten mit NEC und erhöht im Stuhl und Plasma von Tiermodellen von NEC. LPS induziert Darmentzündung bei Tieren, die menschlichen NEC, ähnelt die unterstreicht die Bedeutung der Entzündung in diesem Stoffwechselweg. Spiegelung der etablierten Zellkulturen und Tiermodellen der NEC, glauben wir, dass Induktion von experimentellen NEC über LPS-Verwaltung in der Enteroid Kultur ein nützliches ex Vivo menschlichen Neugeborenen Modell für die Untersuchung von NEC. Im Einklang mit früheren Berichten in anderen etablierten Modellen demonstriert unsere experimentelle NEC Enteroids erhöhte Expression von TLR4 im Vergleich zu Kontrollen.

Das Protokoll für die Induktion von experimentellen NEC über LPS Exposition hat mehrere wichtige Änderungen und Verbesserungen unterzogen. Zunächst wurden Enteroids gewachsen für 5 Tage, dann geimpft mit LPS für 24 h und anschließend gesammelt. Das Protokoll empfiehlt jetzt LPS Impfung am Tag 0 mit fortgesetzten Exposition in jeder Kultur Medienwechsel bis zur Abholung. Darüber hinaus wurde die Dosierung von LPS optimiert. Nach der Durchführung einer Dosis Kurve und Erprobung mehrere LPS-Konzentrationen, wählte man 5 mg/mL. Experimentieren mit LPS Impfung direkt in die Basalmembran Matrix/Enteroid Mischung zum Zeitpunkt der Beschichtung wurde auch erprobt; aber dies war umständlich und Ergebnisse nicht verbessern.

Gibt es Einschränkungen, die behandelt werden sollten, da die Verwendung des menschlichen Enteroid Modells entwickelt. Seit der Entdeckung im Jahr 2007 wurden mehrere verschiedene Protokolle zur etablieren und Kultur Enteroids. Die zahlreichen Wachstumsfaktoren erforderlich für Enteroid Wartung und Differenzierung fehlende Standardisierung, die Reproduzierbarkeit beeinträchtigen können. Darüber hinaus fehlt Enteroid Kultur mechanische Kräfte, die das menschliche Darmepithel unter physiologischen Bedingungen zu beeinflussen. Druck der luminalen Flow und Peristaltik beeinflussen Gene und Proteine Ausdruck, die in diesem Modell nicht berücksichtigt wird. Dieses Modell fehlt auch Nerven, Immunzellen, Mikrobiom, Gefäßsystem und Mesenchym, die im menschlichen Darm Epithel vorhanden sind.

LPS in diesem Modell der menschlichen intestinalen Enteroid verursacht eine Entzündungsreaktion führt zu histologischen, genetische und Protein Ausdruck Änderungen ähnlich denen in menschlichen NEC gefunden. Zwar gibt es mehrere aktuelle Tiermodellen von NEC, unterschiedlich Reaktion auf intestinale Verletzungen und therapeutische Interventionen zwischen den Arten. Da ist es ethisch schwierigen Krankheit Pathophysiologie studieren oder neuartige Therapeutika direkt beim Menschen, vor allem Säuglinge, testen ist es überaus wichtig, weiterhin dieses Romans ex Vivo Modell von NEC mit menschlichem Gewebe zu kultivieren. Menschliche Enteroids sind gentechnische Veränderung zugänglich und möglicherweise bei der Entwicklung von Therapien für viele menschliche Darmerkrankungen16grundlegende. Zukünftige Richtungen sollten Kultur menschlichen Enteroids auf einem durchlässigen Gerüst in einer Perfusion Kammer mit apikalen und basolateralen fließen, um in-vivo Krypta-Villus Architektur sowie physiologische reproduzieren Kräfte wie Peristaltik und luminalen fließen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde unterstützt durch das nationale Institut für Gesundheit Institut für Diabetes und Magen-Darm und Nieren Krankheit Grant (K08DK106450) und Jay Grosfeld Award von der American Pediatric Surgical Association, C.J.H.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4% Paraformaldehyde ThermoFisher AAJ19943K2
A-83 R&D Tocris 2939/10
Amphotericin B ThermoFisher 15290026
B-27 supplement minus Vitamin A ThermoFisher 17504-044
Basement Membrane Matrix (Matrigel) Corning CB-40230C
DMEM/F-12 ThermoFisher MT-16-405-CV
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) ThermoFisher 11-965-118
Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline (DPBS) ThermoFisher 14190-144
Epidermal Growth Factor (EGF) Sigma E9644-.2MG
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma EDS-500G
Fetal Bovine Serum (FBS) Gemini Bio-Pro 100-125
Gentamicin Sigma G5013-1G
GlutaMAX (L-glutamine) ThermoFisher 35050-061
Insulin Sigma I9278-5mL
[leu] 15-gastrin 1 Sigma G9145-.1MG
Lipopolysaccharide (LPS) Sigma L2630-25MG
N-2 supplement ThermoFisher 17502-048
N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid (HEPES) ThermoFisher 15630-080
N-Acetylcysteine Sigma A9165-5G
Nicotinamide Sigma N0636-100G
Noggin R&D Systems INC 6057-NG/CF
Penicillin-Streptomycin ThermoFisher 15140-148
Phosphate Buffered Saline (PBS) Sigma P5368-5X10PAK
RPMI 1640 Medium Invitrogen 11875093
R-Spondin PEPROTECH INC 120-38
SB202190 Sigma S7067-5MG
Tissue Processing Gel (Histogel) ThermoFisher 22-110-678
Wnt3a R&D Systems INC 5036-WN-010
Y-27632 Sigma Y0503-1MG

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459, (7244), 262-265 (2009).
  2. Zachos, N. C., et al. Human Enteroids/Colonoids and Intestinal Organoids Functionally Recapitulate Normal Intestinal Physiology and Pathophysiology. The Journal of Biological Chemistry. 291, (8), 3759-3766 (2016).
  3. Foulke-Abel, J., et al. Human enteroids as an ex-vivo model of host-pathogen interactions in the gastrointestinal tract. Experimental Biology and Medicine (Maywood). 239, (9), 1124-1134 (2014).
  4. Hidalgo, I. J., Raub, T. J., Borchardt, R. T. Characterization of the human colon carcinoma cell line (Caco-2) as a model system for intestinal epithelial permeability. Gastroenterology. 96, (3), 736-749 (1989).
  5. Hilgers, A. R., Conradi, R. A., Burton, P. S. Caco-2 cell monolayers as a model for drug transport across the intestinal mucosa. Pharmaceutical Research. 7, (9), 902-910 (1990).
  6. In, J. G., et al. Human mini-guts: new insights into intestinal physiology and host-pathogen interactions. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 13, (11), 633-642 (2016).
  7. Senger, S., et al. Human Fetal-Derived Enterospheres Provide Insights on Intestinal Development and a Novel Model to Study Necrotizing Enterocolitis (NEC). Cell and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 5, (4), 549-568 (2018).
  8. Moore, S. A., et al. Intestinal barrier dysfunction in human necrotizing enterocolitis. Journal of Pediatric Surgery. 51, (12), 1907-1913 (2016).
  9. Neal, M. D., et al. A critical role for TLR4 induction of autophagy in the regulation of enterocyte migration and the pathogenesis of necrotizing enterocolitis. The Journal of Immunology. 190, (7), 3541-3551 (2013).
  10. Lanik, W. E., et al. Breast Milk Enhances Growth of Enteroids: An Ex Vivo Model of Cell Proliferation. Journal of Visualized Experiments. (132), 56921 (2018).
  11. Mahe, M. M., Sundaram, N., Watson, C. L., Shroyer, N. F., Helmrath, M. A. Establishment of human epithelial enteroids and colonoids from whole tissue and biopsy. Journal of Visualized Experiments. (97), 52483 (2015).
  12. Uzarski, J. S., Xia, Y., Belmonte, J. C., Wertheim, J. A. New strategies in kidney regeneration and tissue engineering. Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 23, (4), 399-405 (2014).
  13. Leaphart, C. L., et al. A critical role for TLR4 in the pathogenesis of necrotizing enterocolitis by modulating intestinal injury and repair. The Journal of Immunology. 179, (7), 4808-4820 (2007).
  14. Neal, M. D., et al. Enterocyte TLR4 mediates phagocytosis and translocation of bacteria across the intestinal barrier. The Journal of Immunology. 176, (5), 3070-3079 (2006).
  15. Sodhi, C. P., et al. Intestinal epithelial Toll-like receptor 4 regulates goblet cell development and is required for necrotizing enterocolitis in mice. Gastroenterology. 143, (3), 708-718 (2012).
  16. Koo, B. K., et al. Controlled gene expression in primary Lgr5 organoid cultures. Nature Methods. 9, (1), 81-83 (2011).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics