Кортизол Измерение в Коала (Phascolarctos cinereus) Мех

JoVE Journal
Biochemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Biochemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Мы представляем протокол для определения оптимального растворителя экстракции для измерения кортизола из меха коалы. Растворителями, используемыми в этом протоколе, являются метанол, этанол и изопропанол. Определение оптимального растворителя извлечения поможет надежно измерить мех, чтобы определить влияние хронического стресса на коал.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Charalambous, R., Narayan, E. Cortisol Measurement in Koala (Phascolarctos cinereus) Fur. J. Vis. Exp. (150), e59216, doi:10.3791/59216 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Оптимальные методы экстракции гормонов, используемые для измерения стресса у животных по типам образцов, не всегда одинаковы. Австралийские культовые сумчатые виды, коала(Phascolarctos cinereus),сталкивается с длительным воздействием антропогенных стрессоров и оценка хронического стресса в диких популяциях является срочно оправданным. Одним из наиболее эффективных способов измерения хронического стресса является анализ глюкокортикоидного гормона кортизола в волосах или мехе, так как он поддерживает физиологические и поведенческие реакции. Это лабораторное исследование проверки направлено на тестирование современных методов для проверки оптимального метода экстракции гормонов, который будет использоваться в качестве неинвазивной меры кортизола в мехе коалы. Признано, что использование неинвазивных методов для измерения гормонов стресса является предпочтительным по сравнению с традиционными, инвазивными методами из-за их идеальной практической и этической точки зрения. Кроме того, сравнительно легче приобретать мех у коал, чем приобретать образцы их крови. В этом исследовании использовались образцы меха коалы, приобретенные в Аделаиде Коала и больнице дикой природы, чтобы запустить ряд методов экстракции гормонов в попытке проверить оптимальный метод экстракции кортизола. Результаты показали, что 100% метанол обеспечивает наиболее оптимальный растворитель добычи по сравнению с 100% этанола или 100% изопропанола на основе результатов параллелизма. В заключение, этот метод извлечения кортизола из меха коалы обеспечил надежный неинвазивный тест, который может быть использован для изучения хронического стресса у коал.

Introduction

Австралийские экосистемы поддерживают жизнь человека путем предоставления услуг, включая продукты питания и волокна среди многих других динамических взаимодействий1. По иронии судьбы, это человеческая деятельность, которая действует в качестве доминирующего драйвера нарушения экосистемы через изменение биоразнообразия2. Фрагментация мест обитания, известная как процесс деления больших непрерывных мест обитания на небольшие участки земли, изолированные друг от друга, является основным антропогенным изменением биоразнообразия, угрожающим австралийским экосистемам2. Фрагментация мест обитания изменяет структуру и разнообразие видового состава в той или инойобласти, тем самым уменьшая площадь среды обитания, необходимую для сохранения жизнеспособных популяций 2. Результатом этого является усиление конкуренции между видами за ресурсы, включая продукты питания, топливо, клетчатку и воду3. Разрушение австралийских экосистем путем изменения биоразнообразия имеет катастрофические последствия для многих австралийских местных видов1.

Самые знаковые сумчатые виды Австралии, коала(Phascolarctos cinereus),зависит от австралийских экосистем, остающихся здоровыми для их выживания4. Введение Европейского урегулирования вызвало быстрое сокращение австралийского населения коал, так как они были убиты за шкуры в погоне за прибылью в большой экспортной торговле5. Эта практика была запрещена в 1980-х и популяции коал смогли стабилизировать5. Тем не менее, экспоненциальный рост популяции людей привел к тому, что этот вид конкурирует за большую часть своей среды обитания, и их выживание снова находится под угрозой6. По данным Международного союза охраны природы (МСОП), все популяции австралийских коал ы перечислены как уязвимые к вымиранию с уменьшением демографиитенденция 7. Этот перечень объясняется неопределенностью вокруг соответствующих параметров популяции и заметными различиями в демографических тенденциях для данного вида7. Как наиболее знаковых и эндемичных животных, коалы в значительной степени пользу австралийской экономики через туризм (NSW Управление окружающей среды и наследия 2018). По оценкам, связанный с коалой туризм создал около 9000 рабочих мест и вносит от $1,1 до $2,5 млрд в экономику (NSW Office of Environment and Heritage 2018). Удаление любого одного вида имеет потенциал, чтобы быть катастрофическим, и можно увидеть в устойчивом упадке родной австралийской дикой природы6. Кроме того, экономика Австралии будет чувствовать последствия, если население австралийских коал продолжать снижаться темпами они6.

Предполагается, что распространенность смертности и заболеваний в ответ на фрагментацию среды обитания является результатом хронического стресса8. Уже, двадцать четыре сумчатых видов были объявлены вымершими в Австралии из-за фрагментации среды обитания, с коалами после аналогичной тенденции8. Сложность фрагментации среды обитания и биологических систем является синергетической, но может быть распакована путем анализа реакции на стресс6. Как правило, любое нарушение в естественной среде животных активирует сложный каскад нейрогормональных событий, известный как "борьба или полет" ответ9,10. Эта реакция на стресс процесс, который начинается в головном мозге, где гипоталамо-гипофизарно-надпочечников (HPA) оси активируется11. Компонент мозга называется гипоталамус релизы кортикотрофина-рилизинг гормона (CRH), который затем сигнализирует передний гипофиза, чтобы освободить адренокортикотрофический гормон (ACTH)11. Это, в свою очередь, стимулирует глюкокортикоидную секрецию из надпочечников медуллы. Организм циркулирует через кровь глюкокортикоиды, что отвлекает хранение глюкозы из гликогена и мобилизует глюкозу из хранящегося гликогена11. Этот каскад нейрогормональных событий является ответом, используемым животным для борьбы с непредсказуемыми раздражителями11. Однако, когда глюкокортикоиды высвобождаются и остаются повышенными в течение длительного периода времени, считается, что животное испытывает хронический стресс12,13. Этот процесс включает в себя отвлечение энергии от других телесных функций организма, так как это необходимо для текущего производства глюкокортикоидов13. В результате, хронический стресс может запретить рост, размножение и иммунитет, все это ключевые черты фитнес, необходимые для выживания14.

Измерение производства глюкокортикоидов животного является общим показателем, используемым для определения того, испытывает ли животное физиологический стресс15. Для этого глюкокортикоиды могут быть измерены в плазме крови, сыворотке крови, слюне, моче или фекалиях16. Тем не менее, данные свидетельствуют о том, что волосы является гораздо более эффективным показателем хронического стресса, в отличие от вышеупомянутых16. Это потому, что волосы, как полагают, включают кровь гормонов во время его фазы роста; она относительно стабильна; и любой кортизол, обнаруженный в волосах, отражает физиологический стресс, испытываемый в период роста волос, который может составить несколько недель до16месяцев. Кроме того, любая коллекция кортизола должна быть неинвазивной, чтобы свести к минимуму стресс, связанный с захватом и обработкой16. Тем не менее, любой стресс, испытываемый во время этого события не повлияет на уровень глюкокортикоидов в волосах16. Там было много исследований, которые исследуют мастерство использования волос для измерения долгосрочного стресса в ряде животных, и включают в себя исследования на оленей, медведей гризли, рекусов обезьян, muskoxen, и бурых медведей17,18, 19 лет , 20 , 21. Кортизол волос, как правило, извлекается при первом мытье образца для обеспечения пота и кожного сала полученных кортизола на хранение на поверхности волос не совместно извлечены с кортизола, а затем распыления образца в бисером бисером22. После стирки образец необходимо высушить, чтобы обеспечить полное испарение22. Наконец, с помощью растворителя, образец может быть извлечен и восстановлен для облегчения анализ кортизола22. Наиболее распространенным растворителем, используемым для извлечения кортизола из меха, является метанол21,23; однако, Есть некоторые исследования, которые используют этанол и изопропанол в своих методах извлечения кортизола. Например, исследование, в ходе которого использовался этанол, было успешным для извлечения кортизола из амниотической жидкости человека24. Кроме того, исследование, которое использовало изопропанол был успешным для извлечения кортизола из человеческих волос и ногтей25,26. По этой причине, это исследование протестировало все три растворителя (метанол, этанол и изопропанол), чтобы определить, какой из них был наиболее успешным для извлечения кортизола из образцов меха коалы.

Основная цель этого исследования заключается в использовании современных методов для проверки оптимального метода экстракции гормонов, которые будут использоваться в качестве неинвазивной меры кортизола из меха коалы. Это было достигнуто путем тестирования трех растворителей извлечения (метанол, этанол и изопропанол). Мы предположили, что метанол будет оптимальным растворителем, используемым для извлечения кортизола из меха коалы, потому что это рекомендуемый растворитель извлечения Arbor assay комплекты кортизола27.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Этот проект был выполнен в соответствии со строгими руководящими принципами по уходу за животными и людьми. Этика животных была предоставлена Западным Сиднейским университетом (A12373). Кроме того, лабораторная оценка рисков и биобезопасность и радиационная форма были представлены и приняты Университетом Западного Сиднея для безопасного проведения этого исследования (B12366).

ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы меха Коала для этого проекта были получены из Аделаиды Коала и дикой больницы, расположенной на 282 Anzac шоссе, Плимптон южная Австралия. Мех забрали из одной коалы, которая была госпитализирована и усыплена из-за тяжелых травм. Покойный коала хранился в морозильной камере в мешке для трупов вскоре после смерти. После удаления умершего коалы из мешка для тела, 1,2 г меха был выбрит с затылка с помощью стандартных клиперов животных. Мех был побрился как можно ближе к коже, чтобы кожа не была разрезана. После того, как побрился, покойный коала был помещен обратно в мешок для тела и помещен в морозильную камеру. Затем мех помещали в сумку из алюминиевой фольги и хранили ниже -20 градусов по Цельсию. В пути мех хранился при температуре окружающей среды, а по прибытии в лабораторию мех хранился при -80 градусах Цельсия.

1. Извлечение кортизола из меха Коалы

  1. Удалите мех из хранилища при -80 градусах Цельсия и дайте время на оттепель.
  2. Взвешивание меха на лабораторно-аналитическом точном балансе.
  3. Поместите 60 мг меха в предварительно взвешенную и помеченную 1,5 мл центрифуги трубки и повторить до 18 труб заполнены.
    ПРИМЕЧАНИЕ: 18 меховых подобразцов были использованы для этого исследования проверки.
  4. Добавьте 1 мл 100% высокопроизводительной жидкой хроматографии (HPLC) класса изопропанола к каждой трубке с помощью пипетки.
  5. Образцы вихрей на 30 с.
  6. Процедите каждый образец с помощью сито точности 0,5 мм, чтобы добиться разделения жидкости и меха.
  7. Отбросьте жидкость в мусорный контейнер.
  8. Поместите каждый образец меха в маркированной пластиковой взвешивания лодки, а затем поместить в вакуумный desiccator, оставить мех высохнуть в течение 3 дней.
  9. После полного высыхания поместите каждый образец в подмаркированную микроцентрифугную трубку мощностью 1,5 мл.
  10. Поместите каждый образец в бисерную мельницу с 3 хромированными стальными бусинками (3,2 мм) и распыляйте в течение 2 мин при 30 встряхиваниях в секунду.
  11. Пипетка 1,5 мл первой техники экстракции (100% аналитический сорт этанола) в 6 микроцентрифуговых трубках площадью 1,5 мл, содержащих образец меха.
  12. Выполните то же самое для 100% аналитического класса метанола и 100% аналитического класса изопропанола до восемнадцати 1,5 мл микроцентрифуговых труб заполнены.
  13. Крышка каждой 1,5 мл микроцентрифуг трубки и инкубировать при комнатной температуре (RT) с постоянной пульсирующей с помощью шейкера в течение 3 ч.
  14. Удалить и процедить образцы с помощью 0,5 мм микро-сито точности.
  15. Перенесите жидкость в новую микроцентрифуговую трубку мощностью 1,5 мл с помощью пипетки, обеспечивая при этом, чтобы мех был соответствующим образом отброшен.
  16. Полностью сухой экстракт растворителя под потоком пара N2 под дымом-купбордой.
  17. Восстановите высушенный образец экстракта с использованием 400 qL буфера асссе (состав, представленный в коммерческом комплекте кортизола; см. Таблица материалов) и 100 л 100% аналитического сорта этанола.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Образец экстрактов может храниться при -80 .

2. Внутренний контроль

  1. Чтобы сделать контроль, сделать пул извлеченных образцов с высоким уровнем гормонов. Чтобы сделать этот бассейн, выберите образцы из животных с известным воздействием стрессора. Например, выберите образцы из коал, которые были спасены от экологическойтравмы, поскольку они, как правило, отображают высокий уровень гормона кортизола 6.
    1. Чтобы сделать пул экстракта, возьмите 20 qL экстракта из каждого образца (n no 10) до получения общего объема в 200 л. Бассейн экстракта может храниться при -80 C до ассс.. Выполнить бассейн в каждом ассее, как низкий или высокий внутренний контроль (см. шаг 2.2).
  2. Для ассоциа, используйте бассейн, чтобы сделать запасы для низких и высоких элементов управления, которые связывают на 70% (C1) и 30% (C2), соответственно. Получить коэффициент разбавления для 30% и 70% связывающих точек от графика параллелизм для экстракта против стандарта кортизола(рисунок 1). Используйте буфер ассеа для разбавления пула образцов. Например, используйте 60 юл экстракта пула и 60 л буфера асссеа для 1:2 разбавления.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для экстракта метанола, 30% точки связывания был аккуратным в то время как 70% точки связывания было примерно 1:2 в случае рисунок 1. Таким образом, они обеспечили фактор разбавления для внутреннего контроля (C1 и C2 соответственно) для выполнения в рамках асссе.

3. Анализ кортизола в экстрактах коалы меха

  1. Используйте коммерческий комплект кортизола(Таблицаматериалов) и установите 96 хорошо полоса пластины, включая образцы, элементы управления, стандарты кортизола, неспецифические связывающие скважины, и максимальный связывания скважин в соответствии с инструкциями поставщика. Используйте лист макета пластин, представленный в буклете комплекта, чтобы перечислить позиции образцов, элементов управления и стандартов на карте пластин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется, чтобы все образцы, элементы управления и стандарты были запущены в дубликат, чтобы обеспечить точность результатов.
  2. Подготовка образцов. Следуйте экстракции гормона меха (раздел 1) для получения 100% метанола, извлеченного меха коалы.
  3. Подготовка реагентов. Следуйте процедуре, описанной в коммерческом комплекте кортизола для подготовки реагентов, включая (1) буфер асссе, (2) мыть буфер, и (3) стандарты (композиции, представленные в комплекте кортизола, Таблица материалов).
  4. В рамках инструкций, предусмотренных в комплекте кортизола, pipet 50 зл образцов или стандартов в колодцы в пластине. Труба 75 л и 50 л ассса буфера в неспецифических связывающих (NSB) скважинах и максимальной связывающей (B0 или нулевой стандарт) скважин, соответственно.
  5. Добавьте 25 зЛ кортизола конъюгированного к каждому колодцу с помощью трубача-ретранслятора. Затем пипета 25 зл антитела кортизола в каждую скважину, за исключением скважин NSB. Аккуратно коснитесь сторон пластины, чтобы реагенты хорошо перемешаны.
  6. Накройте тарелку уплотнителем и встряхните при комнатной температуре в течение 1 ч (при медленной скорости) с помощью орбитального шейкера.
  7. Снимите уплотнитель пластины и аспирируйте скважину, промывая каждую скважину с 300 qL буфера для мытья 4 раза.
  8. Высушите тарелку, нажав тарелку на чистые абсорбирующими полотенцами.
  9. Пипетка 100 л тетраметилбензадина (TMB) субстрата (состав, предусмотренный в комплекте кортизола, Таблица материалов) для каждой скважины.
  10. Поместите уплотнитель пластины на хорошую тарелку и инкубировать на RT в течение 30 минут.
  11. Пипетка 50 л стоп-раствора для каждой скважины.
  12. Поместите хорошо пластины в пластины читателя способны читать 450 нм.
  13. Чтобы рассчитать конечную концентрацию гормона, вывешйте окончательную концентрацию меха кортизола в нг/мг образца, умножая концентрацию гормона пг/мл с окончательным объемом экстракта (0,5 мл) и разделив на массу образца меха (60 мг).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Ассаи выявляет гормоны метаболитов, представляющих интерес, определяется с помощью параллелизма. Используя кривую параллелизма, 50% связывающая точка также определяет коэффициент разбавления образца на стандартной кривой(рисунок1). Как показано на графике параллелизма(рисунок 1), 100% этанола и 100% экстракты изопропанола не обеспечивают параллельное смещение против стандарта кортизола. Тем не менее, 100% экстракт метанола при условии параллельного смещения против стандарта кортизола. Сушеные экстракты запускались аккуратно через разбавление в буфере ассеа (100 л 100% этанола и 400 л буфера асссе).

Коэффициенты внутри- (внутри) и между) асссеифсии вариации (CV) определялись с высоким (примерно 70%) и с низким содержанием (примерно 30%) связывающие примеры экстрактов, проработаны во всех анализах. На основе графика параллелизма(Рисунок 1), 30% (низкий) связывая внутренний контроль были аккуратные коала экстракт бассейн в то время как 70% (высокий) связывание внутренних элементов управления были 1:2 разбавленной коала экстракт бассейн. CV% для внутреннего высокого и низкого внутреннего контроля составили 15%.

Погрешность в рамках ассе можно определить с помощью контроля качества, включая коэффициенты вариации внутри- и межсистемных, которые должны соться 15%. Чувствительность асссея была рассчитана как значение 2 стандартных отклонений от среднего ответа пустых (нулевой привязки) образцов, и выражена как 81.26 pg/well.

Figure 1
Рисунок 1: Параллелизм объединенного меха коалы, извлеченный с использованием 3 различных растворителей (100% этанол, 100% изопропанол или 100% метанол) против стандартной кривой кортизола под кортизолом фермент-иммуноанализ. B/TB - это процент привязки по всей привязке. Коэффициент последовательного разбавления (например, 1:2X средний коэффициент разбавления 2) был обеспечен вместе с концентрацией каждого стандарта. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Во-вторых, связь между каждым экстрактом растворителя и стандартом кортизола была определена с помощью регрессии(рисунок 2). Как показано на рисунке 2, 100% экстракт метанола при условии, лучшая линия регрессии с самым высоким значением R2 по сравнению со 100% этанола и 100% экстракты изопропанола.

Figure 2
Рисунок 2: Регрессионные участки для процентного соединения стандарта кортизола против каждого из 3 растворителей (этанол, метанол и изопропанол), используемых для извлечения меха коалы. Значение R2 было получено из линии наилучшего соответствия. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Кроме того, были проведены исследования в поднаборе меха коалы, извлеченного с помощью каждого из трех растворителей, и результаты приведены в таблице 1 ниже. Как показано в таблице 1, наблюдаемая концентрация стандарта кортизола находилась в пределах 2879,61-125,70 пг/хорошо. Ни метод изтанки этанола или изопропанола не мог достичь консистенции в результате, так как концентрации экстракта меха, полученные с помощью любого из методов, привели к очень высокому диапазону мин-макс концентраций гормонов (см. Таблица 1 цифры отмечены в красном), которые были за пределами обнаружения кортизола асссеев. Тем не менее, экстракты метанола привели к концентрации кортизола в пределах стандарта кортизола (как показано в жирных черных числах в таблице1). Кроме того, концентрации мехового кортизола, обнаруженные с использованием метода извлечения метанола, были весьма последовательными по сравнению с результатами, полученными с использованием двух других методов (см. таблицу1). Таким образом, мы принимаем нулевую гипотезу о том, что метанол является наиболее подходящим растворителем для извлечения гормона коалы по сравнению с этанолом и изопропанолом.

Table 1
Таблица 1: Концентрация кортизола (нг/мг) для меха коалы (n No 18), извлеченная с использованием 3 различных растворителей (этанол, изопропанол или метанол) и работает против стандартной кривой кортизола под ферментом-иммуноанализом кортизола. Смелые красные числа показывают несовместимые концентрации экстрактов этанола и изопропанола, которые были за пределами диапазона ассс (пг/хорошо). Смелые черные цифры показывают концентрации мехового кортизола, извлеченного с использованием метанола, который подпадает под диапазон стандартов кортизола (пг/хорошо). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Есть ряд исследований, которые используют ряд методов для обнаружения кортизола в меха млекопитающих. Это исследование представляет результаты для обнаружения кортизола в мехе, собранных из дикой коалы подвергаются текущему антропогенному стрессу. Это новаторское исследование использовало мех для проверки того, какой из трех широко используемых растворителей лучше всего подходит для извлечения кортизола, мера хронического стресса, из меха коалы. Результаты показали, что 100% метанол был рекомендуемый растворитель для извлечения кортизола в этом типе меха млекопитающих.

Этанол, метанол и изопропанол все основные спирты, которые связаны молекулами водорода и обычно используются в качестве растворителей в экспериментах по экстракции гормонов28. Как правило, полярные вещества лучше всего растворяются в других полярных веществах, в то время как неполярные вещества лучше всего растворяются в других неполярных веществах. Алкогольная группа, содержащая метанол, очень полярная, в то время как алкогольная группа, содержащая изопропанол, очень неполярная. Благодаря своей молекулярной сборке, алкогольная группа, содержащая этанол, имеет то преимущество, что является как полярным, так и неполярным растворителем. Стероидные гормоны, такие как кортизол считаются неполярными, а это означает, что кортизол должен иметь сильную связующую связь с полярными растворителями.

Для более всестороннего анализа растворителей извлечения, используемых для оценки физиологического стресса в мехе коалы, будущие исследовательские проекты должны попытаться идентичные методы в этом порядке, как описано на рисунке 3. Подобные исследования исторически выполняются мыть перед шлифовкой22, с тем чтобы обеспечить отсутствие непреднамеренного пота и / или кожного сала производных кортизола на хранение в меховой образец. Кроме того, важно, что измерение кортизола само по себе не может гарантировать полное указание хронического стресса. Показания кортизола волос являются ценным инструментом при попытке понять физиологический стресс, испытываемый животным, но повышенная активность HPA может произойти при различных условиях, включая физические упражнения, метаболические нарушения и наличие инфекционное заболевание22. Другие важные факторы, которые должны быть приняты во внимание к основной целостности данных гормонов включают в себя следующее. (1) Приемлемый уровень случайной ошибки - коэффициенты вариации, полученные из внутреннего контроля (CV1 и CV2), должны быть усреднены до 15% для всех анализов. (2) Случайная ошибка в образце анализов и дубликаты образцов, запущенных на каждой пластине, должна иметь CV% от 15%; в противном случае образец должен быть повторно запущен. (3) предел обнаружения асссов - концентрация гормона, количественно оцениваемого в рамках каждого теста, должна находиться в пределах предела предела обнаружения асссе (между показаниями для самого высокого разбавления и аккуратного стандарта); в противном случае образцы могут потребовать дальнейшего разбавления (если уровни, обнаруженные в образцах, превышают концентрацию аккуратных стандартов) или не могут быть проанализированы в рамках анализа (если уровни, обнаруженные для образцов, меньше, чем концентрация наиболее разбавленных стандартом). (4) Чувствительность анализов - на это может повлиять фоновое чтение (неспецифическая связывание), поэтому важно поддерживать высокий уровень гарантии качества для проверки (например, оборудование, такое как шайба пластины и считыватель пластин, должны регулярно обслуживаться). (5) Сушка экстракта образца - этот шаг может привести к потенциальному перекрестному загрязнению или потере образцов. Рекомендуется, чтобы образцы высушивались под паром газа N2 по отдельности и заменяли пипетку Pasteur, используемую для извлечения между каждым образцом.

Figure 3
Рисунок 3: Концептуальная диаграмма потока, показывающая ключевые шаги, связанные с ферментом-иммуноанализом коризола из коркиола коалы (ОВОС). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Процедура, изложенная в этом исследовании(Рисунок 3) является тот, который может быть легко воспроизведены, как это относительно легко выполнить, шаг за шагом методологии, которая включает в себя легко доступны хим, реагенты и поставки с оборудованием, которое, вероятно, будет в стандартной аналитической лаборатории. Применение этого исследования позволяет использовать неинвазивную технику для оценки физиологического стресса как у диких, так и у неволе коал.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана путем запуска научно-исследовательского финансирования для Эдварда Нараяна через Западный Сиднейский университет, Школа науки и здравоохранения. Авторы благодарят Джека Нахула за помощь в обработке образцов.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Centrifuge Tubes n/a n/a 1.5 mL
Chrome Steel Beads n/a n/a 3.2 mm x 3
Cortisol Kit Arbor Assays K003-H1W Manufactured in Michigan USA
DetectX Cortisol Enzyme Immunoassay Kit Arbor Assays K003-H5 Used first-time for cortisol testing in koala fur
Ethanol n/a n/a HPLC Grade
Isopropanol n/a n/a HPLC Grade
Methanol n/a n/a HPLC Grade
Micro Pipette n/a n/a n/a
Micro Precision Sieve n/a n/a 0.5 mm
Microplate Reader Bio Radi n/a n/a
Microplate Washer Bio Radi n/a n/a
Orbital Shaker Bio Line n/a n/a
Plastic Weighing Boat n/a n/a n/a
Plate Sealer n/a n/a n/a
Precision Balance n/a n/a n/a
Vortex Mixer Eppendorf n/a n/a

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sandhu, H. S., Crossman, N. D., Smith, F. P. Ecosystem services and Australian agricultural enterprises. Ecological Economics. 74, 19-26 (2012).
  2. Martinez-Ramos, M., Ortiz-Rodriguez, I. A., Pinero, D., Dirzo, R., Sarukhan, J. Anthropogenic disturbances jeopardize biodiversity conservation within tropical rainforest reserves. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113, (19), 5323-5328 (2016).
  3. Aukema, J. E., Pricope, N. G., Husak, G. J., Lopez-Carr, D. Biodiversity Areas under Threat: Overlap of Climate Change and Population Pressures on the World's Biodiversity Priorities. PLoS ONE. 12, (1), 0170615 (2017).
  4. MacDougall, A. S., McCann, K. S., Gellner, G., Turkington, R. Diversity loss with persistent human disturbance increases vulnerability to ecosystem collapse. Nature. 494, (7435), 86-89 (2013).
  5. Hrdina, F., Gordon, G. The Koala and Possum Trade in Queensland, 1906-1936. Australian Zoologist. 32, (4), 543-585 (2004).
  6. Narayan, E. J., Williams, M. Understanding the dynamics of physiological impacts of environmental stressors on Australian marsupials, focus on the koala (Phascolarctos cinereus). BMC Zoology. 1, (1), (2016).
  7. Woinarski, J., Burbidge, A. Phascolarctos cinereus. The IUCN Red List of Threatened Species 2016. (2016).
  8. Gonzalez-Astudillo, V., Allavena, R., McKinnon, A., Larkin, R., Henning, J. Decline causes of Koalas in South East Queensland, Australia: a 17-year retrospective study of mortality and morbidity. Scientific Reports. 7, 42587 (2017).
  9. Hing, S., Narayan, E. J., Thompson, R. C. A., Godfrey, S. S. The relationship between physiological stress and wildlife disease: consequences for health and conservation. Wildlife Research. 43, (1), 51-60 (2016).
  10. Whirledge, S., Cidlowski, J. Glucocorticoids, stree, and fertility. Minerva Endocrinologica. 35, (2), 109 (2010).
  11. Romero, L. M. Physiological stress in ecology: lessons from biomedical research. Trends in Ecology & Evolution. 19, (5), 249-255 (2004).
  12. McEwen, B. S., Wingfield, J. C. What is in a name? Integrating homeostasis, allostasis and stress. Hormones and Behavior. 57, (2), 105-111 (2010).
  13. Wingfield, J. C. The comparative biology of environmental stress: behavioural endocrinology and in ability to cope with novel, changing environments. Animal Behaviour. 85, (5), 1127-1133 (2013).
  14. Chrousos, G. P. Stress and disorders of the stress system. Nature Reviews Endocrinology. 5, (1), 374-381 (2009).
  15. Narayan, E. J., Webster, K., Nicolson, V., Mucci, A., Hero, J. M. Non-invasive evaluation of physiological stress in an iconic Australian marsupial: the Koala (Phascolarctos cinereus). General and Comparative Endocrinology. 187, 39-47 (2013).
  16. Mastromonaco, G. F., Gunn, K., McCurdy-Adams, H., Edwards, D. B., Schulte-Hostedde, A. I. Validation and use of hair cortisol as a measure of chronic stress in eastern chipmunks (Tamias striatus). Conservation Physiology. 2, (1), 055 (2014).
  17. Ashley, N. T., et al. Glucocorticosteroid concentrations in feces and hair of captive caribou and reindeer following adrenocorticotropic hormone challenge. General and Comparative Endocrinology. 172, (3), 382-391 (2011).
  18. Macbeth, B. J., Cattet, M. R. L., Stenhouse, G. B., Gibeau, M. L., Janz, D. M. Hair cortisol concentration as a noninvasive measure of long-term stress in free-ranging grizzly bears (Ursus arctos): considerations with implications for other wildlife. Canadian Journal of Zoology. 88, (10), 935-949 (2010).
  19. Dettmer, A. M., Novak, M. A., Suomi, S. J., Meyer, J. S. Physiological and behavioral adaptation to relocation stress in differentially reared rhesus monkeys: hair cortisol as a biomarker for anxiety-related responses. Psychoneuroendocrinology. 37, (2), 191-199 (2012).
  20. Di Francesco, J., et al. Qiviut cortisol in muskoxen as a potential tool for informing conservation strategies. Conservation Physiology. 5, (1), 052 (2017).
  21. Cattet, M., et al. Quantifying long-term stress in brown bears with the hair cortisol concentration: a biomarker that may be confounded by rapid changes in response to capture and handling. Conservation Physiology. 2, (1), 026 (2014).
  22. Meyer, J., Novak, M., Hamel, A., Rosenberg, K. Extraction and analysis of cortisol from human and monkey hair. Journal of Visualized Experiments. (83), e50882 (2014).
  23. Carlitz, E. H., et al. Measuring Hair Cortisol Concentrations to Assess the Effect of Anthropogenic Impacts on Wild Chimpanzees (Pan troglodytes). PLoS ONE. 11, (4), 0151870 (2016).
  24. Aderjan, R., Rauh, W., Vecsei, P., Lorenz, U., Ruttgers, H. Determination of cortisol, tetrahydrocortisol, tetrahydrocortisone, corticosterone, and aldosterone in human amniotic fluid. Journal of Steroid Biochemistry. 8, (1), 525-528 (1977).
  25. Nejad, J. G., Ghaseminezhad, M. A Cortisol Study; Facial Hair and Nails. Journal of Steroids & Hormonal Science. 7, (2), 177 (2016).
  26. Palme, R., Touma, C., Arias, N., Dominchin, M., Lepschy, M. Steroid extraction: get the best out of faecal samples. Veterinary Medicine Australia. 7, (2), 1-5 (2013).
  27. Davenport, M. D., Tiefenbacher, S., Lutz, C. K., Novak, M. A., Meyer, J. S. Analysis of endogenous cortisol concentrations in the hair of rhesus macaques. General and Comparative Endocrinology. 147, (3), 255-261 (2006).
  28. Kanse, K. S., Joshi, Y. S., Kumbharkhane, A. C. Molecular interaction study of ethanol in non-polar solute using hydrogen-bonded model. Physics and Chemistry of Liquids. 52, (6), 710-716 (2014).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please sign in or create an account.

    Usage Statistics