Undersøkelse av anlegget interaksjoner over vanlige Mycorrhizal nettverk bruker rotert kjerner

Environment

Your institution must subscribe to JoVE's Environment section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

De fleste planter i samfunn trolig er forbundet med arbuscular mycorrhizal (AM) sopp, men formidling av anlegget interaksjoner av dem har blitt undersøkt av voksende planter med versus uten mycorrhizas. Vi presenterer en metode for å manipulere felles mycorrhizal nettverk blant mycorrhizal planter å undersøke deres konsekvenser for plante interaksjoner.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Weremijewicz, J., Janos, D. P. Investigation of Plant Interactions Across Common Mycorrhizal Networks Using Rotated Cores. J. Vis. Exp. (145), e59338, doi:10.3791/59338 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Arbuscular mycorrhizal (AM) sopp påvirke anlegget mineral nærings-opptak og vekst, derfor har de potensial til å påvirke anlegget interaksjoner. Kraften i deres innflytelse er i extraradical mycelia som spres utover næringsstoffer uttømming soner funnet nær røtter til slutt Interconnect personer i et felles mycorrhizal nettverk (CMN). De fleste eksperimenter, men har undersøkt rollen er sopp i anlegget interaksjoner ved å dyrke planter med versus uten mycorrhizal sopp, en metode som ikke eksplisitt adresse rollen som CMNs. Her foreslår vi en metode som manipulerer CMNs for å undersøke deres rolle i anlegget interaksjoner. Vår metode bruker endret beholdere med konisk bottoms med en nylon maske og/eller hydrofobe materialet dekker spalteåpning, 15N gjødsel og en nærings-fattig interstitiell sand. CMNs er igjen enten intakt mellom samspill individer, kuttet av rotasjon av beholdere eller forhindret fra forming av en solid barriere. Våre funn tyder på at roterende beholdere er tilstrekkelig å avbryte CMNs og hindre deres virkninger på plante interaksjoner over CMNs. Vår tilnærming er en fordel fordi den imiterer aspekter av naturen, som seedlings hanke inn allerede etablerte CMNs og bruk av en rekke AM sopp som kan gi ulike fordeler. Selv om eksperimentet vårt er begrenset til undersøker planter på frøplante scenen, kan plante interaksjoner over CMNs oppdages med vårt tilnærming som derfor kan brukes for å undersøke biologiske spørsmål om funksjon av CMNs i økosystemene.

Introduction

Arbuscular mycorrhizal (AM) sopp assistert planter i koloniseringen av landet 460 millioner år siden1 og i dag, de er allestedsnærværende symbionter av planter2, gi dem næringsstoffer fra mineraler som viktig for vekst. De tynne, tråd-lignende hyfer av AM sopp grovfôr for næringsstoffer fra mineraler utover næringsstoffer uttømming soner nær røtter, ofte møter og kolonisere rotsystem nabolandet planter i en "felles mycorrhizal nettverk" (CMN). Vanlige mycorrhizal nettverk kan også danne når fungal germlings bli etablert nettverk3eller når er hyfer sikring (anastomose) med conspecific hyfer4,5,6,7. Omfanget av disse extraradical hyfer i jord er enorm, med extraradical hyfer utgjør 20% til 30% av totale jord mikrobiell biomasse prærien og beite jord8 og strekke på 111 m·cm-3 i uforstyrret grasmark9 .

Vanlige mycorrhizal nettverk partisjon næringsstoffer fra mineraler blant sammen nærliggende planter10,11,12,13. Planter kan motta opptil 80% av deres fosfor og 25% av nitrogen kravene fra AM sopp, samtidig som det gir opptil 20% av deres totale faste karbon til sopp i retur14. Nylig i vitro rot orgel kultur arbeid har funnet at CMNs fortrinnsvis utveksle næringsstoffer fra mineraler med verten røtter som gir mest karbon sopp11,12. Videre kan ulike arter av AM sopp variere i sin kvalitet som symbiotiske partnere, med noen sopp utveksle mer fosfor for mindre karbon enn andre15. Selv om roten orgel kulturer er gunstig modeller for å studere AM symbiose fordi de presenterer nøye kontrollerte miljøer og muligheten til å direkte observere hyphal sammenkoblinger, inneholder de ikke photosynthesizing skyter som påvirker viktige fysiologiske prosesser som fotosyntesen, transpirasjon og dagaktive endringer, så vel som konstituere karbon og mineral næringsstoff synker.

I naturen utnytte seedlings sannsynligvis allerede etablerte CMNs. Inntil nylig, men har forskere bare undersøkt virkningen av AM sopp på plantenæring av voksende planter med og uten AM sopp, ofte med én art av AM sopp. Selv om dette arbeidet har vært enormt informativ til vår forståelse av arbuscular mycorrhizas, har denne metoden oversett potensielt avgjørende rollen som CMNs kan ha i samspill mellom sammenkoblede Salix. Spesielt samhandle planter som er svært avhengig av AM sopp for vekst minimal uten AM sopp16,17, muligens forvirrer vår tolkning av AM sopp-mediert samhandlinger når den brukes som "Kontroller" for grunnlinje referanse.

Vi foreslår en rotert kjerner tilnærming for undersøkelse av rollen CMNs i anlegget interaksjoner og befolkningen strukturering. Vår tilnærming etterligner komponenter på AM symbiosen i naturen fordi hele planter bli etablert CMNs og alle planter dyrkes med AM sopp. Fjerner rot interaksjoner, fokuserer vår metodikk spesielt på interaksjoner formidlet av AM sopp mens også sporing mineral næringsstoffer bevegelse innenfor CMNs. Vår tilnærming bygger på tidligere arbeid som har brukt rotert kjerner i feltet og i drivhuset for å forstå AM fungerer realistisk.

Metoden rotert kjernen har blitt etablert i litteraturen som en metode for å manipulere extraradical hyfer18,19,20,21, og den har hatt flere reincarnations avhengig av formålet over de siste to tiårene. I utgangspunktet mesh poser eller barrierer tillater i vekst av hyfer ble brukt til å gi root-frie avdelinger for å kvantifisere mengden arbuscular mycorrhizal hyfer i jord22,23. Deretter ble sylindriske kjerner av jord i stive vannrør eller plast rør med spor dekket i en nylon maske penetrable hyfer, men ikke røtter, utviklet. Dette kan enkelt roteres for å forstyrre extraradical mycelia18,24,25. Rotert kjernene ble plassert mellom planter og jord hyphal lengder pr. gram jord18, 13C flukser extraradical mycelia24eller fosfor opptak fra plante-fri kjerner ble kvantifisert18. En annen bruk av slike kjerner var å dyrke planter i dem i feltet for å redusere kolonisering av røttene AM sopp gjennom hyppige hyphal avbrudd som et alternativ til sterilisering eller anvendelsen av fungicides, begge har indirekte effekter på jord organisk saken og18andre mikrober.

Hyphal mesh barriere tilnærmingen er brukt til å undersøke næringsstoffer partisjonering og plante interaksjoner over CMNs, men i rektangulære microcosms enn med rotert kjerner. Walder et al.26 undersøkt interaksjoner mellom Linum usitatissimum (Lin) og endringer (Durra) av sporing mineral næringsstoff for karbon-utveksling ved hjelp av isotoper over CMNs av noen av AM sopp Rhizophagus irregularis eller Funneliformis mosseae26. Microcosms i deres studie består plante rom med maske barrierer og hyphal rom bare tilgjengelig for mycorrhizal hyfer merket hyphal avdelinger som inneholdt radioaktivt og stabile isotoper. Kontroller brukte studien behandlinger uten mycorrhizal sopp. Sangen et al.27 brukt en lignende tilnærming til å finne at anlegget signaler kan utføres bare blant etablerte CMNs av F. mosseae når én plante var infisert av en fungal patogen. Også tilsvarende til Walder et al.26, Merrild et al.28 vokste planter i enkelte avdelinger med mesh undersøke anlegg ytelse av Solanum lycopersicum (tomat) frøplanter forbundet med CMNs til en stor Cucumis sativus (agurk) plante som representerte en rikelig karbon kilde. De har også brukt behandlinger uten mycorrhizal sopp i stedet for kuttet CMNs28. I et andre, knyttet eksperiment, karbon for fosfor utveksling ble undersøkt bruke mesh poser merket med 32P. Microcosms med hyphal mesh barrierer og CMN kuttet som en behandling ble brukt av Janos et al.29, som undersøkte konkurransedyktig interaksjoner mellom planter av savanna treslag Eucalyptus tetrodonta og transplantasjon av regnskog treet, Litsea først. I denne studien, løftet Janos et al.29 rom som inneholder seedlings noen centimeter, skyve lag av mesh mot hverandre for å bryte hyphal sammenkoblinger29.

Det siste trinnet i utviklingen av metoden rotert kjernen har vært å dyrke planter i kjerner i potter eller microcosms20,30. Wyss30 brukes rotert kjerner til å fastslå om extraradical AM mycel kan kolonisere Pinus elliottii frøplanter når sprer seg fra en donor eller "sykepleier" AM næringsplanten, Tamarindus indica, og hvordan extraradical mycel av ectomycorrhizal sopp påvirker frøplante ytelse. Store kommersielle rørformede frøplante beholdere (Tabell for materiale) i microcosms var en solid plast (ingen CMNs) eller spor og dekket med en hydrofobe membran. Spor frøplante containere ble enten ikke rotert (intakt CMNs) eller roteres for å bryte etablerte CMNs. Rotated kjerner med maske barriere størrelser ble brukt av Babikova et al.20 for å undersøke belowground signalering gjennom CMNs blant vikker faba (bean) planter. I deres studie, var en sentral donor anlegg i 30 cm diameter mesocosms forbundet av røtter og hyfer (ingen hindring) eller bare av CMNs etablert gjennom en 40 μm mesh. Sentrale planter ble kuttet fra interaksjon med nabolandet planter gjennom rotasjon av mesh-vedlagte kjernene, eller CMNs ble hindret av en omsluttende kjernen 0,5 μm finmasket.

Her presenterer vi en metode som kombinerer aspekter av tidligere rotert kjerner undersøke påvirkning av CMNs på direkte anlegget interaksjoner kombinert med stabil isotop sporing. Våre metoden bruker en "mål anlegget" tilnærming, som det sentrale anlegget rundt er omgitt av nærliggende planter. Planter dyrkes i roterbare frøplante beholdere som spor og dekket med nylon silketrykk mesh, hydrofobe membran, eller er ingen-modifisert solid plast. Vanlige mycorrhizal nettverk er kuttet en gang i uken eller beholdes og 15N isotoper spore bevegelsen av nitrogen fra naboer rotert kjerner til sentrale mål anlegget. Ved å sammenligne anlegget størrelse med mineral næringsstoffer og stabil isotop opptak, vurdere vi hvilke planter kan dra eller lider av CMNs i samspill mellom Salix.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. bygging og montering av roterbare kjerner

  1. Endre kommersielle rørformede frøplante beholdere (heretter kalt "beholdere"; Tabell av materialer) å ha 19 mm bred x 48 cm lengde åpninger.
    1. Bruke en søyleboremaskin med en 19 mm så uten en sentral, pilot vri drill, cut to hull, en over den andre, i sidene av en beholder (2,5 cm diameter x 12,1 cm lengde) slik at hullene er ca 1 cm fra hverandre. Hold beholderen mot et gjerde på drill trykk og stopper med en kort dowel som passer inne i beholderen for å holde det på plass under boring. Bruk en beholder med fleksibel plast for å hindre sprekkdannelse.
    2. Klippe gjenværende tynt stykke plast hullene med saks, wire kutter eller tinn snips (for stiv plast bruker en sabre-så) langstrakt for å gjøre en ca 2 cm bred og 5 cm lange.
    3. Gjenta trinn 1.1.1-1.1.2 på motsatt side av beholderen.
  2. Dekk sporene med nylon maske og/eller hydrofobe membran (figur 1A).
    1. Skjær nylon maske med 40 μm porene i 9,5 cm x 8,5 cm biter. Kuttet så mange brikker som det er beholdere.
    2. Fest nylon mesh eksternt på beholdere å dekke både åpninger med noen liten overlapping i stoff med høy styrke, industrielle varmt lim.
    3. Om forebygging av vann bevegelse er nødvendig, er slik som når du bruker vannløselige næringsstoffer eller isotoper, dekker nylon maske laget med en hydrofobe membran31,32 (Tabell for materiale) der sopp hyfer til Pass, men bare bevegelse av vanndamp og ikke flytende vann.
    4. Plass i varmt lim rundt åpningene på beholderen og langs langsiden av nylon mesh. Rulle beholderen på stoffet å unngå brenner fingrene. Legge til et lag med lim langs stoff kanten der mesh kanter overlapping. Trykk kanten på noen papp til fast forsegle den. Alltid rulle konsekvent i en retning som vil være samme retning av rotasjon av de ferdige beholderne i potter eller microcosms slik at overlappende mesh kanten ikke skyves potensielt grave i underlaget.
    5. Når limet har avkjølt, bånd øverst og nederst endene av stoffet beholderen for å hindre løse kanter og ripping på en fleksibel tape, som elektrikers tape.
  3. Bruker det samme båndet som i trinn 1.2.5, dekke små hullene på sidene av den koniske enden (ikke hullet på spissen av bunnen) i hver beholder å forhindre rot veksten av beholderen i resten av potten/mikrokosmos.
  4. For å hindre tap av jordsmonn samtidig drenering, plassere en glass marmor i bunnen av hver beholder.
  5. For en kontroll behandling som ikke involverer potensielle for en CMN å danne mellom planter, bruke solid, uforandret beholdere (figur 1A).

2. montering av Potter eller microcosms å passe konisk endene av beholdere

  1. Sikre beholdere stå oppreist i en fast stilling og har avløpet, snu en pott slik at bunnen vender. Skjær rundt bunnen av potten, forlate en liten lip for støtte, bruke en sabre-så.
  2. Utarbeidelse av polystyren skum
    1. Kuttet polystyrenskum, ca 36 mm tykk, til samme diameter som bunnen av potten med en bandsaw med en sirkel-skjæring gigg.
    2. Borehull inn i skummet bruker bore trykk og 19 mm hull så (uten en sentral vri drill) i mønsteret som beholdere vil bli plassert.
    3. Bore et sentralt hull med med jevne mellomrom hull for nabolandet enkeltpersoner rundt for et mål anlegget eksperimentet. For en pott med 15.5 cm diameter hull plass seks 12 mm fra hverandre rundt omkretsen av en 11 cm diameter sirkel (figur 1B).
    4. Utforme hullene hexagonally eller i en matrise (figur 1 c, D) for en mikrokosmos eksperiment.

3. fylle beholdere og potter med jord og sand blandinger

  1. Velg en ønsket jord blanding og legge er sopp feltet samlet eller pot-kulturperler inoculum til av jevnt blande hakket rot stykker (1-2 cm lang) grundig med jord. Bland ønsket jord med en ufruktbar silica sand eller glass perler for å redusere konsentrasjonen av næringsstoffer fra mineraler tilgjengelig for planter.
  2. Plasser de fylte containerne boret skum eller mikrokosmos nederst og fylle den interstitielle rommet med en ufruktbar substrat.
  3. Fyll den interstitielle rommet mellom beholdere med nærings-fattig silica sand blanding med en trakt for å hjelpe fylle små områder. For å sikre tilstrekkelig drenering og etterligne teksturen i jord, bland middels partikkelstørrelse sand som 6-20 grad, med små partikkelstørrelse sand, for eksempel 30-65 grade, i en sementblander.

4. etablering av CMNs gjennom Potter/microcosms

  1. Plante forbehandling "sykepleier" planter av ønskede arten i hver beholder å opprettholde AM sopp slik at de kan spre blant beholdere og opprette CMNs.
  2. Når alle beholdere har etablert frøplanter, fjerne skudd av klipping slik at bare én person forblir i hver beholder.
  3. Tillat 2-3 måneder for plantevekst og CMN etablering.

5. etablering av eksperimentelle planter og behandlinger

  1. SOW eksperimentelle planter frø eller transplanting i containere. Hvis seeding, vente til alle beholdere har en spirer frøplante før forbehandling sykepleier planter av klipping deres skudd. Hvis transplanting, klippet alle forbehandling planter før transplanting eksperimentelle planter for å hindre utilsiktet konkurransedyktig effekter.
  2. Etablere CMN behandlinger ved å enten la beholdere ikke flyttet for varigheten av forsøket (intakt CMNs) eller rotere dem ukentlige fysisk bryte hyfer utvide blant endret beholdere (kuttet CMNs; Figur 1A). Når kuttet CMNs, Roter hver beholder gjennom en full rotasjon å unngå utilsiktet endring aboveground samspill, spesielt for heliotropic planter.
  3. Sterkt vann alle Potter eller microcosms umiddelbart etter rotasjon gjenopprette kontakt mellom interstitiell underlaget og sidene av beholdere.

6. sporing av mineral næringsstoffer bevegelsen i CMNs

  1. Gjødsle nærliggende planter med 0,5% 15N beriket KNO3 og NH4Cl.
  2. Gjødsle den mål enkelt med 14N gjødsel lik konsentrasjon.

7. overvåking og vedlikehold av eksperimentet

  1. (I minst månedlig) re tilfeldig stillingene av Potter eller microcosms i løpet av eksperimentet.
  2. Ukentlig måle vekst, for eksempel høyde eller lengste blad lengde (på gress) for å overvåke når veksten begynner å avta, fordi det er viktig å høste før plantene blir rot bundet.

8. innhøstingen av eksperimentet

  1. Klippet alle aboveground vev og plassere individuelle planter i merket konvolutter som identifiserer deres behandling, potten eller mikrokosmos og plassering.
  2. Tørr aboveground vev på 60 ° C til konstant vekt. Måle tørr vekt hver plante vev.
  3. La jorda tørke før utpakking beholdere og høsting røttene.
  4. Delikat børste av mye jord som mulig fra roten systemer og vaske dem i en panne med vann eller under en svak strøm av vann på en sil av 250 mikron porestørrelse.
  5. Tillate at røttene air-dry og veie hele rotsystem.
  6. Klippet rotsystem måfå og lagre rot fragmenter i 50% etanol. Når de er farget33, bruke disse fragmentene for kvantifisering av rot kolonisering bruker støttelinje skjæringspunktet metoden34.
  7. Nytt veie gjenværende rotsystem og lagre den i en merket papir konvolutt tørke på 60 ° C for vurdering av tørr vekt. Bruke denne formelen til å beregne vekten av hele roten systemet:

Equation 1

9. mineral næringsstoffer og stabil isotop analyser

  1. Gruppere seedlings av biomasse i "desil" eller 10 grupper, "octiles" eller 8 grupper, "kvartiler" eller fire grupper, etc. etter rang-bestiller dem vekt hvis vev antallet er for lav for minimumskravene for fordøyelsen å bestemme mineral næringsstoff konsentrasjoner.
  2. Sende foliar prøver til en kontrakt lab for mineral næringsstoffer og stabil isotop analyser (Tabell for materiale).
    1. Beskriv isotopanrikning overflod med følgende vanlige uttrykk:
      Equation 1
      der R representerer de 15N /14N-forhold av et utvalg eller standard som stemningsfullt N.
    2. Bruk ingen-modifisert, solid beholder behandling å tjene som en kontroll for bakgrunnen 15N prosenter i følgende masse balanse ligningen når kvantifisere mengden 15N tatt opp av en målet anlegg i kuttet eller intakt CMN behandlinger:
      Equation 1
      der ses15N representerer isotopanrikning overflod av mål, naboer og målet planter i ingen CMN behandling, og x representerer (som en desimal) prosent nitrogen oppnådd målet anlegget fra nabo beholdere som etiketten er lagt til. Verdier for ses15Nnaboer hentes for hvert mål anleggets composited naboer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

For å bestemme hvordan CMNs kan påvirke anlegg ytelse gjennom nærings partisjonering, vokste vi Andropogon gerardii Vitman, en dominerende prærien gress, i et mål anlegget eksperiment med 6 med jevne mellomrom naboer og intakt, kuttet, eller ingen CMNs. Vi fant at kuttet eller hindre CMNs redusert mål aboveground tørr vekter (figur 2), noe som tyder på at intakt CMNs fremmet plantevekst. Planter med kuttet CMNs og forhindret CMNs svarte spesielt på samme måte som deres behandling, tyder på at rotasjonen av containere ukentlig var vellykket ved å redusere effekten av CMNs. Kuttet CMN behandling, men kan bli foretrukket som en kontroll fordi nylon mesh (som var overlain av en hydrofobe membran i dette eksperimentet) i både intakt og kuttet behandlinger kan påvirke vann dynamics som jord av spor beholdere (rotert eller ikke) tørker raskere enn i ingen-modifisert beholdere.

Konkurranse, hvor veksten av en enkelt undertrykker veksten av en person, ble oppdaget i intakt CMN behandling, men ikke i den avkuttede eller ingen CMNs behandlinger. Vi fant at bare når CMNs var intakt målet og summerte nabo størrelser har en negativ forhold som demonstrert av lineær regresjon (Figur 3). Det kuttet og ingen CMNs behandlinger skiller seg ikke fra hverandre, og sammen, deres bakken avvike ikke betydelig fra null. Derfor de skilte seg betydelig fra den negative skråningen på Behold CMNs behandling (Figur 3). Videre fant vi at Gini koeffisienter, et mål på størrelse ulikhet som spenner fra null til en i som null gjenspeiler en helt lik størrelsesDistribusjon, skilte seg blant behandlinger. Behold CMNs behandling hadde de største ulikhet10,35,36. Størrelse ulikheter påvirkes av konkurranse innenfor befolkninger, spesielt når store individer dominere ressurs oppkjøpet, dermed uproporsjonalt undertrykke veksten av små individer, kalles også asymmetrisk konkurranse37 , 38.

Om næringsstoffer fra mineraler var vekst-begrensende, og CMNs bidro til identifiserte intens konkurranse for disse næringsstoffer gjennom sammenligninger av mineral næringsstoffer blad vev konsentrasjoner versus anlegget størrelse. Av alle mineral næringsstoffer vurdert, fant vi at bare Mn blad vev konsentrasjoner var positivt assosiert med målet anlegget aboveground tørr vekt over alle behandlinger, med ingen betydelige forskjeller mellom bakker, antyder at Mn kan ha begrenset vekst blant alle behandlinger (Figur 4). Likevel ble regresjon linje høyder, som foreslår forskjeller i gjennomsnittlig konsentrasjoner blant behandlinger, berørt av CMN kuttet og forebygging. Mener foliar N konsentrasjoner ikke ble betydelig påvirket av CMN behandlinger, men N konsentrasjon betydelig redusert med over vekt mål planter, antyder en potensiell "fortynning effekt" plante størrelse på vev N39, 40. derfor N var ikke sannsynlig vekst-begrensende mineral næringsstoffer i vårt eksperiment. I en annen lignende eksperiment, mener foliar P var betydelig påvirket av CMN behandling, men også viste en fortynning effekt sammenlignet med plante størrelse for planter med intakt CMNs35.

For å undersøke om CMNs ulikt deling næringsstoffer fra mineraler blant sammen personer, vurdert vi anlegget vevet 15N blad vev versus anlegget størrelse. Vi hadde lagt 15N-label bare til naboer beholdere. Vi fant at målet planter med intakt CMNs hadde høyere 15N konsentrasjoner i forhold til både andre behandlinger, som ikke skiller seg fra hverandre (figur 5A). Selv om målet aboveground tørr vekt var assosiert med hvor mye nitrogen oppnådd fra naboer containere over både intakt og kuttet CMNs behandlinger, hadde intakt CMNs en sterkt positive, signifikant forskjellig skråning fra at kuttet CMNs behandling (figur 5B). Disse resultatene tyder på at store planter, potensielt med rikelig photosynthate, innhentet mer 15N fra CMNs nå i nabolandet beholdere enn små mål individer. Våre resultater tyder også på at hydrofobe membranen vellykket forhindret gratis vann (og påfølgende 15N) bevegelse i potter.

I et annet rotert kjerner målet anlegget eksperiment, guava (Psidium guajava) tre seedlings ble dyrket i store frøplante beholdere er innebygd i store potter, og alle (inkludert store potter) ble fylt med samme relativt næringsrik jord blanding. Når CMNs ble kuttet av rotasjon i fravær av naboer, plantevekst betydelig redusert til samme størrelse som planter i solid beholdere, antyder at rotert planter bare hadde redusert tilgang til full jord volumet av de store pottene (figur 6 ). Når målet planter hadde en rekke naboer, plante størrelse redusert lignende størrelser og noen statistisk synlig effekt av kuttet CMNs forsvant (figur 6).

I et felt eksperiment med rotert-kjerner laget av PVC-rør, undersøkt en av oss påvirker extraradical mycel anlegg ytelse i et felt eksperiment av Soapberry (Sapindus saponaria L.) (figur 7). Selv om extraradical mycel utover rør hadde liten effekt på plantevekst under tretten måneders eksperimentet, redusert kuttet det av rotasjon av rør foliar N, P og Cu konsentrasjoner betydelig (med 25% eller mer).

Figure 1
Figur 1. Eksperimentoppsett beholdere i intakt, kuttet, eller kontroll behandlinger (A), potter i en mål plante eksperimentere (B), eller microcosms med et Sekskantet (C) eller firkantet (D) oppsett av beholdere. Dark ovale flekker på endrede beholdere er en åpning i beholderen dekket med en 40 µm nylon maske for sopp hyfer å trenge (A). Vanlige mycorrhizal nettverk beholdes med ingen rotasjon av beholderne, er kuttet av rotasjon eller forhindres fra å etablere med en solid plast container (A). I et mål anlegget potten eksperiment, kan beholdere plasseres i en skum bunn som plasserer dem (B). For et mikrokosmos eksperiment, kan bunnen av lagt ut i et Sekskantet utvalg med seks equidistant, nærmeste naboer for hver "mål" personlige (C) eller i en matrise med fire nærmeste naboer og fire, litt fjernere, diagonal naboer for hver "mål" (D). Panelet B er endret fra Weremijewicz et al.10. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2. Mener (± SE) aboveground og belowground tørr vekter (g) av målet Andropogon gerardii individer blant vanlige mycorrhizal nettverk behandlinger. Aboveground tørr vekter vises som positive verdier over abscissa og belowground tørr vekt er positive verdier under abscissa. Aboveground tørrvekt barer toppet med samme bokstav ikke avviker av Tukeys ærlig betydelig forskjell innlegg-hoc test på ɑ = 0,05. Belowground tørr vekt skiller ikke mellom behandlinger, og dermed er ikke toppet av bokstaver. Dette tallet er endret fra Weremijewicz et al.10. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3. Total nabo (g) mot målet anlegget aboveground tørrvekt (g) for Andropogon gerardii planter. Planter med intakt felles mycorrhizal nettverk (CMNs) er representert av mørke trekanter og en heltrukket linje, med kuttet CMNs grå firkanter og en stiplet linje og med ingen CMNs av hvite diamanter og en prikket linje. Dette tallet er endret fra Weremijewicz et al.10. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4. Målrette aboveground tørr vekter (g) versus foliar mangan konsentrasjoner (μg·g-1) av Andropogon gerardii. Planter med intakt felles mycorrhizal nettverk (CMNs) er representert av mørke trekanter og en heltrukket linje, med kuttet CMNs grå firkanter og en stiplet linje og med ingen CMN av hvite diamanter og en prikket linje. Dette tallet er endret fra Weremijewicz et al.10. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5. Ses15N (‰) ± SE målet Andropogon gerardii individer (A) med intakt felles mycorrhizal nettverk (CMNs, svarte striper), kuttet CMNs (grå barer), og ingen CMN (hvit barer) og prosent nitrogen innhentet fra nabo beholder jord av planter med Behold CMNs i ambient sol (trekanter) eller skygge (grå firkanter) mot målet aboveground tørrvekt (g; B). barer toppet med samme bokstav i panelet A ikke avviker av Tukeys ærlig betydelig forskjell innlegg-hoc test på ɑ = 0,05. Disse tallene endres fra Weremijewicz et al.10. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 6
Figur 6. Mener (± SE) aboveground og belowground tørr vekter (g) av målet Psidium guajava individer blant vanlige mycorrhizal nettverk (CMNs) og nabo behandlinger. Langs abscissa, ingen nabo behandling er representert ved «0N", en nabo av"1N,"osv., mens en kontroll behandling med ingen CMNs (inokulerte solid beholder og ingen naboer) representeres av lys skyggelegging og bokstaven"C". Biomasse av planter med intakt CMNs er representert med heltrukne stolper, mens de med kuttet CMNs er hachured. Aboveground tørr vekter vises som positive verdier over abscissa belowground tørr vekter er positive verdier under abscissa. Barer toppet med samme bokstav ikke avviker av Tukeys ærlig betydelig forskjell innlegg-hoc test på ɑ = 0,05. Aboveground og belowground tørr vekt på kontroll behandling var bare sammenlignet med intakt og kuttet CMN med ingen naboer (angitt med greske bokstaver) fordi kontrollen ikke inkluderte naboer som en tilleggsfaktor i behandlingen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 7
Figur 7. Utvidelse av metoden rotert kjernen feltforsøk (A) og representative 13-måneden-gamle Sapindus saponaria L. seedlings med intakt (ikke rotert) og kuttet (rotert) felles mycorrhizal nettverk (B). Polyvinylklorid rør (9 cm diameter x 20 cm høyde) ble boret med et hull-så å ha fire 5,3 cm diameter hull i to imot par. Hullene var dekket med en nylon silketrykk mesh med 30 µm porene gjennom hvilke extraradical mycel kunne utvide både fra og til kjernene som var fylt med jord fra planting området (A). Vanlige mycorrhizal nettverk ble holdt intakt eller kuttet av rotasjon bruker en stor pipe skiftenøkkel. Plasseringen av sammenkoblet rotert og ikke rotert kjerner (ca 20 cm fra hverandre) er merket med flagg hver 2 m langs fem transects i eksperimentell plottet i en Litchi Lund (A). Bevis for avbrudd i extraradical mycel redusere N, P og Cu opptak vises chlorotic anleggene merket "rotert" vises i B. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Resultatene bekrefter at vår rotert kjernen metode kan kraftig fokusere på rollen som CMNs i belowground anlegget interaksjoner. Det er flere viktige skritt i protokollen, men som hvis endres, har potensial til å påvirke muligheten til å oppdage CMN effekter. Det er viktig å fylle interstitiell området rundt beholdere med en nærings-fattig medium. I vår mislykket, rotert kjerner mål anlegget eksperimentet av guava treet, selv om det var en markert reduksjon mål vekst i nærvær av flere naboer, ingen effekter av CMNs på belowground konkurransen ble oppdaget, sannsynligvis på grunn av mineral næringsstoffer tilgjengelighet gjennom pottene. I kontrast, sikrer bruk av en nærings-fattig medium mellom rotert kjerner at hyfer må nå i nabolandet beholdere som ofte er fylt med både hyfer og røtter (særlig når du arbeider med rot-intensive gress). Extraradical hyfer i nabolandet beholdere dermed er i direkte konkurranse med rotsystem og må partisjonere næringsstoffer fra mineraler fra slike "patcher" blant anlegg knyttet til en CMN. En annen komponent i å gjøre belowground vekselsvirkningene synlig er å unngå aboveground konkurranse. Våre guava eksperiment viste at effekten av ekstra jord volumtilgang tydelig når målet plantene hadde ingen naboer var i hovedsak eliminert når målet seedlings ble skyggen av naboer. Bruke gress som hovedsakelig vokser vertikalt eller innskrenke frøplante blad kroner å forhindre overlapping vil bidra til å redusere aboveground interaksjoner.

Bruk av noe stive beholdere i stedet for mesh poser, er avgjørende i å opprettholde en lang eksperiment med enkel kuttet CMNs gjennom rotasjon. I et tidlig forsøk på en CMN eksperiment, prøver å trekke en kniv mellom mesh poser å bryte CMNs ikke bare resulterte i skadet poser som røtter kunne stikke men også virket positivt øke jord lufting resulterer i dramatisk forbedret plantevekst når CMNs ble kuttet. Fordi den roterte kjerne tilnærmingen beveger hver beholder i en konstant (takk til støtte posisjon hullene i bunnen av potten eller mikrokosmos), reduserer det omkringliggende substrat avbrudd og potensielle lufting. Det er helt avgjørende, men grundig vannet Potter etter rotasjon av containere tilbake lav fruktbarhet, interstitiell sand substrat for å kontakte tett beholdere.

Metoden foreslått rotert kjernen kan endres på en rekke måter å svare på en rekke spørsmål om funksjon av CMNs og extraradical mycelia. For eksempel reduseres mengden karbon tilgjengelig for Salix å gi CMNs med skyggelegging10. Skygge klut pakket rundt endret frøplante beskyttere å omringe personlige beholdere lyktes redusere karbon klargjøring til CMNs og dermed 15N opptak fra CMNs10. I tillegg befolkningen kan undersøkes i store microcosms (figur 1 c, D) som består av mange planter, hver i en enkelt, roterte beholderen. Det er viktig å merke seg at det må være forsiktig å unngå pseudoreplication41 når du gjør dette. Individuelle planter er absolutt ikke "replikerer" fordi de ikke uavhengig av den andre planter i et mikrokosmos. I stedet er hele eksperimentelle enheten (potten eller mikrokosmos) en gjenskape, det er derfor vi brukte gjennomsnitt eller summert nabo anlegget størrelser per pott før du kjører analyser av varians eller lineære regresjoner.

Vår tilnærming kan endres for feltstudier for å utelukke rot konkurranse og undersøke påvirkning av intakt CMNs. Ved å erstatte beholdere med PVC pipe stykker med store hull dekket med nylon silketrykk mesh, rotert kjerner tåler tøffe feltforhold, som Soapberry eksperimentet. Lik vår guava potten eksperiment, men effekten av kuttet potensielle CMNs kan ikke skilles fra bare begrense jord volumet som næringsstoffer fra mineraler kan være kjøpt.

Vår tilnærming gir en kontrollert, forsiktig sammenligning av planter samspill over CMNs versus mycorrhizal planter som ikke er vedvarende sammenkoblet (i stedet for planter helt mangler mycorrhizas). Derfor det etterligner aspekter av naturen, som seedlings bli etablert CMNs samt bruk av en rekke AM sopp. Siste arbeid har vist at ulike AM sopp arter kan være ulik kvalitet partnere planter, og at tilstedeværelsen av en andre arter av AM sopp på en rotsystem kan indusere en '' sopp arter å gi mer fosfor i retur for karbon enn når alene på rotsystem42. Videre kan ulike arter av sopp gi fordeler enn mineral næringsstoffer oppkjøpet å plante hosts, som tørke og saltholdighet toleranse eller beskyttelse mot patogener2. Disse funnene understreker viktigheten av å bruke en rekke sopp for å etablere CMNs. til tross realisme er en iøynefallende begrensning av vår tilnærming eksperimentets varighet. Beholdere eller PVC rør begrenser hvor lenge før planter blir rot bundet, og dermed en tendens til å begrense fokus til bare frøplanter eller unge saplings. Likevel sender vi at det er stor fleksibilitet i utformingen av mål-plant rotert kjerner eksperimenter der en eller begge målene og naboer kan manipuleres i en rekke måter å forstå rollene til CMNs.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Vi ønsker å takke de to anonyme vurderinger for sine forslag. Vi takker også av mange studenter som har hjulpet med å bygge Potter, microcosms, og spor beholdere og som har bistått med vedlikehold og høsting eksperimenter. Vi takker også North Central College for oppstart midler (til JW) og aktuelle fasiliteter, samt Ashley Wojciechowski for å få et nord sentrale College Richter stipend støtte et eksperiment ved hjelp av disse metodene. Del av dette arbeidet ble finansiert av National Science Foundation doktorgrad avhandling forbedring stipend (DEB-1401677).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Commercial tubular seedlings container (called 'containers' in the manuscript) Stuewe and Sons, Inc Ray Leach Cone-tainer ™ RLC3U
Course glass beads Industrial Supply, Inc. 12/20 sieve Size #1
Course silica sand Florida Silica Sand 6/20 50lb bags None
Fine glass beads Black Beauty Black Beauty FINE Crushed Glass Abrasive (50 lbs) BB-Glass-Fine
Hydrophobic membrane Gore-tex None None
Large commercial tubular seedling containers Stuewe and Sons, Inc. Deepot ™ D16L
Medium silica sand Florida Silica Sand 30/65 50 lb bags None
Nylon mesh Tube Lite Company, Inc. Silk screen LE7-380-34d PW YEL 60/62 SEFAR LE PECAP POLYESTER
Soil and foliar nutrient analysis facility Kansas State University Soil Testing Lab None None
Stable isotope core facility University of Miami None None

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Remy, W., Taylor, T. N., Hass, H., Kerp, H. Four hundred-million-year-old vesicular arbuscular mycorrhizae. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91, (25), 11841-11843 (1994).
  2. Smith, S. E., Read, D. J. Mycorrhizal Symbiosis. 3 edn, Academic Press. (2008).
  3. Giovannetti, M., Avio, L., Sbrana, C. Mycorrhizal Networks. Springer. 41-67 (2015).
  4. Giovannetti, M., Sbrana, C. Cell Biology of Plant and Fungal Tip Growth. Vol. 328. Nato Science Series, Sub-Series I: Life and Behavioural Sciences. Cresti, A., Heath, M., Geitmann, I. B. 221-231 (2001).
  5. Giovannetti, M., Sbrana, C., Avio, L., Strani, P. Patterns of below-ground plant interconnections established by means of arbuscular mycorrhizal networks. New Phytologist. 164, (1), 175-181 (2004).
  6. Avio, L., Pellegrino, E., Bonari, E., Giovannetti, M. Functional diversity of arbuscular mycorrhizal fungal isolates in relation to extraradical mycelial networks. New Phytologist. 172, (2), 347-357 (2006).
  7. Giovannetti, M., et al. At the root of the wood wide web: self recognition and nonself incompatibility in mycorrhizal networks. Plant Signaling & Behavior. 1, (1), 1-5 (2006).
  8. Miller, R., Kling, M. J. The importance of integration and scale in the arbuscular mycorrhizal symbiosis. Plant and Soil. 226, (2), 295-309 (2000).
  9. Miller, R., Jastrow, J., Reinhardt, D. R. External hyphal production of vesicular-arbuscular mycorrhizal fungi in pasture and tallgrass prairie communities. Oecologia. 103, (1), 17-23 (1995).
  10. Weremijewicz, J., Sternberg, L. dS. L. O., Janos, D. P. Common mycorrhizal networks amplify competition by preferential mineral nutrient allocation to large host plants. New Phytologist. (2016).
  11. Fellbaum, C. R., et al. Fungal nutrient allocation in common mycorrhizal networks is regulated by the carbon source strength of individual host plants. New Phytologist. 203, (2), 646-656 (2014).
  12. Lekberg, Y., Hammer, E. C., Olsson, P. A. Plants as resource islands and storage units--adopting the mycocentric view of arbuscular mycorrhizal networks. FEMS Microbiol Ecol. 74, (2), 336-345 (2010).
  13. Jakobsen, I., Hammer, E. C. Mycorrhizal Networks. Springer. 91-131 (2015).
  14. Jakobsen, I., Rosendahl, L. Carbon flow into soil and external hyphae from roots of mycorrhizal cucumber plants. New Phytologist. 115, (1), 77-83 (1990).
  15. Kiers, E. T., et al. Reciprocal rewards stabilize cooperation in the mycorrhizal symbiosis. Science. 333, (6044), 880-882 (2011).
  16. Hartnett, D. C., Hetrick, B. A. D., Wilson, G. W. T. Mycorrhizal influence on intra- and interspecific neighbour interactions among co-occuring prairie grasses. Journal of Ecology. 81, (4), 787-795 (1993).
  17. Hetrick, B. A. D., Wilson, G. W. T., Todd, T. C. Differential responses of C3 and C4 grasses to mycorrhizal symbiosis, phosphorus fertilization, and soil microorganisms. Canadian Journal of Botany. 68, (3), 461-467 (1990).
  18. Johnson, D., Leake, J. R., Read, D. J. Novel in-growth core system enables functional studies of grassland mycorrhizal mycelial networks. New Phytologist. 152, (3), 555-562 (2001).
  19. Leake, J. R., et al. Networks of power and influence: the role of mycorrhizal mycelium in controlling plant communities and agroecosystem functioning. Canadian Journal of Botany-Revue Canadienne De Botanique. 82, (8), 1016-1045 (2004).
  20. Babikova, Z., et al. Underground signals carried through common mycelial networks warn neighbouring plants of aphid attack. Ecology Letters. 16, (7), 835-843 (2013).
  21. Schüepp, H., Miller, D. D., Bodmer, M. A new technique for monitoring hyphal growth of vesicular-arbuscular mycorrhizal fungi through soil. Transactions of the British Mycological Society. 89, (4), 429-435 (1987).
  22. Miller, D. D., Bodmer, M., Schüepp, H. Spread of endomycorrhizal colonization and effects on growth of apple seedlings. New Phytologist. 111, (1), 51-59 (1989).
  23. Jakobsen, I., Gazey, C., Abbott, L. K. Phosphate transport by communities of arbuscular mycorrhizal fungi in intact soil cores. New Phytologist. 149, (1), 95-103 (2001).
  24. Johnson, D., Leake, J., Ostle, N., Ineson, P., Read, D. J. In situ 13CO2 pulse‐labelling of upland grassland demonstrates a rapid pathway of carbon flux from arbuscular mycorrhizal mycelia to the soil. New Phytologist. 153, (2), 327-334 (2002).
  25. Johnson, D., Leake, J., Read, D. J. Transfer of recent photosynthate into mycorrhizal mycelium of an upland grassland: short-term respiratory losses and accumulation. of 14C. Soil Biology and Biochemistry. 34, (10), 1521-1524 (2002).
  26. Walder, F., et al. Mycorrhizal networks: Common goods of plants shared under unequal terms of trade. Plant Physiology. 159, (June 2012), 789-797 (2012).
  27. Song, Y. Y., et al. Interplant communication of tomato tlants through underground common mycorrhizal networks. Plos One. 5, (10), e13324 (2010).
  28. Merrild, M. P., Ambus, P., Rosendahl, S., Jakobsen, I. Common arbuscular mycorrhizal networks amplify competition for phosphorus between seedlings and established plants. New Phytologist. 200, (1), 229-240 (2013).
  29. Janos, D. P., Scott, J., Aristizábal, C., Bowman, D. M. J. S. Arbuscular-mycorrhizal networks inhibit Eucalyptus tetrodonta seedlings in rain forest soil microcosms. Plos One. 8, (2), e57716 (2013).
  30. Wyss Lozano Hoyos, T. Pinus elliottii var. densa Seedling Performance Reflects Ectomycorrhizas, Soil Nutrient Availability and Root Competition. (2010).
  31. Mäder, P., Vierheilig, H., Alt, M., Wiemken, A. Boundries between soil compartments formed by microporous hydrophobic membranes (GORE-TEX) can be crossed by vesicular-arbuscular mycorrhizal fungi but not by ions in the soil solution. Plant and Soil. 152, 201-206 (1993).
  32. Mäder, P., et al. Transport of 15N from a soil compartment separated by a polytetrafluoroethylene membrane to plant roots via the hyphae of arbuscular mycorrhizal fungi. New Phytologist. 146, (1), 155-161 (2000).
  33. Brundrett, M., Bougher, N., Dell, B., Grove, T. Working with Mycorrhizas in Forestry and Agriculture. (1996).
  34. McGonigle, T. P., Miller, M. H., Evans, D. G., Fairchild, G. L., Swan, J. A. A new method which gives an objective-measure of colonization of roots by vesicular arbuscular mycorrhizal fungi. New Phytologist. 115, (3), 495-501 (1990).
  35. Weremijewicz, J., Janos, D. P. Common mycorrhizal networks amplify size inequality in Andropogon gerardii monocultures. New Phytologist. 198, (1), 203-213 (2013).
  36. Weremijewicz, J., O’Reilly, L. dS. L., Janos, D. P. Arbuscular common mycorrhizal networks mediate intra-and interspecific interactions of two prairie grasses. Mycorrhiza. 1-13 (2017).
  37. Weiner, J. Asymmetric competition in plant populations. Tree. 5, (11), 360-364 (1990).
  38. Damgaard, C., Weiner, J. Describing inequality in plant size or fecundity. Ecology. 81, (4), 1139-1142 (2000).
  39. Johnson, C. R., Joiner, J. N., Crews, C. E. Effects of N, K, and Mg on growth and leaf nutrient composition of 3 container grown woody ornamentals inoculated with mycorrhizae. Journal of the American Society for Horticultural Science. 105, (2), 286-288 (1980).
  40. Estrada-Luna, A. A., Davies, F. T., Egilla, J. N. Mycorrhizal fungi enhancement of growth and gas exchange of micropropagated guava plantlets (Psidium guajava L.) during ex vitro acclimatization and plant establishment. Mycorrhiza. 10, (1), 1-8 (2000).
  41. Hurlbert, S. H. Pseudoreplication and the design of ecological field experiments. Ecological Monographs. 54, (2), 187-211 (1984).
  42. Argüello, A., et al. Options of partners improve carbon for phosphorus trade in the arbuscular mycorrhizal mutualism. Ecology Letters. 19, (6), 648-656 (2016).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics