बसिलस सबटिल् स बीजाणु में अंकुरोसोम और भीतरी झिल्ली का दृश्यावलोकन

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Bioengineering

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Summary

अंकुंट रिसेप्टर प्रोटीन बैसिलस सबटिल्स बीजाणु की भीतरी झिल्ली में ' अंकुरोसोम ' में क्लस्टर । हम एक प्रोटोकॉल का वर्णन सुपर संकल्प माइक्रोस्कोपी और फ्लोरोसेंट रिपोर्टर प्रोटीन का उपयोग करने के लिए अंकुरित ओसोम कल्पना । प्रोटोकॉल भी बीजाणु भीतरी झिल्ली डोमेन है कि बेहतर झिल्ली डाई FM4-64 के साथ दाग रहे है पहचानता है ।

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Wen, J., Pasman, R., Manders, E. M., Setlow, P., Brul, S. Visualization of Germinosomes and the Inner Membrane in Bacillus subtilis Spores. J. Vis. Exp. (146), e59388, doi:10.3791/59388 (2019).

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Abstract

बीजाणु के छोटे आकार और अंकुरण प्रोटीन के अपेक्षाकृत कम बहुतायत, एपिफ्लोरेंस माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर अपने सूक्ष्म विश्लेषण में कठिनाइयों का कारण । सुपर संकल्प त्रि-आयामी संरचित प्रदीप्ति माइक्रोस्कोपी (3D SIM) इस बाधा को दूर करने के लिए एक आशाजनक उपकरण है और बैसिलस सबटिल्स (बी. सबटिल्स) बीजाणु के अंकुरण की प्रक्रिया के आणविक विवरणों को प्रकट करता है । यहाँ, हम एक संशोधित सिमचेक (ImageJ) के उपयोग का वर्णन-सहायक 3 डी इमेजिंग प्रक्रिया और बी के सिम माइक्रोस्कोपी के लिए फ्लोरोसेंट रिपोर्टर प्रोटींस ' सबटिल्स ' बीजाणु अंकुरण, क्लस्टर (s) अंकुशन प्रोटीन के. हम भी एक (मानक) 3 डी-सिम इमेजिंग प्रक्रिया FM4-64 के धुंधला के लिए बी सबटिल्ज बीजाणु झिल्ली । इन प्रक्रियाओं का उपयोग करके, हम अंकुरासन स्थानीयकरण के लिए नायाब संकल्प प्राप्त किया और पता चलता है कि बी सबटिलिस KGB80 निष्क्रिय बीजाणु परिभाषित ंयूनतम mops माध्यम पर बीजाणु के बाद प्राप्त की > 80% एक या दो gerd-gfp और gerd-mops है Foci. उज्ज्वल फोकी भी FM4 में मनाया गया-64 दाग ' spores 3 डी-सिम छवियां सुझाव है कि विभिंन तरलता की भीतरी झिल्ली लिपिड डोमेन की संभावना मौजूद हैं । इसके अलावा अध्ययन है कि झिल्ली रंजक और अंकुरण रिपोर्टर प्रोटीन के साथ दोहरी लेबलिंग प्रक्रियाओं का उपयोग सह स्थानीयकरण का आकलन करने के लिए और इस तरह के भीतरी बीजाणु झिल्ली में Bacillus अंकुरित प्रोटीन के संगठन का एक इष्टतम सिंहावलोकन हो रहे है संभव.

Introduction

आदेश के बीजाणु बेसिलेस और क्लोस्ट्रिडिएलीज़ metabolically निष्क्रिय और असाधारण कठोर विसंदूषण सरकारों के लिए प्रतिरोधी रहे हैं, लेकिन जब तक वे अंकुरित, मानव में हानिकारक प्रभाव पैदा नहीं कर सकता1। पोषक तत्वों के अंकुरण में बेसिलस सबटिल्स (बी. सबटिल्स) बीजाणु का उगने से उत्पन्न होना, शुरूआती घटना बीजाणु की भीतरी झिल्ली (आईएम) में स्थित अंकुंत रिसेप्टर्स (जीआरएस) के लिए बाध्यकारी है । बाद में, GRs SpoVA चैनल प्रोटीन भी IM में स्थित करने के लिए संकेतों का पता लगाने । बीजाणु कोर पिरिडीन-2, 6-dicarboxylic एसिड के आदान प्रदान की शुरुआत में यह परिणाम (dipicolinic एसिड; DPA SpoVA चैनल के माध्यम से पानी के लिए बीजाणु कोर सूखी wt के 20% शामिल है) । बाद में, dpa जारी प्रांतस्था पेप्टिडोग्लाइकन hydrolysis के सक्रियण चलाता है, और अतिरिक्त पानी ऊपर उठाना2,3,4निंनानुसार है । इन घटनाओं कोट परतों पर यांत्रिक तनाव के लिए नेतृत्व, इसके बाद टूटना, बहिर्विकास की शुरुआत और, अंत में, वनस्पति विकास । हालांकि, अंकुरण प्रक्रिया के सटीक आणविक विवरण अभी भी हल से दूर हैं ।

बीजाणु अंकुरण के बारे में एक प्रमुख प्रश्न आईएम अंकुरण प्रोटीन के रूप में के रूप में अच्छी तरह से आईएम SpoVA चैनल प्रोटीन आसपास लिपिड के जैव भौतिक गुणों से संबंधित है । यह काफी हद तक स्थिर IM लिपिड bilayer कई छोटे अणुओं के लिए मुख्य पारगम्यता बाधा है, विषाक्त रासायनिक परिरक्षकों सहित, जिनमें से कुछ बीजाणु कोर या वनस्पति कोशिका कोशिका द्रव्य5,6में अपनी कार्रवाई डालती । Im लिपिड bilayer एक जेल राज्य में होने की संभावना है, हालांकि वहां im5में मोबाइल रक्तदाब का एक महत्वपूर्ण अंश है । बीजाणु IM भी महत्वपूर्ण विस्तार5के लिए क्षमता है । इस प्रकार, आईएम की सतह क्षेत्र अतिरिक्त झिल्ली संश्लेषण के बिना अंकुरण पर १.६-गुना बढ़ जाती है और इस झिल्ली की विशेषता कम पारगम्यता और लिपिड गतिहीनता5,6की हानि के साथ है ।

जबकि अंकुरण प्रोटीन के सक्रियण के आणविक विवरण और आईएम लिपिड के संगठन बीजाणु में अध्ययन के लिए आकर्षक विषय हैं, बी सबटिलिस बीजाणु के छोटे आकार और अंकुरण प्रोटीन के अपेक्षाकृत कम बहुतायत, एक चुनौती पैदा सूक्ष्मदर्शी विश्लेषण के लिए । ग्रिफिथ एट अल. संमोहक epifluorescence माइक्रोस्कोप सबूत, प्रतिदीप्त पत्रकारों का उपयोग अंकुरण प्रोटीन के लिए संगलित, पता चलता है कि बी सबटिलिस बीजाणु पाड़ प्रोटीन गर्ड में तीन जीआर subयूनिट्स (ए, बी और सी) के लिए गेरा, बी और कश्मीर grs का आयोजन करता है, एक क्लस्टर में7। वे अंकुरण प्रोटीन के इस समूह के लिए ' अंकुरित ' शब्द गढ़ा और संरचनाओं के रूप में वर्णित ~ ३०० एनएम बड़े IM प्रोटीन फोकी8। बीजाणु अंकुरण की शुरूआत करने पर, फ्लोरोसेंट अंकुरित फोक अंततः बड़े फैलाव फ्लोरोसेंट पैटर्न में बदल जाता है, > के साथ 75% बीजाणु आबादी के इस पैटर्न को प्रदर्शित करता है जिसके साथ 1 ज से एल-वैलाइन8के लिए अंकुरित होता है । ध्यान दें कि ऊपर उल्लेख कागज लगातार फ्लोरोसेंट चित्रों के दर्जनों से औसत छवियों का इस्तेमाल किया, सांख्यिकीय शक्ति हासिल है और कम फ्लोरोसेंट संकेतों की बाधा को दूर इमेजिंग के दौरान मनाया । बैक्टीरियल बीजाणु में इन संरचनाओं के इस दृश्य क्या शास्त्रीय सूक्ष्म उपकरणों के साथ तकनीकी रूप से संभव है और न ही एक बीजाणु में फोकी की राशि का मूल्यांकन और न ही उनके अधिक विस्तृत subcellular स्थानीयकरण के किनारे पर था इस दृष्टिकोण के साथ संभव है ।

यहां, हम संरचित प्रदीप्ति माइक्रोस्कोपी (सिम) के उपयोग के लिए एक विस्तृत दृश्य प्राप्त करने के लिए और अंकुरों की मात्रा (एस) के बीजाणु में बी सबटिल्स, के रूप में अच्छी तरह के रूप में उनके आईएम लिपिड डोमेन9का प्रदर्शन । प्रोटोकाल में स्मस्युलेशन, स्लाइड तैयारी और इमेज एनालिसिस के साथ सिमचेक (v 1.0, एक इमेजेज प्लगइन) के साथ-साथ इमेजेज10,11,12के लिए भी निर्देश हैं ।

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Protocol

1. B. सबटिलिस स्पोर्लेशन (समय: सूक्ष्म प्रेक्षण से 7 दिन पहले)

  1. Day 1
    1. एक Luria पर एक बैक्टीरियल संस्कृति स्ट्रीक-Bertani शोरब (पौंड) आगर प्लेट (1% tryptone, ०.५% खमीर निकालने, 1% NaCl, 1% आगर)13 और ३७ डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात इनसेबेट एकल कालोनियों प्राप्त करने के लिए । का प्रयोग करें बी सबटिलिस KGB80 (PS4150 गेरका gerka gerka-mcherry बिल्ली, गर्ड-gfp kan) तनाव और उसके माता पिता की पृष्ठभूमि तनाव बी सबटिलिस PS4150 (PS832 δgere:: spc, δcote:: tet) के रूप में पहले वर्णित7
      नोट: Δcoteδgere पृष्ठभूमि के साथ बीजाणु का उपयोग अंकुरित दृश्य में आवश्यक है, ताकि बीजाणु कोट परतों7के autofluorescence कम करने के लिए ।
    2. सभी मीडिया, ट्यूबों, pipets और अंय संस्कृति सामग्री के लिए उपयुक्त तरीकों के साथ इस्तेमाल किया जा जीवाणुरहित ।
  2. दिन 2
    1. सुबह में एक एकल कॉलोनी को 5 मिलीलीटर पौंड मीडियम में इन्नोलेट करें और एक स्क्रू कैप ट्यूब में २०० rpm/min और ३७ ° c में निरंतर आंदोलन के तहत संस्कृति को सेते हैं जब तक कि ओडी६०० 0.3-0.4 (लगभग 7 ज) तक पहुंच जाता है ।
    2. बनाने के ५०० एमएल MOPS मध्यम (पीएच ७.५) युक्त 3 एनएम (NH4)6मो7o24· 4H2o, ०.४ Μm ज3बो3, 30 एनएम cocl2· 6H2ओ, 10 एनएम cuso4· 5h2o, 10 एनएम ZnSO4· 7h2ओ, १.३२ mm k2Hpo4, ०.४ mm mgcl2· 6h2ओ, ०.२७६ मिमी k2तो4, ०.०१ मिमी feso4· 7h2ओ, ०.१४ मिमी cacl2· 2h2ओ, ८० मिमी MOPS, 4 मिमी Tricine, ०.१ मिमी MnCl2· 2h2ओ, 10 मिमी डी-ग्लूकोज-मोनोहाइड्रेट, और 10 मिमी एनएच4सीएल ।
    3. पेंच कैप ट्यूबों 10-1-10-7 में तैयार 5 मिलीलीटर एमओपी में पौंड संस्कृति के क्रमिक फैलाव को प्रत्येक और २०० rpm/min और ३७ डिग्री सेल्सियस पर निरंतर आंदोलन के तहत रातोंरात संस्कृतियों को सेते हैं ।
      नोट: यहां तैयार किए गए क्रमिक फैलाव का उद्देश्य अगली सुबह जल्दी घातांक चरण में एक कमजोर पड़ने का लक्ष्य प्राप्त करना है । यह कदम और अगले कदम के लिए कोशिकाओं को MOPS buffered विकास के माध्यम से अनुकूलन की अनुमति आवश्यक हैं ।
  3. दिन 3
    1. 0.3-0.4 के एक आयुध डिपो६०० के साथ mops dilutions में से एक का चयन करें । ०.२ मिलीलीटर की संस्कृति को पूर्व-गर्म करने के लिए (३७ डिग्री सेल्सियस) एक शंक्वाकार २५० मिलीलीटर फ्लास्क और निरंतर आंदोलन के तहत सेने में 20 मिलीलीटर के लिए, जब तक कि आयुध डिपो६०० 0.3-0.4 (~ 7 ज) तक पहुंच जाता है ।
    2. एक शंक्वाकार लीटर फ्लास्क में सतत आंदोलन के तहत 1% (v/v) पूर्व-कल्चर के साथ-साथ चरण 1.3.1 और सेते से 3 दिन के लिए एमओपी आधारित स्पो्यूलेशन मीडियम (२५० मिलीलीटर) को इन्नोलेट करें । FM4-64 PS4150 spores के धुंधला के लिए, 2 μg/mL FM4-64 जांच ( सामग्री की तालिकादेखें) के लिए spores मध्यम 1 या 2 एच के शिखर तक पहुंचने के बाद (आम तौर पर लगभग 2) वनस्पति विकास के ओडी६०० मूल्य और संस्कृति की अनुमति बाद में इसे हल्के5से सुरक्षित करते हुए स्पोरलेट करते हैं ।
  4. 7 दिन: बीजाणु की कटाई
    1. चरण अंधेरे कोशिकाओं और संभवतः गैर परिपक्व बीजाणु से चरण उज्ज्वल बीजाणु भेद करने के लिए 100X आवर्धन पर चरण कन्ट्रास्ट माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके स्पोरिलेशन यील्ड (बीजाणु बनाम वनस्पति कोशिकाएं) निर्धारित करें । एक ९०% चरण उज्ज्वल बीजाणु उपज की उंमीद है ।
    2. गोल नीचे सेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए ४,२७० x g पर बीजाणु गोली । स्टरलाइज्ड अल्ट्रा-प्योर टाइप 1 के ४० मिलीलीटर के साथ बीजाणु गोली 2-3 बार धो लें ५० मिलीलीटर शंक्वाकार अपकेंद्रक ट्यूबों में ( सामग्री की तालिकादेखें) । स्पिन नीचे 15 मिनट (4 डिग्री सेल्सियस) के लिए ४,२७० x जी पर प्रत्येक धोने पर ।
  5. दिन 7: बीजाणु शोधन
    1. बीजाणु शोधन: ७५० μL में बीजाणु गोली निलंबित 20% नोनिओनिक घनत्व ग्रेडिएंट माध्यम ( सामग्री की तालिकादेखें) और ८०० μl पर ५०% नोनिओनिक घनत्व ढाल मध्यम के पर लोड निष्फल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों । २१,५०० x gपर ६० मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज प्राप्त गोली मुक्त बीजाणु होते हैं । २०० μL में बीजाणु गोली निलंबित 20% नोनियोनिक घनत्व ग्रैडिएंट माध्यम और लोड के 1 मिलीलीटर पर ५०% नोनिओनिक घनत्व ग्रैडिएंट माध्यम में एक microcentrifuge ट्यूब, और 15 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज पर २१,५०० x g.
    2. अंतिम बीजाणु तैयार करने और भंडारण धोने: गोली प्राप्त शुद्ध निष्क्रिय बीजाणु शामिल हैं । सजाना अल्ट्रा शुद्ध प्रकार 1 पानी की १.५ मिलीलीटर के साथ बीजाणु गोली 2-3 बार धो ( सामग्री की मेजदेखें) और स्पिन के बीच में ९,५६० x जी पर 15 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर । अंत में, अल्ट्रा में गोली निलंबित-शुद्ध प्रकार 1 पानी की एक अंतिम आयुध डिपो के लिए६०० लगभग 30 । बीजाणु के Aliquots 8 सप्ताह14के लिए-८० डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है ।

2. डिकोटिंग

  1. 1 ज के लिए ७० डिग्री सेल्सियस पर ०.१ एम nacl/0.1 मीटर naoh/1% सोडियम डोडेसिल सल्फेट (एसडीएस)/0.1 m डाइथियोथ्रीटॉल (डीटीटी) के साथ PS4150 बीजाणु का इलाज करें । बीजाणु को निष्फल अल्ट्रा-प्योर टाइप 1 पानी15,16के साथ 10 बार धोएं । ऐसा करके, बीजाणु की बाहरी झिल्ली और बाहरी परतों में कोई भी अधिशोषित FM4-64 जांच को हटा दिया जाएगा ।

3. Coverslip और स्लाइड तैयारी11 (समय: अवलोकन से पहले 1 ज)

  1. पूर्व साफ उच्च परिशुद्धता coverslips ( सामग्री की मेजदेखें) 1 एम एचसीएल के साथ एक धीरे मिलाते हुए पानी स्नान में 30 मिनट के लिए । Coverslips दो बार अल्ट्रा में धो-शुद्ध प्रकार 1 पानी, और उंहें १००% में स्टोर (vol/ उंहें सूखी और उपयोग करने से पहले उनकी स्पष्टता की पुष्टि करते हैं । ग्लास स्लाइड् स को प्री-क्लीन ७०% EtOH में । उंहें सूखी और उपयोग करने से पहले उनकी स्पष्टता की पुष्टि करते हैं ।

4. नमूना प्रतिदीप्त सूक्ष्मदर्शी या जीन फ्रेम स्लाइड10 में बीजाणु (समय 15 मिनट)

  1. पूर्व गर्म २ ७०% etoh साफ और हवा सूखे कांच स्लाइड ( सामग्री की मेजदेखें) एक ७० डिग्री सेल्सियस हीटिंग ब्लॉक पर कई सेकंड के लिए, ड्रॉप ६५ μl निष्फल 2% एक गिलास स्लाइड के शीर्ष पर ७० डिग्री सेल्सियस पर आयोजित ऐगेरोस और शीर्ष पर अन्य कांच स्लाइड जगह ऐगेरोस बी फैल स्लाइड का etween । ऐगेरोस पैच लगभग 5 मिनट में सूख जाएगा ।
  2. ग्लास स्लाइड में से एक को हटाने के बाद एक 1 x 1cm अनुभाग में ऐगेरोस पैच काटें, नमूना के ०.४ μl जोड़ें (फ्लोरोसेंट microspheres या ~ 108/एमएल के बीजाणु), और पैच पर coverslip रखकर उच्च परिशुद्धता coverslip पर पैच हस्तांतरण और इसे बंद फिसलने ।
  3. एक जीन फ्रेम (१.५ x १.६ सेमी2, ६५ μl) सूख स्लाइड पर तय है, जिस पर coverslip फ्रेम के सभी कोनों बंद रखा है, इस प्रकार माइक्रोस्कोपी में उपयोग के लिए स्लाइड को पूरा ।

5. इमेजिंग11,17(समय: 1 ज)

  1. एक संरचित रोशनी माइक्रोस्कोप पर संचरण और प्रतिदीप्ति छवियों के साथ ही लाल और पीले-हरे कार्बोक्सिलेट संशोधित फ्लोरोसेंट माइक्रोबिल्स के मिश्रण पर कब्जा ( सामग्री की मेजदेखें) एक 100x तेल उद्देश्य से सुसज्जित ( संख्यात्मक अपर्चर = १.४९), एक सीसीडी कैमरा और छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर ( सामग्री की मेजदेखें) । परिवेश प्रकाश की अशांति के बिना कमरे के तापमान पर सभी छवियों को उत्पंन करते हैं । हमेशा 100x उद्देश्य और इमेजिंग से पहले ७५% इथेनॉल के साथ स्लाइड साफ करने के लिए सुनिश्चित करें ।
  2. १०० एनएम (व्यास) फ्लोरोसेंट microspheres पर ध्यान केंद्रित है और 100x उद्देश्य पर सुधार की अंगूठी का समायोजन करके बिंदु प्रसार समारोह (पीएसएफ) का अनुकूलन जब तक एक सिमिट्रिक पीएसएफ प्राप्त है, इस प्रकार छवि के धुंधला कम करने । पीएसएफ आवेग प्रतिक्रिया या एक बिंदु स्रोत या बिंदु वस्तु के लिए एक इमेजिंग प्रणाली की प्रतिक्रिया है ।
  3. लगभग 10 दौर फ्लोरोसेंट microspheres के साथ देखने के एक क्षेत्र का चयन करें । छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर के लिए गाइड के रूप में दोनों ५६१ एनएम और ४८८ एनएम उत्तेजन तरंग लंबाई के लिए एक कसा फोकस समायोजन लागू होते हैं ।
  4. संचरण प्रकाश के साथ बीजाणुओं को ध्यान केंद्रित करने और प्रत्येक छवि के लिए २०० ms एक्सपोजर्स के साथ 16 × औसत मोड में एक संचरण प्रकाश छवि पर कब्जा ।
  5. कैप्चर 3D-सिम के कच्चे फ्लोरोसेंट छवियां प्रकाश मोड के साथ बीजाणु "3D-SIM", कैमरा सेटिंग्स को readout मोड इलेक्ट्रॉन गुणा करने के लिए (EM) लाभ 10MHz पर 14-बिट, और EM लाभ १७५ पर । 20% लेजर शक्ति पर ५६१ एनएम लेजर प्रकाश के साथ PS4150 बीजाणुओं में FM4-64 जांच को उत्तेजित करना, और ४०० ms के एक प्रदीप्ति समय ।
  6. Gerkb-mcherry और gerkb-gfp के साथ KGB80 बीजाणु में, क्रमशः, ५६१ एनएम लेजर प्रकाश 1 एस के लिए 30% लेजर पावर पर, और ४८८ एनएम लेजर प्रकाश 3 एस. जेड स्टैक सेटिंग्स के लिए ६०% लेजर पावर पर नीचे मोड, ०.२ μm/चरण, 7 कदम और अंकुरों के लिए 20 कदम के लिए ऊपर में है और IM विश्लेषण, क्रमशः ।
    नोट: इन लेजर मापदंडों के लिए लगभग ४,००० के हिस्टोग्राम खिड़की के एक अधिकतम चमक मूल्य आश्वस्त करने के लिए आवेदन किया गया ।

6. पुनर्निर्माण 3D-FM4 के सिम रॉ छवियां-64 दाग PS4150 Spores

  1. FM4-64 सना हुआ PS4150 spores ' रॉ डेटा के लिए एन-सिम स्लाइस पुनर्निर्माण प्रदर्शन । N-sim स्लाइस पुनर्निर्माण विंडो खोलने के लिए N-SIM पैड टैब पत्रक पर स्लाइस फिर से बनाने के लिए परम बटन क्लिक करें ।
  2. N-SIM स्लाइस पुनर्निर्माण विंडो में पुनर्निर्माण पैरामीटर्स सेट करें । सही खंगाला छवियों को प्राप्त करने के लिए, एन-सिम निर्देश के सुझाव का पालन करें और एन-सिम स्लाइस पुनर्निर्माण विंडो में उचित नियंत्रण पर क्लिक करें ऑटो, उच्च करने के लिए प्रदीप्ति मॉडुलन कंट्रास्ट (आईएमसी) सेट करने के लिए संकल्प शोर दमन (HRNS) करने के लिए १.०० और बाहर का ध्यान कलंक दमन (ofbs) ०.०५ के रूप में शुरू अंक के रूप में ।
  3. छवि को फिर से बनाने के लिए N-SIM स्लाइस पुनर्निर्माण विंडो में फिर से बनाएं स्लाइस बटन क्लिक करें । तेजी से रूपान्तर रूपान्तरित (FFT) छवियों और पुनर्निर्माण स्कोर है, जो12पुनर्निर्माण के बाद प्रदर्शन द्वारा खंगाला छवियों की गुणवत्ता का मूल्यांकन करें ।
  4. सबसे अच्छा पैरामीटर सेटिंग्स प्राप्त कर रहे हैं जब तक Hrns ०.१० से ५.०० और ofbs ०.०१ से ०.५० करने के लिए एन सिम स्लाइस पुनर्निर्माण विंडो में उपयुक्त नियंत्रण पर क्लिक करके समायोजित करें ।
  5. परिवर्तित पैरामीटर्स लागू करने के लिए N-SIM स्लाइस रीसक्शन विंडो में लागू करें बटन पर क्लिक करे. विंडो बंद करने के लिए ' बंद करें ' बटन दबाएं ।
  6. बनाओ एक FM4-64 दाग PS4150 बीजाणु रॉ छवि सक्रिय और क्लिक करें N-सिम पैड टैब शीट पर स्लाइस पुनर्निर्माणबटन को निष्पादित करने के लिए । पुनर्निर्मित छवि सहेजें ।

7. छवि विश्लेषण

  1. KGB80 अंकुरोम के छद्म Widefield छवियों कंवर्ट
    1. कंवर्ट 3 डी-सिम KGB80 के कच्चे छवियों छद्म Widefield छवियों में एक बाईं क्लिक के साथ सक्रिय करके ImageJ प्लगइन Simcheck उपयोगिता रॉ डाटा एसआई को छद्म widefield12। छद्म Widefield कच्चे सिम डेटा और assembles से छवियों औसत, तुलना के लिए, एक पारंपरिक widefield रोशनी12के बराबर की छवि । फॉर इमेजेज ही https://imagej.net/Welcome see. अनियमित रूप से एक व्युत्क्रम संचरण छवि में फ्लोरोसेंट छद्म Widefield छवियों में बाद में अंकुरित हो विश्लेषण के लिए ~ 25 बीजाणु का चयन करें ।
    2. में कुल लगभग ३५० का चयन करें (इस उदाहरण में, ३४६) KGB80 दो स्लाइड् स से दृश्य के 14 फ़ील्ड्स में बीजाणु । चयनित KGB80 बीजाणु में गर्ड-जीएफपी और Gerd-mCherry फ्लोरोसेंट फोकी संख्याओं को दो शोधकर्ताओं द्वारा स्वतंत्र रूप से गिना जाना चाहिए । शोधकर्ता 3 डी-सिम कच्चे छवियों को वापस संदर्भित कर सकते है जब भी बीजाणु में अलग फ्लोरोसेंट अंकुशक घावों की उपस्थिति के संदेह में ।
    3. प्रत्येक गर्ड-GFP और Gerd-mCherry ध्यान और ImageJ के साथ प्रत्येक KGB80 spore के 3 डी छवि की एकीकृत तीव्रता की अधिकतम गहनता का आकलन करें ।
  2. KGB80 अंकुरोम के छद्म Widefield छवियों का विश्लेषण
    1. KGB80 बीजाणु की एकीकृत सिग्नल तीव्रता के रूप में 7 स्टैक्स का माध्य एकीकृत तीव्रता मान का उपयोग करें । इमेजिंग द्वारा पृष्ठभूमि तीव्रता निर्धारित पृष्ठभूमि तनाव समान सेटिंग्स का उपयोग PS4150 । जब वे स्पष्ट रूप से पृष्ठभूमि से अलग हो रहे हैं तो अंकुरोशी घावों के रूप में व्यक्तिगत KGB80 बीजाणु में फ्लोरोसेंट धब्बे का संबंध है ।
    2. एक-तरफ़ा ANOVA-परीक्षण सॉफ़्टवेयर मूल ९.० के साथ महत्व निर्धारण के लिए लागू होते हैं । P मानों को ध्यान में रखते हुए 0.05 < सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण है । Gerd-gfp और gerd-mcherry फोकी संख्या और एकीकृत सिग्नल तीव्रता के माप के सहसंबंध का मूल्यांकन करने के लिए स्पीयरमैन के रैंक सहसंबंध गुणांक18 का उपयोग करें ।

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Representative Results

वर्तमान प्रोटोकॉल बैक्टीरियल बीजाणु के लिए एक सिम माइक्रोस्कोप इमेजिंग प्रक्रिया प्रस्तुत करता है । चित्र 1 में प्रतिबिंबन से पहले दर्शाए अनुसार स्पोलेशन और स्लाइड तैयारी प्रक्रियाएं की गई थीं । बाद में, इमेजिंग और विश्लेषण प्रक्रियाओं दोनों मंद के लिए लागू किया गया (फ्लोरोसेंट प्रोटीन लेबल अंकुरण प्रोटीन) और उज्ज्वल (लिपोफिलिक जांच दाग IM) बीजाणु नमूने के रूप में निंनलिखित पाठ में दिखाया गया है ।

B. सबटिल्स बीजाणु में अंकुरोसोमों का स्थानीयकरण

GerD और Gerd के स्तर के लिए ~ ३,५०० और ~ बीजाणु प्रति क्रमशः ७०० अणुओं, एक अमीर spore मध्यम19में तैयार बीजाणु से निष्कर्षों का पश्चिमी दाग विश्लेषण के आधार पर सूचित कर रहे हैं । दोनों Gerd-gfp और GERD- KGB80 तनाव में mcherry जीन उनके मूल promotor के नियंत्रण में हैं । फ्यूजन प्रोटीन के सापेक्ष कम बहुतायत इमेजिंग के दौरान एक कम फ्लोरोसेंट संकेत करने के लिए नेतृत्व किया, तो यह सिम पुनर्निर्माण एल्गोरिथ्म द्वारा ऐसे मंद कच्चे सिम छवियों फिर से संगठित करना मुश्किल था । हालांकि, सिम माइक्रोस्कोप अभी भी अंकुरित छवि अधिग्रहण के लिए लागू किया गया था, हालांकि कच्चे सिम छवियां छद्म में बदल रहे थे-SIMcheck (ImageJ प्लगइन) द्वारा Widefield छवियां । इसके अलावा, एक सात ढेर 3 डी इमेजिंग इस IM फोकस का एक बेहतर सिंहावलोकन पाने के लिए लागू किया गया था । जैसा कि चित्रा 2के बाएं हाथ के पैनल में दर्शाया गया है, गर्ड-जीएफपी के दो फोकी विभिन्न स्टैक में दिखाई दिए । , कुल में, तीन GerD-GFP फोकी compositive कॉलम के Z3 स्टैक में सफेद तीर द्वारा संकेत कर रहे हैं । चित्रा 2 के दाहिने हाथ पैनल केवल एक gerd के साथ एक बीजाणु से पता चलता है बीजाणु में फोकल प्वाइंट के रूप में संयुक्त कॉलम Z4 स्टैक में सफेद तीर से सबूत । कुल मिलाकर, लगभग ४०% और ५०% बीजाणु में दो या एक गर्ड-GFP और Gerd-mCherry क्लस्टर, क्रमशः (तालिका 1) था । ३४६ बीजाणु की जांच के अलावा, दो 4 गर्ड-gfp foci था, और एक बीजाणु भी 5 gerd-gfp फोकी था । ज़ाहिर है, हमारे हाथों में, एक ही बीजाणु में GerD-GFP और Gerd-mCherry फोकी की संख्या हमेशा एक ही18नहीं थे । के रूप में सिम माइक्रोस्कोप कोई चरण विपरीत विकल्प था, हम बीजाणु स्थानीयकरण के लिए संचरण प्रकाश माइक्रोस्कोपी का इस्तेमाल किया । इस प्रकार, बीजाणु एक चमकीले प्रभामंडल से घिरे हुए गहरे और घने कोर के साथ प्रकट होते हैं ।

KGB80 बीजाणु की एकीकृत प्रतिदीप्ति तीव्रता imagej द्वारा मापा गया था. Spores, जो 0, 4, या 5 फोकी था उनके कम आवृत्ति के कारण हमारे सांख्यिकीय विश्लेषण में शामिल नहीं थे । GerD-GFP और Gerd-mCherry एकीकृत तीव्रता के बीच एक उच्च सकारात्मक सहसंबंध था (स्पीरमैन रैंक सहसंबंध गुणांक = ०.७३) । जबकि GerD-GFP पाड़ प्रोटीन की एकीकृत तीव्रता अलग आबादी (चित्रा 3 सी) के बीच अलग था, gerd की एकीकृत तीव्रता-mcherry अलग आबादी में एक ही के बारे में था (चित्रा 3 डी) । Gerd-gfp और gerd-mcherry की अधिकतम प्रतिदीप्ति तीव्रता कम करने के लिए खड़ा है, जब बीजाणु एकाधिक फोकी था (चित्रा 3 ए, बी) । सभी चमकीले धब्बों की अधिकतम प्रतिदीप्ति, जो अंकुरोतर फोकी के रूप में माना जाता है, PS4150 बीजाणु के अधिकतम ऑटो प्रतिदीप्ति से अधिक थी (पृष्ठभूमी विकृति KGB80 से बीजाणु; चित्रा 3A , ख).

भीतरी झिल्ली का संगठन

के रूप में परिचय में उल्लेख किया है, अंकुरित प्रोटीन बीजाणु IM में स्थित हैं । हालांकि, कुछ विवरण इस मुख्यतः स्थिर झिल्ली के जैव भौतिक गुणों के बारे में जाना जाता है । इस तरह के IM के स्थानीय संगठन के रूप में अधिक जानकारी की खोज, IM प्रोटीन के संगठन की समझ को बढ़ावा देने, विशेष GRs और चैनल प्रोटीन में होगा । B. सबटिलिस बीजाणु एक संरचना है जिसमें कई संकेंद्रित परतें होती हैं, और एक लिपोफिलिक जांच आसानी से इन कई परतों से गुजरेगी जो बीजाणु कोर के आसपास के आईएम को दाग नहीं दे सकती है । इस तरह की जांच के पारित होने की संभावना सबसे अधिक प्रोटीन युक्त कोट परतों और शायद यह भी बाहरी झिल्ली20,21से बाधा है । इस समस्या से उबरने के लिए लिपोफिलिक झिल्ली डाई FM4-६४ को स्पो्यूलेशन के दौरान एक PS4150 संस्कृति से जोड़ा गया. ऐसा करके, PS4150 वनस्पति कोशिका झिल्ली FM4-64 से दाग था, और इस प्रकार असममित स्पो्यूलेशन कोशिका विभाजन पर इस संस्कृति से प्राप्त forespores में झिल्ली और बाद में forespores घिरा हुआ है अच्छी तरह से दाग5। नतीजतन, परिपक्व बीजाणु की झिल्ली visualized जा सकता है । पिछले एक अध्ययन से संकेत मिलता है कि ज्यादातर नहीं तो FM4-64 के सभी IM में साफ बीजाणु5में है । एक लगभग 2 ऊष्मायन और बीजाणु शोधन उपचार के सप्ताह की अवधि के दौरान, धोने की प्रक्रिया लागू बाहरी झिल्ली से किसी भी FM4-64 हटाने, बाद प्रभावी ढंग से decoating उपचार और व्यापक धोने कदम निंनलिखित हटाया जा रहा है 5. हालांकि, decoating प्रक्रिया IM से कोई FM4-64 निकालता है, और न ही अंकुरोम फोकी5,6पर कोई प्रभाव पड़ता है । क्या हमें उत्तेजित है कि उज्ज्वल FM4-64 अंकुरित धब्बे के समान दोनों बरकरार (चित्र 4, बी) और विलेपित बीजाणु (चित्रा4c, डी) PS4150 बीजाणु में दिखाई दिया । इन उज्ज्वल FM4-64 स्पॉट IM में अंकुरित प्रोटीन के क्लस्टरिंग में शामिल किया जा सकता है ।

Figure 1
चित्रा 1: sporulation और स्लाइड तैयारी का अवलोकन. इमेजिंग से पहले आवश्यक आरंभिक चरणों को दर्शाने वाला ओवरव्यू. प्रोटोकॉल में विस्तृत जानकारी दी गई है । () परिभाषित न्यूनतम एमओपी माध्यम में स्पोरिलेशन प्रक्रिया की योजनाबद्ध रूपरेखा । अ B. सबटिलिस PS4150 (PS832 Δगेयर::spc Δकोटे::tet) या KGB80 (PS4150 gerka gerka gerka-mcherry बिल्ली गर्ड-gere kan) एकल कॉलोनी पौंड रिच मीडियम के 5 मिलीलीटर में सभ्य था, और mcherry के 5 मिलीलीटर और 20 मिलीलीटर में अनुकूलित मध्यम बारी में, और अंत में MOPS माध्यम के २५० मिलीलीटर में sporulated । एक प्रारंभिक घातांक चरण संस्कृति (आयुध डिपो६००, 0.3-0.4) सभी मध्यवर्ती संस्कृतियों में प्रयोग किया जाता है । FM4-64 (2 μg/mL) चोटी आयुध डिपो६०० मूल्य तक पहुंचने के बाद बीजाणु झिल्ली धुंधला 1 या 2 एच के लिए PS4150 sporulation माध्यम में जोड़ा गया था । () घनत्व प्रवणता अपकेंद्रण द्वारा माप्स स्पोरिलेशन कल्चर और शुद्ध बीजाणु से बीजाणु संचयन की विधि । () जीन फ्रेम चैम्बर में 1% आगरोस पैड पर बीजाणु स्थिर करने की प्रक्रिया । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: प्रतिनिधि छद्म Widefield (PWF) 3 डी छवियों GerD-gfp और Gerd-mcherry फोकी दो KGB80 (PS4150 Gerd Gerd Gerd-mcherry बिल्ली गर्ड-gfp kan) में निष्क्रिय बीजाणु ' 3 डी-सिम रॉ छवियां दोहरी चैनल उत्तेजना (561nm, 30% लेजर शक्ति के साथ लिया गया था, 1 एस, और 488nm, ६०% लेजर पावर, 3 एस) ऊपर से नीचे Z-स्टैक करने के लिए 7 चरणों का उपयोग कर । बाद में, रॉ सिम छवियों को छद्म में परिवर्तित किया गया-Widefield 3 डी छवियों ImageJ प्लगइन सिमचेक द्वारा । बाएं से दाएं, 3d छवियां (Z2-Z5) gerd-gfp (हरा), gerd-mcherry (लाल) और दो KGB80 बीजाणु (i और ii) की संगत मिश्रित छवियां कक्ष में दिखाए जाते हैं । दो बीजाणु (i और ii) के संचरण (ट्रांस) प्रकाश छवियों में बीजाणु के स्थान का संकेत मिलता है जो एक उज्जवल प्रभामंडल से घिरे हुए गहरे घने बिंब के रूप में प्रकट होता है । स्केल बार = 1 μm और सभी पैनलों एक ही आवर्धन पर हैं । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: KGB80 में गर्ड-जीएफपी की अधिकतम प्रतिदीप्ति तीव्रता (PS4150 गेरका गेरासी गेरीक्-मचेरी कैट गर्ड-जीएफपी क्ण) सुप्त बीजाणु, तथा PS4150 बीजाणु की अधिकतम स्वत प्रतिदीप्ति तीव्रता स्वेच्छाचारी इकाईयों में होती है । सभी बीजाणु सेटिंग्स द्वारा प्रकाशित किया गया प्रोटोकॉल संकेत दिया । पैनलों () और () गर्ड-जीएफपी और गेरेक् स-मचेरी फोकी की अधिकतम प्रतिदीप्ति तीव्रता को क्रमश: KGB80 सुप्त बीजाणु के साथ-साथ दोनों ही मामलों में माता-पिता PS4150 बीजाणु की अधिकतम स्वत: प्रतिदीप्ति तीव्रता को दर्शाते हैं । पैनलों () और () गर्ड-जीएफपी फोकी की एकीकृत प्रतिदीप्ति तीव्रता और Gerd-मचेरी फोकी की एकीकृत प्रतिदीप्ति तीव्रता को क्रमश: बी-सबटिल्स KGB80 सुप्त बीजाणु में दिखाते हैं । हम एक तरह से ANOVA-अधिकतम फोकल प्वाइंट तीव्रता में मतभेदों के निर्धारण के लिए परीक्षणों और सॉफ्टवेयर मूल ९.० के साथ एकीकृत बीजाणु प्रतिदीप्ति तीव्रताओं P मूल्यों को ध्यान में रखते हुए < 0.05 के रूप में महत्वपूर्ण इस्तेमाल किया । 4 या 5 फोकी के साथ बीजाणु उनके कम बहुतायत की वजह से विश्लेषण से बाहर रखा गया । डेटा को नोकदार boxप्लॉट्स में दर्शाया जाता है । भूखंडों में नॉचेस मध्यिका मानों के आस-पास होते हैं जो उनकी चौड़ाई के समानुपाती होते हैं । दिखाया मूंछ १.५ IQR की एक अधिकतम प्रतिनिधित्व करते हैं । तारक माध्य मानों का एक महत्वपूर्ण अंतर दर्शाते हैं । GerD-GFP और Gerd-mCherry एकीकृत प्रतिदीप्ति तीव्रता एक मजबूत सकारात्मक सहसंबंध है (स्पीयरमैन सहसंबंध गुणांक = ०.७३)18कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: प्रतिनिधि छद्म widefield (pwf) छवियां (ए और सी) और खंगाला सिम छवियां (बी और डी) के FM4-64 दाग IM के बी सबटिलिस PS4150 (PS832 δgere:: spc, δcote:: tet) spores । एफएम-४६४ को स्पो्यूलेशन के दौरान बीजाणु में शामिल किया गया था । 3 डी-सिम बरकरार बीजाणुओं की कच्ची छवियां (a और B) और विलेपित बीजाणु (C और D) एक चैनल उत्तेजन (५६१ एनएम लेजर, 20% लेजर पावर, ४०० ms) के साथ ले जाया गया एक नीचे जेड स्टैक करने के लिए 25 कदम ऊपर का उपयोग कर । बाद में, रॉ सिम डेटा माइक्रोस्कोप इमेजिंग सॉफ्टवेयर द्वारा खंगाला गया था ( सामग्री की मेजदेखें) 3 डी में सिम छवियों, या Pwf में सिमचेक (imagej प्लगइन) द्वारा परिवर्तित । सियान तीरों को पॉइंट बी और डीमें आईएम में FM4-64 फोकी को इंगित करते हैं । स्केल बार = 1 μm और सभी पैनलों एक ही आवर्धन पर हैं । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

तनाव बीजाणु गिना Foci फॉकी प्रति बीजाणु (%)
0 1 2 3 4 5
KGB80 ३४६ गर्ड-जीएफपी 2 ४६ ४० 11 1 0
GerKB-mCherry 2 ५३ ४० 5 0 0

तालिका 1: KGB80 बीजाणु में फोकी की उपस्थिति । दोहरे लेबल वाली बी. सबटिल्स KGB80 की जनसंख्या में बीजाणु के प्रति अंकुरोँ फोकी संख्या (PS4150 गेरका gerka gerka-mcherry कैट गर्ड-gfp kan) सुप्त बीजाणु । बीजाणु में प्रतिदीप्ति को अंकुरोकुछ फोकी के रूप में गिना जाता है जब एक फोकस अधिकतम तीव्रता ऑटो प्रतिदीप्ति तीव्रता से अधिक थी, जो अधिकतम तीव्रता PS4150 (PS832 Δगेयर::Spc δकोटे::tet) सुप्त बीजाणु KGB80 बीजाणु के समान प्रदीप्ति विन्यास द्वारा उत्तेजित होते हैं ।

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Discussion

प्रस्तुत प्रोटोकॉल में एक मानक 3D-SIM प्रक्रिया है जिसमें FM4-64 सना बी सबटिल्स बीजाणु होते हैं, जिनमें स्पो्यूलेशन, स्लाइड तैयारी और इमेजिंग प्रक्रियाएं शामिल हैं । इसके अलावा, प्रोटोकॉल एक संशोधित सिमचेक (ImageJ)-बी के सिम माइक्रोस्कोपी के लिए असिस्टेड 3 डी इमेजिंग प्रक्रिया की मदद करता है बीजाणु फ्लोरोसेंट पत्रकारों के साथ लेबल अंकुरित उत्तरार्द्ध प्रक्रिया ने हमें इस मंद उपसंरचना को एंहांस्ड कंट्रास्ट के साथ देखने की अनुमति दी । दो इमेजिंग प्रक्रियाओं के युग्मन से, एक ही सिम माइक्रोस्कोप के साथ एक ही बीजाणु में असतत उप संरचनाओं कल्पना करना संभव है, इस प्रकार अंकुरण प्रक्रिया की एक यंत्रवत समझ के लिए हमारे आधार में सुधार । ध्यान दें कि प्रक्रिया ~ १०० एनएम और ~ 200-250 एनएम के एक अक्षीय संकल्प के एक पार्श्व संकल्प पर चल रही है । इस अंतर हस्तक्षेप कंट्रास्ट (डीआईसी) व्यापक क्षेत्र माइक्रोस्कोपी दृष्टिकोण ग्रिफ़िथ7द्वारा प्रयोग से बेहतर है । समय का समाधान अंकुरण के आरंभ होने पर जनन रूप का विश्लेषण एक वांछित अगला कदम होगा । दुर्भाग्य से, हालांकि सिम माइक्रोस्कोपी सिद्धांत में रहते इमेजिंग के साथ संगत है, अंकुरोम संकेतों की मंद प्रकृति के कारण ऐसे समय का समाधान सिम, विश्लेषण के कारण छवि अधिग्रहण के दौरान नमूनों की तेजी से विरंजन संभव नहीं हैं । विश्लेषण के लिए पर्याप्त बीजाणु प्राप्त करने के लिए, यह सुनिश्चित करें कि बीजाणु कुशलतापूर्वक हो रही है करने के लिए महत्वपूर्ण है । इसलिए शोधकर्ताओं को लक्ष्य के रूप में ९०% कुशलता के साथ स्पॉ्यूलेशन कुशलता की जांच करनी चाहिए । प्रतिनिधि परिणामों में, निष्क्रिय बीजाणु में क्रमशः ~ ५०% और ४०% सभी बीजाणु एक या दो गर्ड-जीएफपी और Gerd-mCherry फोकी (तालिका 1) होते हैं । दो फोकी के साथ बीजाणु का प्रतिशत पहले7ग्रिफिथ्स द्वारा सूचित किया गया है कि तुलना में बहुत अधिक है । वहां कई कारण है कि वर्तमान काम में अलग परिणाम समझा सकता है । सबसे पहले, 3 डी इमेजिंग प्रक्रिया अधिक फोकी का पता लगाने की सुविधा हो सकती है । एक ही बीजाणु में विभिंन फोकी ऊर्ध्वाधर दिशा में विभिंन स्थानों में स्थित है के रूप में चित्रा 1में दिखाया गया है । दूसरा, सीसीडी कैमरा (सामग्री की मेज) और लेजर सिम माइक्रोस्कोप से सुसज्जित एकता इमेजिंग परिणामों के लिए काफी योगदान देते हैं । तीसरे, ग्रिफिथ के दृष्टिकोण के समान7 बेहतर छवि विश्लेषण के लिए लगातार छवियों के औसत दर्जनों, अंकुरण के छद्म widefield छवि भी कच्चे सिम छवियों से एक औसत छवि थी (5 चरणों और 3 झुकाव छवियां) । अंत में, sporulation मध्यम और sporulation शर्तों, बीजाणु संपत्तियों के निर्धारण में एक महत्वपूर्ण चर, कि पहले इस्तेमाल से हमारे काम में अलग हैं । ग्रिफिथ्स एट अल.7 रिच 2X Schaeffer का इस्तेमाल किया-ग्लूकोज (2X एसजी) sporulation के लिए मध्यम, जबकि एक परिभाषित ंयूनतम mops buffered मध्यम यहां कार्यरत था । कई पत्रों का प्रदर्शन किया है कि sporulation मध्यम और शर्तों प्रोटीन संरचना, प्रतिरोध, और बी के अंकुरण पर महत्वपूर्ण प्रभाव है सबटिल्स बीजाणु22,23,24 , 25. वास्तव में, यह दिखाया गया है कि जीआर उपइकाइयों का स्तर अमीर-मध्यम पर प्राप्त लोगों बनाम गरीब माध्यम पर प्राप्त बीजाणु में 3 से 8 गुना कम है । गर्ड का स्तर भी ३.५ के आसपास थे-गरीब मध्यम बीजाणु में कम गुना, और इन बीजाणु बीजाणु अंकुरण26शुरू करने में अधिक समय लगा । हालांकि, यह स्पष्ट नहीं है कि बीजाणुजन की स्थिति भी मनाया अंकुरोत्सर्ग फोकी की संख्या को प्रभावित करती है ।

Ramirez-पेरलता एट अल.' s परिणाम26 संकेत दिया है कि जनसंख्या के स्तर पर बीजाणु के पोषक तत्वों अंकुरण की दर काफी अंकुरण प्रोटीन और गर्ड के स्तर से प्रभावित कर रहे हैं । यदि फ्लोरोसेंट पत्रकारों से बीजाणु प्रति एकीकृत फ्लोरोसेंट तीव्रता gerd और gerd संलयन प्रोटीन के स्तर के लिए सीधे आनुपातिक हैं, दोनों संलयन प्रोटीन के स्तर KGB80 बीजाणु, जो पिछले काम के साथ समझौते में है में व्यापक रूप से अलग 7. यह प्रोटीन स्तर विषमजनन बीजाणु अंकुरण एक बीजाणु स्तर पर मनाया विषमजनन से संबंधित हो सकता है, और अंकुरण फोकी संख्या एक और एक और बीजाणु अंकुरित विविधता के लिए योगदान कारक हो सकता है । इसके अलावा प्रयोग संभावित प्रभाव है कि अंकुरण फोकी संख्या और फोकी अंकुरण प्रोटीन संरचना के एक विश्लेषण पर ध्यान केंद्रित करेंगे (नहीं सभी अंकुरण अंकुरित प्रोटीन संरचना में बराबर हो सकता है) अंकुरित विषमजनन पर हो सकता है । डेटा सहित वर्तमान अनुसंधान प्रश्नों के एक नंबर को जंम दिया: मैं) IM में grs के क्लस्टरिंग में गर्ड की भूमिका क्या है; और द्वितीय) कैसे दो अंय GRs, गेरा और GerB, बीजाणु IM में आयोजित कर रहे हैं?

प्रोटोकॉल मंद और उज्ज्वल बीजाणु के नमूनों के लिए प्रस्तुत किया यह संभव है एक ही बीजाणु में असतत उप संरचनाओं की कल्पना करने के लिए सिम माइक्रोस्कोपी द्वारा । उज्ज्वल FM4-64 स्पॉट कि बीजाणु में मनाया गया हो सकता है के कारण IM के व्यापक तह27। वैकल्पिक रूप से, हम परिकल्पना है कि इन क्षेत्रों im जहां डाई और अधिक आसानी से वृद्धि हुई स्थानीय im तरलता के कारण तक पहुंच प्राप्त कर सकते है के क्षेत्रों रहे हैं । वृद्धि की तरलता (rifs) के ऐसे क्षेत्रों cytoकंकाल ऐक्टिन होमोलॉग mreb द्वारा आयोजित किया जा सकता है, अच्छी तरह से तरल पदार्थ कम ऐक्टिन श्रृंखला रक्तदाब28,29की अपनी एकाग्रता के लिए जाना जाता है । ज़ाहिर है, इसी प्रक्रिया को लागू करने के लिए जंगली प्रकार बी सबटिलिस बीजाणु भी उज्ज्वल FM4 के एक समान पैटर्न की ओर जाता है-64 स्पॉट (हमारे अप्रकाशित टिप्पणियों) । B. सबटिलिस वनस्पति कोशिकाओं में, एक ढह झिल्ली mreb और rifs के क्लस्टरिंग में संभावित परिणाम29। निष्क्रिय बीजाणु की भीतरी झिल्ली की संभावना एक सापेक्ष कम झिल्ली संभावित20,21 है और mreb के detectable स्तर शामिल30 जो उच्च तरलता 29 के बड़े डोमेन में rifs के क्लस्टरिंग के लिए नेतृत्व कर सकते है . क्या ऐसे डोमेन अंकुरित ओसोम की उपस्थिति से मेल कर सकते हैं, इस समय जांच की जा रही है ।

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Disclosures

हितों का टकराव नहीं घोषित ।

Acknowledgments

लेखक सिम इमेजिंग के दौरान उनकी सहायता के लिए Christiaan Zeelenberg धंयवाद । JW एक पीएचडी फैलोशिप के लिए चीन छात्रवृत्ति परिषद और धंयवाद इमेजिंग के प्राथमिक स्तर के दौरान उसकी मदद के लिए Irene Stellingwerf स्वीकार करता है ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Air dried glass slides Menzel Gläser 630-2870
APO TIRF N20R8 100× oil objective (NA=1.49)
B. subtilis KGB80 (PS4150 gerKA gerKC gerKB-mCherry cat, gerD-gfp kan)
B. subtilis PS4150 (PS832 ΔgerE::spc, ΔcotE::tet)
Erlenmeyer flasks 1 L Sigma-Aldrich Z567868
Erlenmeyer flasks 250 mL Sigma-Aldrich Z723088
FluoSpheres carboxylate-modified microspheres Invitrogen, 0.1 μm F8803
FM4-64 Thermo Fisher Scientific F34653
Histodenz nonionic density gradient medium Sigma-Aldrich D2158
ImageJ
iXON3 DU-897 X-6515 CCD camera Andor Technology https://imagej.net/Welcome
LB Agar Sigma-Aldrich L2897
Microfuge tubes 1.5 mL Thermo Fisher Scientific 3451PK
Microscope imaging software Nikon, Japan NIS-Element AR 4.51.01
MilliQ Ultrapure Deminerilzed Water Millipore Milli-Q IQ 7003
Nikon Eclipse Ti microscope
Polypropylene Screw Cap Bottle 180 mL Thermo Fisher Scientific 75003800
Precision Coverslips Paul Marienfeld 117650
Round Bottom tubes 15 mL Thermo Fisher Scientific Nunc TM
Screw cap tubes 50 mL Thermo Fisher Scientific Nunc TM

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References

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