झिल्ली-फ़िल्टर्ड फेज-शिफ्ट Decafluorobutane Nanodroplets का उत्पादन Preformed Microbubbles से

यह प्रोटोकॉल बायोमेडिकल अनुप्रयोगों में उपयोग के लिए कम क्वथनांक वाष्पीकरण योग्य बूंदों की पॉलीडिस्पर्सिटी को कम करने का एक आसान तरीका है। यह तकनीक पूर्वनिर्मित गैस माइक्रोबबल्स को संघनित करती है और परिणामी तरल बूंदों को आकार से इस तरह से फ़िल्टर करती है जो नियंत्रणीय, स्केलेबल और अपेक्षाकृत लागत प्रभावी है। इस विधि को अंतिम बूंद आकार को नियंत्रित करने के लिए विभिन्न फिल्टर का उपयोग करके विभिन्न शेल और गैस सामग्री के साथ विभिन्न प्रकार के लिपिड माइक्रोबबल्स पर लागू किया जा सकता है।

प्रक्रिया का प्रदर्शन Darrah Merillat, डॉ सिरसी की प्रयोगशाला से एक स्नातक शोधकर्ता होगा. sonicator के लिए पावर स्विच चालू करें, और आयाम को माइक्रोटिप अनुलग्नक का उपयोग करके अधिकतम अनुमति दी गई पर सेट करें, और 10 सेकंड के लिए सेट sonication समय सुनिश्चित करें। सतह के ठीक नीचे माइक्रोटिप के साथ ध्वनि बाड़े में गर्म हाइड्रेटेड लिपिड समाधान रखें।

बाड़े में आयोजित गर्म लिपिड समाधान में DFB टैंक आउटलेट से गैस का मार्गदर्शन करने के लिए शीशी की गर्दन पर टयूबिंग की एक उपयुक्त लंबाई संलग्न करें। टैंक वाल्व को धीरे-धीरे तब तक खोलें जब तक कि गैस को लिपिड समाधान पर बहते हुए नहीं देखा जा सकता है, जिससे तरल की सतह पर मामूली लहरें पैदा होती हैं। यदि गैस का प्रवाह बहुत अधिक है, तो माइक्रोबबल गठन के दौरान समाधान ओवरफ्लो हो जाएगा।

sonicator प्रारंभ करें, और माइक्रोबबल्स उत्पन्न करने के लिए इसे लगातार 10 सेकंड के लिए चलाएं। sonication खत्म होने के बाद, तुरंत DFB टैंक वाल्व बंद करें। जल्दी से माइक्रोबबल समाधान कैप, और 55 डिग्री सेल्सियस से नीचे नमूने को ठंडा करने के लिए एक बर्फ स्नान में शीशी जलमग्न।

उपयोगकर्ता के मैनुअल के अनुसार उच्च दबाव वाले एक्सट्रूडर को इकट्ठा करने के लिए 200-नैनोमीटर सिरेमिक फ़िल्टर का उपयोग करें, और इसे वाटरटाइट कंटेनर के केंद्र में रखें, ताकि नमूना आउटलेट ट्यूब को साइड के खिलाफ दबाया न जाए, या क्रिम्प किया गया हो। निर्माता द्वारा आपूर्ति किए गए एडाप्टर का उपयोग करके नाइट्रोजन गैस टैंक के लिए एक्सट्रूडर को जोड़ा जाए। आउटलेट ट्यूब के अंत को एक सिंटिलेशन शीशी में रखें ताकि एक्सट्रूडेड नमूना एकत्र किया जा सके, ट्यूब को शीशी के भीतर रहने के लिए टेप के साथ कंटेनर में सुरक्षित किया जा सके।

यह सुनिश्चित करने के लिए कि एक्सट्रूडर के भीतर कोई दबाव नहीं है, रिलीज वाल्व को खोलें और बंद करें। कक्ष ढक्कन निकालें। और extruder कक्ष के लिए PBS के पांच milliliters जोड़ें.

ढक्कन को बदलें, सुनिश्चित करें कि यह सुरक्षित रूप से वापस जगह में क्लिक करता है। नाइट्रोजन गैस टैंक खोलें, ताकि दबाव गेज 250 पीएसआई पढ़ता है, जिससे यह सुनिश्चित हो सके कि दबाव नियंत्रण वाल्व बंद स्थिति में है। गैस टैंक को बंद करें, और एक्सट्रूडर चैंबर इनलेट वाल्व को खोलें, जिससे पीबीएस समाधान को सिस्टम के माध्यम से धक्का दिया जा सकता है, और नमूना आउटलेट ट्यूब को सिंटिलेशन शीशी में बाहर निकाल दिया जाता है।

जब केवल गैस टयूबिंग से बाहर निकल रही है, तो रिलीज वाल्व खोलें, और दबाव को शून्य पीएसआई तक गिरने की अनुमति दें। फिर सिंटिलेशन शीशी को हटा दें। यह सुनिश्चित करने के लिए रिलीज वाल्व को खोलें और बंद करें कि एक्सट्रूडर के भीतर कोई दबाव नहीं है, और आउटलेट ट्यूब के अंत में एक नया सिंटिलेशन शीशी रखें।

2-मिथाइलब्यूटेन के साथ एक स्टील कंटेनर भरें, और तापमान को माइनस 18 डिग्री सेल्सियस तक लाने के लिए सूखी बर्फ जोड़ें। ठंडा 2-methylbutane में microbubble समाधान डालें, दो मिनट के लिए नमूने को डुबोदें। बुलबुले को धीरे से मिश्रण करने के लिए दो मिनट के दौरान सिंटिलेशन शीशी को स्थानांतरित करें।

तापमान को माइनस 15 और माइनस 18 डिग्री सेल्सियस के बीच बनाए रखने के लिए आवश्यकतानुसार सूखी बर्फ जोड़ें। दो मिनट के बाद, ठंडा 2-methylbutane से microbubbles को हटा दें। धीरे माइक्रोबबल्स मिश्रण करने के लिए शीशी को घुमाएं, और बुलबुले को एक ठंडी 10-मिलीलीटर सिरिंज में स्थानांतरित करें।

Extruder कक्ष ढक्कन निकालें, और धीरे-धीरे सिरिंज पर प्लंजर धक्का देकर कक्ष के लिए microbubble समाधान जोड़ें। Extruder कैप को बदलें, सुनिश्चित करें कि यह जगह में सुरक्षित रूप से क्लिक करता है। सत्यापित करें कि दबाव नियंत्रण वाल्व और extruder के रिलीज वाल्व बंद स्थिति में हैं।

नाइट्रोजन गैस टैंक को तब तक खोलें जब तक कि दबाव गेज 250 पीएसआई न पढ़ता हो। गैस टैंक को बंद करें, और दबाव नियंत्रण वाल्व को खुली स्थिति में बदल दें। जब समाधान ने निकास टयूबिंग पर सिंटिलेशन शीशी को भर दिया है और केवल गैस ट्यूब से बाहर निकल रही है, तो धीरे-धीरे दबाव रिलीज वाल्व खोलें, और दबाव को शून्य पीएसआई तक गिरने की अनुमति दें।

एक 15-मिलीलीटर सेंट्रीफ्यूज ट्यूब के लिए extruded बूंद समाधान के 10 milliliters स्थानांतरण। 1 पर extruded नमूने centrifuge, 500 बार चार डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए जी. समाधान के शीर्ष पर दिखाई देने वाली supernatant और अनायास वाष्पित बूंदों को त्यागें।

20% ग्लिसरॉल और 20% प्रोपलीन ग्लाइकोल के साथ पीबीएस के 10 मिलीलीटर में डीएफपी नैनोड्रोप्लेट्स वाले छर्रे को फिर से निलंबित करें। बाहर निकालना के साथ और बिना संघनित बुलबुला समाधान के आकार वितरण से पता चलता है कि संघनित केवल नमूने में 400 नैनोमीटर के पास केंद्रित एक बहुत व्यापक वितरण है, जबकि एक्सट्रूडेड नमूने में 200 नैनोमीटर पर केंद्रित एक संकीर्ण वितरण है। चरण शिफ्ट बूंदों का विश्लेषण करने के लिए उपयोग किए जाने वाले ट्यूनेबल प्रतिरोध पल्स सेंसिंग विश्लेषण के रूप में उन्हें अतिरिक्त लिपोसोम को हटाने के लिए सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा धोया गया है, यह दर्शाता है कि बूंद आकार 200 नैनोमीटर के पास हैं।

गर्म होने पर नैनोड्रॉपलेट वाष्पीकरण के माइक्रोस्कोपी डेटा से पता चलता है कि कुछ अनायास वाष्पीकृत माइक्रोबबल्स हीटिंग से पहले दृश्य के क्षेत्र में स्पष्ट होते हैं, और हीटिंग के बाद गैस माइक्रोबबल्स की एक बड़ी संख्या देखी जाती है। नैनोड्रॉपलेट्स की माइक्रोस्कोपी छवियों को सीधे एक्सट्रूडर में बिना पूर्व-शीतलन के डाला जाता है, शून्य डिग्री सेल्सियस पर संघनित किया जाता है, और माइनस 18 डिग्री सेल्सियस पर यहां दिखाया गया है। वाष्पीकरण से पहले और बाद में संघनित ऑक्टाफ्लोरोप्रोपेन बूंदों की प्रतिनिधि छवियां भी डीएफबी बूंदों के समान हीटिंग के बाद गैस माइक्रोबबल्स की एक बड़ी संख्या दिखाती हैं।

इस प्रक्रिया के दौरान याद रखने वाली सबसे महत्वपूर्ण बात यह है कि बूंद की उपज संक्षेपण के दौरान तापमान और दबाव पर अत्यधिक निर्भर करती है, और मामूली बदलाव परिणामों को प्रभावित करेंगे। vaporizable बूंदों उत्पन्न करने के बाद, वे विवो इमेजिंग और अल्ट्रासाउंड का उपयोग कर दवा वितरण में अनुकूलित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, साथ ही साथ विवो और पूर्व vivo अनुप्रयोगों में अन्य. इस तकनीक को विकसित करने के बाद, विवो वाष्पीकरण थ्रेसहोल्ड में नैनोड्रॉपलेट आकार और गैस कोर सामग्री के प्रभावों को इस प्रोटोकॉल में मामूली संशोधनों का उपयोग करके पता लगाया गया है।