Induzierbaren, Zelle Typ-spezifischen Ausdruck in Arabidopsis Thaliana durch LhGR-vermittelten Trans-Aktivierung

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Summary

Hier beschreiben wir die Erzeugung und Anwendung einer Reihe von transgenen Arabidopsis Thaliana Linien förderliches induzierbaren, gewebespezifische Ausdruck in den drei wichtigsten Meristeme, schießen Sprossapikalmeristem Meristem, die Wurzel Sprossapikalmeristem Meristem und das Kambium.

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López-Salmerón, V., Schürholz, A. K., Li, Z., Schlamp, T., Wenzl, C., Lohmann, J. U., Greb, T., Wolf, S. Inducible, Cell Type-Specific Expression in Arabidopsis thaliana Through LhGR-Mediated Trans-Activation. J. Vis. Exp. (146), e59394, doi:10.3791/59394 (2019).

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Abstract

Induzierbaren, gewebespezifische Ausdruck ist ein wichtiges und mächtiges Werkzeug, die räumlich-zeitliche Dynamik der genetischen Störung zu studieren. Kombinieren die flexible und effiziente GreenGate System mit dem bewährten und Benchmarking LhGR System (hier als GR-LhG4) für den induzierbaren Ausdruck Klonen, haben wir eine Reihe von transgenen Arabidopsis Linien erzeugt, die die Expression von einem Effektor fahren können Kassette in einer Reihe von spezifischen Zelltypen in drei Stammwerk Meristeme. Zu diesem Zweck wählten wir das zuvor entwickelte GR-LhG4 System basierend auf eine Chimäre Transkriptionsfaktor und cognate pOp Art Förderer gewährleistet strenge Kontrolle über eine Vielzahl von Ausdruck Niveaus. Darüber hinaus wird die Ausdruck Domäne visualisieren denen synthetische Transkriptionsfaktors tätig ist, ein ER lokalisiert mTurquoise2 fluoreszierenden Reporter unter Kontrolle des Veranstalters pOp4 oder pOp6 Fahrer Linien kodiert. Hier beschreiben wir die erforderlichen Schritte zum Erzeugen einer Treiber oder Effektor Linie und zeigen, wie Zelle Art Konkretisierung kann induziert und schießen Sprossapikalmeristem Meristem, die Wurzel Sprossapikalmeristem Meristem und das Kambium von Arabidopsisfolgten. Mithilfe mehrerer oder aller Fahrer Linien, die Kontext spezifische Wirkung des Ausdrückens einer oder mehrere Faktoren (Effektoren) unter Kontrolle des synthetischen pOp Promotors beurteilt werden können schnell, zum Beispiel in F1 Pflanzen eine Kreuzung zwischen einem Effektor und multiple Fahrer-Linien. Dieser Ansatz ist durch die ektopische Expression von VND7, eine NAC Transkriptionsfaktor, der in der Lage, induzieren ektopische sekundäre Zelle Wand Ablagerung Zelle autonom veranschaulicht.

Introduction

Eine große Einschränkung in der Biologie in die genomische Zeitalter ist, die spezifische Rolle der Kontext eines bestimmten Faktor oder genetische Störung zu entschlüsseln. Konstitutive genetische Störungen wie z. B. Verlust der Funktion und Gain-of-Function Ansätze erlauben oft nur Endpunktanalyse der lebenslangen Anpassungsprozesse, die Unterscheidung zwischen primären und sekundären Effekten zu verschleiern. Darüber hinaus können Kontext spezifische Funktionen maskiert oder verdünnt durch groß angelegte Effekte in entfernte Gewebe oder in anderen Phasen der Entwicklung. Darüber hinaus kann im Extremfall Letalität mechanistische Einsicht entgegen. Ideal, um diese Probleme zu umgehen, könnte man die Wirkung von akuten genetische Störung in einem bestimmten Kontext wie z. B. einem bestimmten Zelltyp in gewissem Sinne zeitaufgelösten analysieren. Um dies zu erreichen, sind genetische Werkzeuge für induzierbaren, Zelle Typ-spezifischen Ausdruck erforderlich1. Um eine Ressource für die schnelle Bewertung der räumlich-zeitliche Dynamik einer Reaktion auf einen bestimmten Effektor zu bieten, haben wir kombiniert die Leichtigkeit des Klonens zur Verfügung gestellt von GreenGate System2 mit nachgewiesener Wirksamkeit der GR-LhG4 System3, 4,5,6. Wir haben eine Reihe von Zeilen, die mit dem Ausdruck der Chimären Transkriptionsfaktor, die LhG4 an den Liganden-bindende Domäne der Ratte Kortikoid-Rezeptor (GR)7 unter der Kontrolle der gut-gekennzeichneten Zelle Typ spezifischen Promotoren8fusioniert erzeugt. Im ruhenden Bedingungen, bleibt der Transkriptionsfaktor außerhalb der Kern der cytosolischen HSP90 die GR-Domäne gebunden ist. Mit dem Zusatz von synthetischen Liganden Dexamethason (Dex) nukleare Translokation wird induziert und LhG4 vermitteln Transkription Expressionskassetten unter Kontrolle eines Promotors cognate synthetische pOp-Typ , z. B. ein mTurquoise2-reporter enthalten in den Treiber-Linien, die Ausdruck-Domäne nach Induktion zu visualisieren.  Die Treiber-Zeilen enthalten somit technisch auch eine Effektor-Kassette. Die Kreuzung aus einer Reihe von Treiber-Linien mit einer Linie, die somit eine Effektor-Kassette mit, beispielsweise ein Gen des Interesses unter Kontrolle des gleichen pOp-Art -Promotors tragen ermöglicht die schnelle Beurteilung der die akuten oder langfristige Folgen der Effektor Ausdruck in einer Vielzahl von Zelltypen.

Hier bieten wir ein Protokoll beschreibt die Verfahren notwendig, um die Treiber und Effektor Linien zu erzeugen und zeigen, wie Zelle Art Konkretisierung kann induziert und folgte im schießen Sprossapikalmeristem Meristem, die Wurzel Sprossapikalmeristem Meristem und das Kambium der Arabidopsis. Um die Fähigkeiten und die Spezifität dieses Ansatzes zu veranschaulichen, nutzen wir die bekannten Transkriptionsfaktor VND7 die Xylem-wie sekundäre Zelle Wand Verdickungen ectopically fahren kann9. Behandlung von F1 aus einer Kreuzung zwischen der pSCR10,11 -Treiber und die pOp6:VND7 Effektor Linie führt zur Bildung von ektopische Xylem-wie Zellen in der Stärke-Hülle, die Stammzellen von Arabidopsis .

Um die Generation der großen DNA-Baugruppen erforderlich für den Bau von Fahrer und Effektor Ausdruck Plasmide zu erleichtern, haben wir die schnelle und effiziente GreenGate Klonen Methode2verwendet. GreenGate Klonen ist basierend auf Typ II S Restriktionsenzyme Eco31I oder seine Isoschizomer BsaI2. Diese Enzyme schneiden ihre asymmetrischen Anerkennung Aufstellungsorte produzieren Überhänge mit unterschiedlicher Basenzusammensetzung nachgeschaltet. Durch den Einbau von Eco31I /Bsaich Beschränkung in Oligonukleotide und Zuteilung von bestimmten Überhang Sequenzen auf DNA-Elemente, modulare Klonen erzielt wird, erleichtert die Erzeugung großer Baugruppen. Im Rahmen GreenGate fallen DNA-Module in Kategorien A-F basiert auf Überhang-Sequenz, die als Adapter dienen und sind in dieser Reihenfolge montiert. Die Primer konzipiert, um Ihr gewünschtes Produkt verstärken sollte daher gemäß dem gewählten Modul2 (Abbildung 1A). Wenn es eine interne Eco31I gibt /BsaI Seite und die Reihenfolge ist nicht kompatibel mit den GreenGate-Eintrag und Ziel-Modulen, können Sie fortfahren, ohne mutagenizing, aber mit geringerer Effizienz. Alternativ können Sie Site-verwiesene Mutagenese Eco31I entfernen /Bsaich Restriktionsschnittstellen kümmert sich nicht um Aminosäuren in Genprodukte zu ändern.

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Protocol

Vektoren und Module erhalten Sie aus dem Non-Profit-Repository, Addgene (https://www.addgene.org).

1. Klonen mit GreenGate

  1. Design-Primer mit den in Tabelle 1aufgeführten Überhängen, unten aufgeführten Modul typenspezifische Adapter Sequenzen "NNNN" ersetzen: nach vorne: 5´AACA GGTCTC A NNNN (n) CA* + bestimmten Reihenfolge 3´, rückgängig zu machen: 5´AACA GGTCTC A NNNN (n) mit RFS Ergänzung des spezifischen Sequenz 3´. Fügen Sie die unterstrichenen Basen, um das Leseraster zu gewährleisten.
    Modul-Überhänge:
    Hinweis: im Rahmen Standard-GreenGate sechs Module A-F, sind mit einem Werk Transformation Vektor Backbone in einem Ausdruck Plasmid (Abbildung 1) montiert. In der Regel Hafen A Modul Promotorsequenzen, B-Modul eine N-terminale Tag oder "dummy" Sequenz6, ein C-Modul eine CDS ein D-Modul eine C-terminale Tag oder Dummy, ein E-Modul einen Terminator und ein F-Modul eine Widerstand-Kassette für die Auswahl der transgenen Pflanzen. Adapter für die Kopplung mit anderen vormontierten Einheiten stehen statt der F-Modul2zur Verfügung.
  2. PCR-Amplifikation
    1. Verstärken Sie die Reihenfolge des Interesses mit der gestalteten Primer durch Polymerase-Kettenreaktion (PCR) nach standard-Protokolle.
    2. Trennen Sie das PCR-Produkt auf einem Agarosegel. Verbrauchsteuern und Spalte reinigen das richtige Fragment mit einem kommerziellen kit (siehe Tabelle der Materialien), gemäß den Anweisungen des Herstellers.
  3. Eintrag Modul erstellen
    1. Separat zu verdauen, der Modul-Vektor und der PCR-Fragment (Schritt 1.2.) (Abbildung 1 A, B) mit Eco31I/Bsaich mit 100-500 ng DNA (Vektor oder Fragment), 3 µL 10 x Verdauung Puffer und 5 – 10 U Eco31I in einem Rohr und bringen das Volumen 30 µL mit DdH2O.
    2. Mix vorsichtig von oben und unten pipettieren und Spin-down kurz bei 1.000 X g. Inkubation bei 37 ° C auf einem Heizblock für 15 min (oder im Anschluss an die Empfehlung des gekauften Restriktionsenzym).
    3. Nach der Verdauung, Spalte reinigen jede Probe mit ein kommerziellen kit (siehe Tabelle der Materialien) und quantifizieren die erhaltenen DNA durch die Bestimmung der optischen Dichte bei 260 nm (OD260) mit einem Spektralphotometer.
    4. Mix der 30 – 100 ng einfügen und der 10 – 50 ng verdaut Vektor von oben und unten mehrmals Pipettieren verdaut und inkubieren mit 1 µL T4-Ligase (5 U/µL und 3 µL 10 x T4 Ligatur Puffer in einem Gesamtvolumen von 30 µL bei Raumtemperatur für 1 h (nach der Empfehlung die T4-Ligase-Lieferanten) (siehe Tabelle der Materialien).
      Hinweis: Berechnen des gewünschten Molverhältnis Eintrag Modul: Reiseziel Vektors (z. B. 3:1) für die Ligatur je nach Konzentration und Länge der Eintrag Modul Einsätze.
    5. Um die Effizienz der Umwandlung Wärme inaktivieren die T4-Ligase durch die Reaktion bei 65 ° C für 20 min Inkubation.
    6. Verwendung der Ligatur Produkt, kompetente E. Coli zu verwandeln Zellen entsprechend der standard-Lab-Protokolle und die Ausbreitung der Bakterien auf Agarplatten mit Ampicillin (100 µg/mL) ergänzt
    7. Über Nacht wird inkubieren Sie die Platte mit Bakterien bei 37 ° C.
    8. Bildschirm für die Kolonien mit dem gewünschten Eintrag-Modul von Colony PCR unter Verwendung der Primer 86A1 (5′-GTTGTGTGGAATTGTGAGC-3 ') und 86A2 (5′-GTTTTCCCAGTCACGACG-3 ') und standard-PCR-Zustände.
      Hinweis: Diese Grundierung-Kombination ist gültig für alle Eingabe-Module wie die Primer an den Eintrag Vektor Rückgrat binden.
    9. Wählen Sie einzelne Kolonien für die Plasmid-Isolierung. Verwenden Sie 2 mL LB Flüssigkultur ergänzt mit Ampicillin (100 µg/mL) und Übernachtung im Shaker 37 ° C inkubieren.
    10. Isolieren Plasmide aus der Nacht Flüssigkultur mit einer Mini-Prep Kit oder die gewünschte Extraktion Protokoll (siehe Tabelle der Materialien).
    11. Um Plasmide mit dem richtigen Einsatz zu identifizieren, führen Sie Restriktionsenzym Analyse, z. B. durch die Auswahl zwei Enzyme, die schneiden einzigartig in Ihrem Einsatz durch Mischen von 200 ng von Plasmid, 2 µL 10 x Verdauung Puffer, 5-10 U der ausgewählten Restriktionsenzyme und DdH2 O, 20 µL.
    12. Reihenfolge der ausgewählten Plasmide unter Verwendung der Primer 86A1 und 86A2 (siehe Schritt 1.3.9.).
  4. Ziel-Modul-Erstellung:
    Hinweis: Verwenden Sie für das Ziel-Plasmid die gewünschte Ziel-Modul pGGZ001, pGGZ002 oder pGGZ0032 (Abbildung 1).
    1. In einem Rohr hinzufügen und Mischen von 50 – 150 ng leer Ziel Vektor (z. B. "pGGZ003"), 50-300 ng der einzelnen gefüllt Eintrag Modul, 2 µL 10 x Verdauung Puffer Puffer, 1,5 µL 10 mM ATP, 1 µL T4-Ligase (30 U/µL), 5-10 U µL Eco31I und dH2O auf ein Gesamtvolumen von 20 µl.
      Hinweis: Berechnen des gewünschten Molverhältnis Eintrag Modul: Ziel Vektors (z.B. 3:1) für die Ligatur je nach Konzentration und Länge der Eintrag Modul Einsätze.
    2. Mischen Sie und führen Sie die GreenGate Reaktion2 mit einer PCR-Thermocycler abwechselnd 30 mal 37 ° C für 5 min und 16 ° C für 2 min, gefolgt von einzelnen Schritten von 5 min bei 50 ° C und 5 min bei 80 ° C.
    3. Um die Effizienz zu erhöhen, fügen Sie 1 µL T4-Ligase (30 U/µL) und 1,5 µL 10 mM ATP, die Reaktion und 1 h bei Raumtemperatur, gefolgt von Hitzeinaktivierung der T4 DNA-Ligase bei 65 ° C für 20 min inkubieren.
    4. Verwenden Sie die Ligatur Reaktion zu transformieren kompetente E. Coli und verbreiten die Bakterien auf Agarplatten ergänzt mit der entsprechenden selektierenden Agens Spectinomycin (50 µg/mL).
    5. Übernachtung inkubieren Sie der transformierten E. Coli auf dem Teller bei 37 ° C.
    6. Um Transformation zu bestätigen, neu Streifen Sie jeweils ausgewählte einzelnen Kolonien auf Spectinomycin (50 µg/mL) und Ampicillin (100 µg/mL) mit Platten, beziehungsweise. Verwenden Sie nur Kolonien, die wachsen auf Spectinomycin aber nicht auf Ampicillin Platten.
    7. Inkubieren Sie die E. Coli Kolonien über Nacht bei 37 ° c
    8. Wählen Sie einzelne Kolonien für Plasmid-Isolierung. Verwenden Sie 2 mL LB Flüssigkultur ergänzt mit Spectinomycin (50 µg/mL) und über Nacht in einen Shaker 37 ° C inkubieren.
    9. Isolieren Sie die entsprechenden Plasmiden mit einem Mini-Prep Kit (siehe Tabelle der Materialien).
    10. Überprüfen, indem Sie Restriktionsenzym Analyse (siehe 1.3.12.) und Sequenz ausgewählt positive Konstrukte, die Verwendung von Primern 88 3 (5′-ACCTCTCGGGCTTCTGG-3 '), 88-4 (5′-CCTTTTTACGGTTCCTG-3 '). Wenn die Einlage voll mit diesen Primern sequenziert werden kann nicht, entwerfen Sie interne Primer zur Sequenzierung.
      Hinweis: Zu identifizieren-Klone mit der richtigen Anzahl von pOp wiederholte Sequenzen (siehe Diskussion), der Primer pOp6 (pOp6_F, 5′-TGCATATGTCGAGCTCAAGAA-3 '; und pOp6_R, 5′-CTTATATAGAGGAAGGGTCTT-3 '), die in binden die Kurz gesagt flankierenden Sequenzen für PCR-Amplifikation und anschließende Gelelektrophorese lässt sich durch die Größe unterscheiden.
  5. Fortgeschrittene Supermodule Schöpfung
    1. Zwei unabhängige Sätze von Eintrag Module je nach Bedarf für die Generierung der GR-LhG4 Treiber Linien mit integrierten Reporter-Effektor-Kassette, erste Build zwei fortgeschrittene Plasmide, genannt Supermodules2, vor der Montage des letzten Ausdrucks kombinieren Plasmid in pGGZ001 oder pGGZ003.
    2. Achten Sie darauf, F-H-Adapter am Ende des ersten Supermodule und H-A-Adapter zu Beginn der zweiten Supermodule (dienen als Verbindung zwischen beiden Konstrukte) wie beschrieben2hinzufügen.
      Hinweis: Nur die pGGN000 intermediate Modul trägt die Widerstand-Kassette. Um das Expressionsplasmid zu erzeugen, führen Sie die GreenGate-Reaktion mit der Ziel-Vektor und die pGGN000 und pGGM000 zwischen-Supermodules. Alternativ mischen Sie Ziel Vektor, pGGN000 zwischen Supermodule und der übrigen Einzelmodule GreenGate Reaktion2durchführen. Die letztere Methode kann ist weniger effizient als die ehemalige jedoch schneller.
    3. Erstellen Sie eine pGGM000/pGGN000 Supermodule, mix 1,5 µL (100-300 ng/µL) der einzelnen Eintrag Module mit 1 µL (30 ng/µL) leere fortgeschrittene Vektor (pGGM000 oder pGGN000), 2 µL 10 X Verdauung Puffer, 1,5 µL 10 mM ATP, 1 µL T4-Ligase (30 U/µL) , und 5-10 U Eco31I in einem Gesamtvolumen von 20 µL.
      Hinweis: Berechnen des gewünschten Molverhältnis Eintrag Modul: Reiseziel Vektors (z. B. 3:1) für die Ligatur je nach Konzentration und Länge der Eintrag Modul Einsätze
    4. Mischen Sie und führen Sie die GreenGate-Reaktion wie in Schritt 1.4.2
    5. Zur Steigerung der Effizienz, hinzufügen 1 µL T4-Ligase und 1,5 µL ATP (10 mM) und 1 h bei Raumtemperatur, gefolgt von Hitzeinaktivierung bei 65 ° C für 20 min inkubieren.
    6. Verwenden Sie 10 µL der Ligatur Reaktion, um kompetente E. Coli und Streifen auf Tellern mit Kanamycin (50 µg/mL) zu verwandeln.
    7. Führen Sie über Nacht Inkubation des transformierten E. Coli auf dem Teller bei 37 ° C.
    8. Neu Streifen Sie jeweils ausgewählte einzelne Kolonien auf Kanamycin (50 µg/mL) und Ampicillin (100 µg/mL) Platten, beziehungsweise.
    9. Führen Sie über Nacht Inkubation der E. Coli Kolonien auf der Platte bei 37 ° C.
    10. Wählen Sie einzelne Kolonien, die wachsen nur auf Kanamycin aber nicht auf Ampicillin für Plasmid-Isolierung. Verwenden Sie 2 mL LB Flüssigkultur ergänzt mit Kanamycin (50 µg/mL) und Übernachtung im Shaker 37 ° C inkubieren.
    11. Isolieren der entsprechenden Plasmide mit einer Mini-Prep kit (siehe Tabelle der Materialien).
    12. Überprüfen Sie die Plasmiden durch Restriktionsenzym Analyse (siehe 1.3.12.) und bestätigen Sie durch Sequenzierung mit Primer 87E2 (5´-AGGCATCAAACTAAGCAGAAG-3´) und 87E3 (5´-CGTTTCCCGTTGAATATGGC-3´) an den pGGM000/pGGN000-Backbone glühen. Wenn die Einlage voll mit diesen Primern sequenziert werden kann nicht, entwerfen Sie interne Primer zur Sequenzierung.
      Hinweis: Wenn Klonen in der pGGM000 oder pGGN000 Vektoren nicht erfolgreich ist, ist eine mögliche Lösung zu verdauen, pGGM000 oder pGGN000 mit Eco31I, laufen auf einem Gel und reinigen vom Gel pGGM000 oder pGGN000 Rückgrat (ca. 2000 bp) Fragment ohne die CcdB Kassette (ca. 1400 bp). Dann gehen Sie normalerweise mit der Ligatur-Reaktion.
  6. Verwandeln Sie eine A. Tumefaciens pSOUP+ Belastung (z. B. ASE), wie der pSa-Ursprung der Replikation (Ori A. Tum.) in die Ziel-Vektoren erfordern das Vorhandensein der Helfer Plasmid pSOUP12. Streifen Sie Bakterien auf LB-Platten mit Chloramphenicol (34 µg/mL), Kanamycin (50 µg/mL), Spectinomycin (50 µg/mL) und Tetracyclin (12,5 µg/mL). Zwei bis drei Tage inkubieren Sie die transformierten A. Tumefaciens auf dem Teller in einem Inkubator 28 ° C.

2. Generation Arabidopsis transgener Pflanzen

  1. Umwandlung von Arabidopsis Thaliana.
    Hinweis: Transformieren Sie A. Thaliana Pflanzen nach Zhang Et Al., 2006-13.
  2. Auswahl der transgenen Linien.
    1. Um der transformierten Pflanzen auszuwählen, verwenden Sie das Auswahl-Schema verwendet bei GABI-Kat14 für die Resistenz gegen Silbersulfadiazin15.
    2. Um stabile Linien mit einem möglichst einheitlichen Integration Event auszuwählen, wählen Sie diejenigen in Generation T2, die das Verhältnis 3:1 Segregation in den Widerstand Marker zeigen. Propagieren Sie diese Zeilen zu T3-Generation zu und wählen Sie die Pflanzen homozygot für das Resistenzgen. Alternativ führen Sie eine Southern Blot Analyse oder ein standard quantitative Echtzeit-PCR (SA-qPCR)16 einzelne einfügen Zeilen auswählen.

(3) Induktion von Trans-Aktivierung in Arabidopsis Fahrer Linien

  1. wurzel
    1. Reporter-Ausdruck in A. Thaliana Fahrer Linien erzeugt durch die Schritte 1 und 2, Samen zu sterilisieren, wie unten beschrieben testen.
      1. Hinzufügen von 0,5-1,0 mL 70 % Ethanol + 0,01 % nichtionische Waschmittel, ca. 100 Samen (20 mg) in einer 1,5 ml Reaktionsgefäß und invertieren die Röhre ein paar Mal. Spin-down bei 1000 X g für 15 s und Aufziehen der Überstand.
      2. Hinzufügen von 0,5-1,0 mL absolutes Ethanol. Invertieren des Schlauchs mehrmals, spin-down für 1.000 X g für 15 s und der Überstand verwerfen.
      3. Hinzufügen von 0,5-1,0 mL der absoluten Ethanol und invertieren die Rohr-t ein paar Mal, dann spin-down bei 1.000 X g für 15 s und entsorgen der Überstand.
      4. Lassen Sie Samen im Inneren der Haube trocknen. Fahren Sie mit Schritt 3.1.1.6, wenn Samen in Tuben geschichtet werden sollen.
      5. Hinzufügen von 0,5-1,0 mL sterilem Wasser und invertieren die Röhre ein paar Mal. Spin-down bei 1.000 X g für 15 s und entsorgen der Überstand.
      6. Hinzufügen von 0,5-1,0 mL sterilem Wasser und invertieren der Röhre mehrere Male. Spin-down bei 1.000 X g für 15 s und entsorgen der Überstand.
      7. Hinzufügen von 0,5-1,0 mL sterilem Wasser.
    2. Bereiten Sie Hälfte Stärke Murashige und Skoog mittlere, pH 5.8 zu und 0,9 % Pflanze Agar und 1 % Saccharose. Nach dem Autoklavieren hinzufügen Dexamethason (Dex) aufgelöst in DMSO, um eine Endkonzentration von 10-30 µM, Induktionsplatten und eine gleiche Menge von DMSO, Steuerplatten, beziehungsweise.
    3. Samen für die Wurzel Bildgebung auf Platten und Schichten sie für 48 Stunden in Dunkelheit und Kälte (4 ° C).
    4. Legen Sie Platten senkrecht in eine Pflanze Inkubator (langen Tag (16/8 h), 22 ° C, Luftfeuchtigkeit, 65 %) und fünf Tage lang zu wachsen.
    5. Fünf Tage nach der Keimung (dag), Bild die Sämlinge mit konfokale Laser-scanning-Mikroskopie.
  2. Stamm
    1. Sterilisieren Sie Samen, wie in 2.1.1 beschrieben. und Samen auf ½ MS, 0,9 % Pflanze Agar und 1 % Saccharose-Platten. Schichten Sie für 48 h in Dunkelheit und Kälte (4 ° C).
    2. Übertragen Sie sechs bis sieben Tage nach der Keimung, die Sämlinge zu Boden, jede Pflanze in einen einzigen Topf (langen Tag (16/8 h), 22 ° C, Luftfeuchtigkeit, 65 %).
    3. Trans-Aktivierung im Stängel zu induzieren, durch Bewässerung mit Dex oder mock-Lösung oder durch Eintauchen der Pflanzen in Dex oder Pseudo-Lösungen bzw..
    4. Verwenden Sie für die Bewässerung, eine 25 µM Dex Lösungin Wasser zubereitet aus einem Bestand von 25 mM, die Dex im Äthanol aufgelöst. Wasser alle 2-3 Tage bis zum gewünschten Zeitpunkt der Induktion.
    5. Zum Dippen, bereiten Sie einen 1 L Becher, 750 mL Wasser bzw. 0,02 % Silwet L-77 mit 25 µM Dex oder äquivalente Menge DMSO für die Dex und mock Behandlung enthält. Tauchen Sie Einzelpflanzen für 30 s in der Induktion oder in der Pseudo-Lösung. Wiederholen Sie alle 2-3 Tage bis zum gewünschten Zeitpunkt der Bildgebung.
      Hinweis: Nach dem Eintauchen, sollten die Pflanzen bei hoher Luftfeuchtigkeit eine Stunde lang beibehalten werden.
  3. Shoot Sprossapikalmeristem Meristem (SAM)
    1. Sterilisieren Sie Samen, wie in 2.1.1 beschrieben. Platten mit ½ MS, 0,9 % Pflanze Agar und 1 % Saccharose Medium vorzubereiten und Samen auf Platten gelegt. Speichern Sie die Platten für zwei Tage in Dunkelheit und Kälte für Schichtung.
    2. Setzen Sie Platten in einer vertikalen Position in einem Inkubator Pflanze. Übertragen Sie sechs bis sieben Tage nach der Keimung, die Sämlinge auf den Boden, jede Pflanze in einen einzigen Topf (langen Tag (16/8 h), 22 ° C, Luftfeuchtigkeit, 65 %).
    3. Wenn der Stamm ist ca. 1 cm lang (25-30 dag), sprühen Sie den Blütenstand SAM mit 10-50 µM Dex in H20 eine Gesichtsmaske tragen. Induzieren Sie für Induktion und Bildgebung in einem späteren Stadium der Entwicklung SAMs längere Stiele oder Seitensprosse.
      Bemerkung: SAMs kann auch durch Paintbrushing die Dex-Lösung zur Vermeidung von Sprühtröpfchen induziert. Verwenden Sie eine Maske, wenn Dex durch Sprühen aufgebracht wird.
    4. 24-48 h nach Induktion, sezieren die SAMW und fahren Sie mit Bildgebung (siehe 4.3).
      Hinweis: Nur un-induzierte Pflanzen für die Vermehrung dienten zur Senkung der Wahrscheinlichkeit von Gen-silencing. Pflanzen in T2/T3 wurden für die Bildgebung verwendet.

4. Darstellung der Reporter Ausdruck in Arabidopsis Fahrer Linien.

  1. wurzel
    1. Sämlinge von Platte auf 10 µg/mL Propidium Jodid (PI) Lösung übertragen und Counter für 5 min zu beflecken.
    2. Legen Sie die Wurzeln in ein Mikroskop Kammer imaging (1-Well-Zellkultur-Kammer auf Deckglas II, siehe Tabelle of Materials) und Bild mit einem konfokalen Laser-scanning-Mikroskop mit einem 63 x Wasser eintauchen Ziel (siehe Tabelle der Materialien).
    3. Um PI Fluoreszenz sichtbar zu machen, verwenden Sie eine Erregung Wellenlänge 488 nm und sammeln Emission zwischen 590 und 660 nm. Für mTurquoise2 Fluoreszenz verwenden 458 nm Anregung und Emission zwischen 460 und 615 nm zu sammeln.
  2. Stamm
    1. Führen Sie horizontale Hand geschnitten Abschnitte der Pflanzenstängel mit einer Rasierklinge, besteuert eine Segment von ca. 3 cm. Fix den Stiel mit dem Finger auf der gegenüberliegenden Seite des gewünschten Abschnitts zu schneiden. Führen Sie nacheinander mehrere feine Einschnitte, aber beachten Sie, dass nur Abschnitte aus einer ähnlichen Position im Stamm verglichen werden soll.
    2. Tauchen Sie nach jedem Schnitt die Rasierklinge in einer Petrischale mit Leitungswasser und sammeln Sie die Stamm-Sektionen zu. Färben Sie Abschnitte an dieser Stelle oder montieren Sie direkt auf Objektträger.
    3. Vorbereitung der Färbung, eine 1 mL 250 µg/mL PI-Lösung von Wasser in eine kleine Petrischale (siehe Tabelle der Materialien). Tauchen Sie in den Abschnitten 5 Minuten und spülen Sie sie in Wasser. Übertragen Sie sie auf Objektträger mit der feinen Pinzette oder einem feinen Pinsel. Achten Sie darauf, die Proben mit dem Deckglas nicht quetschen.
    4. Bild Proben mit einem konfokalen Laser-scanning-Mikroskop mit einer 25 x Tauchen Wasser eintauchen Objektiv (siehe Tabelle der Materialien). Verwendung 561 nm Laserlicht zu begeistern PI Fluoreszenz und sammeln von 570 bis 620 nm. Verwendung 405 nm der mTurquoise2 Fluorophor Effektor kodiert, indem der Fahrer begeistern Linie Konstrukte und sammle Emission von 425 bis 475 nm.
  3. Sprossapikalmeristem Meristem schießen
    1. Schneiden Sie den Stiel 2 cm unterhalb der Spitze schießen mit der Pinzette. Halten Sie den Stiel in der Hand und verwenden Sie feine Pinzette, um die Blütenknospen und große Primordia entfernen. Um jungen Primordia entfernen, beheben Sie die SAM in einer aufrechten Position in eine Petrischale mit 3 % Agarose. Verwenden Sie ein Fernglas und Zange, um jungen Primordia in der Nähe von SAM zu entfernen. Alternativ verwenden Sie eine Injektionskanüle (siehe Tabelle der Materialien), diese Primordia abzuschneiden.
    2. Färben der sezierten SAM in eine 250 µg/mL PI-Lösung für ca. 5-10 min. Perform Färbung entweder direkt durch Pipettieren ein paar Tropfen der Färbelösung auf die vorbereiteten SAM oder die Probe zu einem Schlauch gefüllt mit Färbelösung zu übertragen. Halten Sie die SAM untergetaucht vollständig während der Färbeverfahren.
    3. Legen Sie die gefärbte SAM in eine kleine Petrischale (siehe Tabelle der Materialien) mit 3 % Agarose Medium und SAM mit DdH2O.
    4. Bild seziert SAMs mit einem konfokalen Laser-scanning-Mikroskop mit einer 25 x Tauchen Wasser eintauchen Objektiv ausgestattet (siehe Tabelle der Materialien).
    5. Verwendung 561 nm Laserlicht zu begeistern PI Fluoreszenz und sammeln von 570 bis 620 nm. Verwendung 405 nm begeistern die mTurquoise2 Fluorophor und sammeln Emission von 425 bis 475 nm.
      Notieren Sie Bild Stapel über 50 µm in Z-Richtung mit einer Schrittweite von 0,5 µm.
      Hinweis: SAM Bildgebung erfordert wie hier beschrieben einen aufrechte konfokalen Laser-scanning-Mikroskop und ein Objektiv (hier: ein Wasser eintauchen Objektiv) mit langem Arbeitsabstand.

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Representative Results

Generation von Fahrer und Effektor Linien durch Klonen von GreenGate

Die GreenGate Klonen System basiert auf GoldenGate Klonen und Verwendung der Typ IIS Einschränkung Endonuklease Bsaich oder seine Isoschizomer Eco31I. Wie das Enzym produziert Überhänge entfernten vom Standort asymmetrischen Anerkennung der Basenzusammensetzung der Überhänge frei sein können bilden ausgewählt, die die Grundlage die Modularität des Systems. Jeder PCR erzeugte Element, beispielsweise eine Promotorsequenz, CDS oder Terminator, wird zunächst in einen bestimmten Eintrag Vektor mit passenden Überhänge produziert von Beschränkungsauswahl, ein Modul zu generieren eingefügt. Nach subcloning, sind eine Reihe von passenden Modulen, in der Regel sechs für die GreenGate Ligatur Reaktion, was in der Versammlung des Konstrukts in eine binäre Anlage Ziel Vektor verwendet.

Für Fahrer Linien Module mit den DNA-Sequenzen der gewebespezifischen Promoter (pTS), GR-LHG4-Transkriptionsfaktor, der pOp6 Projektträger und der mTurquoise2 Reporter verschmolzen zu einer N-terminalen Signalpeptid und C-terminalen ER Aufbewahrung Signal waren verschmolzen, einschließlich Terminatoren und verschiedene Adaptermodule und ein Modul für transgene Auswahl, wie zuvor beschrieben, 2,8 (Abbildung 2). Effektor Linien entstanden mit pOp6 Promoter und ein Effektor-Kassette, bestehend aus z. B. eines Gens von Interesse und Terminator, sowie ein Modul Codierung ein Resistenzgen für transgene Pflanzenauswahl (Abbildung 2).

Induktion der Fahrer Linien und Visualisierung der Reporter-Fluoreszenz

Induktion mit Dex führt zu Zelle Art spezifische mTurquoise2 Ausdruck in der Wurzel Endodermis (pSCR>> SP-mTurquoise2-HDEL, Abbildung 3A), Phloem Vorstufen und Kambium (pSMXL5>> SP-mTurquoise2-HDEL 17, Abb. 3 b), und die Stammzellen in das Shooting Sprossapikalmeristem Meristem (pCLV3>> SP-mTurquoise2-HDEL 18, Abbildung 3).

Trans-Aktivierung des VND7 in Stärke Scheide Zellen das Kambium

Als Testfall für die Trans-Aktivierung erzielten wir ein Effektor Linie Kodierung, die sekundäre Zelle Wand Meister Transkriptionsfaktors VND7 an die VP16 Aktivierungsdomäne, das gezeigt worden ist fusioniert, sekundäre Zelle Wand Bildung Zelle als autonom zu induzieren misexpressed 8,9,19,20.

Nach 5 Tagen eine Einzelbehandlung mit 15 µM Dex oder DMSO für die induzierte oder mock Pflanzen waren die Visualisierung der ektopische Lignification in der Stärke Scheide bzw. Stamm Abschnitte vorbereitet. Propidium Jodid zeigt in den Stamm starke Affinität zu verholzten Gewebe. Die Stärke Scheide Zellen induziert Proben von Dex, aber nicht in das Mock zeigte ein starkes Signal für den PI-Kanal und einige Zellen zeigen die typischen netzförmig Verdickung der Zellwand im Xylem Zellen (Abbildung 4).

Figure 1
Abbildung 1: Die GreenGate Klonen Prinzip. A) Typ IIS Beschränkung Endonucleases, wie Bsaich /Eco31I, erkennen nicht-palindromische Sequenzen (rot) und in einem definierten Abstand unabhängig von der Reihenfolge (blau) asymmetrisch geschnitten. Öko31I erkennt "GGTCTC", schneidet aus der zweiten Nukleotid stromabwärts des Standortes Anerkennung und schafft einen vier base 5' Überhang. (B) die GreenGate Klonen System basiert auf einem modularen System mit sechs verschiedenen Eintrag Vektoren pGGA000-pGGF000. Diese Vektoren enthalten eine Ampicillin-Resistenz-Kassette (AmpR) und eine CcdB Kassette flankiert durch die spezifischen Adapter für jeden Eintrag-Vektor (z. B. pGGA000 Eintrag Vektor) und die "GGTCTC" Eco31I Anerkennung Websites. Öko31I Verdauung der pGGA000 löst CcdB und schafft die pGGA000-spezifische vier Nukleotid Überhängen (dunkelblau). Insert1 wird noch verstärkt durch Primer beherbergen 'GGTCTC' und pGGA000 spezielle Adapter und nach der Verdauung ligiert in pGGA000. Ebenso Verfahren mit den anderen Modulen. (C) die endgültige GreenGate Reaktion verbindet der Eco31I Verdauung von der Ziel-Vektor-pGGZ001 und die sechs Eintrag Vektoren pGGA000-pGGF000 und der gleichzeitigen Ligatur aller Module in den Ziel-Vektor. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2: Überblick über die Dex-induzierbaren LhGR/pOp-System mit Treiber und Effektor Linien. Im Treiber Linien, gewebespezifische Promotoren (pTS) steuern den Ausdruck des synthetischen Transkriptionsfaktors LhG4, das ist translationally verschmolzen zu den Liganden-bindende Domäne der Ratte Glukokortikoid-Rezeptors (GR) und verhindert dadurch, in Ermangelung von Dex, die nukleare Translokation. Die Effektor-Linie birgt eine transkriptionelle Kassette ein pOp -Element und eine TATA-Box mit einem minimal 35 s -Promoter angetrieben. Gekreuzt mit einer Fahrer-Linie und auf Dex Induktion, bindet GR-LhG4 der pOp - Elementen in die Kassette, Reporter und denen im Modul Effektor induziert die Transkription des mTurquoise2 und der Effektor. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3. Induzierte Fahrer Linien in Wurzel, Stamm und SAM. A) Dex-induzierte Fahrer Linie pSCR >>SP-mTurquoise2-HDEL (keimten in 50 µM Dex) in der Wurzel und mock Behandlung. Die VOGELSCHEUCHE -Promotor (pSCR) vermittelt Ausdruck in der Endodermis, Cortex/Endodermis anfängliche (CEI) und ruhenden Zentrum (QC). Zellen sind gegen gebeizt mit Propidium Jodid (PI). Skalieren Sie Bars = 20 µm. B) Dex-induzierte Fahrer Linie pSMXL5 >>SP-mTurquoise2-HDEL (in einem 50 µM-Dex-Lösung getaucht und nach 3 Tagen visualisiert) in in den Stamm und mock Behandlung. SMXL5 Veranstalter (pSMXL5) vermittelt Ausdruck im Kambium Stammzell-Domäne und Phloem Vorläufer. Zellen sind gegen gebeizt mit Propidium Jodid (PI). Skalieren Sie Bars = 100 µm. C) Dex-induzierte Fahrer Linie pCLV3 >>SP-mTurquoise2-HDEL (10 µM, 48 h) in der SAM-Datenbank. Die CLAVATA3 -Promotor (pCLV3) vermittelt Ausdruck in der Stammzell-Domäne. Bilder unten zeigen XZ und YZ-Querschnitte, Dex-induzierte und mock behandelt, beziehungsweise. Zellen sind gegen gebeizt mit Propidium Jodid (PI). Skalieren von Balken = 20 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 4
Abbildung 4. Ektopische Lignification in der Scheide Stärke des Stammes. A) ektopische Lignification ist fünf Tage nach Dex Induktion der Fahrer Linie gesehen pSCR >> VND7-VP16 im Stamm. Die VOGELSCHEUCHE -Promotor (pSCR) vermittelt Ausdruck in der Stärke Scheide Zellen im Stamm. Linkes Bild zeigt Merge PI-Kanal und Hellfeld, Recht, Bild zeigt nur PI-Kanal. (B) das mock-Steuerelement zeigt kein Signal in der Stärke Scheide Zellen. Zellen sind gegen gebeizt mit Propidium Jodid (PI). Skalieren Sie Bars = 100 µm. PI Fluoreszenz ist falsch gefärbten grün während Chloroplasten Auto-Fluoreszenz ist rot in allen Bildern. Weiße Pfeilspitzen zeigen um Scheide Zellen Stärke. Linkes Bild zeigt Merge PI-Kanal und Hellfeld, Recht, Bild zeigt nur PI-Kanal.  Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Modul 5' Überhang in der Regel verwendet für 3' Überhang
A ACCT Veranstalter AACA
B AACA N-terminale tag GGCT
C GGCT Kodierende Sequenz TCAG
D TCAG C-terminale tag CTGC
E CTGC Terminator ACTA
F ACTA Widerstand-Kassette GTAT

Tabelle 1: Überhänge für besser gekleideteres Design verwendet

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Discussion

Hier beschreiben wir die erforderlichen Schritte zum erzeugen und wenden Sie eine vielseitige und umfassende Toolkit für induzierbaren, Zelle Art spezifische Trans-Aktivierung. Kreuzenden Linien tragen Effektor Kassetten unter Kontrolle des pOp- Promotors mit Fahrer Linien erlaubt der falsche Ausdruck-Effekte in der F1-Generation ermöglicht die schnelle Beurteilung der genetischen Störung in einer Vielzahl von Zelltypen zu studieren. Alternativ Effektor-Konstrukte können verwendet werden, um Fahrer Linien zu verwandeln oder durch Anpassung der Klonierung Strategie, Fahrer und Effektor Konstrukt kann auch auf einem T-DNA kombiniert werden. Anwendungen für dieses System reichen von räumlich und zeitlich gesteuert MIS Ausdruck Studien zur domänenspezifischen Knock-down oder gen bearbeiten und Zelltyp spezifische Ergänzung.

Keines der hier beschriebenen Verfahren sollte eine Herausforderung an Labs für allgemeine molekularbiologische Techniken ausgestattet. LhG4-Expressionssystem wurde gründlich getestet und stellt sicher, dass nicht undicht und tuneable Ausdruck, der zu hoch gefahren werden kann8, Ebenen, obwohl wir machen darauf aufmerksam, dass die Dynamik der Induktor Konzentration empirisch für jeden Fahrer bestimmt werden sollte und Effektor Linie Kombination Kombination dieses bewährte System mit modularen GreenGate Klonen bietet eine rasche und unkomplizierte Möglichkeit, induzierbaren Ausdruck in jeden Zelltyp, die für die spezifischen Promotor verfügbar ist. Wir haben festgestellt, dass Rekombination, die Ereignisse während der Amplifikation der Plasmide auftreten können, die repetitive Sequenzen des Veranstalters pOp-Typ enthalten. Diese führen oft mit weniger Wiederholungen der OP-Sequenz, die durch PCR bewertet werden können. Endgültige Konstrukte sollte immer durch Sequenzierung in Escherichia coli und Agrobacterium Tumefaciensbestätigt werden. Die gelegentliche Rekombinationsereignisse wurden jedoch nur in E. Colinachgewiesen.

Begrenzung der Anwendung dieser Technik ist also die Zeit zum Generieren von transgener Pflanzen.  Es ist von entscheidender Bedeutung, um Gen-silencing, beginnend in der T2-Generation zu testen und nur stabile Linien halten. Um die Möglichkeit der Stummschaltung zu minimieren, empfehlen wir die Samen nur Form-induzierte Pflanzen zu sammeln.

Die hier beschriebene Technik ist komplementär zu anderen Trans-Aktivierung Systeme21,22, wie es eine umfassende Ressource bietet und Gewebespezifität mit induzierbaren Ausdruck kombiniert. Eine mögliche zukünftige Entwicklung dieser Methode ist der Einbau von mehr Zelle typspezifische Promotoren fahren GR-LhG4, zum Beispiel in Geweben außerhalb der wichtigsten Meristeme. In Bezug auf Effektoren ist eine spannende mögliche Erweiterung der Adaption der hocheffizienten gen Bearbeitungs-Tools, um Zelle typspezifische Knock Outs23zu ermöglichen.

In Schürholz Et Al. 20188 beschriebenen Treiber-Verbindungen gibt es von NASC (http://arabidopsis.info/), DNA-Konstrukte in Lampropoulos Et Al., 20132 und Schürholz Et Al. beschrieben, 20188 sind von Addgene (https://www.addgene.org/) zur Verfügung.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Acknowledgments

Arbeit in unseren Laboren wird unterstützt durch die Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) Zuschüsse WO 1660/6-1 (bis S.W) und GR 2104/4-1 (TG) und SFB1101 (zur T.G. und J.U.L) und durch einen Europäischen Forschungsrat Consolidator gewähren (PLANTSTEMS 647148), T.G.  S.W wird durch das Emmy-Noether-Stipendium der DFG durch Grant WO 1660/2 unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ampicillin Carl Roth GmbH + Co. KG K029.1
ATP Sigma-Aldrich A9187
Chloramphenicol Sigma-Aldrich C1919
Column purification Qiagen QIAquick PCR Purification Kit (250)
Culture chamber for imaging Sarstedt AG & Co. KG 1-well tissue culture chamber, on cover glass II
Dexamethasone Sigma-Aldrich D4903
DMSO Fisher Scientific, UK D139-1
Eco31I Thermo Fisher Scientific FD0294
injection cannula (0.30 x 12 mm, 30 G x 1/2) Sterican, Braun
Kanamycin Carl Roth GmbH + Co. KG T832.2
Leica TCS SP5 CLSM, HCX PL APO lambda blue 63x water immersion objectiv Leica, Wetzlar, Germany
MS medium Duchefa, Haarlem, Netherlands M0221.0050
Nikon A1 CLSM, Apo LWD 25x  1.1 NA water immersion objective Nikon, Minato, Tokyo, Japan
Petri dish 35/10 mm Greiner Bio-One GmbH, Germany 627102
Petri dish 60/150 mm Greiner Bio-One GmbH, Germany 628102
Petri dish 120/120/17 Greiner Bio-One GmbH, Germany 688102
Plant agar Duchefa, Haarlem, Netherlands P1001
Plasmid extraction Qiagen QIAprep Spin Miniprep Kit
Propidium iodide (PI) Sigma-Aldrich P4170
Razorblade Classic, Wilkinson Sword GmbH 7005115E
Reaction tubes Sarstedt AG & Co. KG 72.690.001
Silwet L-77 Kurt Obermeier GmbH & Co. KG, Bad Berleburg, Germany
Spectinomycin AppliChem GmbH 3834.001
Spectrophotometer Thermo Fisher Scientific NanoDrop 2000c
Sucrose Carl Roth GmbH + Co. KG 4621.1
Sulfadiazine Sigma-Aldrich S6387
Tetracycline AppliChem GmbH 2228.0025
T4 Ligase 5 U/µl Thermo Fisher Scientific EL0011
T4 Ligase 30 U/µl Thermo Fisher Scientific EL0013

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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