ذوبان الجليد واستزراع كريوبريسيرفينج خطوط الخلايا المورفولوجية

Developmental Biology
 

Summary

خطوط الخلية المورفولوجية هي الكواشف هامة للبحوث الأساسية والطب الأحيائي على حد سواء. توفر هذه المقالة بروتوكولات لذوبان الجليد، وسوبكولتورينج، ونعد من خطوط الخلايا المورفولوجية المستخدمة عادة لمساعدة الباحثين في إدماج استخدام هذه الكواشف في أبحاثهم.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Luhur, A., Klueg, K. M., Roberts, J., Zelhof, A. C. Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines. J. Vis. Exp. (146), e59459, doi:10.3791/59459 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

وهناك حاليا أكثر من 160 خطوط الخلية المورفولوجية متميزة موزعة حسب مركز الموارد المورفولوجية الجينوم (دجرك). مع هندسة الجينوم، يتوقع العدد خطوط الخلايا رواية زيادة. دجرك يهدف إلى تعريف الباحثين باستخدام خطوط الخلايا المورفولوجية كأداة تجريبية لتكملة ودفع جدول أعمالهم البحثية. وترد الإجراءات المتعلقة بالعمل مع مجموعة متنوعة من خطوط الخلايا المورفولوجية ذات الخصائص المميزة، بما في ذلك البروتوكولات لذوبان الجليد واستزراع كريوبريسيرفينج خطوط الخلايا. الأهم من ذلك، يوضح هذا المنشور أفضل الممارسات اللازمة للعمل مع خطوط الخلايا المورفولوجية التقليل من مخاطر التلوث من الكائنات المجهرية العارض أو من خطوط الخلايا الأخرى. الباحثين الذين أصبحوا على دراية بهذه الإجراءات سيكون قادراً على الخوض في العديد من التطبيقات التي تستخدم الخلايا المورفولوجية مثقف بما في ذلك الكيمياء الحيوية وبيولوجيا الخلايا وعلم الجينوم الوظيفي.

Introduction

استخدام المورفولوجية استزراع الخلايا يكمل المجراة في الطيران التحليل الجيني ويخدم كأداة تحقيق الابتدائي لمعالجة العديد من المسائل البيولوجية الأساسية1،،من23. وتوفر خطوط الخلايا المورفولوجية السكان متجانسة فريدة من الخلايا المشتقة من مصادر مختلفة من الأنسجة مع الخلفيات الوراثية المتميزة. خطوط الخلية مناسبة للعديد من التطبيقات بما في ذلك تعبير الجينات المعدلة وراثيا، وعلم الجينوم، transcriptomics، البروتيوميات، جميع، إنتاجية عالية الحمض النووي الريبي التدخل ([رني]) الشاشات وبيولوجيا الخلايا والفحص المجهري. الأهم من ذلك، يسهل استخدام المورفولوجية خلية ثقافة توصيف الردود الزمانية المباشرة للمنبهات المعروفة. وعلاوة على ذلك، المورفولوجية خلية ثقافة قابلة للجينوم كريسبر-Cas9 والتحرير، مما يجعل من السهل نسبيا لإنشاء خطوط الخلايا الجديدة مع الجينوم محددة التعديلات4،،من56، 7.

بمثابة مركز الموارد الجينومية المورفولوجية (دجرك) مركز المستودع وتوزيع لخطوط الخلايا المورفولوجية . أحد الأهداف دجرك مساعدة أعضاء المجتمع للبحث في استخدام موارد الثقافة الخلية المورفولوجية . ويعرض هذا المقال البروتوكولات الأساسية للتعامل مع خطوط الخلايا المورفولوجية . وهو يكمل الموارد الموجودة لمساعدة الباحثين تصبح مريحة مع التعامل مع الثقافات الخلية المورفولوجية وتحقيق مستوى استقلال في تلك التجارب1،2،8،9 ،10.

خطوط الخلية المورفولوجية الأكثر استخداماً: خطوط شنايدر11، Kc16712، قرص imaginal ميتسوبيشي/مياكي والجهاز العصبي المركزي (CNS) خطوط13،14، ميلنر مختبر القرص imaginal خطوط 15،16،خطوط الخلايا المبيض البالغين17، و خطوط رأس18 (الجدول 1). خطوط شنايدر و Kc167 خطوط الخلية جميع الأغراض العامة لاستخدامها في الكيمياء الحيوية والجينات المعدلة وراثيا المؤتلف، وعكس شاشات الجينية. خطوط المختبرية (ML) ميتسوبيشي/مياكي مستمدة من أقراص imaginal اليرقات أو الجهاز العصبي المركزي (CNS) وأنها كانت مفيدة للدراسات المتعلقة نيوروسيكريشن وتنظيم النسخ، وتجهيز الجيش الملكي النيبالي. وكانت خطوط القرص ميلنر (CME) هامة لدراسة توصيل الإشارة. تبقى خطوط الخلايا fGS/برمجيات المصدر المفتوح المستمدة من المبايض الكبار متحولة الكواشف هامة لدراسة التأثير غير الترميز البيولوجيا رنا الصغيرة في الخلية الجرثومية الصيانة والتمايز17،19. وأخيراً، خطوط رأس فريدة من نوعها لأن هذه خطوط الخلايا المشتقة من الأجنة اكتوبيكالي الإعراب عن السرطاني Ras. أنهم على التوقيع النسخي خلايا السلائف العضلات، وتعرب عن piRNA النشطة الآلية20. الأخيرة مراجعة المقالات وفصول الكتب تغطي الطلبات المقدمة من هذه الخطوط الخليوي شعبية مع مزيد من التفاصيل2،3،9.

يمكن سوبكولتوريد جميع خطوط الخلية هذه والمجمدة. هناك متطلبات مختلفة طفيفا ولكن هاما لكيفية المحافظة على كل خط الخلية ومستعدة لتجميد. على سبيل المثال، خطوط الخلايا متميزة تتطلب وسائل الإعلام المختلفة والمكملات الغذائية (الجدول 1). الخطوط تختلف أيضا في خصائص الالتزام السطحية، مورفولوجيس (الشكل 1 و الشكل 2)، النمط الوراثي ومضاعفة الوقت (الجدول 2). نحن الحاضر البروتوكولات الأساسية، وتسليط الضوء على الاختلافات فريدة من نوعها للتعامل مع خطوط الخلية المورفولوجية المختلفة المستخدمة على نطاق واسع.

Protocol

1-ذوبان الجليد وإحياء خطوط الخلايا المجمدة المورفولوجية

  1. تعقيم هود بمسح سطح العمل مع الإيثانول 70%. الاستغناء عن 5 مل الوسط المناسب (الجدول 1) إلى 25 سم2 ر-قارورة (T-25).
  2. إزالة كريوفيال/أمبولي من سائل ن2 أو الثلج الجاف. مسح كريوفيال مع الإيثانول 70%، بعناية ترخي وفتح في أمبولي.
  3. استخدام ماصة باستور، سحب 1 مل من درجة حرارة الغرفة (RT) وسائط الإعلام من قارورة T-25. إضافة وسائط الإعلام ببطء إلى كريوفيال وتخلط برفق إذابة الخلايا المجمدة، وضمان أن لا تجاوز تعليق خلية.
  4. نقل وحدة التخزين بأكملها من تعليق خلية المذابة من أمبولي في قارورة T-25. تكرار لضمان نقل تعليق خلية تماما.
  5. في قارورة في حاضنة 25 درجة مئوية، السماح للخلايا بتسوية والالتزام على الأقل 2 حاء دراسة الخلايا تحت مجهر للتأكد من أن معظم خلايا استقروا على سطح المتنامية. بلطف قم بإزالة الوسائط القديمة واستبدالها مع 5 مل وسائط جديدة. العودة قارورة في الحاضنة.
  6. اليوم التالي، بلطف قم بإزالة الوسائط القديمة واستبدالها مع 5 مل وسائط جديدة. العودة الثقافة للحاضنة.

2-ذوبان الجليد وإحياء خطوط الخلايا المجمدة المورفولوجية (البديل)

  1. في غطاء عقيمة، إذابة الخلايا قبل ريسوسبيندينج بيليه المجمدة مع مل 1 RT وسائل الإعلام. نقل كل تعليق خلية المذابة في أنبوب مخروطي 15 مل.
  2. بيليه الخلايا باستخدام الطرد المركزي في س 1,000 ز لأدنى 5 تجاهل المادة طافية وريسوسبيند بيليه الخلية في 5 مل وسائط جديدة.
  3. نقل وحدة التخزين بأكملها من تعليق خلية في قارورة T-25 واحتضان ثقافة عند 25 درجة مئوية.
  4. ح 1 إلى 2 في وقت لاحق، دراسة الخلايا تحت المجهر التأكد من أن معظم خلايا استقروا على سطح المتنامية. اليوم التالي، تحل محل وسائل الإعلام القديمة مع 5 مل من وسائط الإعلام الجديدة والعودة الثقافة للحاضنة.

3-سوبكولتورينج شبه ملتصقة خلايا تزرع في لوحات الثقافة 100 مم

  1. تعقيم هود بالمسح مع الإيثانول 70%. جلب المواد المعقمة سوبكولتورينج في غطاء محرك السيارة، بما في ذلك زجاجات وسائط الإعلام والماصات والمعونة ماصة ولوحات الثقافة.
  2. دراسة مورفولوجيا والتقاء الثقافة تحت مجهر. البحث عن علامات واضحة للتلوث ميكرورجانيسمال في الثقافة. تحديد ما إذا كانت الخلايا على استعداد لأن باساجيد، تستند إلى خصائص الثقافة: الخلية كثافة ومضاعفة الوقت، بما في ذلك آخر مرة أنهم كانوا سوبكولتوريد.
  3. في حالة ظهور الثقافة عالية روافد (الشكل 1)، تحديد كثافة الخلية. في هود العقيمة، إزاحة الخلايا من سطح المتزايد بيبيتينج يصل إلى 10 مل الوسط من اللوحة والاستغناء عن ذلك عبر الخلايا. كرر عدة مرات، ضمان لا لخلق الرغوة، حتى يصبح السطح تزايد واضح. تحديد كثافة الخلية باستخدام هيموسيتوميتير أو عداد جسيمات تلقائي (الباب 5، الشكل 3). ثقافة فرعية الخلايا إذا كانت كثافة الخلية ما بين 5 106 و 1 × 107 خلايا/مل.
    ملاحظة: هل عدم ثقافة فرعية خطوط الخلايا المورفولوجية لكثافة خلية أدناه 1 × 106 خلايا/مل.
  4. تمييع تعليق خلية تبعاً لذلك باستخدام وسيلة مناسبة لتركيز بذر نهائي على الأقل 1 × 106 خلايا/مل.
    1. باساجينج والصيانة الروتينية، إضافة وحدة تخزين مناسبة لتعليق خلية لوحدة تخزين محددة سلفا من المتوسطة في صفيحة ثقافة جديدة لتحقيق كثافة الخلية البذر المطلوب.
    2. لرفع مستوى ثقافة، نقل جميع تعليق خلية في قارورة كبيرة. تمييع تعليق خلية لكثافة الخلايا المطلوب مع حجم مناسب من المتوسط. توزيع كميات متساوية من تعليق خلية المخفف للوحات الجديدة. يقلل هذا الأسلوب الاختلافات في كثافة الخلايا بين لوحات.
  5. تغطية وتسمية اللوحات مع الأحرف الأولى من اسم المشغل، تاريخ، نسبة تقسيم، كثافة الخلية بذر، معرف خط الخلية، ووسائط الإعلام ومرور عدد وأي إضافات الوسائط مثل المضادات الحيوية.
  6. وضع اللوحات في وعاء من بلاستيك، والعودة المربع للحاضنة.
    ملاحظة: الجدول 3 قوائم السفن الثقافة استخداماً لاستزراع المورفولوجية خلية خطوط وأحجام العمل المرتبطة بها.

4-إزاحة الخلايا ملتصقة نمت في لوحات الثقافة 100 مم

  1. نقل جميع المتوسطة من اللوحة إلى قارورة معقمة جديدة. حفظ في المتوسط.
  2. شطف الخلايا بإضافة 1 مل من 0.05% التربسين-يدتا ببطء اللوحة. دوامة بلطف لضمان الحل التربسين الذي يغطي سطح النمو الكامل. تجاهل الحل التربسين.
  3. إضافة مل 1 0.05% التربسين-يدتا برفق اللوحة. احتضان لوحة عند 25 درجة مئوية بين 3−10 دقيقة في حين رصد علامات مرئية لفصل طبقة الخلية وانزلاق قبالة السطح المتزايد.
  4. إضافة 9 مل الوسط المحفوظة إلى لوحة لوقف نشاط التربسين. مزيج من تعليق خلية ننأى بكتل الخلية. بمجرد قد تم فكها كافة الخلايا، السطح المتزايدة سوف يكون واضحا.
    ملاحظة: استخدام إنزيمات الهضم مثل التربسين الإيدز في باساجينج خطوط الخلايا ملتصقة بشدة. التربسين هو خليط البروتياز غالباً ما تستمد من بنكرياس الخنزير ويتوفر تجارياً في درجات مختلفة من النقاء.

5-دليل خلية عد استخدام الخلية نويباور عد الشريحة

  1. إعداد الشرائح هيموسيتوميتير وساترة بمسح السطح بالكحول 70%.
  2. مزيج تعليق خلية والاستغناء عن 15 ميليلتر من تعليق خلية في حافة مخدد هيموسيتوميتير (الشكل 3A) لملء الدائرة الأولى هيموسيتوميتير. ملء الدائرة الثانية هيموسيتوميتير. سوف يوجه تعليق خلية في قاعة فرز الأصوات بعمل شعري.
  3. استخدام 10 × الهدف المجهر، عد الخلايا داخل منطقة2 1 ملم في وسط الشبكة ملزمة بخطوط متوازية (الشكل 3،د). لتجنب تكرار العد، عد الخلايا التي تراكب أعلى وحدود الأيسر، ولكن لا الخلايا التي تعبر الحدود اليمنى والسفلي من المربعات2 200 ميكرومتر. عد بين الخلايا 100−200. تكرار العد مع الدائرة الثانية.
  4. حساب متوسط تهمتين وتحديد كثافة الخلية وفقا للصيغة التالية: الخلية الكثافة (خلايا/مل) = عدد الخلايا متوسط (ن1 + ن22) × 104.
    ملاحظة: بقاء الخلية عبر كنسبة مئوية خلايا قابلة للحياة مجموع الخلايا. لتحديد صلاحية الخلية، مزيج تعليق خلية مع حجم متساو تريبان الأزرق (0.4%) الحل قبل عد الخلايا يدوياً أو تلقائياً. لا تبت الخلايا الحية الصبغة، بينما الخلايا الميتة وسوف تكون الملون الأزرق.

6-تجميد خطوط الخلايا المورفولوجية

  1. التحقق من البيانات الموروثة مورفولوجية صحية، والنمو، وعدم وجود تلوث. حصاد الثقافات من منتصف مرحلة النمو أواخر سجل (الخطوة 3، 3 أو المادة 4). للعديد من خطوط الخلايا المورفولوجية ، تقريبا بين 4 × 106 خلايا/مل إلى 8 × 106 خلايا/مل.
  2. نقل تعليق الخلية بأكملها في أنبوب مخروطي 15 مل أو 50 مل. جمع الخلايا باستخدام الطرد المركزي في 1,000 س ز لمدة 5 دقائق وتجاهل المادة طافية.
  3. ريسوسبيند بيليه الخلية في وحدة تخزين المتوسطة التجميد (الجدول 4) سوف تؤدي إلى كثافة خلية الأخيرة على الأقل 4 × 107 خلايا/مل.
  4. إضافة dropwise المقدار المناسب من كريوبروتيكتانت ثنائي ميثيل سلفوكسيد ([دمس]) إلى تعليق خلية مثل أن التركيز [دمس] النهائي هو 10%. المزيج بلطف بتعليق خلية.
  5. عناية الاستغناء عن 0.5 مل تعليق خلية في مختبرين كريوفيالس قبل المسمى (~ 2 × 107 خلايا/فيال). ضع امبولات في حاوية تجميد مليئة الايزوبروبانول (الشكل 4 أ). نقل الحاوية التجميد في ثلاجة-80 درجة مئوية بين عشية وضحاها درجة الحرارة من كريوفيالس الانخفاض ببطء (-1 درجة مئوية/دقيقة) بدرجة حرارة الثلاجة.
  6. إخراج كريوفيالس المجمدة وسرعة إرفاقها بالعصي (الشكل 4 باء). إدراج قصب يحتوي على كريوفيالس في اسطوانة (الشكل 4). وبدلاً من ذلك، ضع كريوفيالس المجمدة داخل مربع يبرد قبل تجميد (الشكل 4). مخزن تجميد كريوفيالس في الطور السائل من مجمدات2 ن (4E الشكل،و).
    ملاحظة: عند استخدام تجميد وسائل الإعلام التي تحتوي على [دمس]، تأخير لمدة تصل إلى 30 دقيقة في الرايت لا تضر بالخلايا.

Representative Results

من المهم أن ذوبان الجليد المجمدة المورفولوجية الخلايا سريعاً والثقافة لهم في كثافة خلية التي تجمع بين الثقافة العودة في مرحلة النمو. إذا كان التقيد بالإجراءات لتجميد وذوبان الجليد، كثافة الخلية في قارورة T-25 سوف تساوي على الأقل 4 × 106 خلايا/مل. من ساعة إلى ساعتين بعد ذوبان الجليد، سوف تبدأ معظم خطوط الخلية المورفولوجية لإرفاق إلى السطح المتنامية. تحت ظرف فيه معظم الخلايا لا تعلق على سطح المتزايد خلال ساعتين بعد ذوبان الجليد، من المستحسن لاحتضان الخلايا بين عشية وضحاها قبل تغيير وسائط الإعلام.

وهدف سوبكولتورينج للحفاظ على الخلايا في السجل أسي صحية-مرحلة منحنى النمو. تعتمد معايير سوبكولتورينج على عدم مرئية من التلوث ميكرورجانيسمال، وكثافة الخلية، والحاجة إلى وضع جدول أعمال صيانة عادية. من المهم أولاً تقييم صحة الخلايا وتحديد عدم وجود الملوثات العارض قبل التجميد. معظم الملوثات البكتيرية والفطرية سهلة الكشف ببساطة عن طريق التفتيش البصري. يمكن التعرف على الثقافات الملوثة بزيادة في وسائل الإعلام التعكر. تحت المجهر، قد تظهر الملوثات البكتيرية قضبان، كوتشي، مهدها خلايا الخميرة أو خيوط فطرية الفطرية مثل السلسلة. مصادر أخرى للتلوث مثل المفطورة غير سيتوباثيك لا يمكن كشفها بصريا ويمكن اختبارها بشكل روتيني بفحوصات المستندة إلى بكر21.

يمكن تحديد التقاء خط الخلية بصريا (الشكل 1). خطوط الخلايا المتنامية بسرعة التوصل إلى التقاء في وقت مبكر، وتحتاج إلى أن تكون باساجيد بانتظام. هذه الخطوط هي سوبكولتوريد تصل إلى مرتين في أسبوع. على النقيض من ذلك، خلايا تزايد بطيء باساجيد مرة واحدة على الأقل كل أسبوعين أو أكثر. ومع ذلك، الخلايا بحاجة إلى تغذية وسائط جديدة كل أسبوع. وهذا لمنع استنفاد وسائل الإعلام وتخفف من منتجات النفايات الأيضية من الخلايا. خطوط الخلية المستمدة من مختلف الأنسجة تختلف المصادر في مورفولوجيا بهم (الشكل 2)، خصائص الانضمام، متطلبات وسائل الإعلام (الجدول 1)، ومضاعفة الوقت (الجدول 2). الجدول 5و الجدول 6، الجدول 7و الجدول 8 قائمة وصفات لوسائل الإعلام المختلفة في ثقافة الخلية المورفولوجية .

عد الخلايا يضمن بكثافة بذر دقيقة وروتين يمكن التنبؤ بها سوبكولتورينج. عد الخلايا للتجارب الكمية، أمر أساسي. يتم عد الخلايا أما باستخدام هيموسيتوميتير (الشكل 3A) أو عداد الآلي جسيمات (الشكل 3B). في حالة استخدام عداد الآلي، اتبع إرشادات الشركة المصنعة. عد الخلايا يدوياً باستخدام هيموسيتوميتير سهلة واقتصادية. تحسب عدد الخلايا المغلقة في الشبكات نويباور الأوسط ويتم حساب كثافة الخلية؛ على سبيل المثال، n = خلايا 214، نتج عنه كثافة خلية 2.14 × 106 خلايا/مل (3D الشكل).

تعليق الخلية اثنان ألواح 100 مم، كل 10 مل تحتوي على تعليق خلية في 4 × 106 خلايا/مل وتم جمعها وحراكه في 2 مل من تجميد وسائل الإعلام لتحقيق كثافة 4 × 107 خلايا/مل. ويتضمن كل كريوفيال المجمدة مع 0.5 مل تعليق خلية 2 × 107 الخلايا. وهذا سيؤدي إلى ثقافة مع 4 × 106 خلايا/مل عند إذابة وفقا للبروتوكول الباب 1.

Figure 1
الشكل 1 : صور الممثل ثلاثة متميزة المورفولوجية الخلية خطوط كثافات التقاء وخلية مختلفة. (أ) S2-دجرك الثقافة في 1 × 106 خلايا/مل. (أ ') الثقافة دجرك S2 في 4.5 × 106 خلايا/مل. (ب) مل-BG2-c2 الثقافة في 2 × 106 خلايا/مل. (ب) مل-BG2-c2 الثقافة في 8 × 106 خلايا/مل التي تتراكم وتجميع كبؤر الخلايا. (ج) برمجيات المصدر المفتوح الثقافة في 1 × 106 خلايا/مل. (ج ') الثقافة برمجيات المصدر المفتوح في 4 × 106 خلايا/مل. لم يتم التقاطها بالخلايا في تعليق على نفس المستوى البؤري. شريط المقياس = 100 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم- 

Figure 2
الشكل 2 : صور الممثل ثمانية خطوط الخلية المورفولوجية المميزة. الجولة (A) الجنين المشتقة دجرك S2. (ب) جولة الجنين المستمدة Kc167. (ج) جولة اليرقات المستمدة من الجهاز العصبي المركزي مل-BG2-c2. (د) الجولة اليرقات المغزل على شكل مل-BG3-c2. () CME L1، خط خلية المستمدة من أقراص imaginal اليرقات الساق، أصغر ومورفولوجيا الجولة/مغزلي. (و) مرصد الصحراء والساحل، خط خلية المستمدة من المبايض الكبار، يعرض على شكل شوكي مورفولوجيا. (ز) خط الخلية على شكل المغزل RasV12 معربا عن تنشيط Ras. (ح) RasV12؛ wts[رني] (WRR1), خط خلية يعبر عن رأس المنشط والحمض النووي الريبي مزدوج-الذين تقطعت بهم السبل استهداف القامع الورم الثآليل (wts)، يعرض خصائص الظهارية. شريط المقياس = 50 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3 : يمكن أن تحسب كثافة الخلايا يدوياً باستخدام هيموسيتوميتير أو تلقائياً باستخدام عداد جسيمات الآلي. (A) A هيموسيتوميتير مع دائرتين. (ب) عداد الآلي خلية عرض الإخراج من عدد الخلايا. (ج) ينظر إلى الخلية نويباور تحسن العد الشبكة تحت هدف 10 x. حساب عدد الخلايا ملزمة بالشبكة المركزية3 مم 0.1 (المربع خط متقطع أحمر). (د) الشبكة المركزية على هيموسيتوميتير مليئة بالخلايا للعد. مقياس بار = 1 مم (ج)؛ (د) 0.2 مم. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 4
الشكل 4 : معدات للواسمات. (أ) بتجميد حاوية مخازن امبولات في وضع رأسي لتجميد بطيء. (ب) قصب معدنية لعقد امبولات المجمدة. (ج) ألف اسطوانة لعقد بالعصي. (د) البلاستيك مربع التجميد (كريوبوكس). () اسطوانة يحملون العصي متعددة إدراج في صهريج لتخزين2 سائل ن. (و) ن سائل2 خزان. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

سلالة الخلايا وسائط الإعلام التقيد التربسين
خطوط شنايدر M3 + ببيي + 10% مصل العجل الجنين (FCS)، الرقم الهيدروجيني 6، 6 شبه ملتصقة لا
(S2R +، S2-درسك، S2-دجرك، Sg4) 11
شنايدر في وسائل الإعلام+ + FCS 10%
كيه سي خطوط (Kc167، Kc7E10)21,22 M3 + ببيي + 5 ٪ السفح، 6.6 درجة الحموضة شبه ملتصقة لا
هيكلوني-CCM3، 6.2 درجة الحموضة
القرص إيماجينال والجهاز العصبي المركزي (مل-خطوط)13,14 M3 + ببيي + 10 ٪ السفح، pH 6.6 شبه ملتصقة لا
الأنسولين 10 ميكروغرام/مل
قرص imaginal ميلنر خطوط (CME-خطوط)15 M3 + FCS 2% شبه ملتصقة لا
5 ميكروغرام/مل الأنسولين
استخراج يطير 2.5%
fGS/برمجيات المصدر المفتوح16 م 3 + 10 ٪ السفح، الأس الهيدروجيني 6.8 ملتصقة *
الأنسولين 10 ميكروغرام/مل
1 ملغ/مل ج5ح8كنو4  
0.5 ملغ/مل كهكو3 
الجلوتاثيون 0.6 مغ/مل
استخراج يطير 10%
RasV12 خطوط18 M3 + ببيي + 10 ٪ السفح، pH 6.6 ملتصقة نعم

الجدول 1: متطلبات خصائص ووسائل الإعلام المختلفة المورفولوجية الخلية خطوط- يعزل مختلفة من خطوط شنايدر شبه ملتصقة بما في ذلك S2R + ومركز فحص [رني] المورفولوجية S2 (درسك)، ومركز الموارد الجينومية المورفولوجية S2 (دجرك)، و Sg4 هي خطوط الخلايا تستخدم عادة أن تنتشر قوة عند مثقف في وسائل الإعلام M3 + باكتوبيتوني الخميرة استخراج (ببيي) وتستكمل مع 10% مصل العجل الجنين (FCS). بدلاً من ذلك، غالباً ما يستخدم وسائل الإعلام في شنايدر (pH 6.7-6.8) بدلاً من M3 + ببيي. خطوط كيه سي تتكاثر في أما M3 + ببيي (5 ٪ السفح) أو الوسائط CCM3 خالية من المصل. قرص مل إيماجينال وخطوط الجهاز العصبي المركزي (CNS) تتطلب مكملات الأنسولين للانتشار. تتطلب الخطوط القرص imaginal ميلنر الأنسولين ويطير استخراج مكملات. خطوط الخلايا ملتصقة fGS/برمجيات المصدر المفتوح يتطلب الأنسولين، وأعلى تركيز لاستخراج يطير، فضلا عن الجلوتاثيون للنمو. ملتصقة RasV12 خطوط تنمو جيدا في M3 + ببيي (FCS 10%). ويستخدم التربسين لإزاحة خطوط الخلايا ملتصقة من سطح النمو.

الخلية خط (الأسهم #) النمط الوراثي مضاعفة الوقت (ح) * مصدر النسيج
S2R + (150) أورير 39 الأجنة المتأخرة
S2-دجرك (6) أورير 23 الأجنة المتأخرة
S2-درسك (181) أورير 46 الأجنة المتأخرة
Kc167 (1) ه/سراج الدين 22 6−12 ح الأجنة
مل-BG2-c2 (53) ص v و القانون النموذجي للتحكيم 48 3rd الطور اليرقات الجهاز العصبي المركزي
مل-BG3-c2 (68) ص v و القانون النموذجي للتحكيم 104 3rd الطور اليرقات الجهاز العصبي المركزي
مل-DmD8 (92) ص v و القانون النموذجي للتحكيم 66 3rd الطور الجناح اليرقات القرص
CME W1 Cl.8+ (151) أورير 46 3rd الطور الجناح اليرقات القرص
CME L1 (156) أورير 47 3rd الطور اليرقات الساق القرص
برمجيات المصدر المفتوح (190) بامد86 45 الكبار أم متحولة المبيضين
خطوط RasV12 UAS-التجارة والنقل؛ P(UAS-Ras85D.V12)/17bFO1 ف (Act5C-GAL4) 41−65 الجنين

الجدول 2: يستخدم النمط الوراثي، مضاعفة الوقت، ومصادر الأنسجة على نطاق واسع المورفولوجية الخلية خطوط- ويعرض الوراثي الأنسجة، ومصدر والسكان مضاعفة وقت خطوط الخلايا استخداماً. مضاعفة الوقت يستند النمو في وسائل الإعلام الموصى بها عند 25 درجة مئوية.

سفينة الثقافة حجم الوسائط (mL)
12.5 سم2 ر-قارورة 2.5
25 سم2 ر-قارورة 5
75 سم2 ر-قارورة 15
لوحة 35 مم 1
لوحة 60 مم 4
لوحة 100 مم 10
384-جيدا لوحة * 0.04/جيد
96-كذلك لوحة * 0.1/جيد
48-كذلك لوحة * 0.3/جيد
24-كذلك لوحة * 0.5/جيد
12-كذلك لوحة 1.0/جيد
6-كذلك لوحة 2.0/جيد

الجدول 3: الثقافة السفن والكميات الموصى بها وسائط الإعلام- تتوفر الثقافة سفن من مختلف الأحجام لاستزراع خلايا المورفولوجية . أحجام الوسائط المناسبة (mL) ينصح لكل سفينة. ختم لوحات متعددة التي تحتوي على أقل من 0.5 مل تعليق خلية مع الفيلم البارافين للحد من فقدان وسائل الإعلام بسبب التبخر.

وحدة التخزين
M3 + ببيي، 6.6 درجة الحموضة 70 مل
الحرارة FCS المعطل 20 مل
العقيمة التي تمت تصفيتها [دمس] * 10 مل

الجدول 4: وصفه لإعداد 100 مل من تجميد المتوسطة (م 3 + ببيي، FCS 20%، 10% [دمس]). تحضير الوسائط التجميد حسب الحاجة، وتجنب تخزين التجميد الوسائط التي تحتوي على [دمس] لفترة طويلة.

M3 + المتوسطة ببيي المبلغ
الدروع وغني في M323 1 زجاجة
كهكو3 ز 0.5
استخراج الخميرة حدد ز 1.0
باكتوبيبتوني 2.5 g
العقيمة تنقية المياه 1000 مل

الجدول 5: وصفه للتحضير ل 1 م 3 + ببيي المتوسطة زراعة الأنسجة. ضبط الأس الهيدروجيني إلى 6.6. تعقيم بتمرير الوسيطة من خلال عامل تصفية 0.22 ميكرومتر.

قاعدة M3 المتوسطة لخط الخلية fGS/برمجيات المصدر المفتوح المبلغ
الدروع وغنت M3 1 زجاجة
كهكو3 ز 0.5
ج5ح8كنو4   ز 1.0
العقيمة تنقية المياه مل 1,000

الجدول 6: وصفه ل 1 لتر متوسطة قاعدة fGS/برمجيات المصدر المفتوح M3- ضبط الأس الهيدروجيني إلى 6.8. تعقيم بتمرير الوسيطة من خلال عامل تصفية 0.22 ميكرومتر.

هيكلوني-CCM3 المبلغ
مسحوق CCM3 ز 28.6
ناكو3 ز 0.35
هيدروكسيد الصوديوم N 10 2.5 مل
كاكل2 ز 0.5
العقيمة تنقية المياه مل 1,000

الجدول 7: وصفه ل 1 لتر من هيكلوني-CCM3 الأنسجة الثقافة المتوسطة. ضبط الأس الهيدروجيني إلى 6.2. تعقيم بتمرير الوسيطة من خلال عامل تصفية 0.22 ميكرومتر.

M3 + ببيي + FCS 10% قرص مياكي والمتوسطة خطوط الجهاز العصبي المركزي ميلنر القرص الخطوط المتوسطة fGS/برمجيات المصدر المفتوح الكامل المتوسطة
M3 + ببيي، 6.6 درجة الحموضة 90 مل 90 مل - -
الحرارة المعطل FCS * 10 مل 10 مل 2 مل 10 مل
الأنسولين (10 مغ/مل) - 100 ميليلتر 50 ميليلتر 100 ميليلتر
استخراج يطير - - 2.5 مل 10 مل
الجلوتاثيون (60 ملغ/مل) - - 1 مل
M3، 6.6 درجة الحموضة - - مل 97.5 -
fGS/برمجيات المصدر المفتوح M3، الأس الهيدروجيني 6.8 - - مل 79

الجدول 8: وصفه لإعداد 100 مل المشتركة المختلفة المورفولوجية خلية ثقافة وسائل الإعلام- احتضان FCS في 56 درجة مئوية ح 1 ويهز كل خمس دقائق للحرارة--إلغاء تنشيط بروتينات مكملة.

Discussion

المورفولوجية خلية الثقافات هي الكواشف الأولية للشاشات المستندة إلى خلية إنتاجية عالية. ويكمل استعمالها أيضا المجراة في البحوث الجينية بتوفير عدد سكان متجانسة من الخلايا مناسبة للكيمياء الحيوية واختبار نيات المعدلة وراثيا قبل الحقن في الذباب وبيولوجيا الخلايا، والفحص المجهري، وفي الآونة الأخيرة الخلية الجسمية الوراثي السريع التلاعب جينوم التحرير1،2،3،،من89،10.

البقاء والانتعاش المجمدة المورفولوجية الخلايا حساس لتقلبات جذرية حتى في درجات الحرارة المنخفضة. دجرك يخزن خطوط الخلايا المجمدة في الطور السائل (-196 درجة مئوية) ن2 وينقلهم في الثلج الجاف (-78.50 درجة مئوية). ينبغي عدم نقل امبولات المجمدة التي تنقل في الثلج الجاف إلى السائل ن2 أو ثلاجة-80 درجة مئوية للتخزين. بدلاً من ذلك، ينبغي أن تكون إذابة الخلايا المجمدة وريسيديد في كثافة عالية خلية وقت ممكن عند الوصول (المادة 1 من البروتوكول) ومثقف لأغراضها (القسم 3 من البروتوكول). إذا لم تستخدم خطوط الخلية فورا لإجراء تجارب عليها، cryopreserved الخلايا يجب أن تكون الأسطر (المادة 6 من البروتوكول) حتى تكون جاهزة للاستخدام.

بعض خطوط الخلايا، مثل خطوط مل-BG2-c2 و Ras بحاجة إلى عدة أيام للتعافي من آثار يجري إحياؤها من الدولة كريوبريسيرفيد. كمية كبيرة من الحطام الخلوية ترافق هذه خطوط الخلايا في الأيام القليلة الأولى بعد ذوبان الجليد. بقي دون عائق، سيتم استرداد الخلايا وتتكاثر. وقد تم العديد من خطوط الخلايا المورفولوجية في دجرك تكييف تنمو في M3 تقوم وسائل الإعلام22. لخطوط الخلايا التي تكون بطيئة للتعافي من آثار ذوبان الجليد، قد يكون من المفيد استخدام وسائل مكيفة. يحتمل مكيفة الوسائط تحتوي على عوامل النمو يفرز من الخلايا إلى وسائل الإعلام التي قد تشجع على الانتعاش وانتشار الخلايا بعد ذوبان الجليد.

تتبع خطوط الخلايا عموما منحنى نمو نمطية المكونة من مرحلة انتقالية ومرحلة الأسى، مرحلة الهضبة ومرحلة تدهور. تنتشر العديد من خطوط الخلايا المورفولوجية في السجل-مرحلة النمو عند أنها تستزرع في كثافة بين 1 × 106 و 1 × 107 خلايا/مل عند 25 درجة مئوية. فمن الضروري أن خطوط الخلية هي باساجيد أن هم دائماً في مرحلة النمو الأسى.

التقاء الثقافة، كنسبة مئوية، يصف نمو المساحة التي تغطيها خلايا. التقاء خلية لخط خلية يعتمد على خلية الشكل والحجم. خطوط الخلية متميزة لها مورفولوجيس مختلفة وخصائص الانضمام. كنتيجة لذلك، قد يكون خطوط الخلايا المختلفة في التقاء مماثلة تقريبا كثافة الخلايا متميزة إلى حد كبير (الشكل 1). قد لا يكون التقاء الثقافة مؤشرا مثاليا باساجينج الثقافات الخلية المورفولوجية لخطوط الخلايا المورفولوجية لا تزال تتكاثر أما بواسطة تتراكم فوق بعضها البعض البؤر أو في تعليق حتى بعد سطح النمو غطت (الشكل 1). ومع ذلك، المستخدمين ذوي الخبرة مع خطوط الخلايا المحددة قد غالباً ما تستخدم التقاء كدليل مرئي سريع لعند إلى ثقافة فرعية.

وفي حين أنه من الممكن أن تنمو المورفولوجية خطوط المحيطة RT بين 19−25 درجة مئوية، لا ينصح لتقلبات درجة الحرارة المحيطة قد تؤثر على معدل انتشار. يوصي باستخدام حاضنة مخصصة 25 درجة مئوية. لا تحتاج حاضنة للثقافات الخلية المورفولوجية لتيسير تبادل الغازات CO2 أن لا تستخدم المورفولوجية خلية ثقافة الإعلام CO2 للتخزين المؤقت. الرطوبة داخل الحاضنة لاستزراع خطوط الخلية عاملاً هاما لا يمكن تجاهلها عند استزراع الخلايا في لوحات. اعتماداً على نوع حاضنة وبيئة العمل، قد يكون من الضروري لوضع كوب الماء المعقم داخل الحاضنة. للتقليل من تبخر وسائل الإعلام، استخدام T-قارورة مغلقة أو تخزين لوحات الثقافة في وعاء من بلاستيك محكم مختومة بينما داخل الحاضنة.

من المهم وضع جدول زمني سوبكولتورينج خطوط الخلايا المورفولوجية . لتقدير مدى اتساق مراقبة ومعدل النمو، أنها ملائمة لثقافة فرعية في نسبة حتى هندسية (تقسيم نسبة 1:2, 1:4, 1:8). على سبيل المثال، يمكن تقسيم لوحة المتلاقية 10 مل من الخلايا Kc167 في 8 × 106 خلايا/مل في نسبة 1:8 لتحقيق كثافة بذر 1 × 106 خلايا/مل (1.25 مل تعليق خلية مخفف إلى 8.75 مل وسائط جديدة). ح 72، يتوقع أن تنتشر بكثافة 8 × 106 خلايا/مل، نظراً لمضاعفة وقت ح 24 الثقافات Kc167. ولذلك نسبة تقسيم عازمة على تسهيل روتين ثقافة فرعية ملائمة لتصل إلى مرتين في أسبوع، ضمان أن الخلايا تستزرع دائماً في مرحلة سجل المتسارع النمو. وهذا يسمح لجدول منتظم سوبكولتورينج الخلايا حيث يكون الوقت لالتقاء لا قصيرة جداً أو طويلة جداً. إذا كان الوقت لالتقاء قصيرة جداً، هي سوبكولتوريد الخلايا في خلية أقل كثافة (أعلى نسبة الانقسام). وبالمثل، إذا كان الوقت للتوصل إلى التقاء طويل جداً، هي سوبكولتوريد الخلايا في كثافة خلية أعلى (انخفاض نسبة الانقسام). من المهم أن نلاحظ أن معظم خطوط الخلية المورفولوجية حساسة جداً لخلية منخفض الكثافة (< 1 × 105 خلايا/مل)، وفي الخلايا التي لا يكاد تتكاثر وقد يموت في نهاية المطاف.

تختلف خطوط الخلايا المورفولوجية في خصائص النمو والتشكل. كنتيجة لذلك، قد يكون خطوط الخلايا مع خصائص مميزة التعامل معها بشكل مختلف. معظم خطوط الخلية المورفولوجية شبه ملتصقة. في انخفاض كثافة الخلية، أنها تلتزم بأقوى سطح النمو وعندما تصبح الثقافة المتلاقية، الخلايا تصبح أقل ملتصقة وفصلها بسهولة. يسهل هذا التغيير التدريجي في الخلية الانضمام سوبكولتورينج سهلة لخطوط الخلايا المورفولوجية الأكثر استخداماً (شنايدر، خطوط كيه سي والقرص إيماجينال وخطوط الجهاز العصبي المركزي) كما أنه يسمح للمشغل ببساطة التخلي عن وسائل الإعلام على مدى المونولاير خلية لإزاحة لهم من على سطح النمو عند الثقافة كثيفة. للخطوط التي ملتصقة السطحية مثل خط جرثومة الإناث غمد جسدية الجذعية/المبيض (fGS/برمجيات المصدر المفتوح) وخطوط Ras، الضروري لاحتضان الخلايا في التربسين لمدة قصيرة للمساعدة في فصل الخلايا من سطح النمو.

وتشمل الإضافات وسائل الإعلام لمعظم خطوط الخلية المورفولوجية مصل العجل الجنين (FCS). الأنسولين واستخراج يطير الكبار (FEX) مطلوبة من أجل بعض بنود محددة. FEX يحتوي على غير معرف مكونات أساسية لنمو خطوط محددة القرص imaginal اليرقات وخطوط الخلايا المبيض البالغين. تستعد دجرك، ويجعل FEX الكبار المتاحة المستمدة من 1 أسبوع من العمر أوريغون-R-مودينكودي الذباب (رريد: BDSC_25211) في مختبرين 2.5 مل و 10 مل. دجرك أيضا يوفر إرشادات حول صغيرة الحجم إعداد FEX على موقعها < https://dgrc.bio.indiana.edu/include/file/additions_to_medium.pdf>. ومع ذلك، إعداد FEX، تستغرق وقتاً طويلاً ويتطلب كمية كبيرة من الذباب الكبار.

تجميد خطوط الخلية المورفولوجية يوفر الوقت والمواد الكاشفة لصيانة خطوط الخلايا لا في الاستخدام الفوري. للواسمات يتحقق عن طريق تجميد الخلايا (-1 درجة مئوية/دقيقة) ببطء إلى-80 درجة مئوية في متوسط تحتوي على [دمس]، عامل كريوبروتيكتيفي. خطوة التبريد البطيء أمر حاسم لنجاح تجميد. في ثلاجة-80 درجة مئوية، يتم تبريد ampule الخلايا بمعدل قدرة-1 درجة مئوية/دقيقة عند وضعها في حاوية تجميد مليئة بالكحول. بدءاً من 25 درجة مئوية درجة الحرارة المحيطة، سوف يستغرق ما يصل إلى 2 س لدرجة الحرارة في امبولات تصل إلى-80 درجة مئوية. من المستحسن ترك امبولات لتجميد بين عشية وضحاها.

يجب سرعة ثم نقل امبولات المجمدة في الطور السائل من النيتروجين للتخزين فترات طويلة. في درجة حرارة الغرفة، وسوف يسخن كريوفيال سرعة في حوالي 10 درجة مئوية/دقيقة وسوف يتعرض للخطر في البقاء أعلاه-50 درجة مئوية23. للاحتفاظ بالنقل سريع، التعامل مع امبولات على دفعات صغيرة لتقليل التعرض لدرجة الحرارة المحيطة. وبدلاً من ذلك، وضع كريوفيالس المجمدة على الثلج الجاف بينما كان يستعد لنقلها إلى سائل ن2- إذا لم يتوفر النيتروجين السائل، قد يتم تخزين الخلايا في ثلاجة-80 درجة مئوية، على الرغم من أن تنطوي على خطر تدهور كبير على مر الزمن.

كثافة الخلية أمر بالغ الأهمية لنعد الناجحة، وإحياء خطوط الخلايا اللاحقة. وبصفة عامة، تجميد خلية جديدة ينبغي تجميد خطوط لإنشاء الأولية (امبولات 1−3) حالما يتوفر فائض في الخلايا. بمجرد قد تم خط الخلية مثقف كذلك ستابلي، ينبغي إنشاء مخزون مجمدة من امبولات 10−20. ثم يتم إذابة هذا المخزون للتحقق للانتعاش بعد تجميد الخلايا والجدوى، بعد ذلك يتم نشر للتجريب أو لاستبدال المخزون عندما ينخفض عدد امبولات الأرصدة المجمدة أقل من خمس. وأخيراً، من المهم التحقق من أن الخلايا المذابة الاحتفاظ بخصائص الأسهم الأبوية كما هي معروفة خطوط الخلايا تتطور3،24.

وفي الختام، يقدم هذا المقال تمهيدي للعمل مع الثقافات الخلية المورفولوجية بتوفير المعلومات الأساسية عن مختلف خطوط، وأفضل الممارسات، والبروتوكولات السمعي البصري على المعالجة الأساسية لخطوط الخلايا المورفولوجية . هو يعني هذا المورد موجوداً لتخفيف مقدمة للعمل مع مثقف المورفولوجية الخلايا بسلاسة واستكمال الأدلة التدريبية الموجودة في أي مختبر البحوث.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgments

ونحن نشكر "المعاهد الوطنية للصحة" (المعاهد الوطنية للصحة جائزة P40OD010949) ومجتمع البحوث للاستفادة من الموارد الحمض النووي/ناقل/خلية melanogaster دال- الفني في دجرك مختلف.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100 mm tissue culture plates Corning  430167 Subculturing
25 cm2 T-flask Corning  430168 Subculturing
35HC Liquid Nitrogen Storage Tank Taylor-Wharton 35HCB-11M Cryopreservation
Automated Cell counter BIO-RAD TC20 Counting
Bactopeptone BD BioSciences 211677 Medium additions
Counting Slides BIO-RAD 145-0011 Counting
Cryovial 1 mL Greiner  123263 Cryopreservation
DMSO Sigma Aldrich D5879 Cryopreservation
Freezing Box Nalgene 5029-0909 Cryopreservation
Freezing Container Fisher Scientific 15-350-50 Cryopreservation
Hematocytometer Fisher Scientific #0267110 Counting
Human Insulin Millipore Sigma I9278 Medium additions
Hyclone CCM3 media GE Healthcare Life Sciences SH30061.03 Medium
Hyclone Fetal Bovine Serum GE Healthcare Life Sciences SH30070.03 Medium additions
L-Glutamic acid potassium salt monohydrate Millipore Sigma G1149 Medium additions
L-Glutathione reduced Millipore Sigma G6013 Medium additions
Potassium Bicarbonate Millipore Sigma 237205 Medium additions
Select Yeast Extract  Millipore Sigma Y1000 Medium additions
Shields and Sang's M3 Insect medium Millipore Sigma S8398 Medium
Trpsin-EDTA (0.05 %), phenol red  ThermoFisher Scientific 25300054 Subculturing
Trypan Blue (0.4%) BIO-RAD 145-0013 Counting

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Baum, B., Cherbas, L. Drosophila: Methods and Protocols. Methods in Molecular Biology. Dahmann, C. 420, Humana Press. Ch. 25 391-424 (2008).
  2. Cherbas, L., Gong, L. Cell lines. Methods. 68, (1), 74-81 (2014).
  3. Luhur, A., Klueg, K. M., Zelhof, A. C. Generating and working with Drosophila cell cultures: Current challenges and opportunities. Wiley Interdisciplinary Reviews: Developmental Biology. e339 (2018).
  4. Franz, A., Brunner, E., Basler, K. Generation of genome-modified Drosophila cell lines using SwAP. Fly (Austin). 11, (4), 303-311 (2017).
  5. Housden, B. E., et al. Identification of potential drug targets for tuberous sclerosis complex by synthetic screens combining CRISPR-based knockouts with RNAi. Science Signaling. 8, (393), r9 (2015).
  6. Kunzelmann, S., Bottcher, R., Schmidts, I., Forstemann, K. A Comprehensive Toolbox for Genome Editing in Cultured Drosophila melanogaster Cells. G3 (Bethesda). 6, (6), 1777-1785 (2016).
  7. Ishizu, H., Sumiyoshi, T., Siomi, M. C. Use of the CRISPR-Cas9 system for genome editing in cultured Drosophila ovarian somatic cells. Methods. 126, 186-192 (2017).
  8. Echalier, G. Drosophila Cells in Culture. Academic Press. (1997).
  9. Echalier, G., Perrimon, N., Mohr, S. Drosophila cells in culture. 2nd edition. Elsevier. (2017).
  10. Cherbas, L., Cherbas, P. Drosophila: A practical approach. Roberts, D. B. 10, 2nd, Oxford University Press. 319-346 (1998).
  11. Schneider, I. Cell lines derived from late embryonic stages of Drosophila melanogaster. Journal of Embryollgy and Experimental Morphology. 27, (2), 353-365 (1972).
  12. Echalier, G., Ohanessian, A. Isolement, en cultures in vitro, de lignees cellulaires diploides de Drosophila melanogaster. Comptes rendus de l'Académie des Sciences. 268, 1771-1773 (1969).
  13. Ui, K., et al. Newly established cell lines from Drosophila larval CNS express neural specific characteristics. In Vitro Cellular & Developmental Biology − Animal. 30A, (4), 209-216 (1994).
  14. Ui, K., Ueda, R., Miyake, T. Cell lines from imaginal discs of Drosophila melanogaster. In Vitro Cellular & Developmental Biology. 23, (10), 707-711 (1987).
  15. Currie, D. A., Milner, M. J., Evans, C. W. The growth and differentiation in vitro of leg and wing imaginal disc cells from Drosophila melanogaster. Development. 102, 805-814 (1988).
  16. Niki, Y., Yamaguchi, T., Mahowald, A. P. Establishment of stable cell lines of Drosophila germ-line stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, (44), 16325-16330 (2006).
  17. Saito, K., et al. A regulatory circuit for piwi by the large Maf gene traffic jam in Drosophila. Nature. 461, (7268), 1296-1299 (2009).
  18. Simcox, A., et al. Efficient genetic method for establishing Drosophila cell lines unlocks the potential to create lines of specific genotypes. PLoS Genetics. 4, (8), e1000142 (2008).
  19. Sumiyoshi, T., et al. Loss of l(3)mbt leads to acquisition of the ping-pong cycle in Drosophila ovarian somatic cells. Genes & Development. 30, (14), 1617-1622 (2016).
  20. Dequeant, M. L., et al. Discovery of progenitor cell signatures by time-series synexpression analysis during Drosophila embryonic cell immortalization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112, (42), 12974-12979 (2015).
  21. Young, L., Sung, J., Stacey, G., Masters, J. R. Detection of Mycoplasma in cell cultures. Nature Protocols. 5, (5), 929-934 (2010).
  22. Shields, G., Sang, J. H. Improved medium for culture of Drosophila embryonic cells. Drosophila Information Service. 52, 161 (1977).
  23. Freshney, R. I., Capes-Davis, A., Gregory, C., Przyborski, S. Culture of animal cells : a manual of basic technique and specialized applications. Seventh edition. edn. Wiley Blackwell. (2016).
  24. Lee, H., et al. DNA copy number evolution in Drosophila cell lines. Genome Biology. 15, (8), R70 (2014).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics