الخلية الحرة "استخدام تعبير البروتين" "سرعة نمو بكتيريا" الضمة ناتريجينس

* These authors contributed equally
Bioengineering
 

Summary

نظم التعبير خالية من الخلية أدوات قوية وفعالة من حيث التكلفة لتوليف الفائق وفحص البروتينات الهامة. وهنا يصف لنا إعداد نظام التعبير بروتين الخلية الحرة باستخدام ناتريجينس الضمة لإنتاج البروتين السريع باستخدام بلازميد الحمض النووي والحمض النووي الخطي قالب مرناً.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Wiegand, D. J., Lee, H. H., Ostrov, N., Church, G. M. Cell-free Protein Expression Using the Rapidly Growing Bacterium Vibrio natriegens. J. Vis. Exp. (145), e59495, doi:10.3791/59495 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

البكتيريا البحرية ناتريجينس الضمة قد حصل على اهتمام كبير كمضيف الميكروبية ناشئة عن التكنولوجيا الحيوية بسبب معدل النمو السريع. ويرد وصف بروتوكول عام للإعداد V. ناتريجينس مقتطفات خلية النفط الخام باستخدام معدات المختبرات المشتركة. لقد كان هذا البروتوكول ذات العوائد المرتفعة على وجه التحديد الأمثل للمستخدم إمكانية الوصول وتقليل التكلفة. تخليق البروتين الخلية الحرة (الحراجية) يمكن أن تنفذ في نطاق صغير 10 ميكروليتر دفعة ردود الفعل في شكل جيد 96 أو 384 وتكاثر غلات تركيزات > 260 ميكروغرام/مل سوبر المجلد التجارة والنقل (سفجفب) ضمن حاء 3 عموما، واستخراج النفط الخام خلية الحراجية وإعداد يمكن أن يتحقق في أيام كاملة 1−2 بمستخدم واحد. هذا البروتوكول يمكن دمجها بسهولة في الأنابيب توليف البروتين الموجودة لتسهيل التقدم في الإنتاج البيولوجي وتطبيقات البيولوجيا التركيبية.

Introduction

تخليق البروتين الخلية الحرة طريقة فعالة من حيث التكلفة وتنوعاً للتعبير عن قيمة البروتينات أو الببتيدات1،2،،من34. تاريخيا، تم أداؤه تخليق البروتين خالية من الخلية باستخدام أنظمة تعبير الإشريكيّة القولونية ؛ ومع ذلك، كان هناك طفرة في الآونة الأخيرة في استخدام الكائنات الحية البديلة، غير نموذج مع خصائص الرواية كهيكل للتعبير خالية من الخلية5،،من67،،من89 , 10 , 11 , 12-الكائنات مع التشكيلات الجانبية الأيضية فريدة من نوعها هي رئيس الوزراء المرشحين كبدائل لنظم كولاي خالية من الخلية. على سبيل المثال، تضاعف البكتيريا البحرية ناتريجينس الضمة هي الأسرع نمواً من جميع الكائنات المعروفة مع ملاحظتها وقت أقل من 10 دقيقة13. وهذا قد حصل V. ناتريجينس اهتماما كبيرا كمضيف الميكروبية المستجدة للبحوث والتكنولوجيا الأحيائية14،،من1516،،من1718. نظراً لأن معدل النمو السريع ف. ناتريجينس وقد ارتبطت بمعدلات عالية من البروتين وكفاءة الأيض19،20،21، تسخير جهازها الخلوي للخلية الحرة يمكن توسيع توليف مجموعة الأدوات لإنتاج البروتين السريع والفرز الفائق.

في الآونة الأخيرة، خلية حرة قد ثبت ف. ناتريجينس نظام التعبير التي هي قادرة على إنتاج مجلد سوبر التجارة والنقل (سفجفب) بتركيزات > 260 ميكروغرام/مل في ح 3 مع مروج T79. وكان الهدف العام لتطوير هذا الأسلوب لتزويد المستخدمين مع نظام تعبير الوصول للغاية، وفعالة من حيث التكلفة، واستنساخه، وعالية الغلة من بروتين خالية من الخلايا التي يمكن إعدادها باستخدام معدات مختبر مشترك في فترة قصيرة من الزمن. ويستخدم هذا البروتوكول الثقافات 1 لتر في قوارير اهتزاز، وتحلل الخلية بنبض سونيكاتيون، وردود الفعل دفعة صغيرة الحجم في شكل 96-384 جيدا أو الموازاة وفحص الإنتاجية إلى أقصى حد. تعبير بروتين طويلة ومستمرة بفضل مكملات حمض 3-فوسفوجليسيريك (3-الشبكة) كالطاقة مصدر8،،من2223. عند الانتهاء بنجاح من هذا البروتوكول، وسوف يكون لمستخدم القدرة على التعبير عن بروتين المطلوب أو استخراج مجموعة من البروتينات في شكل الخلية الحرة باستخدام V. ناتريجينس خلية النفط الخام.

بدءاً من مخزون والغليسيرول، مستعدون V. ناتريجينس مقتطفات النفط الخام خلية من الخلايا حصاد بكثافة بصرية في 600 نانومتر (OD600) 1.0. سوف تسفر عن ثقافة 1 لتر تقريبا 2−3 مل من استخراج، وكافية لأكثر من 800 من ردود الفعل الخلية الحرة في استخراج النفط الخام من الخلية 25%. البروتينات يمكن التعبير عنها باستخدام بلازميد الحمض النووي، والحمض النووي الخطي، أو قالب مرناً؛ إلا أن تظل الخطية تدهور قالب الحمض النووي من نوكلياسيس الذاتية عيب كبير عند استخدام نظام النوع المتوحش ضد ناتريجينس الخلية الحرة9. بدءاً من الثقافات ف. ناتريجينس ، البروتين صالحة للاستخدام للتطبيقات المتلقين للمعلومات يمكن أن تحققه مستخدم واحد في 1−2 يوما كاملا.

Protocol

1-إعداد V. ناتريجينس "الخام خلية مقتطفات" – ثقافة البكتيرية

  1. إعداد V. ناتريجينس وسائط النمو البكتيرية رطل-V2 وفقا الجدول 1. تعقيم وسائط الاستنبات بالتعقيم. السماح لوسائل الإعلام لتصل إلى درجة حرارة الغرفة (RT). قم بتخزين الوسائط الزائدة في الرايت
    تنبيه: ارتداء معدات الحماية الشخصية المناسبة (معدات الوقاية الشخصية) والتشاور مع مختبر تعليمات محددة عند التشغيل اﻷوتوكﻻف.
  2. استخدم أسهم والغليسيرول من النوع المتوحش ضد ناتريجينس لتطعيم 3 مل الإعلام رطل-V2. تنمو بين عشية وضحاها في 30 درجة مئوية بينما تهز 225 لفة في الدقيقة.
  3. أغسل 1 مل الثقافة بين عشية وضحاها بالطرد المركزي في 10,600 س ز على benchtop أجهزة الطرد مركزي للحد الأدنى 1 Aspirate المادة طافية دون إزعاج بيليه الناتجة عن ذلك وريسوسبيند في 1 مل الطازجة رطل-V2 وسائط.
  4. في حرف L 4 يعقم إضافة قارورة Erlenmeyer حيرة الغطاء العقيمة، 1 لتر وسائط النمو رطل-V2 الطازجة. تطعيم باستخدام 1 مل ثقافة بين عشية وضحاها غسلها (1:1، 000 إضعاف نسبة). تنمو الثقافة عند 30 درجة مئوية بينما تهز 225 لفة في الدقيقة.
    ملاحظة: يمكن تحجيمها V. ناتريجينس الثقافات لأعلى أو لأسفل مع الاحتفاظ بنسبة تخفيف 1:1,000. على سبيل المثال، إضافة 250 ميكروليتر غسلها الثقافة بين عشية وضحاها إلى 250 مل وسائط النمو رطل-V2 الطازجة في 2 لتر في حيرة قارورة Erlenmeyer مع غطاء العقيمة.
  5. رصد الثقافة OD600 باستخدام جهاز المطياف الضوئي. عندما تصل إلى ثقافة OD600 = 1.0 ± 0.2، ثقافة الحصاد عن طريق استخدام الطرد المركزي في س 3,500 ز لمدة 20 دقيقة في 4 درجات مئوية. مكان بيليه على الجليد.
    ملاحظة: ف. ناتريجينس ينمو بسرعة، حيث الرصد الوثيق للثقافة أمر ضروري. النمو للتطوير التنظيمي600 = 1.0 ينبغي أن حوالي 1.5−2 ح في نسبة تخفيف 1:1,000.
  6. نضح المادة طافية وتخزين فورا بيليه البكتيرية الناتجة في-80 درجة مئوية أو المضي مباشرة إلى الخلية تحلل الموضحة في القسم 2.
    ملاحظة: هذه الخطوة نقطة توقف جيدة؛ ومع ذلك، من المستحسن أن بيليه معالجتها على الفور أو في غضون أيام 1−2 للحصول على أفضل النتائج.

2-إعداد V. ناتريجينس "الخام خلية مقتطفات" – تحلل الخلية

  1. إعداد المخزن المؤقت لتحلل S30 وفق الجدول 1 في تعقيم المياه (DI) وضبط درجة الحموضة إلى 7.7 استخدام حمض الخليك الجليدية.
    تنبيه: حمض الخليك الجليدية يجب التعامل مع معدات الوقاية الشخصية المناسبة عند ضبط درجة الحموضة.
  2. كول S30 تحلل المخزن المؤقت إلى حوالي 4 درجات مئوية في ثلاجة أو في الثلج قبل بدء الإجراء تحلل الخلية.
    ملاحظة: يمكن وضع المخزن المؤقت لتبريد سريع إلى أسفل، تحلل في-20 درجة مئوية. لا تسمح المخزن المؤقت تجميد.
  3. وضع الكريات الخلية على الجليد لمدة دقيقة 10−20 أو حتى مذاب تماما. ريسوسبيند جميع الكريات الناتجة عن نفس الثقافة 1 لتر باستخدام 10 مل من المخزن المؤقت لتحلل S30 الباردة، ثم نقل تعليق إلى أنبوب 50 مل. إذا لم تجمد الكريات في الثلاجة في-80 درجة مئوية في الخطوة 1، 6، تابع مباشرة لاستثارة.
    ملاحظة: زيادة حجم المخزن المؤقت لتحلل S30 المستخدمة في البداية ريسوسبيند الكريات حسب الحاجة.
  4. تعليق الطرد المركزي في س 3,500 ز لمدة 10 دقائق في 4 درجات مئوية. نضح المادة طافية دون إزعاج بيليه. أغسل بيليه مرة ثانية باستخدام 10 مل من المخزن المؤقت لتحلل S30 الباردة. مكان بيليه على الجليد.
  5. في غرفة باردة، إضافة 500 ميكروليتر S30 الباردة تحلل المخزن المؤقت لبيليه في أنبوب 50 مل. استخدام تلميح ماصة واسعة-تتحمل، ريسوسبيند بيليه ونقل تعليق بيليه كامل بعناية إلى أنبوب 2 مل.
    ملاحظة: إذا تحملت واسعة ماصة غير متوفر، واستخدام مقص لقطع نهاية طرف ماصة 1 مل على زيادة تحمل لنقل بيليه.
    1. نقل بيليه قدر الإمكان دون زيادة كبيرة في الحجم؛ ومع ذلك، ينبغي أن حراكه بيليه في سائل ما يكفي تكون سونيكاتيد، كما يتبين من تعليق متجانسة في الأنبوب 2 مل. لا أوفيرفيل على أنبوب 2 مل. التعليق لا ينبغي أن تتجاوز 1.5 مل؛ تقسيم إلى أنابيب متعددة إذا لزم الأمر.
  6. الاحتفاظ ببيليه الخلية على الجليد والعمل في غرفة باردة. ملء كوب 600 مل مع الجليد ومكان حامل أنبوب 2 مل فوق الجليد.
    ملاحظة: أنه من المفيد وضع صاحب الأنبوبة قرب الجانب للكأس، حيث وقف بيليه سيكون مرئياً في الجليد رصد التقدم المحرز في سونيكيشن (انظر الشكل 1).
  7. وقف دوامة بيليه في أنبوب 2 مل بإيجاز مجانسة الخلايا، وفتح أنابيب نفض الغبار لإزالة أي من الخلايا الموجودة في الجزء السفلي من الغطاء، ووضعه في أنبوب مع غطاء حامل. نصيحة سونيكاتور السفلي إلى تعليق حيث أن هذا فقط تحت سطح السائل.
  8. يعد إنشاء سونيكيشن كما هو مبين في الشكل 2 باستخدام سونيكاتور والتحقيق مع قطر تلميح ⅛ بوصة. إدخال الإعدادات التالية في عنصر التحكم سونيكاتور: نبض 20 كيلو هرتز التردد والسعة 50%، في الوقت: 10 ق، وقت إيقاف نبض: 60 ثانية.
  9. تشغيل بروتوكول sonication نبض لثلاث دورات. إذا كان الحجم الإجمالي لتعليق بيليه > 500 ميكروليتر، تشغيل بروتوكول sonication نبض ست مرات.
    ملاحظة: وبصفة عامة، والبقول 3−6 تكفي ضد ناتريجينس الكريات؛ البقول إضافية قد تكون مطلوبة استناداً إلى سونيكاتور. أثناء سونيكاتيون، استخدام منصة مقبض التكيف بتحريك المسبار صعودا ونزولاً أي بيليه قد استقروا في الجزء السفلي من الأنبوب. يمكن إزالة الأنبوب من حامل وإيجاز فورتيكسيد لإعادة مواءمة تعليق ما بين النبضات. انظر المناقشة الواردة أدناه للاتساق المطلوب من الخلايا سونيكاتيد.
    تنبيه: ارتداء حماية السمع المناسب عندما سونيكاتور نشطاً.
  10. وعقب سونيكيشن، استخراج خلية أجهزة الطرد المركزي النفط الخام في س 16,000 ز لمدة دقيقة 30−45 عند 4 درجة مئوية أو حتى يصبح ليستي خالية من أي الحطام الخلوية كما هو مبين في الشكل 3.
  11. في غرفة باردة، الكوة ميكروليتر 50 من supernatants الناتجة إلى أنابيب 2 مل جديدة دون إزعاج بيليه.
    ملاحظة:
    أي حطام يتم نقلها عن طريق الخطأ في أنابيب 2 مل الجديدة سيتم تخفيض جذري القدرات لاستخراج للبروتين عالية الغلة.
    1. بشكل اختياري، جانبا استخراج 10 ميكروليتر من الخلية للقياس الكمي بعد تحلل البروتين في 2 مل منفصلة أنبوب (راجع الخطوة 2، 13 أدناه).
  12. فلاش تجميد مقتطفات خلية النفط الخام عن طريق وضع أنابيب في حامل أنبوب مع سلسلة غمس تعلق كما هو مبين في الشكل 4. غمر الأنابيب في ديوار المحتوية على النتروجين السائل ومكان فورا في ثلاجة في-80 درجة مئوية حتى الاستخدام.
    تنبيه: استخدام معدات الوقاية الشخصية الملائمة للتعامل مع النتروجين السائل بما في ذلك معطف مختبر ونظارات السلامة ودرع الوجه، وساحة كريوجين والقفازات.
  13. بشكل اختياري، تحديد كمية البروتين الكلي للخلية استخدام 10 ميكروليتر جانبا الخطوة 2.11.1 تمييع 1: 100 عينة في 1 × مخزنة الفوسفات المالحة (PBS) واستخدام أي التحليل الكمي القياسي مجموع البروتين مثل برادفورد المقايسة، حمض بيسينتشونينيك الفحص (اتفاق التعاون الأساسي)، إلخ.

3-إعداد مكونات رد فعل الخلية الحرة

  1. مكونات رد الفعل العام
    1. إعداد الأرصدة العامل غلوتامات ملغ وغلوتامات ك في أنابيب 50 مل مع الماء المعقم دي بتركيزات من 100 ملم و 2000 ملم، على التوالي.
    2. إعداد رصيد عامل من 50% (w/v) البولي إيثيلين غليكول (شماعة)-8000 بإضافة 100 مل دي عقيمة الماء كوب 250 مل. مكان محرض مغناطيسية صغيرة إلى الكأس. تزن بها 50 جرام 8000 شماعة وإضافة إلى 100 مل الماء في الكأس.
    3. ضع في الكأس على مجموعة لوحة ضجة ساخنة إلى 100 درجة مئوية ويقلب 250 لفة في الدقيقة حتى 8000 شماعة في الحل. السماح لخليط سائل شماعة-8000 لتبرد قبل نقل إلى أنابيب 50 مل.
  2. مزيج الطاقة الحل الرئيسي
    1. إعداد حل م 5 من كوه بإضافة 140 غ كريات كوه إلى 500 مل الماء المعقم دي.
      تنبيه: إعداد هذا الحل في غطاء كيميائية وارتداء معدات الوقاية الشخصية عند التعامل مع قواعد قوية. الحل سوف تصبح ساخنة حتى غطاء زجاجة يجب أن تكون فضفاضة لمنع تراكم الضغط. يسمح الحل كوه للوصول إلى RT قبل استخدام.
    2. إعداد المخزن مؤقت كوه حبيس 1750 ملم بإضافة 20.85 ز حبيس زجاجة 100 مل. إضافة العقيمة دي الماء ببطء حتى تصل إلى الحجم 40 مل. زجاجة دوامة حل حبيس. استخدام الحل كوه 5 م بضبط درجة الحموضة إلى 8.0 وثم إعادة التخزين الحل إلى 50 مل.
      تنبيه: يجب أن تعالج كوه معدات الوقاية الشخصية المناسبة عند ضبط درجة الحموضة.
    3. إعداد 10 المتبقية × الطاقة ميكس الرئيسية مكونات المخزون بتركيزات المشار إليها في الجدول 2 في الماء المعقم دي ومكان كل الأسهم على الجليد. ذوبان الجليد المخزونات ATP وأنشئ CTP UTP 100 ملم في الرايت ومكان على الجليد.
      ملاحظة: يمكن استخدام ثيرموميكسير تعيين إلى 37 درجة مئوية و 350 دورة في الدقيقة ليذوب الكواشف في الحل إذا لزم الأمر. لا أسخن أو ترك الكواشف على ثيرموميكسير لفترة ممتدة من الوقت.
    4. في أنبوب 15 مل، إضافة كل مكون من مكونات رئيسية مزيج الطاقة الحل وفقا للنظام، ووحدة التخزين المحددة في الجدول 2. دوامة الحل بعد إضافة كل مكون. وهذا سيجعل 5 مل 10 × مزيج الطاقة الحل الرئيسي.
    5. تقسيم 200 ميكروليتر مختبرين في أنابيب 2 مل 10 × مزيج الطاقة الحل الرئيسي. فلاش تجميد كل قاسمة كما يؤديها في الخطوة 2، 12. فور وضعها في الثلاجة-80 درجة مئوية حتى الاستخدام.
  3. مزيج من الأحماض الأمينية الأساسية
    1. لإعداد جديدة 4 × مزيج من الأحماض الأمينية الأساسية، تبدأ بذوبان كل المخزون من الأحماض الأمينية في الرايت وثم وضع كل منهما على الجليد. استخدام دوامة و/أو ثيرموميكسير عند 37 درجة مئوية و 350 دورة في الدقيقة لضمان جميع الأحماض الأمينية الأرصدة يتم حله تماما.
      ملاحظة: لا يجوز حل سيستين تماما؛ يمكن أن يضاف إلى المزيج من الأحماض الأمينية الرئيسية كتعليق. لا أسخن أو ترك الكواشف على ثيرموميكسير لفترة ممتدة من الوقت.
    2. في أنبوب 15 مل، إضافة الأحماض الأمينية الحجم المناسب للماء المعقم دي حيث يكون التركيز النهائي لكل 8 ملم بالترتيب التالي: علاء، الأرجنتين، ASN، ASP، جلن، غلو، الغليسين، له، IIE، LYS، MET، الفنيل ألانين، برو، SER، THR، VAL، الراديكالي، صور. ، لوي، و CYS. بعد إضافة كل من الأحماض الأمينية، مزيج دوامة سيد الحل. وسوف تشكل الأقراص المسرودة في الجدول 2 2.4 مل مزيج من الأحماض الأمينية الأساسية.
    3. تقسيم 200 ميكروليتر مختبرين في أنابيب 2 مل 4 × مزيج من الأحماض الأمينية الأساسية. فلاش تجميد كل قاسمة كما يؤديها في الخطوة 2، 12. ضع فورا في ثلاجة في-80 درجة مئوية حتى الاستخدام.
  4. إنتاج قالب الحمض النووي بلازميد جاهزة للرد
    ملاحظة: وقد تم تحسين التعبير بروتين الخلية الحرة في هذا النظام باستخدام ناقلات تعبير البروتينات الفلورية الخضراء (بروتينات فلورية خضراء) المجلد سوبر T7-pJL1-سفجفب (جدول المواد). من المستحسن استخدام هذا بلازميد كعنصر تحكم لكفاءة رد فعل الخلية الحرة والعمود الفقري pJL1 للاستنساخ والتعبير عن تسلسل البروتين الأخرى. يمكن استخدام قوالب الحمض النووي بلازميد الأخرى؛ ومع ذلك، من المهم ملاحظة أن النسخ يتم التحكم بتسلسل منظم T7 ووجود بوليميريز الحمض النووي الريبي T7. يرد أدناه وصف بروتوكول بسيط للإنتاج الواسع النطاق لأي قالب بلازميد الحمض النووي من تحول كولاي .
    1. تنقية الموجه المطلوب باستخدام مجموعة تنقية بلازميد وفقا لتعليمات الشركة المصنعة (جدول المواد).
      ملاحظة: التركيز بلازميد الدنا القالب قدر الإمكان ينصح لمواجهة قيود حجم ضيق من رد فعل الخلية الحرة. وبصفة عامة، تهدف لأسهم عامل 750−1500 نانوغرام/ميكروليتر.
  5. إنتاج قالب مرناً جاهزة للرد
    ملاحظة: هذا المقطع اختياري. تم اختبار تعبير البروتين باستخدام قالب مرناً تولدها بوليميريز الحمض النووي الريبي T7 المدرجة في القائمة (جدول المواد) من النسخ في المختبر من بلازميد T7-pJL1-سفجفب.
    1. إعداد قالب مرناً من بلازميد الحمض النووي ترميز بروتين اهتمام باستخدام مكونات رد النسخ في المختبر في الجدول 3. احتضان ردود الفعل ح 1 في 37 درجة مئوية في ثيرموسيكلير.
      ملاحظة: من المستحسن لأداء 8−10x من ردود الفعل هذه بالتوازي لتوليد ما يكفي من المواد.
    2. تجمع جميع النسخ من ردود الفعل. تنقية باستخدام مجموعة مواد تنقية ومركزات مرناً وفقا لتعليمات الشركة المصنعة (جدول المواد). الوت قالب مرناً في الماء المعقم دي. تخزين القالب مرناً في-80 درجة مئوية حتى الاستخدام.

4-أداء خالية من الخلية البروتين يكسبريشن باستخدام ردود الفعل ضد ناتريجينس "الخام استخراج"

  1. التعبير بروتين الخلية الحرة باستخدام بلازميد أو قالب الدنا الخطي
    1. إزالة 10 × مزيج الطاقة الحل الرئيسي و 4 × مختبرين الرئيسي مزيج من الأحماض الأمينية من الثلاجة-80 درجة مئوية، ذوبان الجليد في RT، ووضع على الجليد. إزالة بوليميريز الحمض النووي الريبي T7 والأرصدة المانع رناسي من الثلاجة-20 درجة مئوية ووضعه على الجليد. ذوبان الجليد قالب الحمض النووي في الرايت والمكان على الجليد.
    2. إعداد مزيج رئيسي رد فعل الخلية الحرة وفقا الجدول 4 بإضافة كل عنصر في الترتيب التالي لأنبوب 2 مل على الجليد: مزيج من الأحماض الأمينية الرئيسية ومزيج الطاقة الحل الرئيسي، غلوتامات مغ، كغلوتامات، قالب الحمض النووي، شماعة-8000، بوليميراز الرنا T7 ورناسي مثبط. بلطف نفض الغبار الأنبوب بعد كل إضافة إلى مزيج الرئيسي.
      ملاحظة: إذا كان قالب الخطي لاستخدامها للتعبير بروتين الخلية الحرة، إضافة 5−10x ينتج المزيد من المواد بالمقارنة مع بلازميد قالب للحصول على القيمة من البروتين.
    3. إزالة V. ناتريجينس الخام خلية ليستي أعدت في خطوة 2.12 من مجمدات-80 درجة مئوية ومكان على الجليد لدقيقة 10−20 حتى مذاب. إضافة حجم مناسب خلية النفط الخام استخراج إلى مزيج الرئيسي رد فعل الخلية الحرة وفقا الجدول 4 وتخلط بلطف بالتحريك أو بيبيتينج صعودا وهبوطاً.
    4. نقطة النهاية بروتين الخلية الحرة التعبير باستخدام ثيرموسيكلير
      1. "الماصة؛" 10 ميكروليتر مزيج الرئيسي رد فعل الخلية الحرة على الجزء السفلي من لوحة بكر 96-أو 384 جيدا. في ما بين كل نقل للوحة بكر، مزيج مزيج الرئيسي خلال يسددها الأنبوب بلطف.
        ملاحظة: وينبغي أن تكون مختلطة ميكس الرئيسية الخلية الحرة رد فعل جيدا في جميع الأوقات إمكانية تكرار نتائج رد الفعل والتعبير بروتين الخلية الحرة في جميع العينات إلى أقصى حد.
    5. بإيجاز الطرد المركزي اللوحة في 1,000 س ز ل 10 ق لتجميع أي مزيج الرئيسية التي قد تصبح عالقاً في الجانبين من الآبار. ختم الآبار بمادة لاصقة لوحة منع التبخر ومن ثم ضع لوحة بكر في ثيرموسيكلير تعيين في 26 درجة مئوية مع غطاء دافئ في 105 درجة مئوية.
      ملاحظة: حتى توزيع الحرارة وغطاء ساخن ثيرموسيكلير يحسن إلى حد كبير غلة التعبير البروتين.
    6. احتضان ردود فعل الخلية الحرة للحد أدنى من ح 3. بعد الحضانة، أعرب البروتينات يمكن تنقية، كمياً، وتستخدم لعمليات المصب.
      ملاحظة: يمكن قياس البروتينات أعرب مباشرة في رد فعل الخلية الحرة باستخدام أسلوب لاختيار المستخدم. على سبيل المثال، البروتينات الفلورية يمكن قياسها كمياً باستخدام منحنى قياسي خارجية أو يمكن قياس النشاط الإشعاعي في حالة استخدام الأحماض الأمينية راديولابيليد في رد فعل الخلية الحرة. مطيافية الأشعة فوق البنفسجية-المرئية أو فحوصات البروتين الكلي عموما لا ينصح لقياس إنتاج البروتين في الخلية الحرة ردود الفعل دون تنقية أولية شكل مباشر.
    7. وبدلاً من ذلك، رصد حركية التعبير بروتين الخلية الحرة باستخدام قارئ لوحة.
      1. "الماصة؛" 10 ميكروليتر من مزيج رد فعل الخلية الحرة الرئيسية للجزء السفلي من لوحة سوداء بالانزيم 384-جيدا مع الزجاج الشفاف القيعان. تبقى لوحة الفحص على الجليد، أو العمل في غرفة باردة أثناء إضافة مزيج الرئيسي لضمان الحصول على الشخصية الحركية الكاملة. ختم الآبار بمادة لاصقة لوحة واضحة منع التبخر ومن ثم ضع لوحة الفحص في قارئ لوحة في 26 درجة مئوية.
    8. احتضان ردود فعل الخلية الحرة ل 3−6 ح بينما رصد الأطوال الموجية الانبعاثات الإثارة الفلورسنت المناسبة المطابقة للبروتين المعرب عنها. على سبيل المثال، رصد في Ex/م = 485 نانومتر nm/528 سفجفب.
  2. التعبير بروتين الخلية الحرة باستخدام قالب مرناً
    1. ذوبان الجليد قالب مرناً إعدادها في الخطوة 3.5.2 RT والمكان على الجليد.
    2. نفذ الخطوة 4.1.1 من خلال الخطوة 4.1.6 كما سبق تحديده للخطية أو بلازميد الدنا القالب باستخدام الجدول 4 لإعداد مزيج رد بديلة خالية من الخلية رئيسية لقالب مرناً.

5-معايرة من ردود الفعل ضد ناتريجينس الخلية الحرة مع سفجفب

ملاحظة: هذا المقطع اختياري. تركيز أيون الرد الأمثل الخلية الحرة يمكن أن تختلف بشكل طفيف لكل إعداد استخراج النفط الخام على أساس الشروط المستخدمة لتحلل الخلية. النظر في تنفيذ بروتوكول المعايرة أيون اختيارية رد فعل الخلية الحرة الموصوفة أدناه باستخدام سفجفب إذا كانت غلة رد الفعل أقل بكثير مما كان متوقعا (تركيزات < 1.0 ميكروغرام/مل).

  1. إعداد Mg2 + وحلول المعايرة أيون K+ كما هو محدد في الجدول 5 في الماء المعقم دي من 100 ملغ-الغلوتامات و 2,000 ملم الأرصدة غلوتامات ك إعدادها في الخطوة 3.1.1. وضع حلول المعايرة على الجليد حتى حاجة.
  2. وبعد معايرة الخريطة الواردة في الجدول 6، "الماصة؛" ميكروليتر 1 ملغ-الغلوتامات وميكروليتر 2 كغلوتامات أيون المعايرة الحلول في الآبار المناسبة في لوحة بكر 384-جيدا.
    1. ترتيب عمليات من هذه الخطوة كما يلي: ماصة ملغ-الغلوتامات أيون المعايرة الحل في الجزء السفلي من كل جيدا متبوعاً بمحلول المعايرة أيون غلوتامات ك على الجانب من البئر دون لمس السائل الموجودة بالفعل في الآبار.
    2. ختم الآبار عن طريق وضع لاصق أعلى لوحة لمنع التبخر أثناء إعداد مزيج الرئيسي رد فعل الخلية الحرة المعايرة. اضغط برفق لوحة 384-جيدا لخلط الحلول المعايرة غلوتامات ملغ و K.
      ملاحظة: ماصة مكرر ينصح بشدة لإكمال هذه الخطوة، وتكاثر بسرعة.
  3. إعداد رد فعل الخلية الحرة معايرة مزيج الرئيسي كما هو محدد في الجدول 5 باستخدام قالب الحمض النووي بلازميد T7-pJL1-سفجفب في أنبوب 2 مل. إضافة كل المكونات بالترتيب التالي إلى مزيج الرئيسي: مزيج من الأحماض الأمينية الرئيسية ومزيج الطاقة الحل الرئيسي وقالب الحمض النووي T7-pJL1-سفجفب، شماعة-8000، بوليميراز الرنا T7 ومثبط رناسي. نفض الغبار على أنبوب للمزيج بعد كل إضافة مكون بلطف.
    ملاحظة: لا تقم بإضافة Mg2 + أو ك+ للمعايرة مزيج الرئيسي خالية من الخلية.
  4. إزالة اللاصق من اللوحة. بدقة "الماصة؛" 7 ميكروليتر من رد فعل الخلية الحرة معايرة مزيج الرئيسي إلى الجانبين من الآبار دون لمس الحل معايرة أيون المختلطة موجودة بالفعل في الآبار. ختم الآبار بمادة لاصقة واضغط برفق لوحة بكر 384-جيدا لخلط المزيج خالية من الخلية الرئيسية مع الحل معايرة أيون.
    ملاحظة: ماصة مكرر ينصح بشدة لإكمال هذه الخطوة، وتكاثر بسرعة.
  5. باختصار الطرد المركزي العاشر 1,000 لوحة ز ل 10 s لتجمع أي سائل غير مخلوط التي قد تصبح عالقاً في الجانبين من الآبار. ضع لوحة 384-جيدا في ثيرموسيكلير تعيين في 26 درجة مئوية مع غطاء دافئ في 105 درجة مئوية.
  6. احتضان ردود فعل الخلية الحرة ح 3. بعد الحضانة، نقل محتويات كل بئر لوح أسود بالانزيم 384-جيدا مع قيعان الزجاج مع ماصة متعدد القنوات وقراءة الأسفار سفجفب في Ex/م = 485 نانومتر nm/528 استخدام قارئ لوحة لتحديد تركيبة تركيز أيون التي تعطي أكبر قدر من البروتين.

Representative Results

يمكن تنفيذها في بروتوكول وصف لإنتاج البروتين باستخدام V. ناتريجينس التعبير خالية من خلية النظام في أيام 1−2 بواسطة مستخدم واحد، بدءاً من التطعيم للثقافة للبروتين المتوفرة لتطبيقات المتلقين للمعلومات. إعداد مقتطفات خلية النفط الخام ومخزونات ميكس الرئيسية تشمل جزءا كبيرا من هذا الوقت؛ ومع ذلك، وبمجرد إعداد، معظم معظم الكواشف يمكن تخزين طويل الأجل (الجدول 7)، وتستخدم حسب الحاجة، تقصير الوقت المطلوبة لإكمال البروتوكول.

يستخدم تعبير النظام المذكور مع بلازميد الدنا القالب أو مرناً المتولدة عن التفاعلات النسخ في المختبر. وفي حين يمكن أيضا استخدام الحمض النووي الخطية كقالب لإنتاج البروتين، غلة المبلغ أقل بكثير من البروتين. على سبيل المثال، في الظروف المثلى من ردود الفعل في 26 °C، رد فعل خالية من خلية واحدة 10 ميكروليتر يمكن أن تنتج > 260 ميكروغرام/مل من سفجفب في 3 ساعات استخدام pmol 0.3 بلازميد الدنا القالب أو قابلة لمقارنة > 125 ميكروغرام/مل من سفجفب باستخدام بمول 14 من محضر مرناً (الشكل 5A ، ب). بيد pmol 0.3 الخطي الحمض النووي سوف تنتج البروتين أقل بكثير (< 20 ميكروغرام/مل). لكل نوع من أنواع قالب، سيتم إنتاج غالبية البروتين داخل ح 1−1.5؛ ومع ذلك، فمن المستحسن أن رد الفعل هو تشغيل لمدة 3 ساعات على الأقل. تم تحديد تركيزات رد فعل الخلية خالية من سفجفب عبر الانحدار الخطي باستخدام منحنى قياسي سفجفب المنقي قياس fluorescence في Ex/م = 485 نانومتر nm/528.

عائد إنتاج البروتين يتأثر إلى حد كبير بتركيز أيونات البوتاسيوم والمغنيسيوم (ك+ و Mg2 +، على التوالي). عثر تحت ظروف محسنة، بملغ الأمثل2 + وتركيزات أيون K+ أن 3.5 ملم و 80 ملم، على التوالي (الشكل 6 أ، ب). قد يؤدي انخفاض قدرة لنظام التعبير خالية من الخلية لإنتاج البروتين مع غلة ملموس الانحرافات عن تركيزات أيون الأمثل. معايرة إضافية قد تكون ضرورية إذا كانت غلة رد الفعل أقل بكثير مما كان متوقعا. بروتوكول اختياري لمعايرة أيون يرد في القسم 5. وهذا يسمح لبعض المرونة في التعويض عن تقلب استخراج النفط الخام خلية المتكبدة من معدات تحلل الخلية الفردية والظروف.

Figure 1
رقم 1: عرض عن قرب لحامل الكأس وأنبوب على منصة sonication. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
رقم 2: استخراج الإعداد معدات Sonication تحضيرا لخلية النفط الخام- الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3: وجهة نظر من بيليه بعد sonication والطرد المركزي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 4
الشكل 4: فلاش تجميد لتخزين استخراج. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 5
الشكل 5: نتائج الممثل تخليق البروتين خالية من خلية ف. ناتريجينس باستخدام أنواع مختلفة من القوالب. (أ) مقايسة نقطة النهاية لإنتاج سفجفب استخدام تركيزات اكويمولار بلازميد وخطي قالب الحمض النووي (0.3 بمول)، فضلا عن زيادة تركيزات قالب مرناً. تركيز سفجفب الخلية الحرة مصممة باستخدام منحنى قياسي لتنقية سفجفب المقاسة في Ex/م = 485 نانومتر nm/528 بعد 180 دقيقة حضانة عند 26 درجة مئوية في ظروف الرد الأمثل في 10 ميكروليتر مجلدات. (ب) تحليل الحركية من إنتاج سفجفب استخدام تركيزات اكويمولار بلازميد وخطي الدنا القالب، فضلا عن زيادة تركيزات قالب مرناً. أخذ القياسات سفجفب كل 3 دقائق في Ex/م = 485 نانومتر nm/528 أكثر من 180 دقيقة وقت الحضانة مجموع الشروط الرد الأمثل في 10 ميكروليتر مجلدات. لكل من نقطة النهاية وفحوصات الحركية، كانت عينات فارغة تصحيح باستخدام ردود الفعل الخلية الحرة وتستكمل مع كافة المكونات باستثناء القالب. ويرد يعني والانحرافات المعيارية (n = 3). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 6
رقم 6: نتائج ممثلة لمعايرة تركيز أيون- (أ) كانت تستكمل مع زيادة تركيزات Mg2 + V. ناتريجينس الخلية الحرة ردود الفعل والمحتضنة في 26 درجة مئوية لمدة 180 دقيقة في 10 ميكروليتر ردود. وكان تركيز ك+ إجمالي 160 مم لكل Mg2 + تركيزات. تركيز سفجفب الخلية الحرة مصممة باستخدام منحنى قياسي لتنقية سفجفب المقاسة في Ex/م = 485 نانومتر nm/528. (ب) كانت تستكمل مع زيادة تركيزات ك+ V. ناتريجينس الخلية الحرة ردود الفعل والمحتضنة في 26 درجة مئوية لمدة 180 دقيقة في 10 ميكروليتر ردود. وكان تركيز مجموع ملغ2 + 3.5 مم لجميع التركيزات ك+ . لكل التحديدات، كانت عينات فارغة تصحيح باستخدام ردود الفعل الخلية الحرة وتستكمل مع كافة المكونات باستثناء القالب. ويرد يعني والانحرافات المعيارية (n = 3). وقد تم تعديل هذا الرقم من ويجاند et al.9. طبع بإذن من فيغاند، دي جي، ولي، سمو، أوستروف، أ.، الكنيسة، وجنرال موتورز وضع ناتريجينس الضمة خالية من خلية "النظام التعبير". البيولوجيا التركيبية ACS. 7 (10)، 2475−2479 (2018). حقوق الطبع والنشر عام 2018 الجمعية الأمريكية الكيميائية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الجدول 1 إعداد وسائط النمو البكتيرية رطل-V2
المكون الكمية (ز) التركيز النهائي (مم) الحجم النهائي (L)
مرق رطل (ميلر) 25 1
كلوريد الصوديوم 11.69 200
مجكل2 2.20 23.1
الماليزية 0.31 4.2
الجدول 1 إعداد المخزن المؤقت لتحلل S30A
المكون الكمية (ز) التركيز النهائي (مم) الحجم النهائي (L)
تريس الحل (pH 8.0)-1 م (mL) * 25 50 0.5
غلوتامات ملغ 2.72 14
كغلوتامات 6.10 60
ديثيوثريتول (DTT)-1 م (mL) * 1 2

الجدول 1: المواد الكاشفة لإعداد 1 لتر وسائط النمو البكتيرية رطل-V2 و 0.5 لتر من المخزن المؤقت لتحلل الخلية S30A. اضغط هنا لتحميل هذا الملف في Excel- 

إعداد 10 × مزيج الطاقة الحل الرئيسي
المكون تركز الأسهم (مم) التركيز النهائي (مم) الكمية (ميليلتر) الحجم النهائي (ميليلتر)
هيبيس-كوه pH 8 1750 500 1428.57 5000
ATP 100 15 750.00
أنشئ 100 15 750.00
الأداء النظري المركب 100 9 450.00
UTP 100 9 450.00
الحمض الريبي النووي النقال من كولاي مخاطر 600 (mg/mL) * 100 2 100.00
هيدرات إنزيم 200 2.6 65.00
NAD 200 3.3 82.50
مخيم 650 7.5 57.69
حامض فولينيك 100 0.7 35.00
سبيرمدين 1600 10 31.25
3-الشبكة 2000 300 750.00
تعقيم المياه. 49.99
إعداد 4 x ميكس ماجستير من الأحماض الأمينية
المكون تركز الأسهم (مم) التركيز النهائي (مم) الكمية (ميليلتر) الحجم النهائي (ميليلتر)
علاء 168 8 114.3 2400
الأرجنتين 168 8 114.3
ASN 168 8 114.3
آسيا والمحيط الهادئ 168 8 114.3
جلن 168 8 114.3
غلو 168 8 114.3
الغليسين 168 8 114.3
وقال 168 8 114.3
IIE 168 8 114.3
LYS 168 8 114.3
واجتمع 168 8 114.3
PHE 168 8 114.3
برو 168 8 114.3
SER 168 8 114.3
THR 168 8 114.3
فال 168 8 114.3
الحزب الراديكالي عبر الوطني 168 8 114.3
صور. 168 8 114.3
لوي 140 8 137.1
CYS 168 8 114.3
تعقيم المياه. 91.4

الجدول 2: ماجستير الكواشف لإعداد 5 مل 10 × حل الطاقة ميكس ومل 2.4 من 4 × مزيج من الأحماض الأمينية الأساسية-    اضغط هنا لتحميل هذا الملف في Excel-

T7 رنا بوليميراز في المختبر النسخ ردود الفعل
المكون الأوراق المالية (مم) التركيز النهائي (مم) الكمية (ميليلتر) 1 x رد الكمية (ميليلتر) 50 x ردود الفعل
10 × رنابول رد فعل المخزن المؤقت 1.00 50
ATP 100 0.5 0.10 5
أنشئ 100 0.5 0.10 5
الأداء النظري المركب 100 0.5 0.10 5
UTP 100 0.5 0.10 5
قالب الحمض النووي (نانوغرام/ميليلتر) * 1000 500 0.50 25
T7 رنا بوليميراز 200 2.6 2.00 100
رناسي المانع، الفاري 200 3.3 0.50 25
تعقيم المياه. 15.60 780
حجم رد الفعل (ميليلتر): 20

الجدول 3: مكونات النسخ في المختبر لتوليد مرناً.    اضغط هنا لتحميل هذا الملف في Excel-

ميكس ماجستير رد فعل الخلية الحرة
المكون تركز الأسهم (مم) التركيز النهائي (مم) الكمية (ميليلتر) 1 x رد الكمية (ميليلتر) 50 x ردود الفعل
استخراج (%) * 25 2.50 125.00
غلوتامات ملغ 100 3.5 0.35 17.50
كغلوتامات 2000 80 0.40 20.00
4 x ميكس ماجستير من الأحماض الأمينية 8.0 2 2.50 125.00
10 × مزيج الطاقة الحل الرئيسي 1.00 50.00
بلازميد الحمض النووي (نانوغرام/ميليلتر) * 1000 500 0.50 25.00
50% شماعة-8000 (%) * 50 2 0.40 20.00
T7 رنا بوليميراز 1.00 50.00
رناسي المانع، الفاري 0.10 5.00
تعقيم المياه. 1.25 62.50
حجم رد الفعل (ميليلتر): 10
ميكس ماجستير رد فعل الخلية الحرة البديلة لقالب مرناً
المكون تركز الأسهم (مم) التركيز النهائي (مم) الكمية (ميليلتر) 1 x رد الكمية (ميليلتر) 50 x ردود الفعل
استخراج (%) * 25 2.50 125.00
غلوتامات ملغ 100 3.5 0.35 17.50
كغلوتامات 2000 80 0.40 20.00
4 x ميكس ماجستير من الأحماض الأمينية 8.0 2 2.50 125.00
10 × مزيج الطاقة الحل الرئيسي 1.00 50.00
قالب مرناً (نانوغرام/ميليلتر) * 2000 4000 2.00 100.00
50% شماعة-8000 (%) * 50 2 0.40 20.00
رناسي المانع، الفاري 0.10 5.00
تعقيم المياه. 0.75 37.50
حجم رد الفعل (ميليلتر): 10

الجدول 4: مكونات الأمثل ف ناتريجينس الخلية خالية من رد فعل مزيج الرئيسي لقالب الحمض النووي وقالب مرناً.    اضغط هنا لتحميل هذا الملف في Excel-

مغ 2 + معايرة الكمية (ميليلتر) 1 x رد الكمية (ميليلتر) 1 x رد الكمية (ميليلتر) 100 x ردود الفعل الكمية (ميليلتر) 100 x ردود الفعل
النهائي (مم) الأوراق المالية مم 100 ملغ-غلو diH 2 0 مم 100 ملغ-غلو منزوع ح2س
2.5 0 0.00 1.00 0 100
3.5 1 0.10 0.90 10 90
4.5 2 0.20 0.80 20 80
5.5 3 0.30 0.70 30 70
حجم رد الفعل (ميليلتر): 10
ك + معايرة الكمية (ميليلتر) 1 x رد الكمية (ميليلتر) 1 x رد الكمية (ميليلتر) 100 x ردود الفعل الكمية (ميليلتر) 100 x ردود الفعل
النهائي (مم) الأوراق المالية كغلو 2000 مم diH 2 0 كغلو 2000 مم منزوع ح2س
40 30 0.15 1.85 12 148
80 70 0.35 1.65 28 132
160 150 0.75 1.25 60 100
320 310 1.55 0.45 124 36
حجم رد الفعل (ميليلتر): 10
ميكس ماجستير رد فعل أيون المعايرة الخلية الحرة
المكون تركز الأسهم (مم) التركيز النهائي (مم) الكمية (ميليلتر) 1 x رد الكمية (ميليلتر) 50 x ردود الفعل
استخراج (%) * 25 2.50 125.00
غلوتامات ملغ متغير متغير 1.00 50.00
كغلوتامات متغير متغير 2.00 100.00
4 x ميكس ماجستير من الأحماض الأمينية 8.0 2 2.50 125.00
10 × مزيج الطاقة الحل الرئيسي 1.00 50.00
بلازميد الحمض النووي (نانوغرام/ميليلتر) * 1000 250 0.25 12.50
50% شماعة-8000 (%) * 50 2 0.40 20.00
T7 رنا بوليميراز 1.00 50.00
رناسي المانع، الفاري 0.10 5.00
تعقيم المياه. 0.00 0.00
حجم رد الفعل (ميليلتر): 10

الجدول 5: معايرة تركيز أيون يمزج الرئيسي-    اضغط هنا لتحميل هذا الملف في Excel-

خريطة المعايرة أيون CF 40 مم ك+ 80 مم ك+ 160 مم ك+ 320 مم ك+
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
2.5 مم Mg2 + A
3.5 مم Mg2 + ب
4.5 مم Mg2 + ج
مم 5.5 ملغ2 + د

الجدول 6: أيون معايرة الخريطة.    اضغط هنا لتحميل هذا الملف في Excel-

ظروف التخزين وحياة الرف من عناصر قوات التحالف
المكون موقع التخزين مدة الصلاحية
وسائط النمو العقيمة رطل-V2 4 درجة مئوية 3-6 أشهر
خامسا-ناتريجينس "الخام الخلية استخراج" --80 درجة مئوية 1-3 أسابيع
مم 100 ملغ-غلوتامات درجة الحرارة في الغرفة 6 أشهر
كغلوتامات 2000 مم درجة الحرارة في الغرفة 6 أشهر
ربط 50 في المائة--8000 درجة الحرارة في الغرفة 6 أشهر
10 × مزيج الطاقة الحل الرئيسي --80 درجة مئوية 3-6 أشهر
4 x ميكس ماجستير من الأحماض الأمينية --80 درجة مئوية 3-6 أشهر
قالب الحمض النووي بلازميد/الخطي -20 درجة مئوية 6-12 شهرا
مرناً القالب --80 درجة مئوية 3-4 أسابيع

الجدول 7: ظروف التخزين خالية من الخلية وحياة الرف.    اضغط هنا لتحميل هذا الملف في Excel-

Discussion

وقد تم تحسين هذا البروتوكول البرية من نوع ف. ناتريجينس ووسائط النمو البكتيرية التي تتألف من رطل وتستكمل مع أملاح V2 (جدول المواد). يمكن استزراع سلالات أخرى من ف. ناتريجينس وبالمثل لتوليد مقتطفات خلية النفط الخام لتفاعلات الخلية الحرة؛ ومع ذلك، يتطلب استخدامها التحسين إضافية من هذا البروتوكول. بالإضافة إلى ذلك، تم تحسين هذا النظام التعبير بروتين الخلية الحرة باستخدام حمض 3-فوسفوجليسيريك (3-الشبكة) كمصدر للطاقة الأولية للتجديد. يمكن استخدام مصادر أخرى لتجديد الطاقة؛ ولكن الأمثل من الكواشف والمعايرة سيكون على الأرجح الحصول على تعبير البروتينات ذات العوائد العالية10،11.

إيلاء اهتمام خاص للعديد من الخطوات الهامة في هذا البروتوكول سوف ضمان استخراج أقصى إنتاجية عالية الغلة الخلية خالية من إنتاج البروتين. أولاً، يجب أن يكون مستعدا استخراج النفط الخام خلية من الثقافات الخلية V. ناتريجينس تحصد في مرحلة منتصف المتسارع النمو؛ البروتين الغلة القصوى عندما الثقافات تصل OD600 = 1.0 ± 0.2. بينما من الممكن إنتاج بروتين الخلية خالية من الخلايا التي تحصد في طائفة من الكثافة البصرية، وجدنا سابقا أن تحصد في حالة أسي لنمو الخلايا تسفر عن أكثر بكثير البروتين9. لوحظت آثار الكثافة البصرية على أداء استخراج النفط الخام خلية تتسق مع تلك التي أبلغ عنها لنظم التعبير خالية من الخلايا الأخرى المستمدة من الخلايا التي نمت في ظروف ثقافة المجموعة1. لأنه ضد ناتريجينس ينمو بمعدل سريع، من المهم أن ترصد عن كثب الكثافة البصرية للثقافات. وبصفة عامة، يتوقع أن V. ناتريجينس الثقافات ينبغي أن يصل تكاثر التطوير التنظيمي600 1.0 داخل ح 1−1.5 استخدام هذا البروتوكول؛ ومع ذلك، حير ظروف نمو الفردية مثل الاستخدام مقابل قوارير غير حيرة، الذي يؤثر على التهوية، أو الهواء مقابل حضانة المياه، مما يؤثر على معدل واستقرار درجة حرارة الحضانة، قد يغير وقت النمو. وعلاوة على ذلك، من المستحسن عموما مالا يقل عن 250 مل من ف. ناتريجينس في قارورة حيرة ل 1 التأكد من بيليه خلية كبيرة في موسم الحصاد للتلاعب بسهولة ونقل الثقافة. وهذا يحسن إلى حد كبير نجاح إعداد استخراج النفط الخام من الخلية، فضلا عن زيادة الحجم الإجمالي لاستخراج تنتج من بيليه. عند استخدام إعداد مقياس أصغر، ظروف الثقافة والكاشفات يمكن تعديلها على النحو المناسب. للاختمار الواسعة النطاق، مواصلة تحسين ظروف الثقافة قد يكون مطلوباً. وأخيراً، لضمان محصول عالي البروتين، من الأهمية بمكان أن الكريات الخلية تتم معالجتها فورا بعد الحصاد، أو في غضون أيام 1−2 تخزين في-80 درجة مئوية.

تحلل السليم بيليه الخلية بنبض سونيكيشن أمر حاسم لنجاح التعبير بروتين الخلية الحرة وغالباً ما الجانب الأكثر صعوبة في هذا البروتوكول للمستخدمين الجدد. عادة، سوف تسفر عن بيليه جيدا حجم كبير لاستخراج السائل خالية من الحطام. الاستخراج ينبغي أن يكون لزج قليلاً ولكن يمكن بيبيتيد بسهولة عندما اليقوتينج إلى مخزن أنابيب قبل فلاش التجميد في النيتروجين السائل. يصور الشكل 3 تمثيل بيليه جيدا (الشكل 3A) بالمقارنة بيليه سيئة (الشكل 3B) بعد الخطوة الطرد المركزي تحلل الوظيفة. مؤشرا رئيسيا لتحلل الخلية كاملة استخراج خلية النفط خام مجموع البروتين تركيز > 20 ملغ/مل كما يحددها مقايسة بروتين الكلي (الخطوة 2، 13). Sonication الإفراط أو التسخين المفرط لاستخراج النفط الخام خلية سيضر في جهاز الهاتف الخلوي، الذي لا يمكن تحديده دون القيام برد فعل الخلية الحرة. هكذا، فإنه مفيد للغاية لاختبار كفاءة استخراج بفعل تحكم قبل تكريس قدر كبير من الوقت والجهد لتطبيقات التعبير البروتين المتلقين للمعلومات. بينما التحسين إضافية قد تكون ضرورية للمعدات مختلفة سونيكاتيون، قد نبض sonication الخطوات الموضحة عالية استنساخه في أيدينا.

استخدام قالب الحمض النووي الخطي المستمدة من PCR التضخيم أو هضم إنزيم التقييد، أو التوليف الجيني التجارية يمكن أن تزيد القدرة على إنتاج البروتين الفائق والسريع في نظم التعبير الخلية الحرة24. بينما أظهر إنتاج البروتين من القالب الخطي تضخيم بكر، العائد من ردود الفعل هذه السفلي 13.5-fold تقريبا مقارنة بردود فعل استخدام بلازميد الدنا القالب في نسب اكويمولار9. وهذا يرجع أساسا إلى عدم استقرار قالب الحمض النووي الخطية التي من المحتمل قد أفسدتها nucleases الذاتية موجودة في V. ناتريجينس استخراج النفط الخام من الخلية. بينما بالعاثية أمداً التجمع البروتين قد استخدمت سابقا لحماية "الحمض النووي الخطي" قالب24،25، تم العثور على مقتطفات غير متوافقة مع V. ناتريجينس 9. بالإضافة إلى ذلك، بينما قد تسمح زيادة تركيز خطي الدنا القالب لعائد العالي بروتين، تدهور سريع في استخراج النفط الخام من الخلية ستظل مشكلة رئيسية.

قد يكون حلاً للتغلب على تدهور قالب الدنا الخطي لتكملة ردود فعل الخلية خالية مع قالب مرناً المتولدة من النسخ في المختبر للحمض النووي الخطي. من ناحية أخرى، استخدام المانع رناسي يوفر حماية كبيرة ضد تدهور نسخة مرناً ويمكن الحصول على غلة البروتين ملموس في شكل رد فعل الخلية الحرة 10 ميكروليتر (الشكل 5 أ، ب). استنساخ الحمض النووي الخطي في قالب تعميم عن طريق ربط تا، استنساخ توبو، الجمعية البوابة الذهبية أو غيرها من الأساليب جزئ قد تستخدم للتحايل على تدهور القالب. ومع ذلك، كذلك النهج لتثبيط النشاط nuclease سيكون ضروريا للتعبير البروتين كفاءة استخدام خطي الدنا القالب.

وحتى الآن، اقترحت عدة نهج مختلفة لإعداد استخراج النفط الخام للبروتين الخلية الحرة التعبير9،10،،من1126. في وضع هذا البروتوكول، سعينا إلى تحقيق أقصى قدر من الوصول إلى المستخدم وتقليل التكلفة الإجمالية وتقليل الخطوات تستغرق وقتاً طويلاً. على سبيل المثال، غلة نسبة عالية من بروتين يتم تحقيقه باستخدام عملية الطرد المركزي سونيكيشن من خطوتين بسيطة، ولا تتطلب أجهزة المجانسة الخلية، خطوات الغسيل الكلوي مطولة أو رد فعل الجريان السطحي. أنها بسيطة لتنفيذه في فترة قصيرة من الزمن ولا تتطلب مستوى عاليا من الخبرة المعملية. وهكذا، يمكن أن يساعد تيسير التعبير خالية من الخلايا كمعيار للبحث الأكاديمي متعدية الجنسيات وتصميم العملية الصناعية.

يوسع هذا البروتوكول مجموعة الأدوات المتاحة للتحقيق وفائدة ف. ناتريجينس، أحد الكائنات غير النموذجي مع الخصائص البيولوجية الفريدة. العالي البروتين العائد يمكن أن يتحقق باستخدام نصف أو كامل-مستمر الخلية الحرة ردود الفعل، للسماح لتجديد الطاقة، المتسللة من الأحماض الأمينية، والتخلص من نفايات المنتجات3،5،27. وعلاوة على ذلك، الهندسة من البرية من نوع ف. ناتريجينس لإنتاج سلالات الدناز أو رناسي ناقصة، إزالة الأيضية ضارة والمتنافسة، وتعبير عن ترنس إضافية يمكن أن يعزز إنتاج البروتينات في هذا النظام،من2829. كما كشف البيولوجيا الكامنة وراء نموها السريع، مواصلة تطوير V. ناتريجينس نظم خالية من الخلية قد تسريع قدرات بيوبرودوكشن وتمكين التعبير قوية من الببتيدات العلاجية، والجزيئات الصغيرة، والاصطناعية المواد.

Disclosures

جو، ولا، وقد قدمت جي أم سي براءات اختراع المتصلة بهذا العمل.

Acknowledgments

تم تمويل هذا العمل من قبل المعهد الوطني للعلوم الطبية العامة 1U01GM110714-01 وإدارة الطاقة دي-FG02-02ER63445. الكتاب يود أن يشكر الدكتور ريتشارد كوهمان، والدكتور جيني تام، والدكتور إدغار جولوتش لنصائح مفيدة في بناء قسم البروتوكول في هذه المخطوطة.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
15 mL Tubes Corning 352196
2 mL Tubes Eppendorf 22363352
384-well Black Assay Plates Corning 3544
384-well PCR Plates Eppendorf 951020702
50 mL Tubes Corning 352070
96-well PCR Plates Eppendorf 30129300
Adenosine 3',5'-cyclic monophosphate sodium salt monohydrate Sigma A6885
Adenosine 5'-triphosphate - 100 mM NEB N0450L
Applied Biosystems Veriti 384-well Thermocycler ThermoFisher 4388444
Assay Plate Adhesives BioRad MSB1001
β-Nicotinamide adenine dinucleotide hydrate (NAD) Sigma/Roche 10127965001
Coenzyme A hydrate Sigma C4283
Cytidine 5'-triphosphate - 100 mM NEB N0450L
D-(-)-3-Phosphoglyceric acid disodium salt (3-PGA) Sigma P8877
Dewar Flask - 4L ThermoScientific 10-194-100C
DL-Dithiothreitol solution - 1 M Sigma 42816
Folinic acid calcium salt hydrate Sigma 47612
Glacial Acetic Acid Sigma A6283
Guanosine 5'-triphosphate - 100 mM NEB N0450L
HEPES Sigma H3375
L-Glutamic acid hemimagnesium salt tetrahydrate Sigma 49605
L-Glutamic acid potassium salt monohydrate Sigma G1149
LB Broth (Miller) Sigma L3522
Magnesium chloride (MgCl2) Sigma M8266
Plasmid pJL1-sfGFP Addgene 69496
Plasmid Plus Maxi kit Qiagen 12963
Poly(ethylene glycol) (PEG)-8000 Sigma 89510
Potassium chloride (KCl) Sigma P9333
Potassium hydroxide Pellets Sigma/Roche 1050121000
Q125 Sonicator and CL-18 probe with a ?-inch tip Qsonica 4422
RNA Clean and Concentrator Kit Zymo R1013
RNase Inhibitor, Murine NEB M0314
RTS Amino Acid Sampler Biotechrabbit BR1401801
Sodium chloride (NaCl) Sigma S7653
Spermidine Sigma S0266
T7 RNA Polymerase NEB M0251
Tris Solution (pH 8.0) - 1 M Invitrogen AM9856
tRNA from E. coli MRE 600 Sigma/Roche 10109541001
Uridine 5'-triphosphate - 100 mM NEB N0450L
Vibrio natriegens (Wild-type) Lyophilized Stock ATCC 14048

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kwon, Y. C., Jewett, M. C. High-throughput preparation methods of crude extract for robust cell-free protein synthesis. Scientific Reports. 5, 8663 (2015).
  2. Schoborg, J. A., et al. A cell-free platform for rapid synthesis and testing of active oligosaccharyltransferases. Biotechnology and Bioengineering. 115, (3), 739-750 (2018).
  3. Caschera, F., Noireaux, V. Synthesis of 2.3 mg/ml of protein with an all Escherichia coli cell-free transcription-translation system. Biochimie. 99, 162-168 (2014).
  4. Henrich, E., Hein, C., Dötsch, V., Bernhard, F. Membrane protein production in Escherichia coli cell-free lysates. FEBS Letters. 589, (15), 1713-1722 (2015).
  5. Li, J., Wang, H., Kwon, Y. C. Establishing a high yielding streptomyces‐based cell‐free protein synthesis system. Biotechnology and Bioengineering. 114, (6), 1343-1353 (2017).
  6. Moore, S. J., Lai, H. E., Needham, H., Polizzi, K. M., Freemont, P. S. Streptomyces venezuelae TX-TL--a next generation cell-free synthetic biology tool. Biotechnology Journal. 12, (4), 1600678 (2017).
  7. Wang, H., Li, J., Jewett, M. C. Development of a Pseudomonas putida cell-free protein synthesis platform for rapid screening of gene regulatory elements. Synthetic Biology. 3, (1), ysy003 (2018).
  8. Kelwick, R., Webb, A. J., MacDonald, J. T., Freemont, P. S. Development of a Bacillus subtilis cell-free transcription-translation system for prototyping regulatory elements. Metabolic Engineering. 38, 370-381 (2016).
  9. Wiegand, D. J., Lee, H. H., Ostrov, N., Church, G. M. Establishing a Cell-Free Vibrio natriegens Expression System. ACS Synthetic Biology. 7, (10), 2475-2479 (2018).
  10. Des Soye, B. J., Davidson, S. R., Weinstock, M. T., Gibson, D. G., Jewett, M. C. Establishing a High-Yielding Cell-Free Protein Synthesis Platform Derived from Vibrio natriegens. ACS Synthetic Biology. 7, (9), 2245-2255 (2018).
  11. Failmezger, J., Scholz, S., Blombach, B., Siemann-Herzberg, M. Cell-Free Protein Synthesis From Fast-Growing Vibrio natriegens. Frontiers in Microbiology. 9, 1146 (2018).
  12. Moore, S. J., MacDonald, J. T., Wienecke, S. Rapid acquisition and model-based analysis of cell-free transcription-translation reactions from nonmodel bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115, (19), E4340-E4349 (2018).
  13. Eagon, R. G. Pseudomonas natriegens, a marine bacterium with a generation time of less than 10 minutes. Journal of Bacteriology. 83, 736-737 (1962).
  14. Weinstock, M. T., Hesek, E. D., Wilson, C. M., Gibson, D. G. Vibrio natriegens as a fast-growing host for molecular biology. Nature Methods. 13, (10), 849-851 (2016).
  15. Lee, H. H., et al. Vibrio natriegens, a new genomic powerhouse. bioRxiv. 058487 (2016).
  16. Lee, H. H., Ostrov, N., Gold, M. A., Church, G. M. Recombineering in Vibrio natriegens. bioRxiv. 130088 (2017).
  17. Schleicher, L., et al. Vibrio natriegens as Host for Expression of Multisubunit Membrane Protein Complexes. Frontiers in Microbiology. 9, 2537 (2018).
  18. Fernández-Llamosas, H., Castro, L., Blázquez, M. L., Díaz, E., Carmona, M. Speeding up bioproduction of selenium nanoparticles by using Vibrio natriegens as microbial factory. Scientific Reports. 7, (1), 16046 (2017).
  19. Aiyar, S. E., Gaal, T., Gourse, R. L. rRNA promoter activity in the fast-growing bacterium Vibrio natriegens. Journal of Bacteriology. 184, (5), 1349-1358 (2002).
  20. Hoffart, E., et al. High substrate uptake rates empower Vibrio natriegens as production host for industrial biotechnology. Applied and Environmental Microbiology. 83, e01614-e01617 (2017).
  21. Long, C. P., Gonzalez, J. E., Cipolla, R. M., Antoniewicz, M. R. Metabolism of the fast-growing bacterium Vibrio natriegens elucidated by 13C metabolic flux analysis. Metabolic Engineering. 44, 191-197 (2017).
  22. Shin, J., Noireaux, V. Efficient cell-free expression with the endogenous E. Coli RNA polymerase and sigma factor 70. Journal of Biological Engineering. 4, 8 (2010).
  23. Sitaraman, K., et al. A novel cell-free protein synthesis system. Journal of Biotechnology. 110, (3), 257-263 (2004).
  24. Sun, Z. Z., Yeung, E., Hayes, C. A., Noireaux, V., Murray, R. M. Linear DNA for rapid prototyping of synthetic biological circuits in an Escherichia coli based TX-TL cell-free system. ACS Synthetic Biology. 3, (6), 387-397 (2014).
  25. Seki, E., Matsuda, N., Yokoyama, S., Kigawa, T. Cell-free protein synthesis system from Escherichia coli cells cultured at decreased temperatures improves productivity by decreasing DNA template degradation. Analytical Biochemistry. 377, (2), 156-161 (2008).
  26. Failmezger, J., Rauter, M., Nitschel, R., Kraml, M., Siemann-Herzberg, M. Cell-free protein synthesis from non-growing, stressed Escherichia coli. Scientific Reports. 7, (1), 16524 (2017).
  27. Shirokov, V. A., Simonenko, P. N., Biryukov, S. V., Spirin, A. S. Continuous-Flow and Continuous-Exchange Cell-Free Translation Systems and Reactors. Cell-Free Translation Systems. 91-107 (2002).
  28. Michel-Reydellet, N., Woodrow, K., Swartz, J. Increasing PCR fragment stability and protein yields in a cell-free system with genetically modified Escherichia coli extracts. Journal of Molecular Microbiology and Biotechnology. 9, (1), 26-34 (2005).
  29. Swartz, J. R. Expanding biological applications using cell-free metabolic engineering: An overview. Metabolic Engineering. 50, 156-172 (2018).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics