Ein In Vivo Östrogen-Mangel-Maus-Modell zum Screening exogener Östrogen-Behandlungen von Kardiovaskulärer Dysfunktion nach den Wechseljahren

Biochemistry

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Summary

Klinisch, Östrogenmangel bei Frauen in der Wechseljahre kann die Inzidenz von Lipidstörungen und Arteriosklerose verschlimmern. Wir etablierten ein In-vivo-Östrogen-Mangelmodell durch bilaterale Ovariektomie über einen doppelten dorsal-lateralen Schnitt bei ApoE-/- Mäusen. Das Mausmodell ist für das Screening exogener Östrogenbehandlungen von kardiovaskulärer Dysfunktion nach den Wechseljahren anwendbar.

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Sun, B., Yin, Y. z., Xiao, J. An In Vivo Estrogen Deficiency Mouse Model for Screening Exogenous Estrogen Treatments of Cardiovascular Dysfunction After Menopause. J. Vis. Exp. (150), e59536, doi:10.3791/59536 (2019).

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Abstract

Postmenopausale Frauen haben ein höheres Risiko, an Herz-Kreislauf-Erkrankungen zu erkranken als prämenopausale Frauen. Weibliche Mäuse ovariectomisiert (OVX) bei Entwöhnung Sanierung atherosklerotische Läsionen in der Aorta im Vergleich zu weiblichen Mäusen mit intakter Eierstockfunktion. Es fehlen jedoch Labormodelle mit Östrogen-mäusen mit arteriosklerose-anfälligem Status. Dieses Defizit ist entscheidend, weil klinischer Östrogenmangel bei Frauen in der Wechseljahre die Inzidenz von vorbestehenden oder anhaltenden Lipidstörungen und Arteriosklerose verschlimmern kann. In dieser Studie stellen wir ein In-vivo-Östrogen-defizitier-defizitierte Mausmodell durch bilaterale Ovariektomie über einen doppelten dorsal-lateralen Schnitt bei Apolipoprotein E (apoE)-/- Mäusen fest. Anschließend vergleichen wir die Wirkungen von 17-Estradiol und Pseudoprotodioscin (PPD) (ein Phytoöstrogen), das peroral über Haselnussaufstrich verabreicht wird. Wir stellen fest, dass PPD zwar einen gewissen Effekt auf die Reduzierung des Endkörpergewichts und des Plasma-TG bei OVX-ApoE-/- Mäusen ausübt, aber antiatherosklerotische und kardiale Schutzfähigkeiten hat, die mit seinem 17-Estradiol-Pendant vergleichbar sind. PPD ist ein Phytoöstrogen, das berichtet wurde, Anti-Tumor-Eigenschaften auszuüben. Daher ist die vorgeschlagene Methode für das Screening von Phytoöstrogenen über perorale Verabreichung geeignet, um die traditionelle Hormonersatztherapie bei postmenopausalen Frauen zu ersetzen, von der berichtet wurde, dass sie potenziell schädliche tumorigenetische fassungsvermögen. Perorale Verabreichung über Haselnuss-Spread ist nicht-invasiv, so dass es weithin anwendbar auf viele Patienten. Dieser Artikel enthält schrittweise Demonstrationen der bilateralen Ovariektomie über den doppelten dorsal-lateralen Schnitt bei ApoE-/- Mäusen und peroralem 17-Estradiol- oder Phytoöstrogenhormonersatz über Haselnuss-Spread. Plasmalipid- und Herz-Kreislauf-Funktionsanalysen mittels Echokardiographie folgen.

Introduction

Epidemiologische und klinische Studien haben gezeigt, dass postmenopausale Frauen ein wesentlich höheres Risiko für Herz-Kreislauf-Erkrankungen haben als prämenopausale Frauen1,2. Hormonersatztherapie (HRT) kann das relative Risiko für Herz-Kreislauf-Erkrankungen auf 0,37-0,793reduzieren. Unter anderen Komplikationen ist Arteriosklerose, die durch Herz-Kreislauf-Erkrankungen verursacht wird, die häufigste Todesursache weltweit4. Jedoch, Labormodelle mit Östrogen-mangelhafte Mäuse präsentieren Atherosklerose anfälligen Status fehlen. Dieses Protokoll bietet ein In-vivo-Östrogen-Mangel-Maus-Modell zum Screening exogener Östrogen-Behandlungen von kardiovaskulärer Dysfunktion nach den Wechseljahren.

Frühere Studien zeigen, dass die Anwendung von OVX bei atherosklerotischen Nagetieren, die mit einer cholesterinreichen Ernährung gefüttert werden, postmenopausale Frauen nachahmen kann, die an Arterioskleroseleiden 5,6,7,8. Ein reproduzierbares und praktisches Tiermodell, das dem atherosklerotischen Zustand bei Frauen in der Wechseljahre ähnelt, ist die Grundlage der exogenen Östrogenforschung. Hier wurde ein doppelter dorsal-lateraler Schnitt der bilateralen Ovariektomie bei atherosklerose-anfälligen Apolipoprotein E Knockout (ApoE-/-) Mäusen9,10angewendet. Im Vergleich zu mittelabdominalen oder dorsalen Einschnitten ist der doppelte dorsal-laterale Schnitt eine einfachere, weniger zeitaufwändige Methode, die eine schwere Bauchhöhlenhaftung und Entzündungen vermeiden kann. Perorale Verabreichung über Haselnuss-Spread (siehe Tabelle der Materialien) ist nicht invasiv und bequem, so dass es weithin anwendbar als eine langfristige Administrationsmodus11. Slow-Release-Pellet-Implantation ist auch beliebt6. Implantate können jedoch die Inzidenz von Infektionen verschlimmern, insbesondere bei Mäusen, die OVX ausgesetzt sind. Andere nichtinvasive Verabreichungsmodi, wie oral gavage und Wasserverwaltung, haben auch viele Nachteile. Oralgavage in der Regel Stress Mäuse und kann Ösophakenverletzungen verursachen. Die Verabreichung des Hormons über Trinkwasser ist sehr vorteilhaft; die Zugabe von DMSO als Emulgator ist jedoch unvermeidlich, da exogene Östrogene in Wasser unlöslich sind. Hier haben wir uns für perorales 17-Estradiol- oder Phytoöstrogenhormonersatz mittels Haselnussaufstrich für die Langzeitverabreichung entschieden.

Kürzlich wurde die positive Wirkung von HRT auf das Herz-Kreislauf-System von postmenopausalen Frauen in Studien der Frauengesundheitsinitiative (WHI) bestritten12. Auf der einen Seite, exogenes Östrogen allein übt eine positive Wirkung auf das Herz-Kreislauf-System; auf der anderen Seite, Es kann mit Metohydroxyprogesteron Acetat kombinieren, um das Risiko von kardiovaskulären Ereignissen zu erhöhen. Ernster, HRT kann zu Brust- und Gebärmuttertumorprogression führen, und dieser Effekt hat seine Verwendung deutlich eingeschränkt13,14. Mehr Interesse wurde auf die kardiovaskuläre-schützende Wirkung von exogenen Östrogenen ohne mitotische Aktivität in Tumorzellen15,16,17konzentriert. Mehrere Studien an Menschen und Tieren deuten darauf hin, dass Phytoöstrogene mit Strukturen ähnlichdenen von Östrogenen eine vorteilhafte Rolle im Kardiovaskulären Schutz 15,18spielen können.

Die Ziele der vorliegenden Arbeit sind daher (i) der Aufbau eines In-vivo-Östrogen-Mangel-Mausmodells durch bilaterale Eialistomie über einen doppelten dorsal-lateralen Schnitt beiApoE-/- Mäusen und (ii) der Vergleich der kardiovaskulären Schutzwirkungen peroraler 17-Estradiol und Pseudoprotodioscin (PPD) über Haselnussaufstrich verabreicht. 17-Estradiol ist eine Art von exogenem Östrogen, das zu den weiblichen Sexualhormonen6,11,19gehört. PPD, ein Steroid Saponin und Phytoöstrogen aus Dioscorea Pflanzen, wurde zuvor berichtet, Anti-Tumor-Eigenschaften ausüben20.

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Protocol

Alle Tierpflege- und Versuchsprotokolle wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee der Chinese Academy of Medical Sciences und dem Peking Union Medical College (Genehmigungsnummer: SYXK (Peking) 2013-0023) genehmigt. Der Ursprung von ApoE-/- Mäusen ist C57BL/6J9,10.

1. Bilaterale Ovariektomie über einen doppelten dorsal-lateralen Schnitt in ApoE-/- Mäuse

  1. Bei der Entwöhnung (Alter 28 Tage) beanten weiblicheApoE-/- C57BL/6J-Mäuse mit Avertin (Tribromoethanol; 200 mg/kg; intraperitoneal).
    HINWEIS: 32 ApoE-/- Mäuse wurden nach dem Zufallsprinzip in 4 Gruppen eingeteilt: SHAM, OVX, OVX/E2 und OVX/PPD-Gruppe (n = 8 pro Gruppe).
  2. Legen Sie das Tier in anfälliger Position auf einem Heizkissen. Tragen Sie Augenschmierstoff für den Augenschutz während der Anästhesie auf.
  3. Halten Sie die Körpertemperatur innerhalb von 36 °C bei 0,5 °C. 5 mg/kg Körpergewicht des analgetischen Karprofensubkutanen subkutan zum seitlichen Aspekt des Maushalses.
  4. Rasieren Sie einen 3 x 5 cm2 Mausbereich cephalisch aus dem Iliaskamm. Bevor Sie das Tier mit einem 3 x 5 cm2 Blenden-OP-Opus abdecken, reinigen Sie den rasierten Bereich gründlich mit Jod und dann 70% Ethanol. Verwenden Sie während des Experiments sterile Instrumente und Handschuhe.
  5. Verwenden Sie Schere und Zange, um einen Schnitt 1 cm seitlich zur Mittellinie und 1 cm seitlich zu den Zahnrippen zu machen.
  6. Sezieren Sie das subkutane Gewebe mit Zangen.
  7. Verwenden Sie eine SezierenderBrille (siehe Materialtabelle), um das weiße Fettgewebe in der Bauchhöhle zu identifizieren.
  8. Verwenden Sie Mikroschere und Mikrozangen, um einen 0,5-1 cm Schnitt durch die Faszien zu machen, bis die Bauchhöhle erreicht ist.
    HINWEIS: Schließen Sie die Wunden für die scheinbetriebene Gruppe direkt. Die Muskelschicht und die Haut separat mit einer Monofilament-Naht befolgen.
  9. Wenn das weiße Fettgewebe in der Bauchhöhle zu sehen ist, greifen Sie das Fettgewebe mit Mikrozangen und ziehen Sie es vorsichtig heraus. Ein rosa maulbeerförmiger Eierstock, der von Fettgewebe in der Bauchhöhle umwickelt ist, ist zu sehen.
  10. Ligate das 0,5-1 cm proximale Gefäß und das Uterushorn mit einer Monofilament-Naht. Entfernen Sie den Eierstock mit mikroscheren und legen Sie das restliche Gewebe wieder in die Bauchhöhle.
    HINWEIS: Die wichtigsten negativen Symptome für die OVX-Operation ist die Harnleiterligation, die zu einer hohen Sterblichkeit bei OVX-betriebenen Mäusen führt. Dies kann vermieden werden, indem das Gewebe mit einer SezierenderBrille identifiziert wird.
  11. Schließen Sie die Wunden. Die Muskelschicht und die Haut separat mit einer Monofilament-Naht befolgen.
  12. Verwenden Sie Schere und Zange, um einen weiteren Schnitt 1 cm seitlich zur Mittellinie und 1 cm seitlich zu den Zahnrippen auf der anderen Seite zu machen. Wiederholen Sie den obigen Vorgang (1.5 bis 1.11).
  13. Lassen Sie das Tier aus der Anästhesie erwachen. Halten Sie die Maus am ersten Tag nach der Operation getrennt auf.
  14. Reinigen oder ersetzen Sie den Käfig während der Erholungsphase häufig.
  15. Ca. 24 h nach der Operation, verabreichen weitere 5 mg/kg Körpergewicht des analgetischen Carprofen subkutan.

2. Perorale Verabreichung von 17-Estradiol oder PPD über Haselnuss-Spread

  1. 17-Estradiol oder PPD in Sesamöl gründlich auflösen und dann das Sesamöl mit Haselnussaufstrich vermischen (siehe Materialtabelle). Eine tägliche Portion für jede 30 g-Maus enthält 3 g 17-Estradiol oder 15 g PPD, 4 l Sesamöl und 60 mg Haselnussaufstrich. Bereiten Sie ein Placebo für jede 30 g Maus enthält 4 l Sesamöl und 60 mg Haselnuss-Spread.
    HINWEIS: Der tägliche Verabreichungsanteil von 17-Estradiol oder PPD basierte auf früheren Studien6,11 und Vorversuchen.
  2. Eine Woche nach OVX, füttern sie die Mäuse mit einer high-cholesterol Diät (1,25% Cholesterin, 0% Cholat) für 12 Wochen. Ein typisches experimentelles Behandlungsschema, wie es in dieser Studie verwendet wird, ist in Abbildung 1dargestellt.
  3. 5 Tage vor der peroralen Verabreichung der Haselnussausbreitung in Woche 4 trainieren Sie die Mäuse, das Placebo mit ca. 30 mg Haselnussaufstrich für 2-5 Mäuse für 5 Tage zu essen. Trainieren Sie die Mäuse in Gruppen in ihren heimischen Käfigen während der ersten 3 Tage. Legen Sie die Mäuse am vierten und fünften Trainingstag in getrennte Käfige und dienen Sie dem täglichen Teil, um der Versuchssituation zu ähneln.
  4. Legen Sie die Mäuse in den letzten 9 Wochen in getrennte Käfige und servieren Sie dann eine tägliche Portion der Haselnuss-Brotaufstrichsportion für jeden Fütterungsanlass.
    HINWEIS: Eine tägliche Portion mit 17-Estradiol (0,1mg-kg-1) oder PPD (0,5mg-kg-1) über Haselnussaufstrich in DER GRUPPE OVX/E2 bzw. OVX/PPD servieren; eine tägliche Portion mit hormonfreier Haselnussaufstrich in SHAM und OVX-Gruppe servieren.

3. Bestimmung der Intima-Mediendicke und Kardiondysfunktion mit einem Mikroultraschallsystem

  1. Ultrasonografische Biomikroskopie
    1. Einen Tag vor Beendigung untersuchen Sie die Dicke der Intima-Medien und die Herzfunktionsstörung mit einem Mikroultraschallsystem (siehe Materialtabelle), wie zuvor beschrieben21.
    2. Geben Sie vor der Untersuchung jeder Maus eine intraperitoneale Injektion von Avertin (Tribromoethanol) als Anästhesie (n = 8 Mäuse pro Gruppe).
    3. Rasieren Sie das Halshaar jeder Maus sorgfältig. Tragen Sie warmes Ultraschall-Übertragungsgel großzügig auf, um eine optimale Bildqualität zu gewährleisten.
    4. Erhalten Sie ultrasonographische Basisbilder der Aortenwurzel und der aufsteigenden Aorta mit dem 30 MHz Scankopf mit einem Fokus von 12,7 mm und einer Auflösung von 40 m.
    5. Verwenden Sie die Elektrokardiographie mit einer Lead-II-Konfiguration zur Überwachung.
    6. Erfassen Sie rechte parasternale Langachsenbilder der aufsteigenden Aorta, des Aortenbogens und der brachiocephalen Arterienverzweigung in einer Ebene in Systole (Abbildung 3).
  2. Messungen der Intima-Medien und der maximalen Plaquedicke
    1. Passen Sie den Abstand zwischen dem Messumformer und dem arteriellen Ort leicht an, um klare Bilder zu erhalten.
    2. Speichern Sie eine 10 s Cine Loop digital für die Offline-Untersuchung auf einem Bildanalysesystem.
    3. Wählen Sie für weitere Messungen manuell ein optimales Ultraschallbild für Freezeframe. Überprüfen Sie die Bilder in der kleinen Krümmung der aufsteigenden Aorta. Wenn Plaque in der aufsteigenden Aorta zu sehen ist, messen Sie die maximale Plaquedicke. Wenn Plaque in der aufsteigenden Aorta nicht sichtbar ist, messen Sie das maximale IMT.
    4. Messen Sie das IMT (Abstand zwischen der vaskulären luminal-intimalen Schnittstelle und der medial-adventitialen Schnittstelle). Messen Sie die maximale Plaquedicke (der dickste Abstand zwischen der Grenze des Gefäßlumens und der adventlichen Schicht).
    5. Durchschnittliche Daten von drei Läsionsstandorten (Abbildung 3).
  3. Bestimmung der Herzfunktionsstörung mittels Echokardiographie
    HINWEIS:
    Untersuchen Sie die Herzfunktion durch Echokardiographie mit einem Mikroultraschallsystem, wie zuvor beschrieben22.
    1. Richten Sie einen Ultraschallstrahl in Richtung Herz, in der Nähe der Papillenmuskeln.
    2. Erzielen Sie eine zweidimensionale Elektrokardiogramm-basierte Kilohertz-Visualisierung.
    3. Führen Sie die in vivo transthorakale Echokardiographie des linken Ventrikels mit einem 30-MHz-Scankopf durch.
    4. Messen Sie Parameter, die mit der Herzfunktion verbunden sind, digital aus M-Modus-Tracings.
    5. Durchschnitt der Daten von drei bis fünf Herzzyklen (Tabelle 1).
  4. Intra- und Interobserver-Variabilität
    1. Zur Validierung der Intraobserver-Variabilität können Sie die Daten von einem Operator bei zwei verschiedenen Gelegenheiten analysieren.
    2. Zur Bewertung der Interobserver-Variabilität können Sie die Daten von einem anderen Operator analysieren.

4. Wöchentliche Körpergewichtsmessung und Plasma-Gesamtcholesterin (TC) und Triglycerid (TG) Bestimmung

  1. Wöchentliche Körpergewichtsmessung
    1. Messen Sie die Körpergewichte einmal pro Woche von Woche -1 bis Woche 12.
      HINWEIS: n = 8 Mäuse pro Gruppe.
  2. Plasmapräparation
    1. Vor der Entnahme von Blutproben durch intrakardiale Punktion, bereiten Sie Spritzen und Tuben vor. Verwenden Sie EDTA als Antikoagulans. Fügen Sie jeder 2 ml Spritze 10 l 0,5 M EDTA hinzu und fügen Sie jedem 1,5 ml-Rohr 8 l 0,5 M EDTA hinzu.
    2. In Woche 12, nach einer Nacht schnell, beanten die Mäuse mit Avertin (Tribromoethanol; 200 mg/kg; intraperitoneal).
      ANMERKUNG: n = 3 Mäuse pro Gruppe.
    3. Bereiten Sie den ventralen Brustbereich mit 70% Ethanol vor.
    4. Verwenden Sie Schere und Zange, um die Brusthöhle zu öffnen und schneiden Sie die Rippen, bis das schlagende Herz ausgesetzt ist.
    5. Setzen Sie die 25 G Nadel in den rechten Ventrikel ein. Langsam aspirieren, bis Blut in die Spritze zu fließen beginnt.
      HINWEIS: Wir verwenden Einwegspritzen in sterilem Zustand mit 25 G Nadeln (siehe Materialtabelle).
    6. Weiter mit stetigem, gleichmäßigem Druck. Wenn kein Blut gesehen wird, positionieren Sie die Nadel neu und wiederholen Sie die Aspiration.
    7. Halten Sie Mäuse tief beästhestisiert, bevor Sie das erforderliche Blutvolumen sammeln. Normalerweise können bis zu 1 ml Blut entnommen werden. Euthanisieren Sie die Mäuse durch zervikale Dislokation unter diesem tiefen anästhetischen Zustand.
    8. Pipette Blutproben in 1,5 ml Tuben und invertieren das Blut gründlich, um sicherzustellen, dass EDTA in das Blut gemischt. Dann legen Sie die Blutproben sofort auf Eis.
    9. Zentrifugenproben für 20 min bei 400 x g bei 4 °C innerhalb von 30 min der Sammlung.
    10. Sammeln Sie den Überstand sorgfältig. Aliquot und speichern Sie Plasmaproben bei -80 °C.
  3. Konstruieren von Standardkurven für die TC- oder TG-Inhaltsmessung
    1. Für die TC-Standardkurve verschiedene Konzentrationen von Cholesterinstandards vorbereiten: 0 mmol/L, 0,52 mmol/L, 1,03 mmol/L, 2,07 mmol/L, 4,14 mmol/L, 6,20 mmol/L, 8,27 mmol/L und 10,34 mmol/L. Maß O.D. für jeden Cholesterinstandard. Legen Sie den durchschnittlichen O.D. für jeden Cholesterinstandard fest. Legen Sie als vertikalen (Y) Achsenwert die Konzentration als horizontalen (X) Achsenwert fest. Erstellen Sie eine Standardkurve mithilfe einer statistischen Software.
    2. Bereiten Sie für die TG-Standardkurve verschiedene Konzentrationen der TG-Normen vor: 0 mmol/L, 0,45 mmol/L, 0,90 mmol/L, 1,81 mmol/L, 3,62 mmol/L, 5,42 mmol/L, 7,23 mmol/L und 9,04 mmol/L. Messung O.D. für jede TG-Norm. Legen Sie den durchschnittlichen O.D. für jeden TG-Standard als vertikalen (Y) Achsenwert fest; Konzentration als horizontalen (X) Achsenwert festlegen. Erstellen Sie eine Standardkurve mithilfe einer statistischen Software.
      HINWEIS: Für die Standardkurvenkonstruktion wurde in der vorliegenden Studie eine vierparameter-logistische Kurvenanpassung (4-pl) verwendet. Überprüfen Sie die Standardkurve vor der Messung der Plasmaproben, und stellen Sie sicher, dass r2 größer als 0,995 ist.
  4. TC-Inhaltsmessung
    1. Beschriften Sie die Flasche Farbreagenz (25 ml) aus tc Assay Kit als "TC Working Solution".
    2. Wirbel die gekühlten Proben kurz. Bereiten Sie Verdünnungen vor: 20 l Plasma in 80 l destilliertem Wasser. Kurz Wirbelverdünnungen.
    3. Fügen Sie 2,5 l Cholesterinstandards (5,17 mmol/L) oder 2,5 l verdünntes Plasma oder 2,5 l destilliertes Wasser (leer) in die entsprechenden Brunnen einer 96-Well-Platte ein. Triplication wird empfohlen.
    4. Zu allen Brunnen, fügen Sie 250 l des Farbreagenz.
    5. Bei 37 °C für 10 min inkubieren.
    6. Schalten Sie den Mikroplattenleser ein und lassen Sie sich 10 min aufwärmen.
    7. Entfernen Sie die Platte(n) aus dem Inkubator und lesen Sie den Mikroplattenleser bei 510 nm. Stellen Sie sicher, dass keine Blasen oder Staub in den Mikrotiterbrunnen bzw. an der Unterseite der Platte vorhanden sind.
    8. Berechnen Sie die TC-Konzentration wie folgt:
      TC Cont. = Cholesterinstandards Cont. ( Plasmaprobe O.D.-blank O.D)/(Cholesterinstandards O.D.-blank O.D)
  5. TG-Inhaltsmessung
    1. Beschriften Sie die Flasche Farbreagenz (25 ml) aus dem TG-Assay-Kit als "TG Working Solution".
    2. Wirbel die gekühlten Proben kurz.
    3. Fügen Sie 2,5 l TG-Normen (2,26 mmol/L) zu oder 2,5 l verdünntes Plasma oder 2,5 l destilliertes Wasser (leer) zu den entsprechenden Brunnen einer 96-Well-Platte hinzu. Triplication wird empfohlen.
    4. Zu allen Brunnen, fügen Sie 250 l des Farbreagenz.
    5. Bei 37 °C für 10 min inkubieren.
    6. Schalten Sie den Mikroplattenleser ein und lassen Sie sich 10 min aufwärmen.
    7. Entfernen Sie die Platte(n) aus dem Inkubator und lesen Sie den Mikroplattenleser bei 510 nm.
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass keine Blasen oder Staub in den Mikrotiterbrunnen oder auf der Unterseite der Platte vorhanden sind.
    8. Berechnen Sie die TG-Konzentration wie folgt:
      TG-Forts. = TG-Normen Cont. (Plasmaprobe O.D.-blank O.D)/(TG-Normen O.D.-blank O.D)

5. En Gesichtsanalyse aortenatheklerotischer Läsionen

  1. Aorta-Isolation und Exzision
    1. In Woche 12, nach einer Nacht schnell, beanten die Mäuse mit Avertin (Tribromoethanol; 200 mg/kg; intraperitoneal). Euthanisieren Sie die Mäuse durch zervikale Dislokation unter diesem tiefen anästhetischen Zustand.
      HINWEIS: Wir verwendeten 3 Mäuse pro Gruppe.
    2. Bereiten Sie den ventralen Brustbereich mit 70% Ethanol vor. Verwenden Sie Schere und Zange, um die Brusthöhle zu öffnen und schneiden Sie die Rippen, bis das schlagende Herz ausgesetzt ist.
    3. Füllen Sie eine 50 ml Spritze mit Phosphatgepufferter Saline bei pH 7,4 (siehe Materialtabelle). Legen Sie eine 25 G Nadel in den linken Ventrikel und schneiden Sie das rechte Atrium, um hohen Druck durch Perfusion zu vermeiden.
    4. Führen Sie in situ Perfusion mit einer Durchflussrate von 0,05-0,08 ml/min. Perfusionsflüssigkeit mit Geweben absorbieren.
    5. Entfernen Sie Rippen und Lunge in der Brusthöhle mit Schere und Zange. Öffnen Sie dann die Bauchhöhle und entfernen Sie die Organe im Inneren für eine bessere Sicht auf die Aorta.
    6. Entfernen Sie die Aorta, indem Sie das Herz mit den Mikrozangen halten und die Aorta von der Wirbelsäule dorsal mit Mikrosissoren bis zur Iliasverzweigung trennen.
      HINWEIS: Bei der Sezierung in der Nähe der renalen Vorhofzweige, tief schneiden mit Mikroschere, um Aorta-Schäden zu vermeiden.
    7. Fixieren Sie das Herz und die Aorta für 48 h in 4% Paraformaldehyd. Bewahren Sie die Aortas bei Raumtemperatur oder bei 2-8 °C für einige Stunden in der Kabine auf.
      HINWEIS: Dieses Verfahren erleichtert die Reinigung.
  2. Vorbereitung der Aorta
    1. Entfernen Sie das Herz. Entfernen Sie vorsichtig das adventliche Gewebe aus den Aortas mit Mikrozangen und Mikrosissoren unter einem Stereomikroskop. Verwenden Sie Saline, um das Gewebe während der Reinigung feucht zu halten.
      HINWEIS: Achten Sie darauf, die Aorta und einige wichtige Zweige, wie die innomische Arterie, die gemeinsame Halsschlagader und die linke subklavische Arterie nicht zu reißen oder zu nicken.
    2. Lassen Sie 1 mm der innomischen und linken Karotisarterien und schneiden Sie die gesamte linke subklavische Arterie ab.
    3. Schneiden Sie die äußere Krümmung durch die innomische Arterie, dann auf die linke gemeinsame Halsschlagader und dann auf die linke subklavische Arterie.
    4. Schneiden Sie entlang der inneren Krümmung des aufsteigenden Teils bis zum Boden des Bauchteils.
    5. Die Aorta flach auf eine schwarze Kunststofffolie anheften und saline auftragen, damit Aortas nicht trocknen.
  3. Bild der Intimregion von Aorta
    1. Nehmen Sie Fotos von en gesicht aortas mit einem Stereomikroskop auf. Fügen Sie ein Millimeter-Skalalineal in die Bilder ein, um Messungen zu kalibrieren.
    2. Schließen Sie die Bogen- und Brustregionen in ein anderes Bild und den Bauchbereich ein. Speichern Sie Bilder als JPEG oder TIFF.
      HINWEIS: Der Bogenbereich ist von der Kreuzung des Myokards bis 3 mm distal von der linken subklavischen Arterie, die Thoraxregion ist 3 mm distal zur linken subklavischen Arterie bis zur letzten interkostalen Arterie, und die Bauchregion ist die letzte interkostale Arterie zum Iliac Gabelung.
  4. Quantifizierung der atherosklerotischen Läsion-en-Gesichtsmethode
    1. eichung
      1. Öffnen Sie das Bild mit Bildanalysesoftware (siehe Tabelle der Materialien), gehen Sie zu Räumliche Kalibrierung und folgen Sie den Anweisungen.
      2. Ändern Sie Referenzeinheiten in mm, indem Sie das Lineal über der Linie positionieren.
    2. ausmaß
      1. Legen Sie für jedes Bild die richtige Kalibrierung fest.
      2. Messen Sie 3 mm auf dem Lineal.
      3. Bogen- und Thoraxbereichsmessung: Umreißen Sie den Bogenbereich von der Kreuzung des Myokards bis zu 3 mm distal von der linken subklavischen Arterie und der Thoraxregion von 3 mm distal bis zur linken subklavischen Arterie bis zur letzten interkostalen Arterie. Verfolgen Sie Läsionen im Bogen- und Brustbereich und betrachten Sie die Aorta durch das Mikroskop.
      4. Abdominalbereichsmessung: Skibauchregion vom Ende der Brustregion bis zur Iliasbifurkation umreißen. Verfolgen Sie Läsionen im Bauchbereich und betrachten Sie die Aorta durch das Mikroskop.
      5. Berechnen Sie den Läsionsbereich relativ zur inneren Oberfläche der Aorta.
      6. Überprüfen Sie die Quantifizierung durch einen zweiten Beobachter, der blind für die Studiengruppen ist.

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Representative Results

Ein typisches experimentelles Behandlungsschema, wie es in dieser Studie verwendet wird, ist in Abbildung 1dargestellt. Bei der Entwöhnung (Alter 28 Tage) wurden weibliche ApoE-/- C57BL/6J-Mäuse mit Avertin anästhesiert (Tribromoethanol; 200 mg/kg; intraperitoneal). Mäuse wurden bilateral OVX oder Schein durch einen 1 cm dorsalen Schnitt operiert. Eine Woche nach bilateralem OVX wurden die Mäuse 12 Wochen lang mit einer cholesterinreichen Ernährung (1,25% Cholesterin, 0% Cholat) gefüttert. In den letzten 9 Behandlungswochen wurde in den letzten 9 Behandlungswochen 17-Estradiol (0,1mg-kg-1) oder PPD (0,5 mg-kg-1 ) peroral über Haselnussaufstrich peroral verabreicht. Alle Mäuse wurden wöchentlich gewogen. Wie in Abbildung 2dargestellt, wurden die Wirkungen der beiden exogenen Östrogene (17-Estradiol und PPD) auf die Plasmalipide und das wöchentliche Körpergewicht von ApoE-/- Mäusen nach Östrogenmangel bewertet. Nach 12 Wochen einer cholesterinreichen Ernährung zeigten OVX-Mäuse einen bemerkenswerten Anstieg der Plasma-TC- und TG-Konzentrationen. OVX-Mäuse, die peroral mit 17-Estradiol oder PPD über Haselnuss-Spread verabreicht wurden, wiesen signifikant niedrigere Plasma-TC-Konzentrationen auf als scheinbetriebene Mäuse (Abbildung2A). Plasma-TG-Spiegel sanken bei OVX-Mäusen peroral verabreicht mit 17-Estradiol, aber nicht mit PPD (Abbildung 2B). Wie in Abbildung 2Cdargestellt, während bei OVX-Mäusen eine Tendenz zu erhöhtem Körpergewicht (BW) im Vergleich zu den scheinbetriebenen Mäusen beobachtet wurde, wurde BW bei OVX-Mäusen peroral mit 17-Estradiol oder PPD über Haselnuss-Spread nach einer hochcholesterinigen Diät verabreicht. eine gegensätzliche Tendenz bei OVX-Mäusen zeigte. Das endgültige Körpergewicht von Mäusen in verschiedenen Gruppen zeigte jedoch keine signifikanten Veränderungen.

Die kardiovaskuläre Funktion wurde mittels Echokardiographie bewertet. Wie in Abbildung 3 dargestellt, wurde die maximale Plaque oder IMT der aufsteigenden Aorta an OVX-Mäusen peroral mit 17-Estradiol oder PPD über Haselnussaufstrich verabreicht. Der Aortenbogen der mit hoher Cholesterin-Diät gefütterten ApoE-/- Mäuse wurden durch B-Mode-Echokardiographie beobachtet. Repräsentative Längsschnittbilder aufsteigender Aorta wurden durch ultrasonographische Biomikroskopie erfasst. Die roten Pfeile zeigen die Plaketten an. OVX-Mäuse zeigten eine erhöhte maximale Plaque oder IMT der aufsteigenden Aorta im Vergleich zu Scheinmäusen. Nach peroraler Verabreichung von 17-Estradiol oder PPD über Haselnuss-Spread verringerte sich die maximale Plaque oder IMT der aufsteigenden Aorta im Vergleich zu der von OVX-Mäusen deutlich. (Abbildung 3). Wir beobachteten auch herzdysfunktion als Reaktion auf OVX bei ApoE-/- Mäusen nach einer 12-wöchigen High-Cholesterin-Diät Fütterung (Tabelle 1). Die Herzfunktion wurde durch Echokardiographie untersucht. Bei OVX-Mäusen konnte die perorale Verabreichung von 17-Estradiol oder PPD über Haselnuss-Spread teilweise Parameter abmildern, die eine Kardionfunktionsstörung aufweisen.

Als nächstes verwendeten wir en face analysis, um aortenatherosklerotische Läsionen zu bestimmen. Wie bereits berichtet, führte eine cholesterinreiche Ernährung nach 12 Wochen zu einer atherosklerotischen Plaquebildung auf der Luminaloberfläche der Aorta. Wie in Abbildung 4dargestellt, stieg der durchschnittliche Prozentsatz der Aortenläsionsfläche im Verhältnis zur gesamten Aortenfläche bei OVX-Mäusen signifikant an. Nach peroraler Verabreichung mit 17-Estradiol oder PPD über Haselnuss-Spread verringerte sich der Aortenläsionsbereich im Vergleich zum Pendant zu DEN OVX-Mäusen deutlich. Dieses Ergebnis steht im Einklang mit dem in Abbildung 3dargestellten Schutz von 17-Estradiol oder PPD vor der Entwicklung von Arteriosklerose.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass das vorgeschlagene Verfahren, das die bilaterale Ovariektomie über einen doppelten dorsal-lateralen Schnitt bei ApoE-/- Mäusen verwendet, für das Screening nichtinvasiver exogener Östrogenbehandlungen von kardiovaskulärer Dysfunktion nach den Wechseljahren anwendbar ist. Es ist auch besonders nützlich für die Vermeidung von schädlichen tumorigenetischen Kapazität.

Figure 1
Abbildung 1. Maus-Behandlungsschema. Bei der Entwöhnung (Alter, 28 Tage) wurden weibliche ApoE-/- C57BL/6J-Mäuse mit Avertin (Tribromoethanol; 200 mg/kg; intraperitoneal) anästhesiert. Mäuse wurden bilateral ovariectomisiert (OVX) oder Schein durch einen 1 cm dorsalen Schnitt operiert. Eine Woche nach OVX, die Mäuse wurden eine High-Cholesterin-Diät (1,25% Cholesterin, 0% Cholat) für 12 Wochen gefüttert. In den letzten 9 Behandlungswochen wurde in den letzten 9 Behandlungswochen 17-Estradiol (0,1mg-kg-1) oder PPD (0,5 mg-kg-1 ) peroral über Haselnussaufstrich peroral verabreicht. Alle Mäuse wurden jede Woche gewogen. In Woche 12 wurde die Kardiovaskulärfunktionsanalyse mittels Echokardiographie ausgewertet. Nach 12 Wochen einer cholesterinreichen Ernährung wurden alle Mäuse eingeschläfert und Blutproben und Gewebe zur weiteren Untersuchung geerntet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2. Auswirkungen verschiedener exogener Östrogene auf Plasmalipide und wöchentliches Körpergewicht bei ApoE-/- Mäusen. Scheinmäuse unterzog sich einer Scheinoperation und erhielt eine cholesterinreiche Diät. OVX-Mäuse unterzog sich einer bilateralen Eizellenktomie und wurde dann nach dem Zufallsprinzip in die folgenden Gruppen eingeteilt: die OVX-Gruppe, die mit einer cholesterinreichen Diät behandelt wurde; die GRUPPE OVX/E2 (17-Estradiol), die 12 Wochen lang eine cholesterinreiche Diät plus 0,1 mg/kg E2 durch perorale Verabreichung über Haselnussaufstrich für die letzten 9 Behandlungswochen erhielt; und die OVX/PPD-Gruppe, die 12 Wochen lang eine cholesterinreiche Diät plus 0,5 mg/kg PPD durch perorale Verabreichung über Haselnussaufstrich für die letzten 9 Behandlungswochen erhielt. Der Gesamtcholesterin- und Triglyceridspiegel des Plasmas wurde mit enzymatischen Methoden (A-B) gemessen. Die Daten werden als Mittel wert - SEM von n = 5 Mäusen pro Gruppe ausgedrückt. Wöchentliche Körpergewichte wurden von Woche -1 bis Woche 12 (C) gemessen. Die Daten werden als Mittel wert - SEM von n = 8 Mäusen pro Gruppe ausgedrückt. Einweg-ANOVA gefolgt von Dunnetts Post-hoc-Test wurde für mehrere Vergleiche durchgeführt. *p < 0,05 im Vergleich zur Scheingruppe; # p < 0,05 im Vergleich zur OVX-Gruppe. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3. IMT- oder maximale Plaquedickenmessungen bei ApoE-/- Mäusen. B-Modus-Bilder, die den Aortenbogen von ApoE-/- Mäusen zeigen, werden präsentiert. Die Längsbilder der aufsteigenden Aorta wurden durch ultrasonografische Biomikroskopie gewonnen. Die maximale Plaque oder IMT der aufsteigenden Aorta (mm) wurde gemessen. Die ultrasonografischen Bilder zeigen Plaque in der kleinen Krümmung der aufsteigenden Aorta; die roten Pfeile zeigen die Plaketten an. Die Daten werden als Mittelwert von n = 8 Mäusen pro Gruppe ausgedrückt. Einweg-ANOVA gefolgt von Dunnetts Post-hoc-Test wurde für mehrere Vergleiche durchgeführt. *p < 0,05 im Vergleich zur Scheingruppe; # p < 0,05 im Vergleich zur OVX-Gruppe. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 4
Abbildung 4. En Face Analyse von aortenatherosklerotischen Läsionen bei ApoE-/- Mäusen. Der durchschnittliche Prozentsatz der Aortenläsionsfläche im Verhältnis zur gesamten Aortenfläche wurde in allen Gruppen quantifiziert. Gezeigt werden repräsentative Mikrographiken der Intimläsionen (en face) der Aorta. Die Daten werden als Mittelwert von n = 3 Mäusepro Gruppe ausgedrückt. Einweg-ANOVA gefolgt von Dunnetts Post-hoc-Test wurde für mehrere Vergleiche durchgeführt. *p < 0,05 im Vergleich zur Scheingruppe; # P < 0,05 im Vergleich zur OVX-Gruppe. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

täuschung OVX OVX/E2 OVX/PPD
LVIDd (mm) 3,72 x 0,10 3,74 x 0. 24 3,68 x 0,16 3,88 x 0,16
LVIDs (mm) 2,34 x 0,11 2,16 x 0,22 2,12 € 0,13 2,55 € 0,12
IVSd (mm) 0,83 € 0,09 0,84 € 0,07 0,91 € 0,05 0,74 € 0,06
IVSs (mm) 1,24 x 0,02 1,35 x 0,06* 1,45 € 0,04 1,09 € 0,04
PWTd (mm) 0,7 x 0,10 0,68 € 0,04 0,72 € 0,07 0,58 € 0,07
PWTs (mm) 1,10 x 0,12 1,17 x 0,08 1,24 € 0,04 0,98 € 0,08
EDV (mm3) 58,89 € 3,74 59,88 € 9,02 57,39 € 5,79 65,11 € 6,13
ESV (mm3) 18,86 € 2,17 15,75 € 4,00 14,85 € 2,37 23,45 € 2,64
EF (%) 67,84 € 1,52 73,91 €3 ,63* 74,23 € 1,50 63,91 € 3,61
FS (%) 37,19 € 1,53 42,22 € 1,17* 42,36 € 1,21 34,28 € 2,69
LVIDd = LV Innendurchmesser während der Diastole; LVIDs = LV Innendurchmesser während der Systole; IVSd = internes ventrikuläres Septum während der Diastole; IVSs = internes ventrikuläres Septum während der Systole; PWTd = hintere Wanddicke während der Diastole; PWTs = hintere Wanddicke während der Systole; EF = Auswurffraktion; FS = fraktionierte Verkürzung; EDV = enddiastolisches Volumen; ESV = endsystolisches Volumen.

Tabelle 1: Herzfunktionsauswertung mittels Echokardiographie. Parameter, die mit der Herzfunktion digital aus M-Modus-Tracings verbunden sind, wurden in allen Gruppen quantifiziert. Die Daten werden als Mittelwert von n = 8 Mäusen pro Gruppe ausgedrückt. Einweg-ANOVA gefolgt von Dunnetts Post-hoc-Test wurde für mehrere Vergleiche durchgeführt. *p < 0,05 im Vergleich zur Scheingruppe; # p < 0,05 im Vergleich zur OVX-Gruppe.

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Discussion

Die hier beschriebene Methode ist ein Mausmodell, das Lipidstörungen und Arteriosklerose bei Frauen in der Wechseljahre ähnelt. Es ist gut dokumentiert, dass Östrogenmangel bei postmenopausalen Frauen die Inzidenz von vorbestehender oder anhaltender Hypercholesterinämie mit zunehmend komplexen und weit verbreiteten atherosklerostischen Läsionen verschlimmern kann1. Um den atherosklerose-anfälligen Status in der Klinik nachzuahmen, wurden apoE-mangelhafte Mäuse, eine reproduzierbare und bequeme Quelle von Tieren, mit denen atherogenesis23,24,25, untersucht werden. Wie aus der vorliegenden Studie hervorgeht, zeigten weibliche OVX-ApoE-Mäuse bei der Entwöhnung einen Anstieg atherosklerotischer Läsionen in der Aorta im Vergleich zu weiblichen ApoE-/- Mäusen mit intakter Eierstockfunktion. In diesem Tiermodell haben wir auch die Wirkung verschiedener exogener Östrogenersatztherapien auf die atherosklerotische Läsionsgröße unter einem kontrollierten Ernährungszustand verglichen.

Der in diesem Artikel vorgestellte doppelte dorsal-laterale Schnitt der bilateralen Eizellenentzündung ist technisch einfacher, weniger zeitaufwändig und sicherer im Vergleich zum mittleren dorsal-lateralen Schnitt oder mittelabdominalen Schnitt der bilateralen Eizellenentzündung bei ApoE-/- Mäusen. Die bilaterale Ovariektomie über den Mittelbauchschnitt stellt einen großen Nachteil dar: Sie kann zu einer schweren Bauchhöhlenhaftung führen, die wiederum die Medikamentenaufnahme beeinträchtigen kann. Jüngste Berichte zeigen, dass die perorale Verabreichung von niedrig dosierten 17-Estradiol vor zerebraler Ischämieschützt 26. So haben wir in der vorliegenden Studie die perorale Verabreichung über Haselnussaufstrich ausgewählt. Kommerzielle Slow-Release-Pellets sind ein häufig verwendeter Verabreichungsmodus zum Testen pharmakologischer Effekte in einem Mausmodell, können jedoch schädliche Hirnschäden verursachen27. Implantate sind anfällig für Infektionen, insbesondere wenn Mäuse über einen doppelten dorsal-lateralen Schnitt bilateralem OVX ausgesetzt werden. Obwohl eine sorgfältige Desinfektion der Haut vor dem Schnitt durchgeführt wird, ist eine Infektion schwer zu vermeiden. Wasseraufbereitung und Oralgavage sind zwei weniger häufig verwendete Methoden, die getestet wurden. Die Verabreichung des Hormons über Trinkwasser ist sehr vorteilhaft, da es extrem nicht invasiv ist, da fast kein Umgang mit Tieren erforderlich ist. Allerdings ist 17-Estradiol in Wasser ohne Emulgator nicht löslich. So verwendeten wir DMSO in einer Konzentration von weniger als 0,5%, um seine Lösung im Trinkwasser zu erleichtern. Jedoch, Dieser Ansatz für die langfristige Verabreichung von niedrig dosierten DMSO ist schwer zu kontrollieren und toxisch für Mäuse oder Menschen. Mäuse können auch Wasser über die gesamte 24 h Überwachung trinken, was den tatsächlichen Drogenkonsum schwer zu bestimmen macht. Ein weiterer Nachteil dieses Ansatzes ist, dass die Wasseraufnahme des Einzelnen schwer zu kontrollieren ist. Der größte Nachteil der oralen Gavage ist, dass es für Tiere stressig ist und Ösophade verletzungen verursachen kann und das Essverhalten beeinflussen kann. In der hier beschriebenen Methodik wurde vor dem Experiment ein 5-tägiges Training zum Verzehr von hormonfreier Haselnussausbreitung durchgeführt. Ungefähr mehr als 95% der Mäuse akzeptieren die Haselnussausbreitung, wenn sie wie im Protokollabschnitt erwähnt trainiert werden. Sobald sie vollständig gewöhnt sind, werden die meisten Mäuse sie innerhalb von Sekunden konsumieren. In Übereinstimmung mit einer früheren Studie6,11verringerten sich die Plasma-E2-Spiegel bei OVX-Mäusen im Vergleich zum scheinbetriebenen Pendant in Woche 4 (Daten nicht gezeigt). In Woche 12 nach der Bestimmung beobachteten wir eine Uterusatrophie bei OVX-betriebenen Mäusen. Jedoch, die zirkulierenden Östrogenspiegel wurden nicht nach OVX in der vorliegenden Studie überwacht.

In Ermangelung des Nachweises atherosklerotischer Läsionen in der aufsteigenden Aorta kann das aortenhafte IMT durch Messung des Abstands zwischen der lumen-intimalen Schnittstelle und der medial-adventitalen Schnittstelle ausgewertet werden. Diese Messung basiert auf einem zuvor validierten Protokoll beim Menschen28. Durchschnittliche Daten von drei Standorten, die etwa 100 m voneinander entfernt sind. Die kardiale Arbeitsbelastung steigt nach OVX bei ApoE-/- Mäuse können auf ein kompensatorisches hypertrophes Wachstum einzelner Kardiomyozyten zurückzuführen sein, was schließlich zu einer Erhöhung der Herzleistung führen kann (Tabelle 1). Während bei peroraler Verabreichung von PPD für 9 Wochen die kompensatorische Herzhypertrophie mit einem EF% abgeschwächt wurde, der mit dem Schein-Gegenstück vergleichbar war. Zur Validierung der Intra- oder Inter-Observer-Variabilität analysieren Sie Variationskoeffizienten für atherosklerotische Dickenmessungen und Parameter, die mit der Herzfunktion von einem Bediener bei zwei verschiedenen Gelegenheiten oder von einem anderen Bediener in Verbindung gebracht werden.

Wie in unserer Studie dargestellt, neigten OVX-Mäuse, die peroral mit 17-Estradiol oder PPD über Haselnuss-Spread verabreicht wurden, dazu, eine Gewichtszunahme des Körpers zu verhindern und Östrogen-Mangel-assoziierte Lipidstörungen zu reduzieren, obwohl keine signifikanten Unterschiede im Endkörpergewicht Beobachtet. Frühere Studien haben auch gezeigt, dass Lipidparameter Variation kann zu gering sein, um die antiatherosklerotische Wirkung der Hormone zu erklären29. Die wohltuende Wirkung von Östrogen ist nicht auf Veränderungen der Lipidproteineigenschaften beschränkt. Einige nichtlipide Effekte von Östrogen30,31, wie Entzündungen, endotheliale Dysfunktion, und hämodynamische Stase, kann Herz-Kreislauf-Schutz bei menschlichen Erkrankungen erleichtern. Unter Berücksichtigung der in der vorliegenden Studie beobachteten Ergebnisse ist der Schutz von exogenem Östrogen vor der Entwicklung von Arteriosklerose teilweise unabhängig von systemischen Lipidspiegeln. In Endothelzellen hemmte PPD Ausdrücke von Adhäsionsmolekülen und Entzündungsmediatoren (Daten nicht gezeigt). Darüber hinaus könnte PPD die perivaskuläre Fettbildung unterdrücken, die eng mit der endotheliaalen Antikontraktilität korreliert. So war die Wirkung von PPD und 17-Estradiol anders und der zugrunde liegende Mechanismus soll weiter untersucht werden. Zweifellos könnte ein übermäßiger Konsum energiereicher Lebensmittel, wie z. B. Haselnussaufstrich, zu einer Gewichtszunahme führen. Die in dieser Studie genannten geringen Mengen an Haselnussaufstrich (200mg-kg -1-1 ) könnten jedoch nur für weniger als 5 % der täglichen Energieaufnahme der Tiere verantwortlich sein. Auch wurde keine offensichtliche Gewichtszunahme durch die Verwendung dieser Menge an Haselnuss-Spread festgestellt. Die Verwendung von 17-Estradiol und PPD war vor allem für die Behandlung von Herz-Kreislauf-Erkrankungen. Denn während des Fortschreitens der Arteriosklerose bei OVX-operiertem AopE-/- Mäusen wurde von Woche 4 bis Woche 12 17-Estradiol oder PPD peroral verabreicht.

Ein nicht zu vernachlässigender Punkt der klinischen Anwendung von HRT sind seine schädlichen Nebenwirkungen, zu denen Eierstock- und Brustkrebsgehören 13,14. Das Phytoöstrogen in der vorliegenden Studie getestet ist ein Steroid Saponin Verbindung in Dioscorea Pflanzen gefunden. ES wurde berichtet, dass PPD eine hemmende Wirkung auf einige Krebszelllinien20hat. Darüber hinaus zeigt PPD antiatherosklerotische Eigenschaften, die mit denen von 17-Estradiol vergleichbar sind. Das Modell, das wir hier präsentieren, kann helfen, potenzielle Kandidatenverbindungen zu überprüfen, einschließlich Phytoöstrogen, das eine minimale Wirkung auf die Tumorproliferation ausübt.

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Disclosures

Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde von der National Natural Science Foundation of China (81202526 bis J.X.), der National Natural Science Foundation of China (81302769 bis B.S.), der Beijing Municipal Natural Science Foundation (47144226 to B.S.), der Chinesischen Postdoktorandenstiftung unterstützt. Science Foundation (20110490325 bis J.X.) und die Ph.D. Programs Foundation of Ministry of Education of China (20121106120031 bis B.S.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
17β-estradiol, >98% Sigma-Aldrich E8875-250MG Estrogen
Disposable syringes (with 25 G needles) Hunan Luzhou Huikang Development Co., Ltd 0.5*19TWLB Cardiac bleeding
High-cholesterol mouse diet Huafukang Bio-Technology N/A 1.25% cholesterol, 0% cholate
High-Resolution In Vivo Micro-Imaging System VisualSonics Vevo®770 Measurements of intima-media thickness and cardiac dysfunction
2-Methyl-2-butanol Sigma-Aldrich 152463-250ML Preparation of avertin
Micro Dissecting forceps, Curved 8mm Kanghua Medical Equipment Co., Ltd Surgical tools
Micro Dissecting forceps, Straight 8 mm Kanghua Medical Equipment Co., Ltd Surgical tools
Micro Dissecting Scissors, Curved/Sharp 8 mm Kanghua Medical Equipment Co., Ltd Surgical tools
Micro Dissecting Scissors, Straight/Sharp 8 mm Kanghua Medical Equipment Co., Ltd Surgical tools
Monofilament suture 4-0 1/2 5 x 12 19 mm Shanghai Pudong Jinhuan Medical Supplies Co., Ltd R413 Suture and ligation of the tissues
Nut cream (Nutella) Ferrero N/A Medium for peroral 17β-estradiol or PPD
OptiVisor optical glass binocular magnifier Dohegan Optical Company Inc. N/A Assistant of identifying the tissues during ovariectomy
Phosphate-buffered saline at pH 7.4 SIGMA P3813 Preparing 1 L saline
Pro MultiLabel Microplate Reader Tecan Infinite M1000 Plasma TC and TG determination
Pseudoprotodioscin Shanghai Winherb Medical S & T Development W-0427 CAS registry no. 102115-79-7
Rimadyl, 50 mg/mL Pfizer Pharma GmbH 462986 Postoperative analgesia after ovariectomy
Sesame oil Sigma-Aldrich S3547-1L Dissolving the 17β-estradiol or PPD
Solcoseryl Eye-Gel Menarini, Solco Basle Ltd. Eye protection during anesthesia
Stereo microscope MCALON MCL-6STV Image of the intimal region of aorta
Table model high speed centrifuge SIGMA 1-14K Preparation of plasma
Scissors, slight Curve (14 cm) Kanghua Medical Equipment Co., Ltd Surgical tools
Scissors, straight Flat (14 cm) Kanghua Medical Equipment Co., Ltd Surgical tools
Tissue forceps, serrated, slight Curve (14 cm) Kanghua Medical Equipment Co., Ltd Surgical tools
Tissue forceps, serrated, straight Flat (14 cm) Kanghua Medical Equipment Co., Ltd Surgical tools
Tribromoethanol Sigma-Aldrich T48402-5G Preparation of avertin
Triglycerides (TG) assay kit Institute of Nanjing Jiancheng Biology Engineering A110-1 Plasma TG determination
Total cholesterols (TC) assay kit Institute of Nanjing Jiancheng Biology Engineering A111-1 Plasma TC determination

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References

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