Un protocole de stress d'immobilisation chronique pour induire un comportement de dépression chez les souris

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Behavior

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Summary

Cet article fournit un protocole simplifié et normalisé pour l'induction du comportement dépressif-comme dans les souris chroniquement immobilisées en utilisant un restrainer. En outre, le comportement et les techniques physiologiques pour vérifier l'induction de la dépression sont expliqués.

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Son, H., Yang, J. H., Kim, H. J., Lee, D. K. A Chronic Immobilization Stress Protocol for Inducing Depression-Like Behavior in Mice. J. Vis. Exp. (147), e59546, doi:10.3791/59546 (2019).

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Abstract

La dépression n'est pas encore entièrement comprise, mais divers facteurs causatifs ont été rapportés. Récemment, la prévalence de la dépression a augmenté. Cependant, les traitements thérapeutiques pour la dépression ou la recherche sur la dépression sont rares. Ainsi, dans le présent document, nous proposons un modèle de souris de dépression induite par la restriction de mouvement. Le stress léger chronique (CMS) est une technique bien connue pour induire un comportement dépressif. Cependant, il nécessite une procédure complexe consistant en une combinaison de divers stress légers. En revanche, le stress d'immobilisation chronique (SIC) est un modèle de stress chronique facilement accessible, modifié à partir d'un modèle de retenue qui induit un comportement dépressif en limitant le mouvement à l'aide d'un dispositif de retenue pendant une certaine période. Pour évaluer les comportements dépressifs, le test de préférence de saccharose (SPT), le test de suspension de queue (TST), et l'essai d'ELISA pour mesurer des niveaux de corticosterone de marqueur de contrainte sont combinés dans la présente expérience. Les protocoles décrits illustrent l'induction de CIS et l'évaluation des changements de comportement et des facteurs physiologiques pour la validation de la dépression.

Introduction

Le trouble dépressif majeur (MDD) est la principale cause d'incapacité mentale dans le monde, avec une incidence qui augmente plus rapidement que prévu. En 2001, l'Organisation mondiale de la Santé a prédit que la MDD serait la deuxième maladie la plus courante dans le monde d'ici 2020. Cependant, il était déjà le deuxième plus commun en 20131. En outre, les antidépresseurs actuels ont de nombreuses limitations, y compris l'effectivité retardée, la résistance aux médicaments, la rechute, et divers effets secondaires2,3. Les chercheurs doivent donc mettre au point des antidépresseurs plus efficaces. Cependant, la pathophysiologie ambigue de MDD présente un obstacle au développement de nouveaux antidépresseurs.

Le stress à long terme est le principal facteur de risque de TDM. Il peut induire le dysfonctionnement dans l'axe hypothalamic-pituitaire-surrénalien (HPA), qui est également lié à l'étiologie de MDD4,5. Comme décrit précédemment, l'axe HPA joue un rôle critique dans la physiopathologie psychiatrique induite par le stress, y compris la dépression et les troubles anxieux en augmentant les niveaux de corticostérone6,7,8, 9. De nombreux modèles animaux ont été basés sur une activation soutenue de l'axe HPA, qui est observé chez les patients atteints de MDD4. En outre, les glucocorticoïdes élevés induits par le stress chronique et les glucocorticoïdes sous-cutanés causent des comportements dépressifs avec la mort de cellules neurales, l'atrophie des processus neuronaux, et la neurogenèse adulte réduite dans le cerveau des rongeurs10 , 11. Un autre secteur important de cerveau lié à la dépression est le cortex préfrontal médial (mPFC). Le mPFC joue un rôle crucial dans le contrôle des sous-régions du cerveau, telles que l'hypothalamus et l'amygdale, qui contrôlent le comportement émotionnel et les réponses au stress8,9. Par exemple, les lésions dans le dysfonctionnement d'axe induit de mPFC dorsal de MPFC et la sécrétion améliorée de corticosterone due à l'effort de contrainte12,13. Une étude récente a également montré que l'effort de contrainte répété a augmenté des niveaux de corticostérone, qui pourraient êtrediminués par la supplémentation de glutamine par l'intermédiaire du cycle de glutamate-glutamine entre des neurones et l'astrocyte dans le mPFC 9.

Le premier paradigme de stress chronique utilisé pour étudier l'étiologie du MDD a été suggéré par Katz14. Willner et coll. ont ensuite proposé un modèle de stress léger chronique (SMC) basé sur les résultats de Katz. Ils ont confirmé que le modèle avait une validité prédictive en observant que les antidépresseurs rétablissaient le comportement anhédonique induit par le SMC15,16. Typiquement, le modèle de CMS se compose d'une combinaison de divers contraintes douces, telles que le bruit doux, l'inclinaison de cage, la literie humide, les cycles lumière-obscurité altérés, la secousse de cage, la natation forcée, et la défaite sociale. Le modèle CMS est largement utilisé par les chercheurs; cependant, ce modèle est de mauvaise reproductibilité, et le temps et l'énergie-inefficaces. Par conséquent, il y a une demande croissante pour un protocole normalisé et simplifié pour l'induction du comportement dépressif-comme et de l'analyse physiologique pour évaluer la dépression. Par rapport au modèle CMS, le modèle de stress d'immobilisation chronique (CIS; aussi connu sous le nom de stress de contrainte chronique) est plus simple et plus efficace; par conséquent, le modèle CIS peut être largement utilisé dans les études sur le stress chronique17,18,19,20,21,22,23, 24. En outre, CIS peut être employé dans les souris mâles et femelles pour développer des comportements dépressifs25,26. Pendant la CEI, les animaux sont placés dans un cylindre de taille corps-fit pendant 1-8 heures par jour pendant 2 ou 4 semaines9,27,28. De ceux-ci, l'état de contrainte de contrainte pendant 2 heures par jour pendant 2 semaines est suffisant pour causer des comportements dépressifs avec la douleur minimale chez les souris9,28. Dans des conditions de retenue, les niveaux de corticostérone de sang ont été rapidement augmentés9,28,29. Plusieurs études ont montré que le modèle CIS a une validité prédictive, confirmant que les symptômes dépressifs induits par la CEI sont rétablis par les antidépresseurs19,20,30,31. Ici, nous rapportons les procédures détaillées de CeI, aussi bien que quelques résultats comportementaux et physiologiques après CIS chez les souris.

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Protocol

Tous les protocoles expérimentaux et les soins aux animaux ont été menés conformément aux lignes directrices du Comité universitaire de recherche animale pour la recherche animale de l'Université nationale de Gyeongsang (GLA-100917-M0093).

1. Matériaux

  1. souris
    1. Utilisez des mâles de fond de souche C57BL/6 pesant de 22 à 24 g à la semaine postnatale 7. Habituez-vous dans la salle de reproduction pendant 1 semaine avant les expériences.
      REMARQUE : Toutes les souris ont été achetées d'une compagnie animale de laboratoire.
    2. Maison des souris individuellement dans un vivarium à température contrôlée (22-24 oC) sous un cycle de 12 heures de lumière /obscurité (lumières allumées à 6h00 du matin), avec chow de laboratoire normal et l'eau disponible ad libitum.
  2. Restrainer (Restrainer)
    1. Utiliser un réservoir cylindrique, transparent et acrylique (hauteur de 8,5 cm, diamètre de 2,5 cm) fixé sur un piédestal carré pour retenir et produire un comportement dépressif (Figure 1A). Le diamètre de ce cylindre a été fait pour s'adapter au corps de sorte que la souris ne pouvait pas tourner et se déplacer vers l'avant ou vers l'arrière. La carte d'achat peut être achetée commercialement ou fabriquée en laboratoire.
  3. Appareil de suspension de queue
    1. Utilisez une boîte de suspension de queue de taille raisonnable en acrylique translucide (hauteur de 30 cm, largeur de 20 cm, longueur et 20, figure 1B). Pour éviter les interactions entre les animaux, utilisez des cloisons rectangulaires dans la boîte afin que le sol et trois des quatre murs soient bloqués par des plaques acryliques. Laissez les deux côtés restants de la boîte ouverts pour permettre l'enregistrement vidéo et fixer la barre horizontale. La boîte peut être achetée commercialement ou fabriquée en laboratoire.
  4. Dispositif d'enregistrement vidéo et logiciel de suivi vidéo
    1. Utilisez une caméra de télévision en circuit fermé à écran noir et blanc (voir Tableau des matériaux)connectée à un ordinateur et un trépied (ou d'autres produits de soutien) pour permettre l'enregistrement de l'expérience comportementale. L'enregistrement vidéo est essentiel pour permettre la notation comportementale dans cette expérience, parce qu'au moins deux souris sont testées en même temps.
    2. Assurez-vous que la résolution de la caméra est suffisamment élevée pour permettre l'analyse des données vidéo à l'aide du logiciel de suivi vidéo (voir Tableau des matériaux)installé dans l'ordinateur connecté.

2. Induction de la dépression par la retenue de CeIS

REMARQUE: Manipulez la souris doucement, mais fermement avec confiance. La manipulation approximative et provisoire est un autre facteur de stress dans l'expérience et c'est une raison importante pour la souris luttant, mordant, et se grattant.

  1. Mettre la pièce en lumière (200 Lux) à l'aide d'un compteur de lux numérique.
  2. Loger la souris dans une cage séparée au moins une semaine avant l'essai et placer la souris dans la salle d'essai pendant au moins 30 minutes avant l'expérience.
    REMARQUE : Manipulez les souris au moins une fois par jour pendant au moins 3 jours consécutifs avant l'expérience afin que les souris se familiarisent avec l'expérimentateur. Une période d'adaptation avant l'expérience est nécessaire pour s'assurer que les souris s'acclimatent aux circonstances, comme la salle d'essai.
  3. Tenez doucement la queue de la souris pour éviter de tensing la souris, puis placez-la soigneusement sur une surface rugueuse (en haut de la barre de fil de la cage ou du couvercle de cage).
  4. Couvrir la salle de réception d'une petite serviette blanche, puis placer délicatement la souris à l'ouverture de la salle de réception de sorte que la souris entre volontairement dans la salle de réception.
    REMARQUE : Dans ce cas, la souris est positionnée dans la direction opposée à celle avec laquelle elle entre dans la salle de contrôle. Pour amener la souris à entrer volontairement dans la cure-contrôle, la cure-formatrice est recouverte d'une petite serviette pour rendre l'intérieur plus sombre.
  5. Placez la fermeture pour retenir la souris aussi serrée que possible, en prenant soin d'éviter les dommages au corps, tels que la queue, les pieds et les testicules.
  6. Retenez la souris pendant 2 h/jour (9 h à 11 h) pendant 15 jours consécutifs.
  7. Mesurer le poids corporel et l'apport alimentaire toutes les 48 h pendant l'exposition à la retenue (c.-à-d. la quantité d'apport alimentaire pendant les 48 h avant le déclenchement de la contention de mouvement).
    REMARQUE : Lorsque vous mesurez le poids corporel et l'apport alimentaire, placez les souris témoins dans leurs cages d'accueil dans la salle d'essai pendant le SIC. Assurez-vous que d'autres facteurs environnementaux sont les mêmes que pour les souris du SCI.
  8. Confirmer l'induction de la dépression en effectuant des tests comportementaux tels que le test de préférence de saccharose (SPT) et le test de suspension de queue (TST) (se référer aux étapes 4 et 5).
  9. Confirmer l'induction de la dépression en mesurant le marqueur de stress corticostérone à l'aide de l'essai ELISA (voir la section 6).

3. Le test de préférence de saccharose

  1. Avant l'essai, accouchez les souris à la présence de deux bouteilles à boire (l'une contenant 0,1 M de saccharose et l'autre contenant de l'eau ordinaire) pendant 48 h. Changer les positions des deux bouteilles après 24 h pour réduire toute confusion produite par un biais latéral.
  2. Le3ème jour, priver les souris d'eau pendant 24 h.
  3. Le jour de l'expérience SPT, exposez les souris à deux bouteilles à boire pendant 6 h. Après 3 h, changer la position des bouteilles d'eau.
  4. Enregistrez le volume (mL) de la solution de saccharose et de l'eau consommée, puis calculez l'affinité des animaux avec le saccharose.
  5. En général, calculer la préférence de saccharose en pourcentage du volume de consommation de saccharose par-dessus la consommation totale de fluide pendant l'essai.

4. Le test de suspension de queue

  1. Apportez les souris induites par le CEI dans la salle d'essai au moins 30 minutes avant de commencer le TCT.
  2. Mettre la pièce en lumière dans des conditions de gradation (50 Lux).
  3. Pour obtenir le fichier vidéo de la plus haute résolution, placez l'appareil photo le plus près possible de la souris (environ 40 cm de la souris).
  4. Suspendre fermement la souris de la barre horizontale (30 cm de la ligne du bas) à l'aide de ruban adhésif cellophane (la distance de la pointe de la queue est de 1 cm). Terminer le processus d'application de ruban adhésif sur la souris dès que possible pour minimiser d'autres sources de stress.
  5. Une fois que la souris est positionnée au milieu de la boîte de suspension, commencer à enregistrer et observer les altérations comportementales en permanence pendant 6 min.
    REMARQUE : Si la souris tente de grimper sa queue, utilisez un bâton ou un bouchon de montée pour l'empêcher de le faire.
  6. À la fin de l'expérience, déplacez la souris vers sa cage d'origine et retirez soigneusement la bande de sa queue.
  7. Analyser le temps accumulé des périodes immobiles à l'aide du logiciel de suivi vidéo.
    REMARQUE : La durée de l'immobilité est le paramètre CIS le plus important. Cela peut être calculé comme le temps accumulé des périodes immobiles, défini en termes d'un seuil de mouvement contenu dans le dispositif de filtrage de niveau du logiciel.

5. Mesurer les niveaux de corticostérone dans le sang par ELISA

REMARQUE: Un jour après le test comportemental, les souris sont sacrifiées pour la collecte de sang.

  1. Anesthésiez la souris avec 5% d'isoflurane dans une chambre d'induction jusqu'à l'anesthésie. Assurez-vous que la souris a suffisamment de temps dans la chambre d'induction (au moins 2 min) pour éviter de se réveiller pendant la chirurgie.
  2. Recueillir le sang du cœur à l'aide d'une seringue de 1 ml et entreposer le sang dans des vacutainers contenant k3EDTA sur la glace (à 9 h)
  3. Séparer le plasma par centrifugation à 1 000 g pendant 15 min à 4 oC.
  4. Quantifier les niveaux de corticostérone plasmatique à l'aide du kit ELISA de corticostérone (voir Tableau des matériaux) selon le protocole du fabricant.

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Representative Results

Dans l'expérience représentative, toutes les données ont été acquises à partir de 6 à 8 souris par groupe. Les matériaux représentatifs et la méthode d'insertion volontaire de la souris dans la prise de contrôle sont indiqués à la figure 1.

Pour effectuer le test comportemental et l'échantillonnage sanguin après l'induction du CEI, les souris ont été soumises à la procédure expérimentale telle que résumée dans la figure 2A. Comme le montre la figure 2 et la figure 3,le CEI induit bien des comportements dépressifs et libère la corticostérone marqueur de stress. En outre, ces indices ont été récupérés par supplémentation de glutamine (les souris ont été alimentées des régimes glutamine-supplémentés pendant toute la période expérimentale, mg/kg) comme indiqué dans la figure3.

Figure 1
Figure 1 : Configuration de la forfait. (A) Restrainer, (B) boîte de suspension de queue, et (C) bouteille d'eau et buse de boule. (D) Le processus d'insertion de la souris dans la refilante pour induire le SIC. À partir du panneau gauche, la souris entre volontairement dans la salle de contrôle après que la salle de commande est recouverte d'une petite serviette. Le panneau droit montre que la souris est complètement entrée dans la remodelère. Ce chiffre a été modifié à partir de Son et coll.9 La permission de droit d'auteur a été obtenue de la revue pour tous les chiffres réutilisés. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2
Figure 2. Induction du stress chronique d'immobilisation et évaluation des comportements dépressifs chez la souris. (A) Procédure expérimentale. Poids corporel (B) et consommation alimentaire (C) dans le groupe témoin (ligne bleue, n ' 8) et dans le groupe CIS (ligne rouge, n ' 8). (D et E) Préférence de saccharose et temps d'immobilité (n ' 8 dans les deux essais). (F) Niveaux de corticostérone sanguine (n ' 7/groupe). Les données sont affichées comme moyennes - SEM. 'p 'lt; 0.05 comme déterminé par (B et C) aNOVA bidirectionnel avec bonferroni test post-hoc ou (D-F) non apparié étudiant t-test. CIS - stress d'immobilisation chronique, SPT - test de préférence de saccharose, TST - essai de suspension de queue, DC - décapitation. Ce chiffre a été modifié à partir de Son et coll.9 La permission de droit d'auteur a été obtenue de la revue pour tous les chiffres réutilisés. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3
Figure 3. Un régime glutamine-supplémenté améliore les comportements dépressifs-comme. Poids corporel (A) et apport alimentaire (B) dans le groupe témoin (ligne bleue, n ' 7), groupe CIS (ligne rouge, n ' 7) et CIS - groupe complété par la glutamine (ligne verte, n - 7). Préférence de saccharose (C), temps d'immobilité (D) et niveaux de corticostérone de sang (E) (n - 6-7/groupe). Les données sont affichées comme moyennes - SEM. 'p 'lt; 0.05 comme déterminé par (A et B) aNOVA bidirectionnel avec bonferroni test post-hoc ou (C-E) non apparié étudiant t-test. Gln et glutamine. Ce chiffre a été modifié à partir de Son et coll.9 La permission de droit d'auteur a été obtenue de la revue pour tous les chiffres réutilisés. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

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Discussion

La complexité du cerveau et l'hétérogénéité de la MDD rendent difficile la création de modèles animaux qui reproduisent complètement la maladie. De nombreux chercheurs ont surmonté cette difficulté en utilisant une approche basée sur l'endophenotype32, dans laquelle l'anhédonie (manque d'intérêt pour récompenser les stimuli) et le désespoir sont considérés comme des comportements évolutivement conservés et quantifiables dans les modèles animaux, qui sont également vus chez les patients souffrant de dépression33. Dans le présent document, nous avons présenté une méthode dans laquelle la CEI était suffisante pour induire l'anhédonie et le désespoir, démontrant la pertinence translationnelle entre la CEI et le MDD. En outre, de nombreuses études ont utilisé CIS pour identifier le mécanisme provoquant des comportements dépressifs et pour évaluer les antidépresseurs capables de rétablir le comportement normal9,19,20,30, 31,34. Ainsi, le CEI peut être approprié pour étudier l'étiologie du MDD et peut donc être utile dans le développement de nouveaux antidépresseurs.

Plusieurs facteurs influent sur le développement d'un comportement dépressif pendant la CEI. La première est la souche animale parce que l'étendue de la réponse au stress à la CEI peut varier en fonction de la souche animale. En effet, plusieurs différences liées à la souche en réponse à des tests comportementaux dépressifs et des antidépresseurs sont connus35,36. À cet égard, une attention particulière devrait être accordée au comportement d'escalade de la souche C57BL couramment utilisée37,38,39. Deuxièmement, les facteurs de stress environnemental, comme la lumière, le bruit et le logement, devraient être réduits au minimum. Bien que le stress d'isolement social puisse influencer les résultats40,41, nous avons mené CIS sur des souris unifamiliales parce que l'isolement a plus d'avantages que d'inconvénients. Par exemple, il peut minimiser le stress de défaite sociale parce que CIS provoque souvent des souris de groupe à attaquer les uns les autres. En effet, les souris témoins attaquent également leurs colocataires, affectant le comportement de base dans le TST et le SPT. Un autre facteur à considérer avant de commencer l'expérience est le sexe. Dans cet article, nous avons effectué toutes les expériences avec des souris mâles, comme les comportements émotionnels et cognitifs sont affectés par le cycle menstruel chez les souris femelles42,43,44. De plus, les rongeurs femelles sont relativement plus sensibles aux troubles liés au stress, comme la dépression. Par conséquent, si l'expérimentateur veut utiliser des souris femelles, le point temporel de l'induction du comportement dépressif doit être confirmé et le protocole CIS devrait être modifié. En outre, toutes les souris devraient être autorisés une période d'accoutumance à la nouvelle circonstance, et l'expérimentateur devrait éviter d'ajouter de nouveaux animaux à la salle d'essai pendant l'expérience, parce que les souris peuvent sentir de nouveaux indices olfactifs et ultrasoniques au cours de l'expérience . Lorsque l'expérimentateur déplace les souris vers un autre étage ou une longue distance, il est nécessaire de couvrir la cage de reproduction avec un morceau de tissu noir. Enfin, l'âge est un facteur important dans la détermination de l'étendue de la réponse et le rétablissement au stress45. Nous nous sommes concentrés sur l'étiologie du MDD à l'adolescence — des souris de 8 semaines ont été utilisées tout au long de l'expérience. Les expérimentateurs devraient se demander si les facteurs susmentionnés peuvent influer sur les résultats lors de la conception du CEI.

Pour valider l'induction du SCI, des tests qui indiquent la dépression, comme la mesure du poids corporel et de l'apport alimentaire, la TST et le TSP, devraient être effectués et un indicateur de stress physiologique, comme les changements de corticostérone, devrait être étudié9, 46 Annonces , 47. Cependant, la méthode TST appliquée dans cette expérience n'est pas recommandée chez les rats parce que les rats sont trop lourds pour être soutenus par leur queue. Dans de tels cas, le TST devrait être remplacé par la natation forcée ou les essais sur le terrain39,48. Dans cette expérience, la principale considération était la taille de la boîte de suspension. À l'aide de ruban adhésif cellophane, la queue de la souris a été suspendue sur une barre horizontale située au milieu de la boîte au plafond. Par conséquent, la boîte doit être assez grande pour empêcher la souris de contacter le mur pendant l'expérience. Le SPT, un indicateur de l'anhédonie, suggère un trouble émotionnel tel que la dépression. Dans la présente expérience, l'intérêt des souris pour une boisson sucrée a été évalué à l'aide de saccharose.

Afin d'induire un comportement dépressif, nous avons modifié la technique de retenue du modèle CMS pour établir le CIS, qui est une technique simplifiée et hautement reproductible pour effectuer des expériences dans la dépression. Cependant, en utilisant le CEI comme modèle de retenue répétitif, il est possible que les animaux expérimentaux puissent s'adapter à la CEI et y devenir insensibles. En outre, les tests de locomotion peuvent ne pas être appropriés car une contention prolongée pourrait affecter le mouvement des animaux. Par conséquent, l'établissement d'un point de retenue fixe dans un jour et des jours consécutifs est important pour minimiser d'autres facteurs, sauf la dépression. En outre, il est nécessaire d'effectuer le test comportemental et physiologique pour vérifier l'induction de la dépression après l'exposition au CEI.

En conclusion, malgré l'intérêt croissant des chercheurs pour la dépression, il reste difficile de définir systématiquement le mécanisme pathologique, qui peut être attribué à la pathophysiologie diverse et complexe de la dépression. Par conséquent, des modèles animaux simplifiés pour induire la dépression, comme le CEI, peuvent fournir des preuves importantes pour établir le mécanisme de l'induction de la dépression et suggérer une bonne plate-forme expérimentale pour obtenir des réponses thérapeutiques pour un problème mental aussi complexe.

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Disclosures

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Acknowledgments

Cette recherche a été soutenue par le Programme de recherche en sciences fondamentales par l'intermédiaire de la National Research Foundation of Korea (NRF) financé par le Ministère de l'éducation (NRF-2015R1A5A2008833 et NRF-2016R1D1A3B03934279) et la subvention de lnstitute of Health Sciences (IHS) GNU-2016-02) à l'Université nationale de Gyeongsang.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 ml disposable syringes Sungshim Medical P000CFDO
Balance A&D Company FX-2000i
Ball nozzle Jeung Do B&P JD-C-88
CCTV camera KOCOM KCB-381
Corticosterone ELISA kits Cayman Chemical
Digital lux meter TES TES-1330A
Ethovision XT 7.1 Noldus Information Technology
Isoflurane HANA PHARM CO., LTD. Ifran solution
Mice Koatech C57BL/6 strain
Restrainer Dae-jong Instrument Industry DJ-428
Saccharose (sucrose) DAEJUNG 7501-4400
Small animal isoflurane anaesthetic system Summit
Acrylic bar The apparatus was made in the lab for TST test
Tail suspension box The apparatus was made in the lab
Timer Electronics Tomorrow TL-2530
Water bottle Jeung Do B&P JD-C-79

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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