Isolatie van Myo cellen van volwassen muizen traan en submandibulaire klieren

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

De traanklier (LG) heeft twee soorten cellen uitdrukken α-Smooth spier actine (αSMA): Myo cellen (MECs) en pericyten. MECs zijn van ectodermale oorsprong, gevonden in vele klier weefsels, terwijl pericyten zijn vasculaire gladde spiercellen van endodermal oorsprong. Dit protocol isoleert MECs en pericyten van muizen LGs.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Zyrianova, T., Basova, L. V., Makarenkova, H. Isolation of Myoepithelial Cells from Adult Murine Lacrimal and Submandibular Glands. J. Vis. Exp. (148), e59602, doi:10.3791/59602 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

De traanklier (LG) is een exocriene tubuloacinar klier die een waterige laag van traanfilm afscheidt. De LG epitheel boom bestaat uit acinaire, ductale epitheel, en Myo cellen (MECs). MECs Express alpha Smooth spier actine (αSMA) en hebben een samentrekbaar functie. Ze zijn te vinden in meerdere klier organen en zijn van ectodermale oorsprong. Bovendien, de LG bevat SMA + vasculaire gladde spiercellen van endodermal oorsprong genaamd pericyten: samentrekbaar cellen die envelop het oppervlak van vasculaire buizen. Een nieuw protocol stelt ons in staat om zowel MECs en pericyten te isoleren van volwassen muizen LGs en submandibulaire klieren (SMGs). Het protocol is gebaseerd op de genetische etikettering van MECs en pericyten met behulp van de SMACreErt2/+: Rosa26-TdTomatoFL/FL muis stam, gevolgd door de voorbereiding van de LG single-cell schorsing voor FLUORESCENTie geactiveerd cel sorteren (FACS ). Het protocol zorgt voor de scheiding van deze twee cellen populaties van verschillende oorsprong op basis van de expressie van de epitheel cel adhesie molecuul (EpCAM) door MECs, terwijl pericyten niet Express EpCAM. Geïsoleerde cellen kunnen worden gebruikt voor cel teelt of Genexpressieanalyse.

Introduction

Myo cellen (MECs) zijn aanwezig in vele exocriene klieren, waaronder traan, speeksel, harderian, zweet, prostaat, en de borst. MECs zijn een uniek type cel dat een epitheel en een glad spier fenotype combineert. MECs Express α-Smooth spier actine (SMA) en hebben een samentrekbaar functie1,2. In aanvulling op MECs, de traanklier (LG) en de submandibulaire klier (SMG) bevat SMA + vasculaire cellen genaamd pericyten, die cellen van endodermal oorsprong die envelop het oppervlak van vasculaire buizen3. Hoewel MECs en pericyten Express veel markers, SMA is de enige marker die niet wordt uitgedrukt in andere LG en SMG cellen1,3.

In de laatste 40 jaar rapporteerden verschillende laboratoria analyses voor de dissociatie van verschillende exocriene klier weefsels, waarbij niet-enzymatische en enzymatische benaderingen werden toegepast. In één van de eerste rapporten die in 1980 worden gepubliceerd, beschreven Fritz en coauteurs een protocol om katachtige parotis acini te isoleren gebruikend opeenvolgende spijsvertering in een Collagenase/trypsine oplossing4. In 1989, Hann en coauteurs aangepast dit protocol voor acini isolatie van Rat LGs met behulp van een mengsel van Collagenase, hyaluronidase en DNase5. In 1990, Cripps en collega's publiceerde de methode van niet-enzymatische dissociatie van traanklier acini6. Later, in 1998, Zoukhri en coauteurs terug naar een enzymatische dissociatie protocol voor het opvolgen van CA2 +-Imaging op LG en SMG geïsoleerde acini7. Binnen het laatste decennium, hebben de onderzoekers hun nadruk op isolatie van stam/voorlopercellen van exocriene klieren gedraaid. Pringle en coauteurs beschreven een protocol in 2011 voor de isolatie van de muis SMG stamcellen8. Deze methode werd gebaseerd op isolatie van stamcellen-bevattende salispheres, die in cultuur werden gehandhaafd. De auteurs beweerden dat de proliferatie cellen die stamcel-geassocieerde markers uitdrukken van deze salispheres8zouden kunnen worden geïsoleerd. Shatos en coauteurs publiceerden het protocol voor de isolatie van de voorganger cel van ongewonde volwassen rat LGs gebruikend enzymatische spijsvertering en het verzamelen van "bevrijd" cellen9. Later, in 2015, Ackermann en coauteurs aangepast deze procedure te isoleren vermoedelijke "muizen traanklier stamcellen" ("mLGSCs") die kunnen worden gepropageerd als een mono-Layer cultuur over meerdere passages10. Echter, geen van de eerder genoemde procedures toegestaan voor het onderscheiden van cellulaire subtypen en individuele populaties van geïsoleerde epitheelcellen. In 2016, Gromova en coauteurs publiceerde een procedure voor de isolatie van de stem van LG/stamvader cellen van volwassen muizen LGs met behulp van FACS11. Dit protocol was echter niet bedoeld om MECs te isoleren.

Onlangs hebben we aangetoond dat we in staat zijn om SMA + cellen isoleren van 3 week-oude SMA-GFP muizen12. Echter, op dit moment hebben we niet gescheiden verschillende populaties van SMA + cellen. Hier vestigden wij een nieuwe procedure voor de directe isolatie van onderscheiden MECs en pericyten van volwassen LGs en SMGs.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle dieren werk werd uitgevoerd volgens de National Institute of Health (NIH) richtsnoeren en werd goedgekeurd door de institutionele Dierenzorg en het gebruik Comite van de Scripps Research Institute. Alle inspanningen werden geleverd om het aantal muizen en hun lijden te minimaliseren. Alle proefdieren kregen een standaard dieet met gratis toegang tot leidingwater.

Opmerking: De belangrijkste stappen voor MEC en pericyte isolatie zijn schematisch beschreven in Figuur 1a-F. Alle reagentia en apparatuur die voor deze procedure worden gebruikt, worden beschreven in tabel 1.

1. muizen en etikettering van de SMA-cellen

  1. Gebruik volwassen (2-4 maanden oud) Tamoxifen-afleidbaar, αSMA gedreven reporter muizen SMACreErt2/+: Rosa26-TdTomatoFL/FL.
    Opmerking: De SMACreErt2 stam werd vriendelijk verzorgd door Dr. Ivo Kalajzic13. Rosa26-TdTomatoFL/FL (B6. CG-gt (ROSA) 26Sortm9 (CAG-tdTomato) Hze/J, ook bekend als Ai9) stam (# 007909) werden gekocht van Jackson Laboratory (Sacramento, CA). SMA + cellen werden gelabeld door intraperitoneale tamoxifen (TM) Administration.
  2. Voorbereiding van Tamoxifen oplossing
    1. Bereid gefilterde maïsolie. Gebruik 0,22 µm vacuümfilter sinds maïsolie is viskeuze.
    2. Breng 1 g TM poeder van de fles over in een tube van 50 mL. Voeg 1 mL ethanol toe aan de fles, dop en schud het om vervolgens te spoelen toe te voegen aan een 50 mL buis. Herhaal nog eens 1 mL ethanol.
    3. Voeg gefilterde maïsolie toe om 50 mL van een 20 mg/mL TM oplossing te maken. Draai de buis, wikkel het in folie, en zet het in een schudden waterbad of schudden incubator op 45 ° c.
    4. Het kan ongeveer 12-24 uur duren om het TM te ontbinden. Van tijd tot tijd, verwijder de buis en controleer of de resterende kristallen. Zodra de TM is volledig opgelost, hoeveelheid en op te slaan bij-80 ° c. Een ontdooide hoeveelheid kan worden hergebruikt.
  3. Om te labelen SMA + cellen, injecteren muizen ze intraperitoneaal (IP) met TM op twee opeenvolgende dagen.
    1. Injecteren 3-4 weken oud SMACreErt2/+: Rosa26-TdTomatoFL/f een geslacht muizen met TM op 100 µ l/20 g (of 2 mg/20 g) lichaamsgewicht (Figuur 1a). Muizen zijn klaar om te worden gebruikt voor cel isolatie in 2-3 dagen na de laatste TM injectie. Indien nodig, geïnjecteerde muizen kunnen worden opgeofferd op langere termijn na TM injectie.
      Opmerking: Als controles voor een goede compensatie tijdens FACS, een wild type (C57Bl/6) muis en een SMACreErt2/+: Rosa26-TdTomatoFL/FL muis niet geïnjecteerd met TM (met "ongekleurd" MECs) van dezelfde leeftijd nodig zou zijn. Gebruik dezelfde berekeningen die voor 2 SMACreErt2/+: Rosa26-TdTomatoFL/FL muizen. Niet geïnjecteerd SMACreErt2/+: Rosa26-TdTomatoFL/FL zal de evaluatie van de DSRed achtergrond. De C57Bl/6 muis zal dienen als een negatieve controle van ongekleurde cellen.

2. oplossingen en buffers

Opmerking: De LG is een epitheel oorsprong klier die een extracellulaire matrix die dissociatie van cellen maakt moeilijk bevat. Daarom is het gebruik van een speciale combinatie van enzymen en een multistep spijsvertering hieronder beschreven wordt aanbevolen.

  1. Dispase type II voorraad oplossing (25x)
    1. Los 120 mg dispase type II poeder op in 2 mL 50 mM HEPES/150 mM NaCl om een 25x stockoplossing te bereiden (de uiteindelijke concentratie van dispase moet 30 eenheden/mL zijn). Eenheden per milligram kunnen variëren afhankelijk van het aantal muizen en de concentratie van de dispase moet dienovereenkomstig worden aangepast.
    2. Bereid 200 µ L-fracties en bewaar ze bij-70 °C voor maximaal 6 maanden of 4 °C gedurende meerdere dagen. Niet bevriezen/ontdooien van de hoeveelheid dispase meer dan een keer om enzym degradatie te voorkomen.
  2. DNase type I stockoplossing
    1. Los 5 mg DNase type I poeder op in een 5 mL oplossing van 50% glycerol, 20 mM tris buffer (pH 7,5), en 1 mM MgCl2 (voorraad concentratie moet ongeveer 2000 eenheden/ml). Eenheden per milligram kunnen variëren afhankelijk van het aantal muizen en dus concentratie van DNase moet dienovereenkomstig worden aangepast.
    2. Filter de stockoplossing met behulp van een 0,22 µm filter en een 10 mL spuit.
    3. Bereid 200 µ L-fracties en bewaar ze bij-70 °C voor maximaal 6 maanden of 4 °C gedurende meerdere dagen. Niet bevriezen/ontdooien meer dan een keer om enzym degradatie te voorkomen.
  3. Spijsvertering medium
    1. Aan 10 mL van DMEM lage glucose zonder glutamine, toevoegen 100 µ L van de cultuur supplement van de cel (b.v., Glutamax, Zie lijst van materialen) voor een verdunning van 1:100.
    2. Tot 2 mL DMEM lage glucose met cel kweek supplement, voeg 6 mg Collagenase type I toe en meng grondig door pipetten (enzym op nat ijs), 160 µ L van dispase stockoplossing (2,4 U/mL eindconcentratie), 16 µ L van DNase type I stockoplossing (8 U/mL eindconcentratie) , en 12 µ L van 1 M CaCl2 (6 mm eindconcentratie).
      Opmerking: Calcium is nodig om enzymatische activiteit te verhogen14,15. Alle berekeningen zijn voorzien voor de isolatie van cellen uit vier traanklieren van twee volwassen muizen. Het volume van de spijsvertering kan variëren, afhankelijk van de hoeveelheid weefsel en het aantal replica's. Gebruik niet meer dan 4 traanklieren van 2-4 maanden oude muizen per 2 mL medium.
  4. Blokkeren medium I
    1. Aan 25 mL van DMEM/F-12, voeg FBS (15% eindconcentratie), 250 µ L van de cultuur supplement van de cel (Zie lijst van materialen) voor een verdunning van 1:100, en 50 µ l van 0,5 M EDTA pH 8,0 (1 mm definitieve concentratie) toe.
      Opmerking: Van de verschillende soorten medium die werden vergeleken voor dit protocol DMEM/F-12 gaf de beste resultaten. Dit medium is ook gebruikt door andere onderzoekers te isoleren/cultuur epitheelcellen16,17.
  5. Blokkeren medium II
    1. Tot 25 mL PBS, voeg 50 µ L van 0,5 M EDTA pH 8,0 (1 mM eindconcentratie).
  6. Herstelmedium
    1. Tot 2 mL Peeters aangevuld met 5 mM MgCl2, voeg 100 µ l van DNase type I stockoplossing toe aan 100 U per 2 ml eindconcentratie. Relatief hoge concentraties van DNase-type I is nodig om de aggregatie van epitheelcellen te verminderen.
  7. Fluorescentie Activated Cell sorteren (FACS) buffer
    1. Voeg tot 486,5 mL PBS 12,5 mL serum (2,5% eindconcentratie) en 1 mL 0,5 M EDTA pH 8,0 (1 mM eindconcentratie) toe.
      Opmerking: De buffer kan worden opgeslagen bij 4 °C gedurende maximaal 6 weken.

3. Adult muis traanklier oogsten en microdissection

  1. Verdoven de muis door Isofluraan inhalatie (pas de Isofluraan debiet of de concentratie tot 5% of meer) en het offer door cervicale dislocatie. Voer anesthesie en euthanasie volgens institutionele IACUCs aanbevelingen uit.
  2. Met behulp van fijne Tang en schaar, verwijder de huid tussen het oog en oor (Figuur 2a).
  3. Om ontleden een LG, Trek voorzichtig LG met een pincet en op hetzelfde moment krassen op het bindweefsel rond de LG met behulp van de scherpe punt van kleine schaar om het te bevrijden (Figuur 2b).
  4. Vermijd snijden met een schaar, zoals de LG en parotis speekselklieren bevinden zich zeer dicht bij elkaar en moet worden gescheiden voorafgaand aan de dissectie. Wanneer LG en parotisklieren zijn gescheiden, snijd de LG met behulp van een schaar. Plaats de klieren in een 35 mm schaal met 2 mL koude PBS (Blijf op het ijs) (Figuur 1b).
  5. Zoals de LG wordt gedekt door een bindweefsel capsule/envelop, trim elke omliggende vet en bindweefsel onder een ontleden Microscoop en verwijder de LG capsule met twee Tang.
    1. Herhaal deze stap voor alle klieren.
  6. Controleer een klein stukje weefsel onder fluorescerende Microscoop om ervoor te zorgen Cell labeling (figuur 1c).

4. voorbereiding van LG single-cell schorsing

  1. Breng alle LGs in een 35 mm schotel met 0,5 mL kamertemperatuur (RT) spijsvertering media en Mince LGs met behulp van kleine scharen in zeer kleine stukjes (ongeveer 0.2-1 µm2). Normaalgesproken duurt het ongeveer 3 min tot 4 LGs Mince (figuur 2c).
  2. Breng het gehakte weefsel over in een 2 mL ronde bodem buis met behulp van een breed pipet filter tip. Gebruik een pipet van normale grootte met het uiteinde afgesneden (figuur 2D).
  3. Voeg tot 2 mL spijsvertering medium en meng door het inverteren van de buis.
  4. Plaats buis in een schudden incubator (of schudden waterbad), bij 37 °C, 100-120 rpm voor 90 min.
  5. Elke 30 min langzaam pipet klier stukken 20-30 keer met behulp van een 1.000 µ L filter tip met de dalende boring grootte (figuur 2D). Na incubatie/trituration, neem een 10 µ L hoeveelheid en Inspecteer onder een Microscoop voor clusters. Als clusters voortduren, voortzetting van de spijsvertering.
  6. Na 90 min, passeren de steekproef 2-3 keer door middel van een insuline spuit naald (31G) om verder te ontgrendelen cellen in suspensie.
    Opmerking: Geen zichtbare traanklier stukken moeten blijven in de oplossing zodra de spijsvertering is voltooid (figuur 1d).
  7. Overdracht cel schorsing om een 15 mL buis en voeg blokkeren media type I tot een totaal van 5 mL. Omkeren van de buis 2-3 keer te mengen.
  8. Passeer de cel schorsing door middel van een 70 μm cel zeef geplaatst op een 50 mL buis. Was de zeef met 1 mL van het blokkeren van media type I. Herhaal stap 4,8 opnieuw.
  9. Centrifugeer monsters bij 0,4 x g voor 5 min bij RT.
  10. Aspireren de bovendrijvende. De cellen in 2 mL van het blokkeren van mediumtype II opnieuw onderbreken met behulp van een pipet uiteinde van 1 mL en de schorsing van de cel in een micro centrifugebuis van 2 mL overbrengen.
  11. Centrifugeer de cellen bij 0,4 x g (24 x 1.5/2.0 ml rotor; Zie de lijst van materialen) voor 3 min bij RT.
  12. Aspireren bovendrijvende en re-Suspend cellen in 1 mL van de cel loslating oplossing (Zie tabel van materialen).
    Opmerking: Hier, de cel detachement oplossing is Accutase, een mariene oorsprong enzym met Proteolytische en collagenolytic activiteit die los/scheidt cellen voor de analyse van de cel oppervlak markers.
  13. Incubeer cellen bij 37 °C, bij 100-120 rpm voor 2-3 min. over-spijsvertering met cel loslating oplossing kan beschadigen cellulaire membranen.
  14. Overdracht cel schorsing in een 50 mL buis en voeg maximaal 10 mL van het blokkeren van mediumtype I. centrifugebuis bij 0,4 x g (24 x 1.5/2.0 ml rotor; Zie de lijst van materialen) voor 5 min.
  15. Gooi bovendrijvende en re-Suspend cellen in 6 mL van de herstelmedia en incubeer cellen voor 30 min bij RT.
  16. Controleer 10 µ L van cel opschorting onder de Microscoop om volledige cel dissociatie te verzekeren (Figuur 3).
  17. Tel cellen met behulp van een cel teller en Trypaanblauw blauw. Normaal, verwachten wij 4 x 105-6 x 106 cellen van vier lgs (één steekproef).
  18. Centrifugeer cellen bij 0,4 x g (24 x 1.5/2.0 ml rotor; Zie de lijst van materialen) voor 3 min bij RT en ga verder met antilichaam kleuring.

5. antilichaam het bevlekken

  1. Voeg tot 5 X105 cellen toe aan een tube van 2 ml met 400 µ l van FACS buffer. Voeg 5 µ L van briljante Violette 421 anti-Mouse CD326 (EpCAM) en 0,5 µ L van Ghost Red 780 (levensvatbaarheid kleurstof).
  2. In parallel, voor te bereiden controles om FACS compensatie aan te passen:
    Negatieve controle-1 (cellen van wild type muis)
    Achtergrond controle ongekleurd cellen uit SMACreErt2/+: Rosa26-TdTomatoFL/FL
    Cy7-780 gekleurde cellen (cellen uit het wild type muis gekleurd met de Ghost Red 780 levensvatbaarheid kleurstof)
    EpCAM-briljante Violette 421 (cellen van wilde type muis die met het EpCAM-briljante Violette 421 antilichaam wordt bevlekt).
    Opmerking: Voor elk controlemonster gebruik een minimum van 1 x 105 cellen per 400 µ l van FACS buffer.
  3. Na het toevoegen van elke reagens mix cellen grondig door pipetten.
  4. Wrap Tube (s) met folie en roteren buizen voor 45 min bij 4 ° c.
  5. Centrifugeer monsters bij 0,4 x g (24 x 1,5/2,0 ml rotor; Zie de lijst van materialen) voor 3 min bij 4 °c.
  6. Re-Suspend cellen in 1 mL van de FACS buffer. Het is belangrijk om cellen te wassen om de achtergrond te verminderen tijdens de compensatie.

6. fluorescentie geactiveerd cel sorteren

  1. Overdracht van cel schorsing in 5 mL FACS buizen en ga verder met FACS analyse. Houd cellen op ijs.
  2. Compensatie aanpassen met één kleur besturingselementen.
  3. Sorteer cellen op 20 psi via een sproeier van 100 μm met behulp van de juiste stroom cytometer (Zie tabel van materialen). Gating strategy18 wordt weergegeven in Figuur 1e en Figuur 4.
  4. Verzamelen gesorteerde cellen in middelgrote, RNA-later, FACS of lysis buffers afhankelijk van de downstream-procedures (Figuur 1e, F).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Muismodel te isoleren SMA + MECs en pericyten
Het gevestigde protocol zorgt voor de isolatie van twee zuivere populaties: MECs en pericyten van LGs en SMGs (Zie tabel 1). Deze twee typen cellen hebben een andere grootte en uitstraling. Microvasculaire pericyten, ontwikkelen rond de wanden van haarvaten (figuur 5a) en hebben een vierkante vorm (Figuur 5b), terwijl MECs surround de LG secretoire acini, hebben lange processen en bezetten een relatief groot gebied (figuur 5a, B ). De beschreven procedure is gebaseerd op genetische cel etikettering van SMA + in de TM-afleidbaar SMACreErt2/+: Rosa26-TdTomatoFL/FL muis stam. Additonally, EpCAM antilichamen kunnen de onderzoekers te onderscheiden epitheel SMA+: EpCAM+ cellen van ectodermale oorsprong (MECs) en SMA+EpCAM- cellen van endodermal oorsprong (pericyten).

Voorbereiding van de schorsing met één cel
De LG bevat een gloeiende extracellulaire matrix die grondig moet worden verteerd. De meegeleverde protocol maakt de voorbereiding van een enkele cel oplossing voor FACS analyse en verdere toepassingen. Het voorbeeld van gescheiden cellen wordt weergegeven in Figuur 3.

MEC en pericyte isolatie door FACS
Om MECs van pericyten te onderscheiden, werden de enige cellen bevlekt met antilichaam aan EpCAM, die slechts epitheelcellen ontdekt. De belangrijkste bevolking van cellen werd bepaald door voorwaarts en zij verstrooiings gebied gating (figuur 4a). Doubletten werden uitgesloten door de voorwaartse spreiding gebied versus breedte en met de zijkant Scatter gebied versus breedte (figuur 4b). Dode cel uitsluiting werd gedaan via Ghost Red 780 (levensvatbaarheid kleurstof) (figuur 4c). Een ongelabelde controle (figuur 4e), achtergrond controle en antilichaam controle gelabeld met een enkele primaire antilichaam werden gebruikt om de achtergrondgeluid (niet-specifieke antilichaam bindend) te bepalen en om een goede compensatie voor een optimale scheiding vast te stellen tussen de signalen (figuur 4D). Data analyses werden uitgevoerd met behulp van FlowJo software.

MECs en pericyten werden gated door DsRed labeling. DsRed+ Dim (niet afgebeeld) en DsRed+ Bright cellen binnen zowel mec en pericyte cel populaties werden gedetecteerd (figuur 4D). De helderheid van gelabelde cellen kan afhangen van het niveau van de SMA-expressie of de mate van verslaggever activering op TM injectie19. Slechts werd de DS rode+ heldere cel bevolking verzameld aangezien slechts de volledig onderscheiden cellen werden vereist. De DS Red+ Dim Cell populaties vereisen verder onderzoek.

Downstream-toepassingen
Het is algemeen bekend dat MECs een belangrijke samentrekbaar functie in exocriene klieren speelt. Bovendien zijn ze zeer plastic cellen en hebben kenmerken van stamcellen. Daarom kunnen geïsoleerde MECs worden gebruikt in meerdere toepassingen. Bijvoorbeeld, kunnen de cellen worden gekweekt, gebruikt voor de isolatie van RNA of transplantatie (Figuur 1f)12,20,21,22.

Parameter Traanklier Submandibulaire klier
Aantal muizen per monster 2 1
Aantal klieren per monster 4 2
De klieren van de dissectie Los van de parotis klier Scheiden van sublinguale klier
Concentratie van Collagenase per monster 6 mg/2 mL 9 mg/2 mL
Benaderend cel aantal na enzymatische scheiding 4x105-6x105 9x105-1.5 X106
Herstel stap (Zie de sectie "volwassen muis traanklier eencellige dissociatie", punt 15) Cellen in 6 ml herstelmedia opnieuw onderbreken Cellen in 12 mL herstelmedia opnieuw onderbreken
Volume van FACS buffer tijdens antilichaam het bevlekken 400 µ L 2 tubes door 400 µ L; het is beter om de cellen te splitsen in twee of drie buizen die elke buis heeft niet meer dan 6x105

Tabel 1: wijzigingen van het protocol voor de isolatie van cellen uit de submandibulaire klier (SMG). De tabel beschrijft belangrijke wijzigingen die nodig zijn om MECs en pericyten te isoleren van muizen SMG in vergelijking met de procedure voor muizen LG.

Figure 1
Figuur 1: een schematische weergave van het experiment. (A) IP-injecties van de SMACreErt2/+: Rosa26-TdTomatoFL/FLmuizen met TM. (B) isolatie en gehakt van de LG of SMG. (C) analyse van de cel etikettering met behulp van fluorescentiemicroscoop. Dmulti-step enzymatische spijsvertering om een single-cell oplossing voor te bereiden. Het is essentieel om de spijsverterings stappen onder een lichte Microscoop te controleren om ervoor te zorgen dat de cellen van clusters worden vrijgegeven. (E) voorbeeld van GATING toont SMA + Bright DS Red +/EpCAM + (MECs) en DS Red + Bright/EpCAM-(pericyten). (F) de verzamelde MECs en pericyten zouden aan verschillende stroomafwaartse procedures met inbegrip van de cultuur van de cel, de isolatie van RNA en de analyse van de genexpressie en cel transplantatie kunnen worden onderworpen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: kritieke stappen van LG isolatie/gehakt. (A) verwijdering van de huid tussen het oog en oor ontleden LG. gestreepte gele cirkel geeft LG locatie. (B) LG dissectie. Gele pijlpunt wijst gebied tussen traan en parotisklieren. (C) LG gehakt in de spijsvertering medium met behulp van een schaar met gebogen, stompe uiteinden. Doverdracht van gehakt weefsel in 2 ml buis. Gele pijlpunt toont brede boring maat 1 ml tip die nodig zijn voor de overdracht. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 4

Figuur 3: confocale en differentieel interferentie contrast (DIC) beelden illustreren gescheiden enkele cellen van muizen LG. (A-C) enkele cellen geïsoleerd van twee lgs van een 4 maanden oude SMACreErt2/+: Rosa26-TdTomatoFL/FL muis. Kernen zijn gekleurd met DAPI (blauw). Witte pijlpunten duiden op SMA + (DS Red) cellen: MECs of pericyten. Schaalbalk = 15 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 3

Figuur 4: identificatie van muizen LG MECs en pericyten met behulp van FACS. (A) bepaling van de belangrijkste populatie van LG cellen door voorwaartse en zijdelingse spreiding gebied gating. (B) uitsluiting van doubletten via forward spreidings gebied versus breedte. (C) dode cel uitsluiting via Ghost Red 780 (levensvatbaarheid kleurstof). (D) MEC (SMA+ Bright/EpCAM+) en Pericyte (SMA+ Bright/EpCAM-) populaties onderscheiden op basis van kleuring met EpCAM antilichaam. (E) ongelabelde controle (cellen van wild type muis). Op elk perceel wordt het% van de gated cellen geleverd. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 5
Figuur 5: confocale beelden tonen verschil in verdeling en vorm tussen MECs en pericyten geïsoleerd van muizen LG. (A) hele Mount voorbereiding van LG met gelabelde cellen waaruit verschil in verdeling tussen mec en pericyten. (B) de vorm van mec en pericyte is anders. Pericyte is relatief klein en heeft squired vorm, terwijl MEC is groot en heeft onregelmatige vorm en een aantal lange processen. Pijlpunten = MECs en pericyten. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Dit manuscript beschreef een protocol van MEC en pericyte isolatie van LG en SMG. Deze procedure was gebaseerd op genetische etikettering van SMA, de enige betrouwbare biomarker van MECs en pericyten.

De urgentie om dit protocol te ontwikkelen werd gemotiveerd door de bijna totale afwezigheid van literatuur die de isolatie van MECs van muizen LGs en SMGs benadrukt. Hoewel de genetische etikettering eerder werd gebruikt, gebruikend SMA-GFP muizen om SMA + cellen van jonge drie-week-oude LGs12te isoleren, liet het niet het gebruik toe deze oudere muizen voor cel isolatie toe te schrijven aan gedeeltelijk verlies van signaal in volwassen muizen. Bovendien geven GFP-geëtiketteerde cellen een vrij hoge achtergrond in FACS toepassingen23 en vereisen extra compensaties. In tegenstelling, de SMACreErt2/+: Rosa26-TdTomatoFL/FL muis lijn toont geen of een lage achtergrond en hoge niveaus van SMA labeling activering in de hele muis postnatale ontwikkeling, volwassenheid en veroudering. Gebruik van de SMACreErt2/+: Rosa26-TdTomatoFL/FL muis is vooral belangrijk voor studies gericht op progressie van de ziekte of veroudering, aangezien SMA + cellen in deze muizen kunnen worden geëtiketteerd voorafgaand aan de ontwikkeling van de ziekte en later bestudeerd wanneer ziekte/veroudering vordert. Een andere kritieke stap van het protocol is grondig LG gehakt en de volgende spijsvertering. Deze stap kan het cellen aantal dat tijdens FACS analyse wordt verkregen verminderen. Globaal, is de isolatie en de directe analyse van primaire cellen ook belangrijk toe te schrijven aan significante veranderingen in de transcriptie profielen van cellen die in cultuur24worden gehandhaafd.

Bovendien, het beschreven protocol voor MEC en pericyte isolatie van muizen LGs maakt verschillende downstream-procedures. Eiwitten, RNA en DNA-extracties zijn mogelijk van zowel eencellige populaties, hoewel verschillende muizen/monsters moeten worden verwerkt in parallel of sequentieel om het aantal cellen te verhogen. Samen genomen, de verkregen resultaten tonen een effectieve en relatief eenvoudige manier voor MEC en pericyte isolatie van verschillende muizen klierweefsel.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen en geen conflicten van andere belangen.

Acknowledgments

Wij danken Dr. Ivo Kalajzic voor het verstrekken van ons met de SMACreErt2 muis stam, Tok Umazume voor muis staart en genotypen, Mark Shelley voor het verwerven van professionele Foto's voor figuur 2. Wij danken ook Scripps Raad van wetenschappelijke redactie en Mark Shelley voor wetenschappelijke Engels bewerken. Wij zijn dankbaar voor de Scripps Research Institute flow Cytometry core voor hulp bij het sorteren van cellen en Dr Robin Willenbring voor meerdere discussies/advies over FACS data-analyse.

Dit werk werd gesteund door de nationale instituten van gezondheid, het nationale Instituut van het oog verleent 5 R01 EY026202 en 1 R01 EY028983 aan H.P.M.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Biosafety Cabinet SterilCard Baker 19669.1 Class II type A/B3
10 mL Disposable serological pipets VWR 89130-910 Manufactured from polystyrene and are supplied sterile and plugged
10 mL Disposable serological pipets VWR 89130-908 Manufactured from polystyrene and are supplied sterile and plugged
15 mL High-clarity polypropylene conical tubes Falcon 352196
25 mL Disposable serological pipets VWR 89130-900 Manufactured from polystyrene and are supplied sterile and plugged
5 mL FACS round-bottom tubes Fisher Scientific, Falcon 14-959-11A
50 mL High-clarity polypropylene conical tubes Falcon 352070
Antibiotic-antimycotic Invitrogen 15240-062
Appropriate filter and non-filter tips Any available Any available
BD Insulin Syringes Becton Dickinson 328468 with BD Ultra-Fine needle ½ mL 8 mm 31 G
BD Syringes 10 mL Becton Dickinson 309604 Sterile
Brilliant Violet 421 anti mouse CD326 (EpCAM) Biolegend 118225 Monoclonal Antibody (G8.8)
CaCl2 1M solution BioVision B1010 sterile
Cell culture dishes 35 mm Corning 430165 Non-pyrogenic, sterile
Collagenase Type I Wortington LS004194
Corn oil Any avaliable Any avaliable From grocery store
Corning cell strainer size 70 μm Sigma-Aldrich CLS431751-50EA
Digital Stirrer PC-410D Corning Item# UX-84302-50
Dispase II Sigma-Aldrich D4693-1G
Dissecting scissors, curved blunt McKesson Argent 487350 Metzenbaum 5-1/2 Inch surgical grade stainless steel non-sterile finger ring handle
DNase I Akron Biotech, catalog number AK37778-0050
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium – low glucose (DMEM) Sigma-Aldrich D5546-500ML with 1,000 mg/L glucose and sodium bicarbonate, without L-glutamine
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/F12 (DMEM/F12) Millipore DF-042-B without HEPES, L-glutamine
Easypet 3 pipette controller Eppendorf 4430000018 with 2 membrane filters 0.45 µm, 0.1 – 100 mL
Ethanol Sigma-Aldrich E7023-500ML
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma-Aldrich E6758
Fisher Vortex Genie 2 Fisher Scientific 12-812
FlowJo version 10 Any available Any available
Fluorescence binocular microscope Axioplan2 Carl Zeiss ID# 094207
Ghost Red 780 Viability Dye Tonbo Biosciences 13-0865-T100
GlutaMAX Supplement ThermoFisher Scientific, Gibco 35050061
Glycerol 99% Sigma-Aldrich G-5516
Hand tally counter Heathrow Scientific HEA6594
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) Sigma Millipore H6648-500ML Modified, with sodium bicarbonate, without calcium chloride, magnesium sulphate, phenol red.
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) ThermoFisher Scientific 14025092 With calcium, magnesium, no phenol red.
Hausser Bright-Line Phase Hemocytometer Fisher Scientific 02-671-51B 02-671-51B
HEPES 1 M solution ThermoFisher Scientific, Gibco 15630-080 Dilute 1/10 in ddH20
HyClone Fetal Bovine Serum (FBS) Fisher Scientific SH3007002E
Hydrochloric Acid (HCl), 5 N Volumetric Solution JT Baker 5618-03 To adjust Tris buffer pH
Innova 4230 Refrigerated Benchtop Incubator New Brunswick Scientific SKU#: Shaker; 37 °C, 5% CO2 in air
Iris scissors Aurora Surgical AS12-021 Pointed tips, delicate, curved, 9 cm, ring handle
Isoflurane Inhalation Anesthetic Southern Anesthesia Surgical (SAS) PIR001325-EA
MgCl2 1 M solution Sigma-Aldrich 63069-100ML
Microcentrifuge tubes 1.5 mL ThermoFisher Scientific 3451 Clear, graduated, sterile
Microsoft Power Point Any available Any available
NaCl powder Sigma-Aldrich S-3014
Nalgene 25 mm Syringe Filters Fisher Scientific 724-2020
Pen Strep Gibco 15140-122
pH 510 series Benchtop Meter Oakton SKU: BZA630092
Phosphate buffered saline (PBS) ThermoFisher Scientific 10010023 pH 7.4
Pure Ethanol 200 Proof Pharmco-Aaper 111000200
Red blood cell lysis buffer 10x BioVision 5831-100
Roto-torque Heavy Duty Rotator Cole Parmer MPN: 7637-01
Safe-lock round bottom Eppendorf tubes 2 mL Eppendorf Biopur 22600044 PCR inhibitor, pyrogen and RNAse-free
Scissors Office Depot 375667
Sorting flow cytometer MoFlo Astrios EQ Beckman Coulter B25982 With Summit 6.3 software
Sorvall Legend Micro 17R Microcentrifuge Thermo Scientific 75002441 All centrifugation performed at RT
Sorvall RT7 Plus Benchtop Refrigerated Centrifuge Thermo Scientific ID# 21550 RTH-750 Rotor. All centrifugation performed at RT
Stemi SV6 stereo dissecting microscope Carl Zeiss 455054SV6 With transmitted light base
Tamoxifen Millipore Sigma T5648-1G
Trizma base powder Sigma-Aldrich T1503
Trypan blue solution Millipore Sigma T8154
Two Dumont tweezers #5 World Precision Instruments 500342 11 cm, Straight, 0.1 mm x 0.06 mm tips
Upright microscope Any available Any available With transmitted light base
Vacuum filtration systems, standard line VWR 10040-436
Variable volume micropipettes Any available Any available

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Makarenkova, H. P., Dartt, D. A. Myoepithelial Cells: Their Origin and Function in Lacrimal Gland Morphogenesis, Homeostasis, and Repair. Current Molecular Biology Reports. 1, (3), 115-123 (2015).
  2. Haaksma, C. J., Schwartz, R. J., Tomasek, J. J. Myoepithelial cell contraction and milk ejection are impaired in mammary glands of mice lacking smooth muscle alpha-actin. Biology Of Reproduction. 85, (1), 13-21 (2011).
  3. Siedlecki, J., et al. Combined VEGF/PDGF inhibition using axitinib induces alphaSMA expression and a pro-fibrotic phenotype in human pericytes. Graefe’s Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. (2018).
  4. Fritz, M. E., LaVeau, P., Nahmias, A. J., Weigel, R. J., Lee, F. Primary cultures of feline acinar cells: dissociation, culturing, and viral infection. American Journal of Physiology. 239, (4), G288-G294 (1980).
  5. Hann, L. E., Tatro, J. B., Sullivan, D. A. Morphology and function of lacrimal gland acinar cells in primary culture. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 30, (1), 145-158 (1989).
  6. Cripps, M. M., Bromberg, B. B., Bennett, D. J., Welch, M. H. Structure and function of non-enzymatically dissociated lacrimal gland acini. Current Eye Research. 10, (11), 1075-1080 (1991).
  7. Zoukhri, D., Hodges, R. R., Rawe, I. M., Dartt, D. A. Ca2+ signaling by cholinergic and alpha1-adrenergic agonists is up-regulated in lacrimal and submandibular glands in a murine model of Sjogren's syndrome. Clinical Immunology and Immunopathology. 89, (2), 134-140 (1998).
  8. Pringle, S., Nanduri, L. S., van der Zwaag, M., van Os, R., Coppes, R. P. Isolation of mouse salivary gland stem cells. Journal of Visualized Experiments. (48), (2011).
  9. Shatos, M. A., Haugaard-Kedstrom, L., Hodges, R. R., Dartt, D. A. Isolation and characterization of progenitor cells in uninjured, adult rat lacrimal gland. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53, (6), 2749-2759 (2012).
  10. Ackermann, P., et al. Isolation and Investigation of Presumptive Murine Lacrimal Gland Stem Cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56, (8), 4350-4363 (2015).
  11. Gromova, A., et al. Lacrimal Gland Repair Using Progenitor Cells. Stem Cells Translational Medicine. 6, (1), 88-98 (2017).
  12. Hawley, D., et al. Myoepithelial cell-driven acini contraction in response to oxytocin receptor stimulation is impaired in lacrimal glands of Sjogren's syndrome animal models. Scientific Reports. 8, (1), 9919 (2018).
  13. Matic, I., et al. Quiescent Bone Lining Cells Are a Major Source of Osteoblasts During Adulthood. Stem Cells. 34, (12), 2930-2942 (2016).
  14. Bond, M. D., Van Wart, H. E. Characterization of the individual collagenases from Clostridium histolyticum. Biochemistry. 23, (13), 3085-3091 (1984).
  15. Eckhard, U., Schonauer, E., Brandstetter, H. Structural basis for activity regulation and substrate preference of clostridial collagenases. G, H, and T. Journal of Biological Chemistry. 288, (28), 20184-20194 (2013).
  16. Breggia, A. C., Himmelfarb, J. Primary mouse renal tubular epithelial cells have variable injury tolerance to ischemic and chemical mediators of oxidative stress. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 1, (1), 33-38 (2008).
  17. Mueller, S. O., Clark, J. A., Myers, P. H., Korach, K. S. Mammary gland development in adult mice requires epithelial and stromal estrogen receptor alpha. Endocrinology. 143, (6), 2357-2365 (2002).
  18. Guthmiller, J. J., Zander, R. A., Butler, N. S. Measurement of the T Cell Response to Preerythrocytic Vaccination in Mice. Methods in Molecular Biology. 1325, 19-37 (2015).
  19. Seime, T., et al. Inducible cell labeling and lineage tracking during fracture repair. Development, Growth & Differentiation. 57, (1), 10-23 (2015).
  20. Hawley, D., et al. RNA-Seq and CyTOF immuno-profiling of regenerating lacrimal glands identifies a novel subset of cells expressing muscle-related proteins. PLoS One. 12, (6), e0179385 (2017).
  21. Tata, A., et al. Myoepithelial Cells of Submucosal Glands Can Function as Reserve Stem Cells to Regenerate Airways after Injury. Cell Stem Cell. 22, (5), 668-683 (2018).
  22. Song, E. C., et al. Genetic and scRNA-seq Analysis Reveals Distinct Cell Populations that Contribute to Salivary Gland Development and Maintenance. Scientific Reports. 8, (1), 14043 (2018).
  23. Knight, A. ndrewW., B, N. Distinguishing GFP from cellular autofluorescence. Biophotonics International. 8, (7), 7 (2001).
  24. Januszyk, M., et al. Evaluating the Effect of Cell Culture on Gene Expression in Primary Tissue Samples Using Microfluidic-Based Single Cell Transcriptional Analysis. Microarrays (Basel). 4, (4), 540-550 (2015).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics