Een muis model van vasculaire Heterotopic milt transplantatie voor het bestuderen van milt celbiologie en transplantatie immuniteit

* These authors contributed equally
Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Dit protocol Details van de chirurgische stappen van een muismodel van vasculaire heterotopic milt transplantatie, een technisch uitdagend model dat kan dienen als een krachtig instrument in het bestuderen van het lot en de levensduur van de Miltcellen, de mechanismen van verschillende milt cel populaties in progressie van de ziekte, en transplantatie immuniteit.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Wang, J. J., Qiu, L., Fernandez, R., Yeap, X. Y., Lin, C. X., Zhang, Z. J. A Mouse Model of Vascularized Heterotopic Spleen Transplantation for Studying Spleen Cell Biology and Transplant Immunity. J. Vis. Exp. (148), e59616, doi:10.3791/59616 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

De milt is een unieke lymfe orgel dat een cruciale rol speelt in de homeostase van het immuunsysteem en hematopoietische systemen. Patiënten die splenectomie hebben ondergaan, ongeacht neerslaan oorzaken zijn vatbaar voor een overweldigende post-splenectomie infectie te ontwikkelen en de ervaring verhoogde Risico's van diepe veneuze trombose en maligniteiten. Onlangs, epidemiologische studies aangegeven dat splenectomie zou kunnen worden geassocieerd met het optreden van hart-en vaatziekten, wat suggereert dat fysiologische functies van de milt nog niet volledig zijn erkend. Hier introduceren we een muismodel van vasculaire heterotopic milt transplantatie, die niet alleen kan worden gebruikt om de functie en gedrags-activiteit van milt immuun cel subsets in verschillende biologische processen studie, maar ook kan een krachtig instrument om te testen het therapeutische potentieel van milt transplantatie bij bepaalde ziekten. De belangrijkste chirurgische stappen van dit model zijn donor milt oogst, het verwijderen van de ontvanger inheemse milt, en milt Graft revascularisatie. Met behulp van congenic muis stammen (bijv. muizen met CD 45.1/CD 45.2 achtergronden), hebben we opgemerkt dat na syngeneic transplantatie, zowel donor-afgeleide milt lymfocyten en myeloïde cellen gemigreerd uit de Graft zo vroeg post-operatieve dag 1, gelijktijdig met de instroom van meerdere soorten ontvangers cellen, waardoor het genereren van een unieke hersenschim.  Ondanks de relatief uitdagende technieken, kan deze procedure worden uitgevoerd met > 90% slaagkans. Dit model maakt het bijhouden van het lot, levensduur, en de functie van splenocyten tijdens steady state en in een ziekte setting na een milt transplantatie, waardoor het aanbieden van een grote kans om de duidelijke rol voor de milt afgeleide immuun cellen te ontdekken in verschillende ziekteprocessen.

Introduction

De milt is het grootste secundaire lymfe orgaan in het lichaam en is kritiek in de immune en hematopoietische systemen. De functies worden voornamelijk uitgevoerd door twee morfologisch verschillende compartimenten, de rode pulp en de witte pulp1. De rode pulp is een drie-dimensionale trabekelnetwerk van veneuze sinussen en milt koorden die bestaan uit reticulaire vezels, reticulaire cellen, en de bijbehorende macrofagen. Deze unieke structuur kan de rode pulp op te treden als een effectief bloed filter dat buitenlandse materialen en oude of beschadigde bezinkingen verwijdert. De witte pulp bevat follikels, marginale zone, en de periarteriolar lymfe scheden (PALS) en is een belangrijke site voor antigeen overvulling en verwerking, lymfocyten automatisch besturen, transformatie, proliferatie, en rijping2. Niettemin, de milt is algemeen beschouwd als een uitvoerbaar orgaan, omdat andere lymfeorganen, zoals lymfeklieren, kan ook uitvoeren van een aantal van haar functies en het verlies van milt niet meestal leiden tot de dood. Splenectomie is daarom op grote schaal uitgevoerd als een therapeutische methode voor patiënten met milt letsel of goedaardige hematologische ziekten3. Echter, patiënten met splenectomie geconfronteerd met een aantal lange-termijn complicaties. Bacteriële infecties zijn de best-erkende complicaties van splenectomie4,5. Onlangs heeft de overweldigende post-splenectomie sepsis is erkend als een intensieve complicatie van splenectomie geassocieerd met een hoge mortaliteit6. Bovendien blijkt uit recente epidemiologische studies dat splenectomie kan worden geassocieerd met het optreden van hart-en vaatziekten, wat suggereert dat verdere fysiologische functies van de milt nog moeten worden verkend7,8.

Zowel milt transplantatie en milt allotransplantation zijn gebruikt in de kliniek. Momenteel, milt transplantatie door het implanteren van secties van milt weefsel in zakjes gemaakt in de grotere Omentum wordt beschouwd als de enige mogelijkheid voor het behoud van milt functie na traumatische splenectomie9,10. Echter, de werkzaamheid van deze operatie is discutabel als post-chirurgie complicaties zoals aseptische necrose van de milt weefsel en kleine darmobstructie als gevolg van postoperatieve aanhechtingen kunnen optreden11. Milt allotransplantation is betrokken bij multiviscerale transplantatie12. Klinisch bewijs van multiviscerale transplantatie suggereert dat milt allotransplantation kan een beschermende rol spelen in kleine darm Allograft afwijzing zonder dat graft-versus-host Disease (GVHD)12. Maar toch is de literatuur betreffende het gunstige effect van milt allotransplantation als component van multiviscerale transplantatie nog beperkt en de onderliggende mechanismen blijven worden bepaald. In 2006, Yair Reisner et al. gemeld dat transplantatie varken embryonale milt weefsel dat geen T-cellen heeft om muizen kon genezen hemofilie A, een genetische ziekte zonder dat GVHD13, ondersteuning van die milt transplantatie houdt therapeutische belofte in bepaalde ziekten. Daarom is er behoefte aan verder onderzoek naar het therapeutische potentieel van milt transplantatie.

De dierlijke modellen van milt transplantatie zijn waardevol om de niet gewaardeerde functie van de milt-afgeleide immune cellen in ziektevooruitgang te onderzoeken evenals het potentiële therapeutische effect van milt transplantatie te testen. Experimentele hele milt transplantatie modellen zijn gedocumenteerd sinds begin 1900, zoals beoordeeld door Cohen14. In 1969, Coburn Richard J. en Lee et al. gedetailleerd de techniek van milt transplantatie bij ratten15,16. Meer recentelijk, Swirski FK et al. beschreven een muismodel van milt transplantatie17. Vergeleken met ratten modellen, Muismodellen van de milt transplantatie zijn aantrekkelijker te wijten aan de verschillende inherente voordelen. Bijvoorbeeld, door gebruik te maken van een muismodel, kunnen we toegang tot een expansieve verscheidenheid van reagentia die niet beschikbaar zijn voor die van Rat modellen. Bovendien, door het gebruik van congenic muizen (bijvoorbeeld muizen met CD 45.1/CD 45.2 achtergrond), een syngeneic milt transplantatie maakt het mogelijk om het lot, de levensduur en de functie van splenocyten18track. Gebaseerd op het werk van Swirski FK et al.17, hebben we dit vereenvoudigde en verbeterde Protocol van milt transplantatie in muizen verder vastgesteld. Het protocol hieronder beschreven combineert zowel betrouwbaarheid en haalbaarheid op een gestandaardiseerde wijze en kan worden gebruikt als een instrument om milt biologie en transplantatie immuniteit studie.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle procedures en het gebruik van dieren in deze studie werden uitgevoerd volgens de protocollen goedgekeurd door de Northwestern University interne zorg en het gebruik Comite (DEC). In deze studie, 8 tot 10 week oude mannelijke CD 45.2 en CD 45.1 muizen (zowel op BALB/c achtergrond, van Jackson Laboratory) werden gebruikt als milt donoren en ontvangers, respectievelijk te creëren syngeneic milt transplantatie modellen. Alle dieren werden gehuisvest in de steriele omgeving in de dieren faciliteiten van de Northwestern University. Het oog smeermiddel werd toegepast op alle muizen post-anesthetization om droogte te voorkomen.

1. chirurgische voorbereiding, anesthetization, en analgesie regime

  1. Plaats een steriel wegwerp Laken (45,7 cm x 66 cm) op het chirurgische platform. Grijp voorzichtig de muis, injecteren ketamine (50 mg/kg) en xylazine (10 mg/kg) ze intraperitoneaal (i. p) voor anesthesie, en injecteren 0,05 mg/kg buprenorfine onderhuids voor analgesie.
  2. Zorg voor de diepte van de anesthesie door teen-pinch, scheren het haar in de hele buik gebied met een scheermes en plaats de muis op de steriele chirurgische platform onder de operationele Microscoop op 6-10x vergroting.

2. donor milt oogst

  1. Steriliseer de buik met een alcohol prep pad, veilig de ledematen met chirurgische tape, en maak een 3-4 cm middellijn verticale huid incisie van de pubis aan de xiphoid proces met een schaar.
  2. Intrekken van de buikwand met steriele OPROLMECHANISMEN gemaakt van paperclips. Verplaats de darmen naar de rechterflank van de buik (chirurg links) kant met een steriele wattenstaafje om de milt bloot. Toeschroeien de korte maag ader verbonden aan de milt met een steriele lage temperatuur cauterisatie (Figuur 1a). Plaats een stuk steriel gaas gedrenkt met 37 ° c zout over de milt te houden vochtig (Figuur 1b).
  3. Scheiden en mobiliseren van de poortader van de pancreas weefsel (figuur 1c) door ligating de poortader takken (superieure pancreaticoduodenal ader en rechter maag ader); plaats een hechtdraad rond de poortader DISTAAL van de milt ader (figuur 1d).
  4. Flip de milt aan de rechterkant om de aorta en coeliakie stam bloot met de milt slagader (Figuur 1e). Ontleden en mobiliseren aorta-coeliakie-milt slagader door ligating de Leverslagader en maag slagader; plaats een hechtdraad rond de aorta proximaal van de coeliakie slagader (Figuur 1f-G).
  5. Injecteren 100 internationale eenheden (IU) heparine in de inferieure vena cava (IVC) om het hele lichaam te heparinize en 3 minuten wachten om de heparine te verzekeren effecten te nemen. Binden de aorta proximaal aan coeliakie slagader, transect de poortader, en vervolgens perfuse het hele lichaam met behulp van 10 mL van heparinized koude (4 ° c) zoutoplossing (10 mL/20 s) van de abdominale aorta DISTAAL naar coeliakie stam (figuur 1h).
  6. Verzamel de milt Graft en bloc met de bijbehorende aorta-coeliakie-milt segment en de poortader samen met een segment van milt ader en een klein deel van de pancreas weefsel. Behoud van de graft in 5 mL van 4 °C zoutoplossing vóór transplantatie. Euthanaseren de muis door cervicale dislocatie.

3. ontvanger splenectomie en milt enten implantatie

  1. Plaats een verwarmingskussen op het chirurgische platform en stel de temperatuur in op 37 °C. Plaats een steriel Laken (45,7 cm x 66 cm) bovenop het verwarmingskussen om een steriel chirurgisch platform te creëren. Herhaal de stappen 2,1 en 2,2 voor chirurgische voorbereiding en anesthetization. Maak een 3-4 cm middellijn incisie en trek de buikwand zoals beschreven in stap 2,1 en stap 2,2.
  2. Voorzichtig Beweeg de darm naar de rechterkant van de muis met een steriele wattenstaafje aan de ontvanger de milt bloot. Binden de milt ader en slagader en verwijder de milt.
  3. Voorzichtig Beweeg de darm naar de linker kant van de muis en bedek de darmen met natte gaas (gedrenkt met steriele 37 °C zoutoplossing). Ontleden en binden de lumbale takken van de infrarenal aorta en IVC; Cross-Clamp de infrarenal aorta en IVC met behulp van twee 4 mm microvasculaire klemmen.
  4. Plaats een 11-0 nylon hechting door de infrarenal aorta (een volledige dikte) en trekken om een elliptische aortotomy te maken door een enkele snede met een microschaar (de lengte moet overeenkomen met de diameter van de donor aorta, Figuur 2a). Pierce het IVC met een 30 G naald om een elliptische venotomy te creëren en de opening te verlengen tot donor poortader-matched lengte met behulp van microschaar (Figuur 2a).
  5. Wis het intraluminal bloed of bloedstolsel (in de aorta en IVC) met 500 l van heparinized Saline (10 eenheden/mL).
  6. Plaats de milt graft in de rechterflank van de ontvanger muis buik; Identificeer zorgvuldig de aorta manchet van de donor en de poortader van de donor. Na ervoor te zorgen dat de schepen niet zijn gedraaid, bedek de milt Graft met gaas gedrenkt met koude (4 ° c) zoutoplossing.
  7. Sluit de aorta manchet van de donor aan op de proximale en distale Apex van de aortaotomy van de ontvanger met twee verblijf hechtingen (11-0 nylon hechting, zelfde als hieronder) (Figuur 2b, C). Maak een anastomosis met 2-3 beten van ononderbroken 11-0 nylon hechtingen tussen de aorta manchet van de donor en de aortaotomy (voorste wand) van de ontvanger (figuur 2D). Draai de milt enten naar de linkerkant van de ontvanger; Maak de anastomosis tussen de aorta manchet van de donor en de aortotomy (achterste wand) van de ontvanger (figuur 2e).
  8. Voer een anastomosis uit om de poortader van de donor aan te sluiten op de achterste wand van het IVC van de ontvanger, met 4 tot 5 beten van ononderbroken hechtingen aan de binnenzijde van het IVC en sluit vervolgens de hechtdraad aan de buitenkant van het IVC (figuur 2F, G).
  9. Laat het schip klemmen en gebruik steriele wattenstaafje om tamponade bloeden totdat de milt kleur wordt teruggewonnen (figuur 2H).
  10. Sluit de buik met een 5-0 synthetische absorbeerbare vicryl hechting in een doorlopend patroon. Sluit de huid laag met een 5-0 nylon hechting in een onderbroken patroon.
    Opmerking: Voor de stappen 4.7-4.8, alternatief, maak een anastomosis tussen de poortader van de donor en het IVC van de ontvanger eerst (stap 4,8); Maak dan een anastomosis tussen de aorta manchet van de donor en de achterste wand van de aortotomy van de ontvanger, met behulp van 2 tot 3 doorlopende hechtingen in de binnenkant van de aorta en sluit de hechtdraad aan de buitenkant van de aorta.

4. terugwinning van dieren

  1. Injecteer 1 mL warme zoutoplossing onderhuids via 4 afzonderlijke locaties (0,25 mL/locatie) na het sluiten van de buik.
  2. Houd de muis in een incubator met temperatuur gecontroleerde (30 ° c) voor de eerste paar uur na de operatie, de muis te controleren totdat zij heeft weer voldoende bewustzijn, en breng de muis naar een nieuwe schone kooi met regelmatig voedsel en water, met een verwarming pad (30 ° c ) onder de kooi. Houd de muis na de operatie in een aparte kooi.

5. post-chirurgische pijnbestrijding

  1. Injecteren 0,05 mg/kg buprenorfine onderhuids 24 h en 48 h na de operatie te handhaven analgesie regime.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

De hele procedure van de muis milt transplantatie kan worden voltooid binnen 90 min door ervaren microchirurgen. Ons laboratorium heeft uitgevoerd meer dan 100 milt transplantaties bij muizen. Het succespercentage is meer dan 90%, zoals gedefinieerd door het voortbestaan van zowel de ontvanger muis en de milt Graft op post-operatieve dag (POD) 1 of POD 7 (onze studie eindpunt). Het voortbestaan van de milt Graft werd bevestigd door de macroscopische verschijning en stroming Cytometry analyse van de splenocyten. Op basis van onze ervaring, de flow Cytometry analyse (LIVE/dode cel levensvatbaarheid assays) is zeer gevoelig om te bepalen of een milt Graft is overleefd, als de meerderheid van de Miltcellen zou dood zijn als de milt enten waren necrotic. De technische uitdagingen van deze procedure, gemeenschappelijke complicaties, en hun probleemoplossing zijn samengevat in tabel 1.

Voor het testen van de Graft morfologie post-transplantatie, Haemotoxylin en eosine (H & E) kleuring werd uitgevoerd in de milt isografts van BALB/c muizen op POD 1 en POD 7. De representatieve Foto's worden weergegeven in Figuur 3. De architectuur van de milt isografts bleef intact tijdens de eerste postoperatieve week. De rode pulp, witte pulp, en de marginale zone waren nog steeds duidelijk en te onderscheiden. Om de cel migratie na milt transplantatie te onderzoeken, werd de Stroom Cytometry uitgevoerd bij peul 1 en peul 7 om de fenotypes van leukocyten in de milt isografts, lymfeknopen, bloed, en beenmerg te onderzoeken. Zoals weergegeven in figuur 4a, bij pod 1, 51 ± 7% (gemiddelde ± SD, hetzelfde als hieronder) van de Miltcellen werden donor-afgeleide en 46 ± 3% werden ontvanger-afgeleide. Bij POD 7, donor-afgeleide leukocyten goed voor 32 ± 10% van de totale Miltcellen, en de ontvanger-afgeleide cellen waren tot 56 ± 13%. We hebben ook opgemerkt dat milt leukocyten gemigreerd naar de lymfeklieren, bloed en beenmerg zo vroeg op dag 1 en gehandhaafd op dag 7 (figuur 4b), het genereren van een unieke hersenschim waardevol voor splenocyte handel onderzoek.

Tabel 1: Methoden voor probleemoplossing.

Figure 1
Figuur 1: donor milt oogst. (A) toeschroeien de korte maag ader verbonden aan de milt. (B) plaats een klein stukje steriel warm nat gaas over de milt te houden vochtig. (C) ontleden en isoleren van de poortader achter de alvleesklier. (D) binden de kant takken van de poortader en plaats een hechting rond de poortader DISTAAL aan de milt ader. De stippellijnen vertegenwoordigen de locatie transecting later voor de anastomosis met de ontvanger IVC. (E) Flip de milt over aan de rechterkant van de buik (links chirurg) aan de aorta en coeliakie stam bloot met zijn takken, waaronder milt slagader. (F) ontleden en mobiliseren aorta-coeliakie-milt slagader door ligating de twee andere takken. (G) plaats een hechtdraad rond de aorta proximaal van de coeliakie slagader. De stippellijnen vertegenwoordigen de locatie transecting later gebruikt voor de anastomosis met de ontvanger abdominale aorta. (H) na ligating de aorta en transecting de poortader, perfuse de milt Graft met 10 ml van heparinized zout door de aorta. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: milt enten implantatie. (A) na isolatie en kruis klem de aorta en IVC, maken een longitudinale aortotomy en venotomy in de aorta en IVC, respectievelijk. (B-D) Plaats de milt Graft aan de rechterkant van de buik (de linker kant van de chirurg). Maak de end-to-side anastomosis tussen de donor aorta manchet en de voorste wand van de aortotomy van de ontvanger, met behulp van 2-3 beten van de aanhoudende hechtdraad. (E) draai de milt transplantaat naar de linker flank van de ontvanger; Herhaal de vorige procedure tussen de donor aorta manchet en de achterste wand van de ontvanger van de aortotomy en sluit de hechtdraad aan de buitenkant van de aorta. (F-G) Maak een end-to-side anastomosis tussen de donor poortader en de achterste wand van het IVC van de ontvanger, met behulp van 4 tot 5 beten van continue 11-0 nylon hechting aan de binnenkant van het IVC en sluit vervolgens de hechting aan de buitenkant van het IVC. (H) na het voltooien van de anastomosis, laat het schip klemmen en plaats een aantal wattenstaafjes te helpen stoppen met het bloeden. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: representatieve histologie van milt isografts op dag 1 en dag 7 na de operatie. Syngeneic milt transplantaties werden uitgevoerd met behulp van BALB/c muizen. Milt isografts werden geoogst op dag 1 en dag 7 post-transplantatie en vast in 10% formaline voor 48 h. H & E kleuring werd uitgevoerd met behulp van paraffine-embedded weefsel sectie. De representatieve histologie toont aan dat de milt isografts intact blijft bij 1 week post-transplantatie. Schaalbalk = 250 μm. POD, post-operatieve dag. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 4
Figuur 4: De hersenschim gemaakt door syngeneic milttransplantatie. Drie syngeneic milt transplantaties werden uitgevoerd met behulp van BALB/c CD 45.2 muizen als donoren en BALB/c CD 45.1 muizen als ontvangers. De milt enten, bloed, lymfeklier (LN), en beenmerg (BM) in de ontvangende muizen werden geoogst op dag 1 en dag 7 post-transplantatie. Single cell isolatie en flow Cytometry analyse werden uitgevoerd om het fenotype van de cellen te analyseren. (A) representatieve dot percelen (gating van Live singlets) waarin de percentages van de donor of ontvanger-afgeleide leukocyten in de aangegeven monsters. Bpercentages (gemiddelde ± SEM) van de aangegeven populaties in donor cellen in de aangegeven monsters op dag 1 en dag 7. POD = post-operatieve dag. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Aanvullend figuur 1: representatieve percelen (n = 3) waarin de percentages van donor-afgeleide versus ontvanger-afgeleide lymfocyten in de geplante milt, lymfeklieren, bloed, en het beenmerg. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend figuur 2: representatieve percelen (n = 3) waarin de percentages van donor-afgeleide versus ontvanger-afgeleide CD11b + Ly6C + monocyten in de geplante milt, lymfeklieren, bloed, en beenmerg. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Overtuigend bewijs suggereert dat milt-afgeleide monocyten spelen een belangrijke rol in steriele inflammatoire processen zoals atherosclerose19, acute ischemische hersenen20 of longschade18, evenals myocard I/R letsel en het verbouwen van21,22,23. Deze rapporten benadrukken de ondererkenning rol van de milt bij veel chronische ziekten, waarvan hart-en vaatziekten is een belangrijke (vooral gezien het is de nummer een moordenaar wereldwijd). De muismodel van de milt transplantatie biedt een grote kans om de rol van de milt afgeleide immuun cellen in verschillende ziekten te ontdekken, alsmede hoe ze worden klaargemaakt in de milt. Bijvoorbeeld, met behulp van de Muismodellen van milt transplantatie, Swirski et al. gevonden dat in reactie op ischemische myocard letsel, milt-afgeleide monocyten verhogen hun beweeglijkheid, migreren uit de milt, zich houden aan gewonde weefsel, en bijdragen aan de het helen van de wond17. Voorts is dit model nuttig om de longevities van rijpe immune cellen in de milt en de onderliggende mechanismen aan te pakken en therapeutisch potentieel van milt transplantatie te onderzoeken.

Er moeten verschillende aspecten in aanmerking worden genomen om het succes van dit protocol te verbeteren. Ten eerste is het van cruciaal belang om de juiste experimentele dieren te kiezen tijdens het ontwerpproces, aangezien de muis gewicht, stam, en de gezondheidstoestand kan de moeilijkheidsgraad van de chirurgische stappen en experimentele resultaten beïnvloeden. Ons laboratorium raadt het gebruik van 8 tot 12-weken oude muizen met meer dan 25 g gewicht aan de sterfte die kan worden veroorzaakt door bloeden te verminderen. Ten tweede, tijdens de milt oogst procedure, te veel manipulatie van de milt schepen kunnen gemakkelijk leiden tot het fokken of vasospasme en mogelijk resulteren in micro trombose in de milt Graft. Vertrouwd raken met de anatomie van de muis buik voor de operatie zou nuttig zijn om het leerproces te versnellen. Ten derde, tijdens de ontvangende operatie, de milt Graft moet altijd worden gehandhaafd vochtig en koel. De aangewezen bescherming van milt enten kon de transplantatie ischemie/reperfusie (I/R) verwonding verminderen en enten mislukking na transplantatie verhinderen. Daarnaast, gezien het feit dat de donor schepen voor anastomosis zijn relatief lang, het positioneren van de milt enten goed voordat de anastomosis is van cruciaal belang om te voorkomen dat verdraaien van de schepen. Bovendien moeten de diameters van de ontvanger aortotomy en venotomy van IVC altijd vergelijkbaar zijn met die van de donor aorta en poortader om de juiste doorbloeding te garanderen en trombose te voorkomen.

De gemiddelde opslagtijd van de milt enten in 4 ° c zoutoplossing is ongeveer 10 minuten. De totale ischemische tijd moet worden beperkt tot minder dan 50 min te zorgen voor minimale transplantatie falen. Wij raden het gebruik van de Universiteit van Wisconsin (UW) koude opslagoplossing voor het behoud van de milt Graft, indien meer dan 1 h koud, ischemische tijd nodig is in studies. Opgemerkt moet worden dat een klein deel van de alvleesklier intiem hechten aan de milt, en proberen om het geheel te verwijderen uit de milt enten zou gemakkelijk leiden tot Graft of vasculaire complicaties en aanzienlijk verhogen van de operatietijd. We merkte op dat de alvleesklierweefsel gehecht aan de milt Graft zou ondergaan atrofie op POD 7 hoewel sommige levensvatbaar bleef met de milt enten. Al dan niet te verwijderen van de alvleesklierweefsel verbonden met milt enten hangt af van het onderzoek doeleinden.

De beschikbaarheid van congenic muizen heeft het mogelijk gemaakt om de oorsprong van de Miltcellen, donor versus ontvanger na transplantatie te traceren. In deze studie, gebruikten we BALB/c CD 45.2 en BALB/c CD 45.1 congenic muizen als milt donoren en ontvangers om een syngeneic milt transplantatie model te creëren. Orgaan of weefseltransplantatie tussen deze congenic muis stammen is op grote schaal gebruikt om de oorsprong en de ontwikkeling van het immuunsysteem te volgen. Ondanks het recente rapport over een punt mutatie in verband met CD 45.1 dat NK Cell Response24invloeden, geen transplantatie afwijzing werd gerapporteerd tussen deze stam combinaties. We zagen een aanzienlijke toevloed van cellen in de cel milt enten die zich hebben voorgedaan zodra bij POD 1. Het is waarschijnlijk dat de ontvangende cellen gereageerd op de transplantatie I/R letsel als de meerderheid van de ontvangende cellen werden granulocyten. Onze resultaten toonden aan dat een relatief hoog percentage van milt lymfocyten bleef van donor oorsprong. Meer interessant, deze lymfocyten gemigreerd naar (herbevolkt) in andere lymfe compartimenten (lymfeklier, beenmerg, en circulatie). Deze bevindingen vragen ons om te speculeren dat lymfocyten die afkomstig zijn van milten zijn zeer belangrijk in de adaptieve immuniteit. Er zijn echter meer onderzoeken nodig om de verschillende rollen van milt lymfocyten af te bakenen in adaptieve versus aangeboren immuniteit (Figuur 4, aanvullend Figuur 1 en aanvullend Figuur 2).

De belangrijkste beperking van dit protocol is dat het uitgebreide microchirurgische opleiding voor individuen met beperkte microchirurgische ervaring vereist om deze techniek te beheersen. Op basis van onze leerervaring in de algehele muis Solid orgaantransplantatie modellen (bijv. muis hart, Long, of nier transplantatie), kan het 6-10 maanden duren voor een nieuw opgeleide persoon (zonder experimentele microchirurgische techniek) om vakkundig meester deze Techniek. Vergeleken met Muismodellen van hart, of nier transplantatie, kan dit model meer uitdagend omdat het gaat om extra weefsel dissectie stappen om de milt Graft te isoleren tijdens de donor procedures. Bovendien is de diameter van de donor poortader (rond 0,6 mm) kleiner dan het IVC, wat het voor de anastomosis moeilijker maakt. Een andere beperking is dat het niet duidelijk is of de geënte milt massaal zou worden binnengevallen door de ontvanger ' cellen op latere transplantatie fase (bijv. POD 60). Echter, dit model is ook zeer aantrekkelijk voor zijn verschillende inherente voordelen. Ten eerste, muizen en mensen delen een substantieel scala van soortgelijke genomen, waardoor een relatief nauwkeurige weergave van een realistische toepassing. Bovendien, in vergelijking met de muismodel van niet-vasculaire milt transplantatie met behulp van de secties van milt weefsel, dit vasculaire milt transplantatie model is minder waarschijnlijk complicaties te ontwikkelen, zoals aseptische necrose van de milt weefsel en kleine darmobstructie als gevolg van postoperatieve adhesie.

Het muismodel van milt transplantatie is eerder gemeld door Swirski FK et al. De gedetailleerde informatie is echter niet beschreven.  Onze studie biedt een uitgebreide stap-voor-stap Protocol van muis milt transplantatie voor geïnteresseerde onderzoekers te volgen en te Mater deze techniek. Bovendien, dit protocol elimineert een aantal onnodige stappen beschreven in het rapport van Swirski FK et al. (bijvoorbeeld de galwegen afbinding) en introduceert de 11-0 hechting voor anastomosis, die zou helpen verkorten de chirurgische tijd en het bloeden te voorkomen.

Samenvattend, zou dit model een krachtig hulpmiddel kunnen zijn om de mechanismen van de milt bevolking in reacties op ziekteverwekkers, verwonding, ontsteking, of transplantatie afwijzing te onderzoeken en is waardevol voor de test van het therapeutische potentieel van de milt Transplantatie. Met de juiste training en praktijk, kan deze procedure worden uitgevoerd met > 90% succes.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Auteurs bedanken Noordwestelijke Universiteit uitgebreide transplantatiecentrum en de Feinberg school of Medicine onderzoek cores programma voor resource en financiering te ondersteunen. Specifiek, werden de Stroom Cytometry en de histologie diensten verstrekt door de Noordwestelijke Universiteit Stroom Cytometry kernfaciliteit en muis histologie en het fenotype laboratorium, respectievelijk, allebei waarvan door NCI P30-CA060553 worden gesteund die aan Robert H wordt toegekend Lurie uitgebreide Cancer Center. Wij danken de heer Nate Esparza voor het corrigeren van dit manuscript.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ketamine Wyeth 206205-01
Xylazine Lloyd Laboratories 139-236
Heparin solution Abraxis Pharmaceutical Products 504031
Injection grade normal saline Hospira Inc. NDC 0409-4888-20
70% Ethanol Pharmco Products Inc. 111000140
ThermoCare Small Animal ICU System Thermocare, Inc.
Adson Forceps Roboz Surgical Instruments RS-5230
Derf Needle Holder Roboz Surgical Instruments RS-7822
Extra Fine Micro Dissecting Scissors Roboz Surgical Instruments RS-5881
Micro-clip Roboz Surgical Instruments RS-5420
7-0 silk Braintree Scientific SUT-S 103
11-0 nylon on 4 mm (3/8) needle Sharpoint DR4 AK-2119
Ms CD45.2 antibody BD Bioscience 553772
Ms CD45.1 antibody BD Bioscience 553776
Ms CD11b antibody BD Bioscience 557657
Ms B220 antibody BD Bioscience 553089
Ms Ly6C antibody eBioscience 48-5932-80
Ms Ly6G antibody BD Bioscience 561236
Ms F4/80 antibody BD Bioscience 565614
Ms CD11c antibody BD Bioscience 558079
Ms CD3 antibody eBioscience 48-0032-82
Ms CD4 antibody BD Bioscience 552051
Ms CD8 antibody BD Bioscience 563786
LIVE/DEAD™ Fixable Violet Dead Cell Stain Kit Thermo Fisher L34955

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cesta, M. F. Normal structure, function, and histology of the spleen. Toxicologic Pathology. 34, (5), 455-465 (2006).
  2. Mebius, R. E., Kraal, G. Structure and function of the spleen. Nature Reviews Immunology. 5, (8), 606-616 (2005).
  3. Misiakos, E. P., Bagias, G., Liakakos, T., Machairas, A. Laparoscopic splenectomy: Current concepts. World Journal of Gastrointestinal Endoscopy. 9, (9), 428-437 (2017).
  4. Kristinsson, S. Y., Gridley, G., Hoover, R. N., Check, D., Landgren, O. Long-term risks after splenectomy among 8,149 cancer-free American veterans: a cohort study with up to 27 years follow-up. Haematologica. 99, (2), 392-398 (2014).
  5. Thai, L. H., et al. Long-term complications of splenectomy in adult immune thrombocytopenia. Medicine (Baltimore). 95, (48), e5098 (2016).
  6. Sinwar, P. D. Overwhelming post splenectomy infection syndrome - review study. International Journal of Surgery. 12, (12), 1314-1316 (2014).
  7. Rorholt, M., Ghanima, W., Farkas, D. K., Norgaard, M. Risk of cardiovascular events and pulmonary hypertension following splenectomy - a Danish population-based cohort study from 1996-2012. Haematologica. 102, (8), 1333-1341 (2017).
  8. Crary, S. E., Buchanan, G. R. Vascular complications after splenectomy for hematologic disorders. Blood. 114, (14), 2861-2868 (2009).
  9. Di Carlo, I., Pulvirenti, E., Toro, A. A new technique for spleen autotransplantation. Surgical Innovation. 19, (2), 156-161 (2012).
  10. Holdsworth, R. J. Regeneration of the spleen and splenic autotransplantation. British Journal of Surgery. 78, (3), 270-278 (1991).
  11. Tzoracoleftherakis, E., Alivizatos, V., Kalfarentzos, F., Androulakis, J. Complications of splenic tissue reimplantation. Annals of the Royal College of Surgeons of England. 73, (2), 83-86 (1991).
  12. Kato, T., et al. Transplantation of the spleen: effect of splenic allograft in human multivisceral transplantation. Annals of Surgery. 246, (3), discussion 445-436 436-444 (2007).
  13. Aronovich, A., et al. Correction of hemophilia as a proof of concept for treatment of monogenic diseases by fetal spleen transplantation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, (50), 19075-19080 (2006).
  14. Cohen, E. A. Splenosis; review and report of subcutaneous splenic implant. Archives of surgery. 69, (6), 777-784 (1954).
  15. Coburn, R. J. Spleen transplantation in the rat. Transplantation. 8, (1), 86-88 (1969).
  16. Lee, S., Orloff, M. J. A technique for splenic transplantation in the rat. Surgery. 65, (3), 436-439 (1969).
  17. Swirski, F. K., et al. Identification of splenic reservoir monocytes and their deployment to inflammatory sites. Science. 325, (5940), 612-616 (2009).
  18. Hsiao, H. M., et al. Spleen-derived classical monocytes mediate lung ischemia-reperfusion injury through IL-1beta. Journal of Clinical Investigation. 128, (7), 2833-2847 (2018).
  19. Robbins, C. S., et al. Extramedullary hematopoiesis generates Ly-6C(high) monocytes that infiltrate atherosclerotic lesions. Circulation. 125, (2), 364-374 (2012).
  20. Kim, E., Yang, J., Beltran, C. D., Cho, S. Role of spleen-derived monocytes/macrophages in acute ischemic brain injury. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 34, (8), 1411-1419 (2014).
  21. Bronte, V., Pittet, M. J. The spleen in local and systemic regulation of immunity. Immunity. 39, (5), 806-818 (2013).
  22. Wang, N. P., et al. Recruitment of macrophages from the spleen contributes to myocardial fibrosis and hypertension induced by angiotensin II. Journal of the Renin-Angiotensin-Aldosterone System. 18, (2), 1470320317706653 (2017).
  23. Tian, Y., et al. The spleen contributes importantly to myocardial infarct exacerbation during post-ischemic reperfusion in mice via signaling between cardiac HMGB1 and splenic RAGE. Basic Research in Cardiology. 111, (6), 62 (2016).
  24. Jang, Y., et al. Cutting Edge: Check Your Mice-A Point Mutation in the Ncr1 Locus Identified in CD45.1 Congenic Mice with Consequences in Mouse Susceptibility to Infection. Journal of Immunology. 200, (6), 1982-1987 (2018).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics