Bruk av en Wireless video-EEG system for å overvåke epileptiform utslipp etter lateral Fluid-perkusjon indusert Traumatisk Brain skade

Behavior
 

Summary

Her presenterer vi en protokoll for å indusere alvorlig TBI med lateral væske perkusjon skade (FPI) modell i voksen, mannlig Wistar rotter. Vi viser også bruken av et trådløst telemetri system for å samle kontinuerlige video-EEG innspillinger og skjerm for epileptiform utslipp i samsvar med post-traumatisk epileptogenesis.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

McGuire, M. J., Gertz, S. M., McCutcheon, J. D., Richardson, C. R., Poulsen, D. J. Use of a Wireless Video-EEG System to Monitor Epileptiform Discharges Following Lateral Fluid-Percussion Induced Traumatic Brain Injury. J. Vis. Exp. (148), e59637, doi:10.3791/59637 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Den laterale Fluid perkusjon skade (FPI) modellen er godt etablert og har blitt brukt til å studere TBI og post-traumatisk epilepsi (PTE). Det er imidlertid rapportert om betydelig variasjon for de spesifikke parametrene som brukes i ulike studier som har brukt denne modellen, noe som gjør det vanskelig å harmonisere og tolke resultatene mellom laboratorier. For eksempel er variasjon rapportert om størrelsen og plasseringen av craniectomy, hvordan luer lås navet plasseres i forhold til craniectomy, det atmosfæriske trykket som påføres Dura og varigheten av trykk pulsen. Hver av disse parametrene kan påvirke skade alvorlighetsgrad, som direkte samsvarer med forekomsten av PTE. Dette har blitt manifestert som et bredt spekter av dødelighet, rettende refleks ganger og forekomst av convulsive beslag rapportert. Her gir vi en detaljert protokoll for metoden vi har brukt for å bidra til å lette harmonisering mellom studiene. Vi brukte FPI i kombinasjon med et trådløst EEG telemetri system for kontinuerlig overvåking for electrographic endringer og oppdage beslag aktivitet.  FPI er indusert ved å skape en 5 mm craniectomy over venstre halvkule, mellom Bregma og lambda og tilstøtende til lateral ryggen. En luer lås navet er sikret på skallen over craniectomy. Denne huben er koblet til FPI-enheten, og en trykk puls på 20 millisekunder leveres direkte til intakt Dura gjennom trykkslangen som er koblet til huben via en Twist Lock-kontakt. Etter gjenoppretting er rottene re-anesthetized for å fjerne huben. Fem 0,5 mm, rustfritt stål EEG elektrode skruer er plassert i kontakt med Dura gjennom skallen og tjene som fire opptaks elektroder og en referanse elektrode. Elektrode ledningene samles inn i en pidestall-kontakt som er festet på plass med beinsement. Kontinuerlige video/EEG-opptak samles i opptil 4 uker etter TBI.

Introduction

I en 2015 rapport til Kongressen, Centers for sykdom Control rapportert at ca 2 500 000 personer per år lider traumatisk hjerneskade (TBI) i USA1. Det anslås at TBI forårsaker 20% av symptomatisk epilepsies og 5% av alle epilepsies2,3,4. I tillegg utvikler omtrent 20% av TBI-pasientene post traumatisk epilepsi5. Viktigere, kroniske, tilbakevendende beslag som oppstår som en konsekvens av TBI er ofte pharmacoresistant, øke byrden av sykdommen6. De nøyaktige mekanismene som fører til post traumatisk epilepsi (PTE) er fortsatt uklart. Imidlertid har flere viktige epidemiologi studier undersøkt forekomsten og potensiell risiko for å utvikle post traumatisk epilepsi (PTE)2,4,7,8,9 ,10,11. Disse epidemiologi studerer hver forsterket sammenhengen av skade alvorlighetsgrad med risiko for epileptogenesis.

Nåværende metoder som har blitt mye brukt til å identifisere romanen anti-epilepsi terapier har støttet seg tungt på modeller som bruker kjemoterapi-convulsants eller elektrisk veden å indusere epilepsi12. Gitt den høye forekomsten av farmako til legemidler utviklet i disse modellene av TBI pasienter, hypothesize vi at TBI-indusert beslag kan være forskjellig fra chemoconvulsant eller veden-indusert beslag og kan innebære ulike veier eller prosesser av epileptogenesis. Derfor kan en TBI-modell være bedre egnet for utvikling av behandlinger som er mer effektive for å forhindre post-traumatisk epileptogenesis.

Den flytende perkusjon skade (FPI) modell av TBI har blitt brukt i flere ti år og er en veletablert metode for å undersøke både TBI og Pte13,14,15,16,17, 18. men som vi nylig har gjennomgått, er det en høy grad av variasjon i FPI metodene rapportert på tvers av laboratorier19,20. Denne mangelen på konsistens mellom laboratorier forhindrer reproduserbarhet av prekliniske funn og gjør tolkningen av resultatene en utfordring. Som en konsekvens har økt interesse og innsats blitt anvendt mot å etablere en større harmonisering for disse typer studier21,22,23,24.

I et forsøk på å ytterligere øke konsistens og harmonisering mellom laboratorier fokusert på å studere post-traumatisk epileptogenesis, gir vi her en detaljert metodikk for vår tilnærming. Vi har tidligere rapportert en 60% forekomst av convulsive beslag innen seks uker etter alvorlig TBI20. Vi nå bruk denne adgang å dataskjerm rotter begynnelse dagen av skaden og kontinuerlig følge etter etter seg 24 timene om dagen for til 4 ukens. Vi har valgt å bruke et trådløst telemetri system som gir flere fordeler. For det første, rotter er kjøpedyktig fritt bevege om deres bur, og således reduserer trykk. Andre en reduksjon i signal støy som rotte fungerer som bakken. I tillegg bruker vårt nåværende system en akselerometer som oppdager rask bevegelse i alle tre flyene (X, Y og Z) og kan være nyttig å identifisere convulsive anfall hendelser. Til slutt gir det trådløse telemetri systemet for enklere styring av rotter som supplerende saltvann injeksjoner, veiing og gjennomføre nevrologiske alvorlighetsgrader, noe som er komplisert når rotter er festet til en snor. Denne tilnærmingen har imidlertid også flere begrensninger. For det første, det Initial bekostning av en system å fortegnelse fra til åtte rotter samtidig kan inne området av $60 000. For det andre er strøm begrenset av en batterikilde. Dette krever daglig overvåkning og utskifting av batterier. Tiden som kreves mellom batteri endringer kan påvirkes av samplingsfrekvensen. Men for en 1000 Hz samplingsfrekvens, skiftes vanligvis batteriene en gang i uken. Den begrensede strømforsyningen begrenser også systemet til opptak fra bare fire EEG signaler. Endelig, signal drop out er begrenset, men forekommer av og til. Imidlertid gir denne tilnærmingen en konsistent og pålitelig metode for å overvåke post-traumatisk epileptogenesis og kan hjelpe til med identifisering av romanen terapeutiske behandlinger.

Protocol

Alle prosedyrer ble godkjent av og fulgt retningslinjer ved Universitetet i Buffalo institusjonelle Animal Care og bruk komiteen.

1. Fluid perkusjon skade

  1. Bruk en Laboratoriefrakk eller kirurgisk kappe, kirurgisk maske, kirurgiske hansker og hode dekk og sterilisere alle verktøy og materialer som tar kontakt med operasjonsstedet.
  2. Bedøve en 10-12-uke-gammel, hann, Wistar rotte (350-400 g) med 3% isoflurane og 1 L/min oksygen i en induksjon kammer av passende størrelse for rotter. Fjern rotte fra induksjon kammeret og flytte den til prep området når den er bevisstløs. Sett den sterile øyen salven inn i begge øynene.
  3. Barbere håret på rotten ' leder med elektrisk avklipt med en #40 blad fra rettferdig over det eyes å det caudal basis av det ører å tilvirke nok inngrep åker. Fjern eventuelle løse, klippet håret fra området.
  4. Rengjør operasjonsstedet ved å bruke 2% chlorohexidine skrubb til barberte hodebunnen etterfulgt av 70% etanol. Start på midten og flytte utover i konsentriske sirkler bort fra snittet området. Gjenta denne prosessen 3 ganger. Påfør Betadine løsning på området på samme måte og lov til å tørke.
  5. Plasser anesthetized rotte i stereotaxic rammen og opprettholde anestesi på 2-3% isoflurane-1 L/min oksygen via nosecone. Sjekk for tap av tilbaketrekking refleks av hindlimb bentap og tap av palpebral refleks for å sikre at rotta er i et kirurgisk fly av anestesi.
  6. Overvåk respirasjonsfrekvens, hjertefrekvens, kroppstemperatur og oksygenmetning gjennom hele operasjonen. Oppretthold hjertefrekvensen mellom 300-400 BPM og SpO2 over 90%.
    Merk: en puls-oximeter festet til en bakre fot kan brukes til å gi konstant lese ut av hjertefrekvens og SpO2. En hjertefrekvens over 400 BPM indikerer at rotta ikke er tilstrekkelig anesthetized. En selvregulerende oppvarming pad, koblet til en rektal termometer, satt til 37 ° c, kan plasseres under rotte gjennom hele kirurgi for å opprettholde kroppstemperatur. En stereomikroskopet med lys kilde i kombinasjon med en optisk fiber lampe er nyttig for å visualisere prosedyren.
  7. Bruk en 23 g nål for å injisere 0,5% bupivakain hydrochloride intradermalt inn i hodebunnen på snittstedet for lokale analgesi 10-15 minutter før du gjør et snitt.
  8. Lag en 1,5-2,5 cm midtlinjen snitt gjennom huden og muskelen i hodebunnen ved hjelp av en #10 skalpell blad. Trekk tilbake huden og muskelen for å avdekke skallen og gi et klart kirurgisk felt. Reflektere den underliggende konseptet og fettvev bort fra benet med sterile bomullspinner.
    Merk: en elektrisk cauterization-enhet er nyttig for å oppnå rask hemostase.
  9. Barbere ned den laterale ryggen av venstre parietal benet ved hjelp av en kirurgisk curette å produsere en jevn flat overflate slik at bunnen av den kvinnelige-kvinnelige luer lås hub kan hvile flush med skallen.
  10. Skyll skallen overflaten og omkringliggende vev med 2,0 mg/mL Gentamicin oppløsning i sterilt saltvann. Blot overflødig løsning med en steril pensle.
  11. Påfør 3% hydrogen peroxide til skallen for å tørke benet.
    Merk: Hvis benet ikke er tilstrekkelig tørt Dental sement vil ikke overholde riktig og danner en solid forsegling.
  12. Lag en 5 mm diameter craniectomy området gjennom venstre parietal bein.
    Merk: en trephine som er plassert i en strøm drill som er festet til stereotactic ammen, kan være nyttig for å starte craniectomy. Bruk en hånd Drill med en 5 mm diameter trephine for langsomt å fullføre craniectomy gjennom de resterende bein. Når nær å fullføre craniectomy, Roter trephine i revers for å hindre brudd på den underliggende Dura mater. Det vil være en tynning av skallen rundt omkretsen av disken og skallen klaffen vil føle seg løs når du trykker lett.
  13. Fjern bein klaff med kirurgisk curette og glatt vev tang.
    Merk: noen blødninger kan forekomme, men hemostase kan raskt oppnås ved å påføre lett trykk med sterile bomullspinner.
  14. Bruk en stereomikroskopet og belysning for å visuelt inspisere Dura for eventuelle tegn på brudd.  En tynn kant av benet vil forbli rundt omkretsen av craniectomy området.  Forsiktig fjerne denne felgen med glatt vev pinsett tar seg ikke å sprekke den Dura.
  15. Serviett skallen med 70% etanol for å fjerne eventuelle bein støv og tørke skallen.
  16. Påfør et tynt lag med Cyanoacrylate gel lim rundt den nederste kanten av luer lås navet og fest den til skallen over craniectomy uten å hindre åpningen. Vær forsiktig så du ikke tar limet i kontakt med Dura. Videre forsegle luer låsen på plass med et ekstra tynt lag med lim rundt utsiden base av huben.
  17. Forbered en slurry av Dental sement. Påfør sement på overflaten av skallen rundt og over bunnen av luer låse navet for å sikre den på plass.
  18. Fyll luer lås navet med et sterilt konserveringsmiddel gratis kunstig cereberal spinalvæske (CSF) løsning (pH 7,4) ved hjelp av en sprøyte og nål slik at en konveks bolus av saltvann kan sees over toppen av felgen.
    Merk: løsningen vil holde Dura fuktig som Dental sement tørker så vel som fungerer som en indikasjon på integriteten til forseglingen. Hvis løsnings nivået faller i det hele tatt, er det en indikasjon på en lekkasje i systemet og luer-låsen må fjernes og byttes ut.
  19. Når Dental sement er fullstendig kurert, avvikle gass anestesi og fjerne rotte fra stereotaxic rammen.
  20. Plasser rotta på en plattform ved siden av FPI-enheten.
  21. FPI-enheten har en buet metall tupp som strekker seg fra trykkgiveren ved enden av væske beholderen. Sikre en 12 cm lengde av trykkslangen til enden av den buede spissen med den motsatte enden avslutte i en 2 cm mannlig luer lås vri kontakt. Sikre rotta å det FPI apparat av forbinde det kvinner enden på det hub på rotten ' Skull å det mannlig forbinde.
    Merk: Pass på at tilkoblingen er tett sikret og at alle luftbobler er fjernet fra systemet.
  22. Plasser dyret i sternal recumbency og gjentatte ganger se for retur av abstinens refleks. Snarest rotta gjenvinner tilbaketrekking refleks bortsett fra er fremdeles bedøvet, løslate det pendelen av det FPI apparat å anledning en enkelt 20 MULTIPLE SCLEROSIS trykk impuls og indusere skaden.
    Merk: det er viktig å ikke indusere skaden mens dyret er dypt anesthetized som dette har en tendens til å forårsake økt dødelighet på grunn av neurogenic-indusert lungeødem. Alle enheter viser variasjon. Men på enheten som brukes for dette eksperimentet, en 17 ° vinkel plassering av hammeren produserer en 2,2-2,3 atmosfærisk trykk puls. Uskadet, humbug dyr gjennomgår alle de samme prosedyrene med unntak av den faktiske væsken pulsen til induserer skade.
  23. Umiddelbart koble rotte fra FPI enheten etter skade, Legg den i sternal recumbency, og gi ekstra oksygen (1 L/min) via en nese kjegle til spontan puste retur. Apnea er en forventet konsekvens av skaden. Om nødvendig, gi periodiske manuelle åndedrag via en pose ventil maske til rotte begynner å spontant puste på egen hånd.
    Merk: typisk, apnea varer mindre enn 2 min. En forbigående rask økning i hjertefrekvens (> 500 BPM) er observert umiddelbart etter administrering av trykk pulsen på grunn av en katekolaminer burst. Denne kan kontrollert med en impuls oximeter knyttet til rotta ' fot og kanne tjene som en mulig indikatoren det en alvorlig skaden har hendelse.
  24. Dataskjerm rotta fortsatt og fortegnelse klokken av retur av rettende refleks (stabile førlighet på alle fire lemmer).
  25. Omfanget av atmosfærisk trykk puls for hver rotte bør være innenfor ± 0,05 atmosfærer av hverandre. Bekreft at hver av trykk pulsen gir et jevnt signal på oscilloskop med konsistent amplitude og varighet.
    Merk: et støyende signal kan indikere luftbobler i systemet som må fjernes før du leverer skade pulsen. Atmosfærisk trykkpulser som produserer en alvorlig skade, i dette eksperimentet, er de som vanligvis resulterer i dyr rettende tider på 30-60 min. Dette spekteret av rettende tider er forbundet med en dødelighet på ca 40-50%).
  26. Administrere 10 mL prewarmed saltvann subkutant som en støttende pleie.
  27. Retur rotta å dens hjem bur og tillate den å komme seg for det vil si 4 h.
    Merk: økt dødelighet har blitt observert når rottene er plassert umiddelbart tilbake under anestesi.

2. implantation av kortikale EEG-elektroder og video-EEG-opptak

  1. For 4 h etter skaden, bedøve rotta idet tidligere beskrevet og sted den rygg inn i stereotactic rammen å fjerne det luer lås hub og fordypning sement.
    Merk: navet og sement vil lett festes med moderat trykk. Når du fjerner navet, sjekk nøye for eventuelle brudd eller skade på Dura. Gjenoppbygger euthanize noen dyr med skade på Dura.
  2. Påfør en liten dråpe 0,5% bupivakain hydrochloride i skallen på hver av de stedene der 5 pilothull skal bores (se figur 1).
  3. Bor pilothull gjennom skallen med en håndholdt 0,1 mm Drill bit.
  4. Sikre en elektrode skrue i rustfritt stål i hvert pilothull på følgende steder: en referanse skrue plasseres caudal på lambda over lillehjernen. Opptaks elektroder plasseres: 1) over halvkule ipsilateral og rostral til craniectomy; 2) over halvkule ipsilateral og caudal til craniectomy; 3) over halvkule kontralateral og rostral til craniectomy; 4) over halvkule kontralateral og caudal til craniectomy.
  5. Serviett skallen med 70% etanol for å fjerne eventuelle bein støv.
  6. Dekk craniectomy området med et tynt lag av steril bein voks for å dekke den eksponerte Dura.
  7. Koble en elektrode rekke til de 5 EEG-elektrodene ved å pakke den eksponerte enden av en fargekodet elektrode ledning tett rundt den utpekte elektrode skruen i rustfritt stål.
    Merk: den motsatte enden av hver elektrode ledning er plassert i et bestemt, angitt sted innenfor pidestall-kontakten.
  8. Forbered en slurry av beinsement.
  9. Samle elektrode ledningene inn i en spole under sokkelen og fest ledningene og sokkelen på plass med beinsement. Hold sokkelen i posisjon til beinsement har herdet.
    Merk: benet må være spesielt tørt og blottet for REST blod for å oppnå riktig vedheft og forhindre for tidlig fjerning av senderen.
  10. Fest den trådløse senderen med nye batterier til sokkelen før du fjerner dyret fra stereotactic ramme.
  11. Sted det dyr i sin hjem bur og sted byrået inne nærhet å det få og i lys av en betegnet videokameraet. Initiere video/EEG opptak.

3. innsamling av video-EEG innspillinger

  1. Før samle EEG signaler, gjør en frekvens feie av rommet der rotter vil bli plassert for EEG samling for å identifisere eventuelle forstyrrende frekvenser for å hindre innsamling av EEG opptak med noen frekvens som har bakgrunnsstøy.
  2. Sett alle sendere til spesifikke frekvenser som er fri for interferens.
  3. Angi samplingsfrekvens og inngangsområde for hver programmerbare sender.
    Merk: Dette kan gjøres ved hjelp av et smart verktøy fra systemprodusenten. Sendere kan prøve med en maksimal hastighet på 1000 Hz, og et maksimalt inngangsområde på ± 10 mV. I dette eksperimentet ble EEG innspillinger mellom 0,5 Hz til 30 Hz analysert. Derfor ble samplingsfrekvensen satt til 250 Hz. Vi observerer vanligvis amplituder på mindre enn 1 mV. Derfor var det angitte inntastingsområdet på ± 2 mV.
  4. Bruk EEG samling programvare levert av produsenten for å kontinuerlig spille inn video-EEG begynnelsen på dagen for skader knytte hver trådløse senderen via en unik frekvens til en bestemt mottaker.
    Merk: hver sender mottaker par er i stand til å overvåke 4 monopolar EEG-kanaler, og akselerasjon i X-, Y-og Z-flyene. EEG-data kan skrives til en lagrings server. Video dataene bør lagres på en NAS-enhet som er koblet til lagrings serveren. Den EEG analyseprogramvaren synkroniserer video og EEG opptak basert på tiden vedlikeholdes av lagringen server.
  5. Bruk video samling programvare å fortegnelse video av hver rotten med dens egen 2 MP resolution kameraet (1920 x 1080) konfigurert å fortegnelse for 30 rammens/s.
    Merk: hvert kamera har sin egen infrarøde belysning for video samling om natten.
  6. Konfigurer systemet til å automatisk lagre alle video og EEG opptak til en lagrings server hver 24 h. Videoene produserer ganske store filer.

4. video/EEG analyse

  1. Synkroniser video med hver EEG innspilling på 1/10 s oppløsning. Gjør dette ved hjelp av systemet produsenter video/EEG analyseprogramvare som skaper en metafil med stempel på presis tid av både EEG og video.
  2. Manuelt skjermen gjennom EEG innspillinger for å identifisere indeks hendelser som definerer anfall aktivitet.
  3. Bruke video/EEG analyseprogramvare og indeksen EEG hendelser, opprette en konfigurasjonsfil som bruker nøkkelparametre (dvs. makt i bestemte frekvensbånd, forholdet mellom frekvensbånd til den totale kraften, akselerasjon terskel, etc.) for å definere egenskapene av de potensielle anfall hendelser.
  4. Kjør EEG analyseprogramvare for å identifisere potensielle regioner EEG opptak som kvalifiserer basert på parametrene valgt i konfigurasjonsfilen.
    Merk: EEG analyseprogramvaren gir mulighet for automatisk anfall deteksjon og fremhever regioner av interesse i EEG signaler og gir FFT makt spektrum analyse over signalet.
  5. Anerkjenne muligheter convulsive anfall av benytter video innspillingen avhentet i løpet av oppkjøpet, hvilke er samtidighet med hver rotten ' respekt EEG registreringene.

Representative Results

Med denne modellen, indusert vi alvorlig TBI i voksen, mannlig, Wistar rotter. Under betingelsene vi beskriver her, vi vanligvis observere dødelighet på 40-50%, og rettende refleks ganger på 30-60 min som tidligere beskrevet20. Vi var i stand til å samle video/EEG innspillinger 24 h/dag begynner på dagen for skaden. Et diagram som viser plasseringen av fire monopolar EEG-elektroder og en enkelt referanse elektrode er vist i figur 1a. Bilder som viser plasseringen og utseendet til TBI-lesjoner som forventes med forholdene beskrevet her, vises i figur 1B-D. Under de forholdene som er beskrevet her, vi konsekvent observerer deltaet bremse i løpet av de første tre dagene innlegget TBI. Mindre alvorlig skadet rotter utstillingen ensidig, intermitterende deltaet bremse (tall 2C-D). I kontrast er kontinuerlig, bilateral delta langsom observert etter mer alvorlige skader (Figur 3C-D). En viss grad av deltaet bremse ble konsekvent observert i alle TBI rotter, men ble ikke påvist i noen humbug operert (craniectomy bare) kontroll rotter (tall 2a-b; 3a-b). Omfattende deltaet bremse ble konsekvent observert i løpet av de tre første dagene etter skade i de fleste TBI rotter. Interessant, rotter karakteristisk viser uttalt vekt forlis i løpet av det for det første tre dager stolpe skaden. Ikke-convulsive beslag er tidvis observert i løpet av den første uken etter TBI (fig. 4 C-D). Kliniske beslag, presentere som Spike klynger forbundet med oppdrett og fallende samt underarm klonus kan observeres etter 1-ukers post TBI (figur 5C-D). Til slutt, figur 6 presenterer representative bilder av sporadisk intermitterende signal slippe ut og tap av signal på grunn av batteriets feil.

Figure 1
Figur 1 . Plassering av craniectomy, elektrodeplassering og lesjon. (A) viser et skjematisk diagram av rotte skallen med plasseringen av craniectomy (grå sirkel i venstre halvkule), fire Monopolar elektroder (sorte prikker; 1, 2, 3, 4) som ligger mellom Bregma og lambda og en referanse elektrode (svart prikk, R) plassert midtlinjen, bakre til lambda; (B) viser KORONALE T2 Mr-skanning etter obduksjon med plasseringen av den lesjon som identifiseres av en rød sirkel; (C) viser et 2D-kart over cortex der plasseringen og størrelsen på lesjon er identifisert (blå region). (D) viser en Nissl beiset koronale delen med lesjon eske, lesjon er 100/forstørret i bildet til høyre. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2 . Ensidig, intermitterende deltaet bremse samlet på dagen for en moderat TBI. (A) viser en 90 s EEG spor fra en humbug operert, uskadet kontroll rotte på dagen av operasjonen. Alle fire kanalene presenteres. En 10 s lange spor (tatt fra eske regionen) ble Hentet fra tredje kanal for å bedre visualisere Baseline EEG mønster. En 2048 MS EPOC delen av dette ble deretter valgt for å bli analysert i tilsvarende FFT. (B) FFT analyse av 2048 MS valgte EPOC fra uskadet humbug opererte dyret på dagen for kirurgi. (C) viser en 90 s EEG spor, som demonstrerer intermitterende, ensidig deltaet bremse mønster av en moderat skadet dyr på dagen for skade. En 10 s lange spor (tatt fra eske regionen) ble Hentet fra tredje kanal for å bedre visualisere deltaet bremse EEG mønster. En 2048 MS EPOC delen av dette ble deretter valgt for å bli analysert i tilsvarende FFT. (D) FFT analyse av 2048 MS valgte EPOC fra moderat TBI dyret på dagen for skaden. 90 s EEG tracings, fra topp til bunn er biopotentials 1, 2, 3, 4, tilsvarende deres steder rundt craniectomy området som sett i figur 1. Grå vertikale merker definere 1 s intervaller på EEG spor. Alle EEG-spor vises på en skala (± 500 μV).  Innenfor FFT analyse grafer var samlet analysert frekvensområde 0,5-30 Hz. Dette ble ytterligere brutt ned i 4 separate frekvensbånd av delta (gul, 0,5-4 Hz), theta (Purple, 4-8 Hz), Alpha (rød, 8-12 Hz), og Beta (grønn, 12-30 Hz).  % (Power) grafen vist i FFT analysen forteller hvilken prosentandel av den totale makten i den analyserte EPOC kommer fra hver tidligere spesifiserte frekvensbånd, noe som åpner for videre matematisk karakterisering av EEG bølgeform mønstre. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3 . Bilateral, kontinuerlig delta bremse samlet på dagen for en alvorlig TBI. (A) viser en 90 s EEG spor fra en humbug operert, uskadet kontroll rotte på dagen av operasjonen. Alle fire kanalene presenteres.  En 10 s lange spor (tatt fra eske regionen) ble Hentet fra tredje kanal for å bedre visualisere Baseline EEG mønster. En 2048 MS EPOC delen av dette ble deretter valgt for å bli analysert i tilsvarende FFT. (B) FFT analyse av 2048 MS valgte EPOC fra uskadet humbug opererte dyret på dagen for kirurgi. (C) viser en 90 s EEG spor, som demonstrerer den kontinuerlige, bilaterale deltaet bremse mønster av en alvorlig skadet dyr på dagen for skade.  En 10 s lange spor (tatt fra eske regionen) ble Hentet fra tredje kanal for å bedre visualisere deltaet bremse EEG mønster. En 2048 MS EPOC delen av dette ble deretter valgt for å bli analysert i tilsvarende FFT. (D) FFT analyse av 2048 MS valgte EPOC fra alvorlig TBI dyret på dagen for skaden. 90 s EEG tracings, fra topp til bunn er biopotentials 1, 2, 3, 4, tilsvarende deres steder rundt craniectomy området som sett i figur 1. Grå vertikale merker definere 1 s intervaller på EEG spor. Alle EEG-spor vises på en skala (± 500 μV).  Innenfor FFT analyse grafer var samlet analysert frekvensområde 0,5-30 Hz.  Dette ble ytterligere brutt ned i 4 separate frekvensbånd av delta (gul, 0,5-4 Hz), theta (Purple, 4-8 Hz), Alpha (rød, 8-12 Hz), og Beta (grønn, 12-30 Hz). % (Power) grafen vist i FFT analysen forteller hvilken prosentandel av den totale makten i den analyserte EPOC kommer fra hver tidligere spesifiserte frekvensbånd, noe som åpner for videre matematisk karakterisering av EEG bølgeform mønstre. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4 . Nonconvulsive electrographic anfall samlet 3 dager innlegg alvorlig TBI. (A) viser en 90 s EEG spor fra en humbug operert, uskadet kontroll rotte 3 dager25 etter operasjonen. Alle fire kanalene presenteres. En 10 s lange spor (tatt fra eske regionen) ble Hentet fra tredje kanal for å bedre visualisere Baseline EEG mønster. En 2048 MS EPOC delen av dette ble deretter valgt for å bli analysert i tilsvarende FFT. (B) FFT analyse av 2048 MS valgte EPOC fra uskadet humbug opererte dyr på dagen tre25 etter operasjonen. (C) viser en 90 s EEG spor tre 25 dager etter alvorlig skade.  Dette showet bygningen, rask skyter mønster presentere bilateralt og på tvers av alle 4 samle kanaler.  En 10 s lange spor (tatt fra eske regionen) ble Hentet fra tredje kanal for å bedre visualisere skyter EEG mønster. En 2048 MS EPOC delen av dette ble deretter valgt for å bli analysert i tilsvarende FFT. (D) FFT analyse av 2048 MS valgte EPOC fra alvorlig TBI dyret på dagen for skaden.  90 s EEG tracings, fra topp til bunn er biopotentials 1, 2, 3, 4, tilsvarende deres steder rundt craniectomy området som sett i figur 1. Grå vertikale merker definere 1 s intervaller på EEG spor. Alle EEG-spor vises på en skala (± 500 μV).  Innenfor FFT analyse grafer var samlet analysert frekvensområde 0,5-30 Hz.  Dette ble ytterligere brutt ned i 4 separate frekvensbånd av delta (gul, 0,5-4 Hz), theta (Purple, 4-8 Hz), Alpha (rød, 8-12 Hz), og Beta (grønn, 12-30 Hz).  % (Power) grafen vist i FFT analysen forteller hvilken prosentandel av den totale makten i den analyserte EPOC kommer fra hver tidligere spesifiserte frekvensbånd, noe som åpner for videre matematisk karakterisering av EEG bølgeform mønstre. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5 . Convulsive electrographic beslag samlet 9 dager etter TBI. (A) viser en 90 s EEG spor fra en humbug operert, uskadet kontroll rotte ni (9) dager etter operasjonen. Alle fire kanalene presenteres. En 10 s lange spor (tatt fra eske regionen) ble Hentet fra tredje kanal for å bedre visualisere Baseline EEG mønster. En 2048 MS EPOC delen av dette ble deretter valgt for å bli analysert i tilsvarende FFT. (B) FFT analyse av 2048 MS valgte EPOC fra uskadet humbug opererte dyr på dagen ni (9) etter operasjon. (C) viser en 90 s EEG spor ni (9) dager etter alvorlig skade. Dette showet bygningen, rask skyter mønster presentere bilateralt og på tvers av alle 4 samle kanaler. En 10 s lange spor (tatt fra eske regionen) ble Hentet fra tredje kanal for å bedre visualisere skyter EEG mønster.  En 2048 MS EPOC delen av dette ble deretter valgt for å bli analysert i tilsvarende FFT. (D) FFT analyse av 2048 MS valgte EPOC fra alvorlige TBI dyr ni (9) dager etter skade. 90 s EEG tracings, fra topp til bunn er biopotentials 1, 2, 3, 4, tilsvarende deres steder rundt craniectomy området som sett i figur 1. Grå vertikale merker definere 1 s intervaller på EEG spor. Alle EEG-spor vises på en skala (± 500 μV). Innenfor FFT analyse grafer var samlet analysert frekvensområde 0,5-30 Hz. Dette ble ytterligere brutt ned i 4 separate frekvensbånd av delta (gul, 0,5-4 Hz), theta (Purple, 4-8 Hz), Alpha (rød, 8-12 Hz), og Beta (grønn, 12-30 Hz).  % (Power) grafen vist i FFT analysen forteller hvilken prosentandel av den totale makten i den analyserte EPOC kommer fra hver tidligere spesifiserte frekvensbånd, noe som åpner for videre matematisk karakterisering av EEG bølgeform mønstre. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 6
Figur 6 . Signalet faller ut. Dette er 3 separate eksempler på hva signal slippe ut på grunn av senderen eller mottakeren problemer vises som på EEG innspillingen. (A) Dette er et eksempel på periodisk frafall av EEG-signalet på et opptak.  (B) Dette er et eksempel på å slippe ut på grunn av batteriets feil under kontinuerlig trådløs telemetri vises som på en EEG sporing.  (C) i sirkler regionen, kan det bli sett at når kvaliteten på signalet (QoS) drops fra 100 til 0, blir EEG tracing flat og stillestående ved 0 μV.  Grå vertikale merker definere 1 s intervaller på EEG spor. Alle EEG-spor vises på en skala (± 500 μV). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

Det er rapportert om betydelig variasjon mellom laboratorier for de spesifikke parametrene og metodene som brukes for FPI TBI Model 14,26,27,28. Disse inkonsekvenser har resultert i motstridende resultater og gjøre det vanskelig å harmonisere innsats og utfall mellom laboratorier. Her har vi presentert en detaljert metodikk som beskriver vår tilnærming til langsiktig, kontinuerlig innspilling av video/EEG å overvåke for post-traumatisk epileptiform aktivitet. En rekke trinn er avgjørende for å generere reproduserbar resultater med den beskrevne metoden.

For det første, gitt at forekomsten av post traumatisk epilepsi samsvarer med skade alvorlighetsgrad, gjelder forhold som resulterer i de mest alvorlige TBI. Nærmere bestemt, bruk en 5 mm craniectomy for å sikre at et tilstrekkelig stort område av Dura er eksponert. I tillegg sikre en kvinnelig-kvinnelig luer lås enhet på overflaten av skallen, med åpningen plassert rett over craniectomy. Dette er forskjellig fra andre laboratorier som har brukt en mindre craniectomy (3 mm) og/eller plassert en modifisert nål hub inne i craniectomy, som effektivt reduserer åpningen størrelse. Ved å plassere luer-låsen utenfor craniectomy, opprettholdes 5 mm åpningen. Disse spesifikke parametrene påvirker den samlede kraften som brukes på Dura. Den atmosfæriske trykket påføres Dura har også en stor innvirkning på alvorlighetsgraden av skaden observert. Dessverre er atmosfærisk trykk svært variabel og ser ut til å være enheten avhengig. Noen laboratorier har rapportert å bruke en trykk puls på 8-10 MS18. I kontrast, metoden beskrevet her resulterer i en 20 MS trykk puls. Dette er forenlig med andre laboratorier som ser ut til å generere mer alvorlig skade 14,28. Det er klart at skaden-inducing trykk puls er en parameter som viser betydelig variasjon mellom laboratorier og må være empirisk definert. Imidlertid kan skade alvorlighetsgrad fastsettes basert på en kombinasjon av dødelighet (40-50%), rettende refleks ganger (> 30 min)26. Det er også viktig at bare dyr med en intakt Dura bli inkludert i studien. I tillegg, hvis craniectomy er okkludert av noen lim eller sement slik at en del av Dura under craniectomy ikke utsettes for full kraft av væsken trykk puls, så dyret bør elimineres fra studien.  Også overflødig lim under luer låsen kan følge Dura og fjerne den med sement cap selv etter en vellykket skade.  Til slutt gir den glatte formen på trykk puls kurven på oscilloskop-sporet indikasjonen på at det ikke er noen luftbobler i væskekammeret og indikerer at stempelet beveger seg uten impedans.

Anestesi er en annen kritisk faktor som må kontrolleres. Isoflurane eksponering bør holdes på de laveste nivåene mulig å opprettholde et kirurgisk fly av anestesi. Rotter utsatt for høyere nivåer av isoflurane eller for lang varighet er mer sannsynlig å utvikle neurogenic-indusert lungeødem. Utarbeidelse av skallen representerer en annen kritisk aspekt av metoden. Spesielt, tørker skallen og fjerner alle Ben støv hjelper å forhindre rottene fra fjerner senderen for tidlig.

Plassering av skruer og tilkobling av EEG ledningene er åpenbart avgjørende for å produsere konsekvent reproduserbar innspillinger. Det er viktig at skruene ikke er plassert for dypt som å indusere en lesjon på hjernen. Benet klaff utvinnes fra craniectomy av voksne (12 uker gammel) mannlig Wistar rotter er gjennomgående 2 mm tykk. Bruk EEG elektrode skruer med en 2,5 mm aksel. Det er nyttig å bruke tipsene til buet mygg hemostatic tang som en spacer for å sikre at skruene bare strekker seg til bunnen av benet og ikke stikker inn i hjernen.

Tilnærmingen som presenteres her har noen begrensninger. Batterier må skiftes med jevne mellomrom. Hyppigheten av batteri endringer avhenger av samplingsfrekvensen. Batterier skiftes vanligvis en gang i uken for en samplingsfrekvens på 1000 Hz. Denne tidsrammen kan utvides ved å redusere samplingsfrekvensen. Systemet er også begrenset til opptak fra fire monopolar EEG-elektroder. Men dette gir to kanaler per halvkule og kan skille mellom fokal og generalisert hendelser og kan skille mellom fremre og bakre endringer. Til tross for disse begrensningene, gir denne tilnærmingen en rimelig metode for å gjennomføre kontinuerlig video/EEG overvåking og påvisning av epileptiform endringer etter alvorlig TBI.

Metoden som beskrives her, resulterer i både electrographic og convulsive anfall innen en måned etter TBI. Derfor gir denne tilnærmingen en rimelig tidsramme for å studere potensielle legemiddel selskap for å forebygge epileptogenesis etter alvorlig TBI. Denne tilnærmingen gir også en metode for å undersøke de molekylære mekanismene forbundet med PTE og kan føre til identifisering av potensielle biomarkører som kan brukes til å identifisere pasienter som er mest utsatt for å utvikle PTE.

Disclosures

Chelasea R Richardson er en ansatt i emka Scientific, leverandøren av dette trådløse telemetri-systemet som er beskrevet.

Acknowledgments

Vi ønsker å takke Paul Dressel for hans uvurderlig støtte i grafisk design og utarbeidelse av tall.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.00 mm Drill Bits Drill Bit City: New Carbide Tools 05M200
3M ESPE Durelon Carboxylate Cement 3M , Neuss Germany 38019 Dental Cement
4-0 Suture Ethicon, Sommerville, NJ K831H 4-0 Ethicon Perma-hand Silk, 26mm 1/2c Taperpoint, 30" (75cm), Black Braided non-absorbable suture 
5 mm outer diameter trephine Fine Science Tools 18004-50
Bonewax Medline Industries, Mendelcin, IL REF DYNJBW25
Buprenorphine HCL, Injection (0.3 mg/mL) 1 mL vial Par Pharmalogical, Chestnut Ridge NY 3003706 NDC 42023-179-01
Dumont #6 Forceps Fine Science Tools 11260-20
Dumont #7b Forceps Fine Science Tools 11270-20
ecgAUTO EMKA Technologies, Falls Church, VA
Female Luer Thread Style Coupler Clear Polycarbonare   Cole-Palmer instrument SKO#45501-22 Order lot #214271
Foot Power Drill Grobet USA, Carlstadt, NJ Model C-300
GentaMax 100 (Gentamicin, Sulfate Solution) Phoenix, Manufactured by Clipper Distributing Company LLC, St. Joseph, MO NDC 57319-520-05
Hill's Prescription Diet a/d Canine/Feline  Hill's Pet Nutrition, Inc. , Topeka, KS
IOX2 Software  EMKA Technologies, Falls Church, VA
Isoflorane, USP Piramal Enterprise Limited, Andhra, India NDC 66794-013-25
IsoTech Anesthesia machine SurgiVet WWV9000
Lateral FPI device AmScien 302 curved tip, with pressure tubing extension. connected via screw lock connector (Cole-Palmer; #4550-22)
Leica A60 Stereomicroscope Leica Biosystems, Richmond, VA PN: 10 450 488
Marcaine (0.5%) Bupivacaine hcl injection usp 5 mg/mL Hospira, Lake Forest, IL CA-3627 50mL multiple dose vial; NDC 0409-1610-50
Micro-Adson Forceps Fine Science Tools 11018-12
Olsen-Hegar Needle Holders with Suture Cutters Fine Science Tools 12002-14
PALACOS R+G bone cement with gentamicin Heraeus,  REF: 5036964 Radiopaque bone cement containing 1 x 0.5g Gentamicin
Physio Suite Kent Scientific, Terrington, CT
Povidone-iodine solution Betadine 
Puralube Vet Ointment Dechra Veterinary Products, Overland Park KS NDC 17033-211-38
Scalpel blade (#10) and holder Integra Miltex, York, PA REF: 4-110
Scalpel Handle - #4 Fine Science Tools 10004-13
Sickle Knife Bausch + Lomb Storz Instruments N1705 HM 5mm curved blade. Round handle. Overall length 168mm, 6.6 inches.
Silverstein Micro Mirror Bausch + Lomb Storz Instruments N1706 S8 3mm diameter. Angled 45 degrees. Overall length 180mm, 7.2 inches
Storage NAS Synology Inc.  DS3615xs
Synology Assistant  Synology Inc. 
Thermal Cautery Unit Geiger Medical Technology, Delasco Council Bluffs, IA Model NO: 150
Vetivex Dechra Veterinary Products, Overland Park KS Veterinary pHyLyteTM Injection pH 7.4 (Multiple Electrolytes Injection, Type 1, USP)
Video Cameras TRENDnet, Torrance, CA TV-IP314PI Indoor/Outdoor 4MP H.265 WDR PoE IR Bullet Network Cameral
Video NAS Synology Inc.  DS916
Wistar IGS rats  Charles River strain code 003 12 wk old at the time of injury
Wullstein Retractor Fine Science Tools 17018-11

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Flanagan, S. R. Invited Commentary on Centers for Disease Control and Prevention Report to Congress: Traumatic Brain Injury in the United States: Epidemiology and Rehabilitation. Archives of Physical Medicine and Rehabilitation. 96, 1753-1755 (2015).
  2. Annegers, J. F., Coan, S. P., Hauser, W. A., Leestma, J., Duffell, W., Tarver, B. Epilepsy, vagal nerve stimulation by the NCP system, mortality, and sudden, unexpected, unexplained death. Epilepsia. 39, 206-212 (1998).
  3. Lowenstein, D. H. Epilepsy after head injury: an overview. Epilepsia. 50, Suppl 2 4-9 (2009).
  4. Englander, J., et al. Analyzing risk factors for late posttraumatic seizures: a prospective, multicenter investigation. Archives of Physical Medicine and Rehabilitation. 84, 365-373 (2003).
  5. Faul, M. X. L., Wald, M. M., Coronado, V. G. Traumatic Brain Injury in the United States: Emergency Department Visits, Hospitalizations and Deaths 2002-2006. Centers for Disease Control and Prevention, National Center for Injury Prevention and Control. Atlanta (GA). (2010).
  6. Herman, S. T. Epilepsy after brain insult: targeting epileptogenesis. Neurology. 59, 21-26 (2002).
  7. Annegers, J. F., Coan, S. P. The risks of epilepsy after traumatic brain injury. Seizure. 9, 453-457 (2000).
  8. Christensen, J., Pedersen, M. G., Pedersen, C. B., Sidenius, P., Olsen, J., Vestergaard, M. Long-term risk of epilepsy after traumatic brain injury in children and young adults: a population-based cohort study. Lancet. 373, 1105-1110 (2009).
  9. Webb, T. S., Whitehead, C. R., Wells, T. S., Gore, R. K., Otte, C. N. Neurologically-related sequelae associated with mild traumatic brain injury. Brain Injury. 29, 430-437 (2015).
  10. Mahler, B., Carlsson, S., Andersson, T., Adelow, C., Ahlbom, A., Tomson, T. Unprovoked seizures after traumatic brain injury: A population-based case-control study. Epilepsia. 56, 1438-1444 (2015).
  11. Wang, H., et al. Post-traumatic seizures--a prospective, multicenter, large case study after head injury in China. Epilepsy Research. 107, 272-278 (2013).
  12. Simonato, M., French, J. A., Galanopoulou, A. S., O'Brien, T. J. Issues for new antiepilepsy drug development. Current Opinion in Neurology. 26, 195-200 (2013).
  13. Xiong, Y., Mahmood, A., Chopp, M. Animal models of traumatic brain injury. Nature Review Neuroscience. 14, 128-142 (2013).
  14. Kharatishvili, I., Nissinen, J. P., McIntosh, T. K., Pitkanen, A. A model of posttraumatic epilepsy induced by lateral fluid-percussion brain injury in rats. Neuroscienc. 140, 685-697 (2006).
  15. McIntosh, T. K., et al. Traumatic brain injury in the rat: characterization of a lateral fluid-percussion model. Neuroscience. 28, 233-244 (1989).
  16. Thompson, H. J., et al. Lateral fluid percussion brain injury: a 15-year review and evaluation. Journal of Neurotrauma. 22, 42-75 (2005).
  17. Curia, G., Eastman, C. L., Miller, J. W., D'Ambrosio, R. Modeling Post-Traumatic Epilepsy for Therapy Development. Translational Research in Traumatic Brain Injury. Laskowitz, D., Grant, G. Boca Raton (FL). (2016).
  18. D'Ambrosio, R., Fairbanks, J. P., Fender, J. S., Born, D. E., Doyle, D. L., Miller, J. W. Post-traumatic epilepsy following fluid percussion injury in the rat. Brain. 127, 304-314 (2004).
  19. Saatman, K. E., et al. Classification of traumatic brain injury for targeted therapies. Journal of Neurotrauma. 25, 719-738 (2008).
  20. Smith, D., Brooke, D., Wohlgehagen, E., Rau, T., Poulsen, D. Temporal and Spatial Changes in the Pattern of Iba1 and CD68 Staining in the Rat Brain Following Severe Traumatic Brain Injury. Modern Research in Inflammation. 4, 9-23 (2015).
  21. Ndode-Ekane, X. E., et al. Harmonization of lateral fluid-percussion injury model production and post-injury monitoring in a preclinical multicenter biomarker discovery study on post-traumatic epileptogenesis. Epilepsy Research. 151, 7-16 (2019).
  22. Ciszek, R., et al. Informatics tools to assess the success of procedural harmonization in preclinical multicenter biomarker discovery study on post-traumatic epileptogenesis. Epilepsy Research. 150, 17-26 (2019).
  23. Immonen, R., et al. Harmonization of pipeline for preclinical multicenter MRI biomarker discovery in a rat model of post-traumatic epileptogenesis. Epilepsy Research. 150, 46-57 (2019).
  24. Kamnaksh, A., et al. Harmonization of pipeline for preclinical multicenter plasma protein and miRNA biomarker discovery in a rat model of post-traumatic epileptogenesis. Epilepsy Research. 149, 92-101 (2019).
  25. Redell, J. B., Moore, A. N., Ward, N. H., Hergenroeder, G. W., Dash, P. K. Human traumatic brain injury alters plasma microRNA levels. Journal of Neurotrauma. 27, 2147-2156 (2010).
  26. Smith, D., et al. Convulsive seizures and EEG spikes after lateral fluid-percussion injury in the rat. Epilepsy Research. 147, 87-94 (2018).
  27. Eastman, C. L., Fender, J. S., Temkin, N. R., D'Ambrosio, R. Optimized methods for epilepsy therapy development using an etiologically realistic model of focal epilepsy in the rat. Experimental Neurology. 264, 150-162 (2015).
  28. Shultz, S. R., et al. Can structural or functional changes following traumatic brain injury in the rat predict epileptic outcome. Epilepsia. 54, 1240-1250 (2013).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics