Måle sperm veiledning og motilitet innenfor Caenorhabditis elegans Hermafroditt reproduktive tarmkanalen

Developmental Biology
 

Summary

Sperm må kunne navigere gjennom oviduct for å gjødsle en oocyte. Her beskriver vi en analyse for å måle sperm migrasjon innenfor C. elegans Hermafroditt livmoren. Denne analysen kan gi kvantitative data på sperm distribusjon i livmoren etter mating, samt på hastighet, retningsbestemt hastighet, og reversering frekvens.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Hu, M., Legg, S., Miller, M. A. Measuring Sperm Guidance and Motility within the Caenorhabditis elegans Hermaphrodite Reproductive Tract. J. Vis. Exp. (148), e59783, doi:10.3791/59783 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Vellykket befruktning er grunnleggende for seksuell reproduksjon, men lite er kjent om mekanismene som veileder sperm til oocytter innenfor den kvinnelige reproduktive tarmkanalen. Mens in vitro studier tyder på at sperm av internt gjødsling dyr kan svare på ulike signaler fra sine omgivelser, den manglende evne til å visualisere sin atferd inne i kvinnelige reproduktive tarmkanalen skaper en utfordring for å forstå sperm migrasjon og mobilitet i sitt opprinnelige miljø. Her beskriver vi en metode som bruker C. elegans som overvinner denne begrensningen og utnytter deres gjennomsiktige epidermis. C. elegans hanner beiset med en mitokondrie fargestoff er paret med voksen hermafroditter, som fungerer som modifiserte kvinner, og innskudd fluorescensmerkete merket sperm inn i Hermafroditt livmoren. Migrasjon og motilitet av merket sperm kan deretter spores direkte ved hjelp av et Epi-fluorescens mikroskop i en live Hermafroditt. I vill-type dyr, ca 90% av merket sperm krype gjennom livmoren og nå befruktning området, eller spermatheca. Bilder av livmoren kan tas 1 time etter mating for å vurdere fordelingen av sperm i livmoren og prosentandelen av sæd som har nådd spermatheca. Alternativt kan time-lapse bilder tas umiddelbart etter mating for å vurdere sperm hastighet, retningsbestemt hastighet og reversering frekvens. Denne metoden kan kombineres med andre genetiske og molekylære verktøy tilgjengelig for C. elegans å identifisere romanen genetiske og molekylære mekanismer som er viktige i å regulere sperm veiledning og motilitet innenfor den kvinnelige reproduktive tarmkanalen.

Introduction

Den molekylære mekanismer som spermatozoa (referert til som sperm) navigere gjennom den kvinnelige reproduktive tarmkanalen mot oocyte er ikke godt forstått, men er grunnleggende for seksuell reproduksjon. Sperm motilitet er svært dynamisk og avhenger av robust kommunikasjon signaler som endrer sperm hastighet og retningsbestemt motilitet1,2,3, 4,5,6 , 7 andre er , 8 på alle , 9 andre priser , 10 andre , 11 flere , 12. C. elegans har blitt en kraftfull modell for å studere sperm bevegelse i vivo fordi Hermafroditt gjennomsiktige epidermis tillater sporing av levende sperm på én celle oppløsning2,3, 8,10. Hensikten med dette papiret er å gi metoder for å vurdere sperm bevegelse i C. elegans Hermafroditt livmoren.

I dyrearter hvor sperm og oocyte møtes i det ytre miljø (dvs. acquatic miljøer), sperm svare på chemotactic signaler skilles ut av oocytter. Disse signalene guide retning sperm bevegelse, bringe dem nærmere signalkilden4,6,11. Men mye mindre er kjent om sperm bevegelse i arter som gjødsle internt. En stor utfordring er arkitekturen i den kvinnelige reproduktive kanalen, som er utilgjengelig for mikroskopi i de fleste arter. I vitro studier hos mennesker, mus og griser, for eksempel, gir bevis for at subpopulasjoner av sperm kan svare på chemoattractants, væskeflyt, og termisk graderinger1,5,7,9, det er 12. Med disse systemene, manglende evne til å visualisere og spore sperm bevegelse in vivo steder alvorlige begrensninger på strategier for å oppdage de viktigste mekanismene som regulerer disse funksjonene.

For å overkomme disse begrensningene har vi utviklet metoder som bruker nematode C. elegans til å visualisere sperm direkte etter befruktning, for å måle individuelle overførings parametre for sperm i Vivo, og for å måle evnen til en sæd befolkning til å målrette befruktning området. Disse metodene, sammen med C. elegans molekylær og genetisk verktøysett, lette oppdagelsen av den kjemiske signalering molekyler og molekylære maskiner som regulerer sperm motilitet atferd. For eksempel, genetisk skjermene kan gjennomført inne hermafroditter eller hanndyr å identifisere gener det er vesentlige for effektiv sperm bevegelse inne vivo13. Molekyler kan injiseres inn i Hermafroditt gonad å teste for effekter på sperm aktivering, migrasjon hastighet, og retningsbestemt motilitet3. I tillegg kan de beskrevne metoder brukes til å overvåke rogue sperm migrasjon i utenfor livmoren kroppen steder og å evaluere sperm konkurranse10,14.

C. elegans finnes i naturen som hermafroditter og hanner (se figur 1). Den Hermafroditt gonad har to U-formede armer som er speil bilder av hverandre. Under L4 larvestadiet scenen, den mest proksimale bakterieceller (dvs. cellene i nærheten av spermatheca) gjennomgår spermatogenesis. Hver primære spermatocyte inn meiose og produserer fire haploide via. Disse via skyves inn i spermatheca sammen med de første modne oocyte og gjennomgår spermiogenesis15. Voksen hermafroditter bytte fra spermatogenesis til oogenese. Oocytter modnes i en samlebånd mote langs gonad, med de mest modne oocyte ved proksimale enden av gonad, ved siden av spermatheca. MSP signaler fra sperm er nødvendig for å utløse meiotic modning og ovulation16,17. Mann C. elegans, derimot, har en J-formet gonad som produserer bare sperm. Via er lagret i den banebrytende vesicle. Ved mating med Hermafroditt eller hunn, den mannlige setter inn spiklene nær halen inn i snappe. Via aktiveres under utløsning, når de kommer i kontakt med sædvæsken18. C. elegans sperm ikke svømme som de ikke er pisket. I stedet gjennomgår de gjennom reproduktive tarmkanalen, ved hjelp av fingeraktige for bevegelse. Det er godt etablert at mannlige sperm, som er større i størrelse, har et konkurransefortrinn over Hermafroditt sperm14.

I denne metoden, mannlige C. elegans opptre som sperm donor og er paret med voksen hermaprhodites. Voksne hanner er farget med et fluorescerende mitokondrie fargestoff til produsert merket sperm. Når avsatt gjennom Hermafroditt snappe, må sperm krype rundt embryo i livmoren mot spermatheca, eller befruktning området. Den gjennomsiktige epidermis av C. elegans modellen gjør det mulig for direkte visualisering av hver enkelt sperm som den navigerer gjennom den kvinnelige reproduktive tarmkanalen. I de senere årene, har vår Lab med hell brukt denne metoden til å demonstrere viktigheten av en klasse av F-serien prostaglandiner i guiding sperm fra snappe til spermatheca19,20. Den molekylære mechansims styrende sin syntese av Hermafroditt og respons av sperm er fortsatt under etterforskning. Men denne metoden for å vurdere sperm motilitet og migrasjon forenkler identifisering av de viktigste aktørene som kontrollerer sperm og oocyte kommunikasjon i internt gjødsling dyr. Følgende protokoll beskriver trinn for trinn hvordan du utfører denne analysen.

Protocol

Merk: alle trinnene i denne protokollen utføres ved romtemperatur (~ 20-22 ° c) eller i konstant temperatur inkubatorer innstilt på 16 ° c eller 20 ° c. Mann og Hermafroditt C. elegans dyrkes ved hjelp av standard kultur forhold og NA22 eller OP50 E. coli som mat kilde21,22. Den vill-type N2-hermafroditter og tåke-2 (Q71) hanner brukes i prosedyren under.

1. dag 1: plukke L4 Stage hermafroditter for mating

  1. For å oppnå konsistente resultater bør alle hermafroditter synkroniseres når voksne reproduserer aktivt. Pick 20-30 L4 scenen hermafroditter til en 6 cm seeded nematode vekstmedium (NGM) plate. Ruge hermafroditter ved 20 ° c for 28-30 h.
    Merk: Bare 12-15 hermafroditter vil bli brukt til mating. De resterende hermafroditter er overskudd.

2. dag 1: farging av hanner med fluorescerende mitokondrie Dye (mito-Dye)

  1. Lag en mannlig flekker plate ved å plassere en prikk av E. coli (mat prikk) i sentrum av en unseeded NGM plate. For å gjøre maten prikk, bruk slutten av et glass røring stang å skrape E. coli fra bakterien plenen av en seeded plate og sette den på unseeded plate. Prikken skal være ~ 5-7 mm i diameter.
  2. Bland sammen 2 μL av 1 mM mito-Dye (se tabell over materialer) i DMSO og 10 ΜL av M9 buffer (3 g KH2PO4, 6 g av na2HPO gav NaCl, 1 ml 1 M MgSO4, H2O til 1 L. Tilsett MgSO4 etter autoklavering). Pipetter alle mito-Dye løsning på maten prikken på den mannlige farging plate. La platen tørke i mørket (~ 30 min).
    Merk: Mito-Dye er lysfølsom. Shield alle løsninger, plater og ormer som inneholder mito-Dye fra lys. Oppbevar 1 mM-aksjen ved-20 ° c.
  3. Pick ~ 100 1-3 dag gamle voksne hanner23 til mito-Dye beiset mat prikk på den mannlige farging plate. Pakk platen i aluminiumsfolie og ruge over natten ved 16 ° c. For mating, bruk ~ 50-60 menn per 12-15 hermafroditter. Hvis mer enn ~ 100 menn er nødvendig, gjøre mer farging plater for å hindre overbefolkning av menn.
    Merk: Hanndyr kanne likeledes være flekkete av incubating inne en 10 μM mito-Dye løsning inne M9 buffer for 3 h opp på en ur barometer. Hold ormer dekket for å hindre fordampning og lys eksponering. Etter 3 timer, bruk en Pasteur Pipet å overføre menn på en 10 cm seeded NGM plate. Overfør så lite av mito-Dye løsning som mulig. Pakk platen i aluminiumsfolie og ruge over natten i 16 ° c.

3. dag 2: mating

  1. Velg farget menn fra dag 1 på en ny, seeded NGM plate. La platen stå i mørket til paringen. Dette trinnet sikrer at overflødig mito-Dye beiset bakterier rundt menn er fjernet. Carryover av overdreven mito-Dye flekket bakterier på mating plate kan flekken Hermafroditt vev.
  2. Lag en parring plate ved å slippe 2 μL av en tykk E. coli blanding på en unseeded NGM plate. La de tykke bakteriene tørke for å gjøre parings punktet. Hanner og hermafroditter vil bli overført til denne prikken for mating. For å lage tykke e. coli, spinne ned 3 ml over natten E. coli og resuspend bakteriene pellet i 1 ml av M9. Denne blandingen kan oppbevares ved 4 ° c og gjenbrukes i opptil 6 måneder.
    Merk: Tykkelsen på E. coli -løsningen kan justeres. Hvis løsningen er for tynn, kan menn krype bort fra mating prikk i stedet for aggregering på den for mating. Mating prikker laget av en E. coli soluton som er for tykk kan redusere paring effektivitet.
  3. Mens parings platen fra trinn 3,2 tørker, bland sammen 300 μL av 1% (w/v) Tricaine (Tri), 300 μL av 0,1% (w/v) Tetramisole (tet) og 900 μL av M9.
    Merk: Lagre 1% (w/v) Tricaine og 0,1% (w/v) Tetramisole som aliquotes ved-20 ° c. Unngå gjentatte fryse tine.
  4. Overføring 600 μL av tet/Tri-løsningen til et klokke glass.
  5. Transfer 12-15 hermafroditter plukkes på dag 1 til tet/Tri-løsningen i klokke glasset. Ruge i 30 minutter for å nakkens hermafroditter. Hold klokke glasset tildekket for å forhindre at tet/Tri-løsningen fra fordamper.
    Merk: Det er viktig at hermafroditter er anesthetized i minst 30 min. mindre tid kan føre til en bevegelig orm under bildeoppkjøp, som kan interefere med bildebehandling.
  6. Mens hermafroditter er incubating, hakke 50-60 beiset menn fra trinn 3,1 på mating prikk (trinn 3,2). Oppbevar platen i mørket til trinn 3,8.
  7. Etter 30 min inkubasjons i tet/Tri-løsningen, bruk et glass Pasteur-Pipet for å overføre immobilisert hermafroditter fra klokke glasset til en unseeded NGM-plate. Fjern så mye væske som mulig og la overflødig væske tørke.
    Merk: Ikke la hermafroditter tørke overdrevet. Så snart all synlig væske har fordampet, begynner neste trinn.
  8. Overfør anesthetized-hermafroditter fra unseeded NGM-plate til parings punktet med fargede hanner. Ruge i mørket i 30 min slik at menn til å pare med hermafroditter.
  9. Etter mating i 30 min, Monter hermafroditter umiddelbart for time-lapse Imaging eller overføre hermafroditter på en ny, seeded NGM plate for å hvile i 1 time før bildebehandling.
    Merk: Time-lapse videoer av Hermafroditt livmoren brukes til å kvantifisere sperm hastighet og reversering frekvens. Still bilder av livmoren tatt 1 time etter mating brukes til å kvantifisere sperm distribusjon, eller spem veiledning.

4. dag 2: montering ormer for visualisering

  1. Opprette en monterings pute med 2% agarose i H2O
    Merk: 2% agarose kan lages i bulk, aliquoted inn i glass reagensrør og oppbevares ved 4 ° c. Ved behov kan hver alikvot bli microwaved før hver bruk og lagres i en varme blokk for å hindre at den solidifying.
    1. Hvis du vil lage en monteringsplate, justerer du de tre glass objektglassene side om side med de lange kantene. Plasser to stykker maskeringstape oppå hverandre på begge de ytre lysbildene. Disse ytre glass lysbilder med tape vil fungere som støtte, slik at tykkelsen på den resulterende agarose puten vil være "to tape dyp".
    2. Plasser ~ 75 μL av smeltet 2% agarose på midten lysbildet (dette er lysbildet uten tape). Plasser umiddelbart et nytt glass objekt lysbilde oppå agarose. Denne topp glass lysbilde bør være vinkelrett på de andre lysbildene, med hver ende hviler på båndet av de to støtte lysbilder.
    3. La agarose stivne (~ 30 s). Forsiktig fjerne det øverste glasset lysbildet ved å skyve den av agarose puten.
  2. Plasser 10-15 μL av tet/Tri-løsningen på 2% agarose pad. Overfør den paret hermafroditter på puten. Pass på å overføre så lite bakterier som mulig.
  3. Plasser en cover slip over ormer på agarose puten.

5. dag 2: oppsett av Image Acquisition

Merk: Eventuelle oppreist miscroscope utstyrt med Epi-fluorescens, 10x og 60x mål, og et digitalt kamera kan brukes til å tilegne seg bilder for sperm distribusjon. Programvare som er i stand til å anskaffe bortfalt bilder er nødvendig for å vurdere sperm hastighet, retningsbestemt hastighet, og reversering frekvens.

  1. Image oppkjøpet 1 time etter mating
    1. Monter glidebryteren på scenen på mikroskopet. Se igjennom det øye stykker å avsøke for ormer på agarose pute benytter det 10x mål med det rød fluorescens utstråling filterene (TRITC filterene). En gang en orm er blitt grunnlegge, i korte trekk på fluorescens lyset å se hvis ormen har paret. Hvis sperm er synlig i livmoren, Bytt til 60x mål.
      Merk: Trykket skapt av 60x målet på dekkglass kan skade noen skjøre ormer, forårsaker tarmen eller gonad å extrude fra dyret. Skanning for vellykket mating ved hjelp av 10x mål kan minimere ormer ' eksponering for ekstra trykk. Ikke utsett de med følgende ormer for lengre perioder med fluorescerende lys.
    2. Bruk differensial interferens Contrast mikroskopi (DIC) til å plassere ormen slik at både den snappe og en spermatheca er i sikte. Fokuser bildet ved å fokusere på midten av spermatheca. Kontroller eksponeringen for både DIC-og TRITC-kanaler. I DIC bør interne ormen strukturer være godt synlig. I TRITC, bør individuell sperm være synlig som distinkte puncta.
      Merk: Hvert bilde skal fange livmoren fra snappe til en av spermatheca. Hvis livmoren er for lang til å passe på ett bilde, kan to separate bilder tas. Det er ikke nødvendig for alle bildene som skal tas på samme eksponeringsnivå. Imidlertid er det viktig at enkelte sperm kan skilles og kvantifisert i fluorescens bilder.
    3. Tilegne seg DIC og fluorescens bilder for hver livmor.
    4. Gjenta trinn 5.1.1-5.1.3 til alle paret hermafroditter er avbildet.
  2. Registrere tidsforløp videoer
    1. Skann agarose puten og Finn hermafroditter som inneholder merket sperm i livmoren, som beskrevet i trinn 5.1.1 og 5.1.2
    2. Konfigurere programvaren til å kjøpe tid-lapse bilder i DIC og TRITC kanaler. Vanligvis er time-lapse bilder tatt på 15-30 s intervaller for 10-20 min per livmor.

6. kvantifisering

  1. Kvantifisere sperm distribusjon på livmor bilder tatt 1 time etter mating
    1. Fra og med en snappe på den ene enden og spermatheca på den andre, dele livmoren i tre deler. Disse vil representere de tre sonene. Sone 1 (Z1) inneholder en snappe og sone 3 (Z3) inneholder spermatheca.
    2. Manuelt telle antall sædceller i hver tredjedel av livmoren, og rapportere nummeret i hver sone som en prosent av den totale sperm i hele livmoren. Nedenfor finner du et eksempel.
      Equation
      Merk: noen ganger må signal intensiteten til TRITC-kanals bildet justeres slik at alle sæd som har blitt fanget i bildet kan være synlige og kvantifisert.
  2. Spore sperm i tidsforløpbilder
    Merk: I denne utredningen brukte vi NIS-Elements-programvaren til analyse. I avsnittene nedenfor gir vi instruksjoner for manuelt sporing sperm bruke denne programvaren (trinn 6.2.1) samt åpen kildekode-programvare ImageJ/Fiji (trinn 6.2.2).
    1. Sporing sperm med NIS-Elements
      1. Åpne. nd2-filen med tidsforløp serien som skal spores. Hvis du vil begynne å spore, åpner du sporings panelet ved å høyreklikke i programvaren og velge analyse kontroller | Å spore.
      2. Velg Definer ny avkastningi sporings panelet. Definer hver region av interesse (ROI) ved å klikke over hver sæd som skal spores. Det vises et farget merke over den valgte sæden. Klikk Fullfør når alle ROIs er valgt.
      3. Når ROIs er identifisert, flytter du til neste bilde i tidsforløp serien. Dra ROI-markøren til den nye plasseringen av sæden i bildet. Fortsett å gjøre dette til sæden ikke lenger kan spores. Prikkede linjer vil vises ved å koble hver av plasseringene ROI-markøren er plassert gjennom alle rammene til tids forløps bildet.
        Merk: Bare sperm i sone 2 bør spores som sperm i Zones 1 og 3 har en tendens til å bevege seg i et sirkulært mønster selv i vill-type dyr.
      4. Eksporter alle målbare data (for eksempel banelengde, tid, XY-posisjon osv.) fra den sporede sæden til et Excel-dokument ved å klikke Eksporter i sporing-panelet.
    2. Sporing sperm med Fiji
      1. Konvertere TRITC kanal bilder i tidsforløp serien til TIF-filer. Lagre alle filer fra en serie i en mappe.
      2. Importer bildene til Fiji ved hjelp av importfunksjonen BioFormats. Importer bilder fra en tidsforløp serie som én hyperstack.
      3. Åpne TrackMate i Fiji24 via plugins | Sporing | Manuell sporing med TrackMate. En diaglogue boks vil åpnes.
      4. Velg TrackMate-verktøyet på verktøylinjen i Fiji. Dobbeltklikk på sperm som vil bli sporet. Det vises en grønn sirkel med stiplede linjer. Denne sirkelen kan flyttes ved å klikke inne i sirkelen og dra til ønsket posisjon. Størrelsen på denne sirkelen kan endres ved samtidig å trykke på alt -tasten og rulle musen.
      5. En gangnummeret og plasseringen av det bane er blitt sette, falle i staver på sirklene atter. De stiplede grønne linjene vil bli til en heldekkende grønn linje. Trykk samtidig på Shift -og L -tastene for å slå på sporingsmodus. Dette vil bli angitt i verktøylinjen for Fiji.
      6. Gå til neste delbilde i tidsforløp serien. Hvis du vil angi den nye plasseringen av den sporede sæden i den nye rammen, holder du musen over det nye punktet og trykker på A -tasten. Aktivitetsmåleren vises nå på den nye plasseringen, og det vises en linje som kobler sammen plasseringene der aktivitetsmåleren er plassert i de forrige rammene.
      7. Etter at sporene er fullført, klikker du analyser i dialogboksen TrackMate for å generere nødvendige data.
    3. Hvis du vil beregne hastigheten, deler du den totale banelengden til sæden med medgått tid.
    4. For å beregne vectorial hastighet, tegne en linje gjennom livmoren starter fra den snappe peker mot spermatheca. Mål avstanden sæden har migrert langs denne linjen fra begynnelsen til slutten av sporet. Del denne distansen med medgått tid. Negative verdier indikerer at sæden har migrert bort fra spermatheca.
    5. Hvis du vil registrere tilbakeførings frekvens, teller du antall ganger sæd sporingen har generert en vinkel som er mindre enn 90 ° i løpet av tre påfølgende tidsforløp RAM mer.

Representative Results

For å generere resultatene avbildet i denne utredningen, Fog-2 (Q71) hanner ble farget med mito-Dye og paret med vill-type, N2 hermafroditter. Figur 2 gir en samlet ordning for metoden, inkludert ormen forberedelse, mating, og analyse. Som film 1 viser, har den voksne Hermafroditt reproduktive luftveiene to armer som er speil bilder av hverandre. Ved mating, merket sperm er avsatt i Hermafroditt livmoren gjennom snappe. Sæden flytte rundt utvikle embryo i livmoren mot spermatheca, hvor de er lagret til befruktning. Som bakterieceller i den voksne Hermafroditt utvikle seg til oocytter, den proksimale, mest modne oocyte skyves inn i spermatheca via skjede celle contrations. Befruktning oppstår mens oocyte er i spermatheca.

Å kvantifisere sperm distribusjon og migrasjon gjennom kvinnelige reproduktive tarmkanalen, den Hermafroditt livmoren er delt inn i tre soner (film 1, figur 3a). Sone 1 spenner over den første tredje delen av livmoren, som starter fra en snappe. Sone 2 spenner over midten tredjedel av livmoren, og sone 3 spenner over den siste tredjedel av livmoren og inkluderer spermatheca. Riktig sæd veiledning ved bruk av vill-type, N2 -hermafroditter og tåke-2 (Q71) hanner bør resultere i ca. 90% av den merkede sæden som når spermatheca, eller sone 3 (figur 3b).  Siamesere som resulterer i for få (figur 3c, mindre enn 10-15 sperm) eller for mange (figur 3D, livmor fylt med sperm) sperm i livmoren bør ikke telles. I siamesere som resulterer i mindre enn 10-15 sperm, 3-4 rogue sperm kan tungt skew dataene. På samme måte, når livmoren er fylt helt med sperm, kan sæden ikke migrere hensiktsmessig. Sperm kan virke spredt over hele uteri av noen mutanter som viser dårlig sperm veiledning fenotype. Men i dette tilfellet, bør sperm ikke fylle hver spalte i livmoren, som vist i figur 3D. Kvantifisering av hver arm av gonad regnes som en prøve, eller en n.

Time-lapse bilder er tatt for å kvantifisere sperm hastighet og reversering frekvens. Bare sperm i sone 2 skal spores (figur 4a) fordi sperm i soner 1 og 3 (film 1) har en tendens til å bevege seg i et sirkulært mønster, selv innenfor vill-type dyr. Laspe bilder tatt på 15-30 s intervaller brukes vanligvis til å spore sperm. Bare sperm som kan følges i påfølgende rammer for mer enn 2,5-3 min er kvantifisert. I figur 4b-M, sperm preget av den røde og blå prikker tilfredsstille dette kriteriet, mens sperm preget av den grønne prikken ikke. Derfor er verdiene som er definert i figur 4n , kvantifisert for sæden som er merket med de røde og blå prikkene (figur 4O), mens de for sæden som er merket med den grønne prikken, ikke ble kvantifisert.

Figure 1
Figur 1: Cartoon av den voksne C. elegans Hermafroditt og male. Store reproduktive strukturer er merket i figuren. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: skjematisk diagram av prøven forberedelse og datainnsamling. Hanner beiset med mito-fargestoff er paret med synkronisert voksen hermafroditter. Time-lapse bilder av paret hermafroditter er tatt umiddelbart etter mating for å fange data for sperm hastighet og reversering frekvens. Fortsatt bilder av paret hermafroditter er tatt 1 time etter mating for å vurdere sperm distribusjon i livmoren. Se teksten for mer informasjon. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: kvantifisere sæd fordeling i Hermafroditt livmor. (A). skjematisk av C. elegans Hermafroditt livmor. V = snappe, E = embryo, S = spermatheca, O = oocyte, Z1-Z3 = Zones 1-3 brukes til å måle sperm distribusjon. (B-D). DIC + TRITC fusjonerte (venstre panel) og TRITC bare (høyre paneler) bilder av vill-type Hermafroditt uteri 1 h etter mating til tåke-2 (Q71) hanner beiset med mito-Dye. Sperm vises rødt. Gule konturer angir plasseringen av spermatheca. Scale bar: 20 μm. Z1, Z2, Z3 kvantifisering i B representerer prosent sæden i hver sone ± standardavvik. Bilder i C og D representerer siamesere som har resultert i for få (c) eller for mange (D) sperm for kvantifisering. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: kvantifisere sperm hastighet og reversering frekvens under migrasjon gjennom livmoren. (A). dic + TRITC fusjonerte bilde av en Hermafroditt livmor som inneholder fluorescerende sperm (rød). V = snappe, gul = spermatheca, Z1-Z3 = tre soner i livmoren, svart boks: sone 2. (B-M). Tidsforløp TRITC kanal bilder zoomet inn på sone 2 (svart boks i A). Bilder ble anskaffet ved 20 s intervaller. 3 individuelle sperm ble sporet i hvert bilde (rød, grønn og blå prikker). Fargede prikker i panel M representerer banen til hver sæd fra B-L. Scale bar = 20μm. (N). ligninger og definisjoner for sperm hastighet, vektor hastighet og reversering frekvens. (O). hastighet, vectorial hastighet og reversering hyppigheten av sperm spores i paneler B-L av de røde og blå prikker. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Movie 1
Film 1: film av sperm bevegelse og migrasjon. En wildtype Hermafroditt ble paret med tåke-2 (Q71) hanner beiset med mito-Dye. Filmen er en sammensatt av time-lapse bilder tatt på varierte tidsintervaller. Vennligst klikk her for å se denne videoen. (Høyreklikk for å laste ned.)

Discussion

Evne til sperm til å navigere i convoluted kvinnelige reproduktive tarmkanalen og finne oocytter er avgjørende for seksuell reproduksjon. Nyere studier ved hjelp av sperm av internt gjødsling dyr foreslår de aktivt svare på ulike miljømessige signaler, inkludert kjemiske signaler, Fluid Flow, og temperatur graderinger1,5,7, 9 andre priser , 12. men, disse observasjonene har i stor grad resultert fra in vitro eksperimenter og lite er kjent om sperm atferd og kommunikasjon innen reproduktive tarmkanalen. En av de viktigste barrierene for å anskaffe in vivo data om sperm migrasjon og motilitet er mangelen på synlighet innenfor de fleste kvinnelige reproduktive traktater. Metoden vi har beskrevet her bruker C. elegans overvinner denne begrensningen. Som representative resultatene viser, gir den gjennomsiktige epidermis for direkte visualisering og sporing av hver sperm på én celle oppløsning i en levende, intakt organisme.

C. elegans har to kjønn. De menn, med en XO genotype, produserer bare sperm, og i denne metoden, brukes som sæddonorer. Hermafroditt, med en XX-genotype, er modifiserte hunner. Deres gonader først gjennomgå spermatogenesis under den fjerde larvestadiet scenen og bytte til oogenese i voksen alder25. Denne analysen bruker voksen hermafroditter, som reproduktive vev gir en modell for den kvinnelige reproduktive tarmkanalen. Utnyttelsen av begge kjønn i denne analysen tillater oss å identifisere genetiske og molekylære trasé i både mannlige og kvinnelige som kan regulere sperm veiledning og motilitet. Kombinert med hele rekke genetiske og molekylære teknikker tilgjengelig for C. elegans, denne metoden kan føre til romanen innsikt i sperm migrasjon og motilitet samt sperm og oocyte kommunikasjon.

Noen kritiske trinn i denne protokollen garanterer ytterligere vurdering, i tillegg til detaljene i protokollen delen.

Ormer
Fog-2 (Q71), HIM-5 (e1490), eller ham-8 (e1489) mutant hanner kan brukes i stedet for N2 hanner. Disse mutasjoner øke hyppigheten av menn i kulturer, men påvirker ikke mannlig mating eller sperm funksjoner13. Kvinner, som Fog-2 (Q71) kvinner, kan brukes i stedet for hermafroditter. Imidlertid, kvinner må være pre-paret med hanndyr å tillate lated oocyte utviklingen. Tilstedeværelsen av befruktet embryo fra denne pre-mating sikrer også at livmoren er lang nok til å vurdere sperm distribusjon. Hvis det vurderes mutant eller eksperimentell hermafroditter, ta med en kontrollgruppe (r). Mutant hermafroditter bør for eksempel pares med wildtype N2-hermafroditter som en kontroll for andre variabler i analysen. Hermafroditter som er matet med bakterier som inneholder plasmider for RNA forstyrrelser analyser bør også mates med bakterier som inneholder tomme vektor kontroll. Avstanden fra den snappe, hvor sperm er inseminert, til spermatheca, befruktning området, kan variere avhengig av antall egg i livmoren (dvs. livmoren utvides med økende egg nummer). Hvis sammenligninger mellom genotyper er gjort, Velg hermafroditter hvis uteri inneholder lignende antall egg. Ikke Velg hermafroditter som inneholder klekking embryo eller bevegelige larver. En tid kurs kan utføres for å identifisere den optimale alder hvor hermafroditter skal analyseres.

Plukking av hermafroditter og hanner
Det er viktig at hermafroditter plukket for denne analysen er ikke fra overgrodd eller sultet plater. Mat og feromon stikkord modulere uttrykk for DAF-7, en TGFß homologe. Den DAF-7 stien har blitt vist regulere syntesen av F-serien prostaglandiner som spiller viktige roller i guiding sperm til spermatheca20. Plukke hermafroditter fra overfylte eller sultet plater kan føre til dårlig sperm veiledning ikke er relatert til målet av interesse. Tettheten av platene ser ikke ut til å påvirke den mannlige sperm. Men menn som er for ung eller for gammel kan resultere i redusert paring effektivitet (dvs. prosent av hermafroditter på mating plate som har nok sperm i sine uteri å kvantifisere). 1-3 dag gamle voksne hanner er optimale for denne analysen23.

Anesthetizing hermafroditter
I våre hender, Tetramisole og Tricaine kombinasjonen sikrer at ormer er immobilisert, og holde seg i live under mating og bildeoppkjøp. Andre anestesimidler, slik som natrium Natriumazid, kan også brukes. Natrium Natriumazid er imidlertid svært giftig og forhold må være standardisert. Immobilisering teknikker bruker mikroperler, agarose, og materialer kamre er ikke anbefalt som de forstyrrer parring.

Mannlig farging
Den mito-Dye brukt i dette manuskriptet, MitoTrackerCMXRos, har vært mye brukt for merking sperm, så vel som andre mitokondrier, i C. elegans. Sæden merket med denne mito-Dye er fullt funksjonell, beholder sin evne til å være aktivert, migrere, gjødsle oocytter, og produserer levedyktig avkom26,27. Andre mitokondrie fargestoffer, slik som rhodamine 6G og DiOC6 har blitt brukt til å beis C. elegans mitokondrier28,29. Men, betingelser for disse fargestoffer må være standardisert for merking sperm i denne analysen. I tillegg til mitochrondrial merkings mekanismer, kan DNA-flekker, som Syto17, også brukes til å merke sæd for migrasjon analyser30. Mens disse merkingsteknikker er relativt enkle og raske å utføre, transgene strategier kan også være ansatt for å generere sperm som uttrykker fluorescerende koder under sperm bestemte arrangører31,32.

Parring
Mating prikker som er for tykke kan redusere paring effektivitet. Forsiktighet bør utvises for å overføre så lite bakterier som mulig når du overfører menn og anesthetized hermafroditter på mating prikk.

Making agarose pads og plassere dekselet slip
Luftbobler kan genereres i agarose pads. De kanskje brekker lyset i løpet av image oppkjøpet eller, når stor nok, anledning ormer å falle gjennom, gjør den utelukket å erverve bildet (). På samme måte kan luftbobler opprettes langs hermafroditter når deksel Seddelen plasseres over dem på agarose puten. Disse boblene brekker lys og føre til redusert bildekvalitet. Praksis vil bidra til å redusere forekomsten av luftbobler.

Kvantifisering
Når kvantifisere sperm distribusjon, ulike z-fly gjennom livmoren av en orm kan ha små forskjeller i sperm distribusjon. Vi finner at å ta et enkelt bilde fokusert på spermatheca gir oss reproduserbar resultater som ligner resultater oppnådd ved snitt flere z-seksjoner. Vi anbefaler å fokusere bildet på midten av spermatheca, men fokal flyene kan endres litt basert på eksperimentator behov. Det er imidlertid avgjørende at alle bildene er tatt på samme måte. Videre er det viktig at bare sperm som er i fokus telles. Det er telleren skjønn i å bestemme kriteriene for i-fokus sperm. Det er imidlertid avgjørende at kriteriene brukes systematisk for hver orm som er kvantifisert. For sæd sporing tilbyr mange programvare automatiske sporingsfunksjoner. Vi finner imidlertid at manuell sporing overgår programvaren automatisk sporing algoritme for to hovedgrunner: 1) overflod av lignende størrelse kjerner innenfor trange rom gjør det vanskelig for programvaren å skille mellom individuelle sperm og opprette definerte ROIs for hver sæd. 2) som sperm gå inn og ut av fokus, deres intensitet SKIFT, noe som gjør det vanskelig for programvaren å holde styr på sperm over lengre perioder.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter.

Acknowledgments

Vi oppriktig takker vår avdøde mentor, Dr. Michael Miller, for hans inspirerende og uselvisk mentorer og etablering av denne metoden som et verktøy for å bedre forstå sperm og oocyte kommunikasjon. Hans plutselige bortgang har vært et enormt tap for hans familie, hans laboratorium, og det vitenskapelige samfunnet. Denne studien ble støttet av NIH (R01GM085105 til MAM og F30HD094446 til MH). Innholdet er utelukkende ansvaret til forfatterne og representerer ikke nødvendigvis den offisielle synspunktene til National Institutes of Health.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents and Material
60 mm x 15 mm Petri dish Fisher FB0875713A
Agar Fisher BP1423-500
Sodium Chloride Fisher S671-3
Peptone Fisher BP1420-500
Cholesterol Sigma-Aldrich C8667
LB broth, Miller Fisher 1426-2
Escherichia coli strain NA22 Caenorhabditis Genetics Center (CGC) NA22 Either this or OP50 E. coli can be used for C. elegans maintenance and assay. Both may be purchased at the CGC
N2 CGC N2
fog-2(q71) CGC CB4108
Platinum wire 0.25 mm dia Alfa Aesar 10288
5 3/4" Disposable Pasteur pipet Fisher 13-678-20A
Watch glass Fisher 02-612A
5 mm Dia. Glass rod Fisher 50-121-5269
MitoTracker CMXRos (Mito-dye) Fisher M7512 Shield from light, store at -20 °C
Monopostassium phosphate Fisher P285-500
Disodium phosphate Fisher S374-1
Magnesium sulfate Fisher M63-500
Dimethyl sulfoxide Fisher BP231-1 DMSO
Aluminum foil Fisher 01-213-102
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate Sigma E10521-10G Tricaine is the common name. Store in aliquotes at -20 °C.
Tetramisole hydrochloride Sigma L9756-5G Store in aliquotes at -20 °C
Agarose Fisher BP1356-100
Coverslips Fisher 12-548-A 18 x 18-1
Frosted microscope slides Fisher 12-552-3
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
16 °C and 20 °C incubators Fisher 97-990E Same model, set at different temperatures.
Upright Microscope with epi-fluorescence illuminator, camera, and 10x and 60x objectives Nikon
Software with image acquisition and tracking capabilities Nikon NIS-elements AR
Stereo-microscope Nikon SMZ800N Any stereo-microscope that can be used to visualize C. elegans may be used with this protocol

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Boryshpolets, S., Perez-Cerezales, S., Eisenbach, M. Behavioral mechanism of human sperm in thermotaxis: a role for hyperactivation. Human Reproduction. 30, (4), 884-892 (2015).
  2. Edmonds, J. W., McKinney, S. L., Prasain, J. K., Miller, M. A. The gap junctional protein INX-14 functions in oocyte precursors to promote C. elegans sperm guidance. Developmental Biology. 359, (1), 47-58 (2011).
  3. Edmonds, J. W., et al. Insulin/FOXO signaling regulates ovarian prostaglandins critical for reproduction. Developmental Cell. 19, (6), 858-871 (2010).
  4. Espinal-Enriquez, J., Priego-Espinosa, D. A., Darszon, A., Beltran, C., Martinez-Mekler, G. Network model predicts that CatSper is the main Ca(2+) channel in the regulation of sea urchin sperm motility. Scientific Reports. 7, (1), 4236 (2017).
  5. Hunter, R. H., Nichol, R. A preovulatory temperature gradient between the isthmus and ampulla of pig oviducts during the phase of sperm storage. Journal of Reproduction and Fertility. 77, (2), 599-606 (1986).
  6. Hussain, Y. H., Guasto, J. S., Zimmer, R. K., Stocker, R., Riffell, J. A. Sperm chemotaxis promotes individual fertilization success in sea urchins. Journal of Experimental Biology. 219, (Pt 10), 1458-1466 (2016).
  7. Kantsler, V., Dunkel, J., Blayney, M., Goldstein, R. E. Rheotaxis facilitates upstream navigation of mammalian sperm cells. Elife. 3, e02403 (2014).
  8. Kubagawa, H. M., et al. Oocyte signals derived from polyunsaturated fatty acids control sperm recruitment in vivo. Nature Cell Biology. 8, (10), 1143-1148 (2006).
  9. Miki, K., Clapham, D. E. Rheotaxis guides mammalian sperm. Current Biology. 23, (6), 443-452 (2013).
  10. Ting, J. J., Tsai, C. N., Schalkowski, R., Cutter, A. D. Genetic Contributions to Ectopic Sperm Cell Migration in Caenorhabditis Nematodes. G3. 8, (12), Bethesda. 3891-3902 (2018).
  11. Yanagimachi, R., et al. Chemical and physical guidance of fish spermatozoa into the egg through the micropyledagger, double dagger. Biology of Reproduction. 96, (4), 780-799 (2017).
  12. Zhang, Y., et al. Generation of Gradients on a Microfluidic Device: Toward a High-Throughput Investigation of Spermatozoa Chemotaxis. PloS One. 10, (11), e0142555 (2015).
  13. Hoang, H. D., Miller, M. A. Chemosensory and hyperoxia circuits in C. elegans males influence sperm navigational capacity. PLoS Biology. 15, (6), e2002047 (2017).
  14. Hansen, J. M., Chavez, D. R., Stanfield, G. M. COMP-1 promotes competitive advantage of nematode sperm. Elife. 4, (2015).
  15. L'Hernault, S. W. Spermatogenesis. WormBook: The Online Review of C. Elegans Biology. 1-14 (2006).
  16. Miller, M. A., et al. A sperm cytoskeletal protein that signals oocyte meiotic maturation and ovulation. Science. 291, (5511), 2144-2147 (2001).
  17. Greenstein, D. Control of oocyte meiotic maturation and fertilization. WormBook: The Online Review of C. Elegans Biology. 1-12 (2005).
  18. O'Hagan, R., Wang, J., Barr, M. M. Mating behavior, male sensory cilia, and polycystins in Caenorhabditis elegans. Seminars in Cell & Developmental Biology. 33, 25-33 (2014).
  19. Hoang, H. D., Prasain, J. K., Dorand, D., Miller, M. A. A heterogeneous mixture of F-series prostaglandins promotes sperm guidance in the Caenorhabditis elegans reproductive tract. PLoS Genetics. 9, (1), e1003271 (2013).
  20. McKnight, K., et al. Neurosensory perception of environmental cues modulates sperm motility critical for fertilization. Science. 344, (6185), 754-757 (2014).
  21. Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. An introduction to worm lab: from culturing worms to mutagenesis. Journal of Visualized Experiments. (47), (2011).
  22. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook: The Online Review of C. Elegans Biology. 1-11 (2006).
  23. Chatterjee, I., et al. Dramatic fertility decline in aging C. elegans males is associated with mating execution deficits rather than diminished sperm quality. Experimental Gerontology. 48, (11), 1156-1166 (2013).
  24. Tinevez, J. Y., et al. TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking. Methods. 80-90 (2017).
  25. Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. A Transparent Window into Biology: A Primer on Caenorhabditis elegans. Genetics. 200, (2), 387-407 (2015).
  26. Sato, M., Sato, K. Degradation of paternal mitochondria by fertilization-triggered autophagy in C. elegans embryos. Science. 334, (6059), 1141-1144 (2011).
  27. Wang, Y., et al. Kinetics and specificity of paternal mitochondrial elimination in Caenorhabditis elegans. Nature Communications. 7, 12569 (2016).
  28. Wolke, U., Jezuit, E. A., Priess, J. R. Actin-dependent cytoplasmic streaming in C. elegans oogenesis. Development. 134, (12), 2227-2236 (2007).
  29. Mottram, L. F., Forbes, S., Ackley, B. D., Peterson, B. R. Hydrophobic analogues of rhodamine B and rhodamine 101: potent fluorescent probes of mitochondria in living C. elegans. Beilstein Journal of Organic Chemistry. 8, 2156-2165 (2012).
  30. Singson, A., Hill, K. L., L'Hernault, S. W. Sperm competition in the absence of fertilization in Caenorhabditis elegans. Genetics. 152, (1), 201-208 (1999).
  31. Wu, J. C., et al. Sperm development and motility are regulated by PP1 phosphatases in Caenorhabditis elegans. Genetics. 190, (1), 143-157 (2012).
  32. Seidel, H. S., et al. A novel sperm-delivered toxin causes late-stage embryo lethality and transmission ratio distortion in C. elegans. PLoS Biology. 9, (7), e1001115 (2011).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics