Evaluación de la prehensión habilidosa en ratones mediante un auto-entrenador

Behavior

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Summary

El método para evaluar el impacto de la formación en las habilidades motoras es una herramienta útil. Desafortunadamente, la mayoría de las evaluaciones conductuales pueden ser intensivas en mano de obra y/o costosas. Aquí describimos un método robótico para evaluar la habilidad de la prehensión (alcance a agarrar) en ratones.

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Hubbard, R., Dunthorn, J., O’Brien, R. J., Tasch, D., Tasch, U., Zeiler, S. R. Evaluating Skilled Prehension in Mice Using an Auto-Trainer. J. Vis. Exp. (151), e59784, doi:10.3791/59784 (2019).

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Abstract

Describimos un método para introducir ratones ingenuos en una nueva tarea de prehensión (alcance a alcance). Los ratones se alojan solos en jaulas con una ranura frontal que permite al ratón salir de su jaula y recuperar pellets de comida. Se emplea una restricción alimentaria mínima para alentar a los ratones a realizar la recuperación de alimentos de la ranura. A medida que los ratones comienzan a asociarse llegando a la ranura para la comida, los pellets se retiran manualmente para estimular la extensión y pronación de su pata para agarrar y recuperar el pellet a través de la ranura frontal. Cuando los ratones comienzan a alcanzar los pellets a medida que llegan a la ranura, el ensayo conductual se puede realizar midiendo la velocidad a la que agarran y recuperan con éxito el pellet deseado. A continuación, se introducen en un auto-entrenador que automatiza tanto el proceso de proporcionar pellets de alimentos para que el ratón pueda agarrar, como la grabación de intentos exitosos y fallidos de alcanzar y agarrar. Esto permite la recopilación de datos de alcance para varios ratones con un esfuerzo mínimo, que se utilizará en el análisis experimental según corresponda.

Introduction

Los métodos para probar experimentalmente una lesión motora antes y después de neurológica, así como para modular el tiempo, la cantidad y el tipo de entrenamiento motor son importantes para la investigación traslacional. En la última década, los ratones, debido a la facilidad de la manipulación genética, se han convertido en un sistema modelo popular en el que esclarecer los mecanismos del aprendizaje motor antes y después de las lesiones. Sin embargo, los ensayos conductuales en ratones no se han optimizado de la misma manera que tales ensayos han sido para otros mamíferos (especialmente ratas). Además, hay diferencias importantes entre el comportamiento de un ratón y una rata que sugieren fuertemente entrenar a las dos especies de diferentes maneras1,2.

Los movimientos prensales calificados utilizan una mano/pata para colocar alimentos en la boca, manipular un objeto o utilizar una herramienta. De hecho, llegar a captar diversos objetos en la vida diaria es una función fundamental de las extremidades superiores y el acto de alcance a comer es una forma de prehensión que muchos mamíferos utilizan. Muchos de los cambios genéticos, fisiológicos y anatómicos que sustentan la adquisición de habilidades prensiles han sido bien definidos en el campo3. Al traducir los hallazgos preclínicos a los resultados clínicos, se necesita una prueba relevante que sea eficiente y reproducible. Los estudios de alcance de roedores y humanos demuestran que el comportamiento de la prehensión es similar en humanos y en animales4. En consecuencia, estas similitudes sugieren que las pruebas de prension pueden servir como modelo traslacional para investigar el aprendizaje motor, así como impedimentos y tratamientos de enfermedades humanas. Por lo tanto, la evaluación de la prehensión en ratones puede ofrecer una poderosa herramienta en la investigación traslacional que estudia los estados de salud y enfermedad4.

Desafortunadamente, la tarea de prehensión en ratones, incluso para un entorno de laboratorio a pequeña escala, puede ser laboriosa y llevar mucho tiempo. Para aliviar este problema, aquí se describe una versión automatizada de la tarea de prehensión. La tarea descrita requiere que los ratones extiendan una sola pata a través de la ranura frontal de la jaula doméstica del ratón, pronifen la pata extendida, agarren la recompensa de pellets de alimentos y tiren del pellet de vuelta al interior de la jaula para su consumo. Los datos resultantes se presentan como un éxito de prehensión o un error. Esta automatización registra con éxito los datos y reduce la carga y el tiempo con que los investigadores deben participar en la tarea.

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Protocol

Todos los métodos descritos aquí han sido aprobados por la ACUC (Comité de Cuidado y Uso de Animales) de la Universidad Johns Hopkins.

1. Preparación de jaulas de ratón para su uso

  1. Cree una abertura ranurada con dimensiones de 0,8 cm de ancho y 7 cm de altura desde la base en el extremo frontal de cada jaula, como se ilustra en la Figura 1. Esta ranura sirve como la abertura a través de la cual el animal alcanzará.
    NOTA: El auto-entrenador fue diseñado para su uso con las dimensiones estándar de la jaula del ratón (como se muestra en la Figura 1) suministradas por la mayoría de los proveedores de suministros de investigación animal. Además, el auto-entrenador soportará fácilmente otros tipos de jaulas.
  2. Dentro de cada jaula individual, agregue una plataforma adyacente a la ranura para permitir que los ratones se pongan de pie y alcancen los pellets presentados. Asegúrese de que la plataforma se encuentra por encima del suelo de la camada de la jaula, aproximadamente 3 cm de altura. Utilice platos Petri fijados con superpegamento y tapados por una hoja de metal de aproximadamente 10 cm x 15 cm, sin embargo, cualquier superficie plana lo suficientemente grande como para que un ratón se ponga de pie para alcanzar desde será suficiente.
  3. Crear una muesca vertical a través de la mitad de la parte delantera de la jaula que mide 0,8 cm de ancho y 7 cm de alto que permitirá a un ratón alcanzar su pata fuera de la jaula.
  4. A partir de una fina lámina de metal, (aproximadamente 2 mm de espesor) cortar una puerta de jaula en rectángulos que miden 5 cm x 10 cm para servir como una abertura uniforme a través de la cual el animal debe alcanzar.
    NOTA: Los ratones pueden masticar jaulas de plástico que cambiarían el tamaño de la abertura. El ratón alcanzará a través de esta ranura de 0,8 cm cuando la puerta de la jaula metálica se coloca sobre la abertura ranurada de la jaula durante las pruebas con cinta adhesiva, manteniendo el ancho efectivo de la ranura entre jaulas.
  5. Cubra la ranura de cada jaula con cinta adhesiva cuando su ratón no esté siendo probado para evitar que la basura sea expulsada de la jaula.

2. Introducción de ratones al movimiento de alcance

  1. Registre el peso inicial de cada ratón y calcule el 85% de ese valor para encontrar su peso objetivo, redondeando hasta 20 g si el resultado es menor. Dales un régimen de alimentación para llevarlos y luego mantener este peso objetivo.
    1. Dar a cada ratón 2,5 g de pellets el primer día y anotar cualquier cambio en su peso 24 h más tarde.
      NOTA: Pese los ratones una vez al día y espere una caída de peso de 0,25-1 g por día.
    2. Cambie la alimentación diaria de cada ratón según sea necesario, basándose en este cambio inicial y los cambios continuos en el peso de cada ratón, con el fin de inducir la pérdida gradual de peso (menos de 0,8 g perdidos por día) y luego mantener el peso objetivo resultante. Variar entre tres a seis 500 mg de pellets (1,5 a 3,0 g) por día para ser eficaz.
      NOTA: Los ratones permanecen en esta dieta para mantener su peso objetivo a lo largo del protocolo.
  2. Cuando un ratón ha alcanzado su peso objetivo, introducir cada ratón en el concepto de subir a la ranura cerrada para un pellet de alimentos suplementario. Comience una sesión de entrenamiento colocando un pellet de 45 mg en la superficie del pellet, directamente delante de la ranura, y permita que cada ratón lo recupere. La mayoría de los ratones tomarán a este arreglo de alimentación dentro de 1-2 días.
  3. Una vez que el ratón asocia una ranura abierta con ser alimentado, anímelos a alcanzar con una pata, en lugar de la boca.
    NOTA: Este es el paso más complejo, tomar 1-2 días, e inculcar un comportamiento contraproducente en ratones por error es muy fácil; consulte la sección de discusión para obtener más información y asesoramiento.
    1. Usando un par de pinzas, sostenga un pellet en la misma posición en la que el ratón ha recuperado pellets previamente. A medida que el ratón comienza a morder el pellet, tire de él aproximadamente medio centímetro de tal forma que el pellet esté fuera del alcance de su boca.
      NOTA: Un ratón en su peso objetivo intentará recuperar el pellet fuera de alcance. Cada vez que el ratón extiende una pata a través de la ranura, reforzar ese comportamiento permitiendo que se coma el pellet. Algunos ratones pueden exhibir una preferencia por una pata sobre la otra cuando se extienden para alimentos.
    2. Aunque no es instrumental para la experimentación, registre si se prefiere la pata izquierda o derecha. Esto puede permitir potencialmente mayores tasas de éxito general en el ensayo conductual; alternativamente, elimine una variable forzando a cada ratón a alcanzar con la misma pata.
      NOTA: Se obtienen mejores resultados si los ratones utilizan su pata preferida.
    3. A medida que cada ratón se asocia extendiendo una pata con comer un pellet, reforzar aún más ese comportamiento mediante la retención del pellet en respuesta a los intentos de recuperar el pellet con la boca y la lengua. Los ratones comenzarán a cumplir con este acuerdo durante 2 a 3 días.
    4. Finalizar la introducción del comportamiento deseado de alcance de la pata colocando el pellet de 45 mg justo por debajo de 1 cm del borde exterior de la puerta de la jaula, de tal manera que el punto más a la izquierda o a la derecha del pellet (ya sea a la derecha o a la izquierda de la ranura de la jaula del investigador 's perspective, respectivamente) es tangente a una línea que se extiende directamente desde el borde de la ranura de la puerta de la jaula. Permita que el ratón intente recuperar el pellet, estando vigilante para eliminar el pellet y evitar su consumo si el ratón debe intentar por algún otro método que la extensión de la pata.
      NOTA: Cuando un ratón extiende constantemente una pata para agarrar y es capaz de tocar el pellet proporcionado, está listo para la prueba usando el auto-entrenador descrito a continuación y el ensayo de comportamiento asociado. El tiempo desde las introducciones ingenuas hasta la preparación variará entre ratones; si hay rezagados que tardan más de dos semanas en entenderse, deben excluirse del conjunto de datos.

3. Uso del auto-entrenador

NOTA: Consulte la Figura 1-3 y la sección de discusión para obtener una descripción completa del hardware, el software y las acciones físicas del auto-entrenador.

  1. Prepárese para la sesión de entrenamiento.
    1. Calibrar el sensor de pellets de cebo. Haga clic en la flecha Ejecutar en la interfaz LabVIEW y observe el sensor de pellets de cebo leyendo tanto con y sin un pellet en su lugar. Haga clic en el botón Detener para detener esta ejecución de prueba y cambie el objetivo del sensor de pellets de cebo a un valor entre esas dos lecturas(Figura 3 y Tabla 2). La mayoría de las condiciones de iluminación proporcionan una lectura entre 1 y 4.
    2. Coloque la jaula del ratón modificada en el auto-entrenador(Figura 2). Fije la puerta de la jaula (Figura 1)y alinee el pellet al borde de la ranura como en el procedimiento manual.
  2. Ejecute la sesión de entrenamiento del ratón mediante la interfaz LabVIEW.
    1. Introduzca la información necesaria para registrar datos sobre la sesión de entrenamiento(Figura 3 y Tabla 2).
      1. Haga clic en el campo ID del ratón y escriba el nombre de archivo de cada sesión de entrenamiento con el teclado del equipo.
      2. Haga clic en el campo Total de pellets para dispensar durante la rutina para controlar cuántos pellets se dispensan para un solo experimento (normalmente 20 - 30). Para ello, haga clic en las flechas arriba y abajo o introduzca el número con el teclado del ordenador.
      3. Haga clic en el campo Pausar después del número de pellet para establecer una pausa de 5 s después de eliminar el pellet indicado de la tabla de buceo. Para ello, haga clic en las flechas arriba y abajo o introduzca el número con el teclado del ordenador.
      4. Haga clic en el campo Longitud de pausa para establecer una pausa entre el momento en que se retira un pellet de la tabla de buceo y el momento en que se dispensa un nuevo pellet. Para ello, haga clic en las flechas arriba y abajo o introduzca el número con el teclado del ordenador
        NOTA: Por lo general, 1 s es un tiempo de pausa adecuado. Si los ratones están ansiosos después de dispensar cada pellet, es aconsejable aumentar la longitud de la pausa utilizando el campo Longitud de pausa a 5 s.
      5. Registre manualmente la distancia a la que se coloca el pellet en el campo Distancia de alcance. Para ello, haga clic en las flechas arriba y abajo o introduzca el número con el teclado del ordenador
        NOTA: El tamaño de las matrices de aceleración y tiempo se expone con fines de depuración y puede omitirse.
      6. Haga clic en el campo Carpeta para contener registros para seleccionar la ubicación del archivo para guardar los datos recopilados.
      7. Una vez rellenados los campos de información, haga clic en el botón Ejecutar para comenzar la sesión de entrenamiento. El auto-entrenador dispensará pellets individuales y rastreará si caen a través del embudo hasta que el número total de pellets haya sido dispensado, y el último pellet haya sido recuperado o dejado caer por el ratón. El programa se detendrá automáticamente en este punto. Si es necesario, también se puede detener prematuramente haciendo clic en el botón Detener.
    2. Una vez configurado el software, coloque la jaula de inicio del ratón para ser probado en el pedestal y observe el ratón para que pueda medir si el ratón realmente ha aprendido a intentar el comportamiento de alcance novedoso requerido. Después de hacer clic en el botón Ejecutar, permita que el ratón investigue la ranura y su nuevo entorno desconocido.
      NOTA: De forma similar a cuando se introducen ratones en el concepto de alcanzar, esperar que algunos ratones sean más compatibles que otros. Los ratones que han captado el concepto deben tratar de alcanzar dentro de 5-10 min y asociarán el movimiento del auto-entrenador con el pellet presentado, como cuando asocian una ranura descubierta con alimentos en las etapas iniciales de este protocolo.

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Representative Results

En general, se recomienda que cada sesión de entrenamiento consista en aproximadamente 20-30 pruebas, que pueden ser establecidas por el usuario, se ejecutan automáticamente por el auto-entrenador y se guardan en un único archivo de registro por sesión y ratón. Cada prueba se puede ejecutar consecutivamente, justo después de la otra, con 2-5 s de pausa. Los ratones entrenados en el auto-entrenador exhiben un aumento en la habilidad en 10 sesiones de entrenamiento.

Para comparar la utilidad del auto-entrenador con el entrenamiento manual (considerado el estándar de oro), entrenamos ratones macho adultos C57bl/6 de 100 a 140 días de edad manualmente y usando el auto-entrenador. Todo el manejo y uso de animales se realizó de acuerdo con y con la aprobación del Comité de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Johns Hopkins. Los ratones entrenados con el auto-entrenador aprendieron la tarea de la prensión y exhiben un claro aumento en la habilidad motora(Figura 4). Este aumento de la habilidad es similar al observado cuando el animal es entrenado manualmente sin el uso del auto-entrenador(Figura 4). Para estos datos, la prehensión manual fue anotada como exitosa cuando el ratón alcanzó su extremidad delantera a través de la hendidura, agarró el pellet y se lo comió sin golpearlo de su espacio de descanso, dejándolo caer, o de cualquier otra manera perder el control. El porcentaje de intentos exitosos de prehensión se determinó por pellet. Un bloque de entrenamiento consistía en 30 pellets a una distancia de 1 cm con cada pellet presentado uno a la vez. Los ratones entrenados en el auto-entrenador fueron entrenados según el protocolo descrito anteriormente. Cada punto de la Figura 4 representa un día de entrenamiento durante el cual los animales alcanzaron 30 pellets y se graficaron como un porcentaje correcto. No hubo diferencia estadística entre las dos líneas que utilizan una prueba t no paramétrica con corrección para comparaciones múltiples.

Figure 1
Figura 1: Imágenes ejemplares de la jaula del hogar. (A) Vista de pájaro de una jaula doméstica estándar modificada con la plataforma (naranja) y ranura en la parte delantera de la jaula. (B) Vista frontal de una jaula doméstica modificada con una abertura ranurada con aproximadamente 0,8 cm x 7 cm.(C)puerta de jaula cortada de una lámina delgada de metal y envuelta con cinta adhesiva para proteger los bordes. (D, E) puerta de jaula colocada delante de la ranura para servir como una abertura uniforme a través de la cual el ratón debe alcanzar; vistas frontales (D) y oblicuas (E). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2 : Imágenes ejemplares de Auto-Trainer. (A, B) En la imagen se muestra el auto-entrenador sin (A) o con (B) una jaula de ratón modificada en su lugar. (C-J) Vistas detalladas del diseño del soporte de pellets de alimentos de la tabla de buceo visto desde la parte delantera (C,D,H,I) o desde el lado (E,F,G,J), con (D,E,F,I) o sin (C,G,H,J) un pellet alimentario. Tenga en cuenta que la distancia de pellets desde el animal se puede modificar fácilmente ya que la distancia de la jaula desde el tablero de buceo es modificable. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. 

Figure 3
Figura 3 : Captura de pantalla del software. Captura de pantalla del programa utilizado para ejecutar el auto-entrenador. La imagen muestra los campos de entrada importantes descritos en el protocolo. Consulte el Cuadro 2 para obtener más información. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4 : Datos representativos. La prensión calificada aumenta a un nivel similar en estanca utilizando paradigmas de auto-entrenador y entrenamiento manual. La gráfica muestra el éxito de alcance a agarre (media +/- SEM; manual: gris, n a 14; auto-entrenador: negro, n-15). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. 

Paso Duración estimada (en días) Comentario
2.1 Pérdida de peso 3 a 5 Dependiendo del peso intial y, por lo tanto, de la cantidad de peso que hay que perder hasta el objetivo
2.2 Entrenamiento en tragamonedas 1 Los ratones aprenden a sentirse cómodos acercándose a la ranura abierta para comer
2.3 Forma 4 a 8
2.3.1 Uso de patas 1 El éxito aquí depende de proporcionar rápidamente el pellet después del ratón, negó su comida, pausos para el pellet.
2.3.2 Preferencia de pata 1 Determinar si el ratón prefiere la pata izquierda o derecha.
2.3.3 Restringir el uso de la pata 2 a 3 Como en el paso anterior, es fundamental evitar la recuperación con la boca y la lengua.
2.3.4 Pinzas 1 Algunos ratones se topan en tomar el pellet por sí mismos en lugar de las pinzas, alimentarlos un poco menos
3. Entrenamiento automático 10 a 15 Días hasta el asucontote.

Tabla 1: Horario de entrenamiento del ratón utilizando el auto-entrenador.

CAMPO DE ENTRADA Uso
ID del ratón Introduzca el nombre de archivo en el que se guardarán los datos recopilados.
Total de pellets a dispensar durante la rutina Introduzca el número total de pellets que se dispensarán durante la sesión de entrenamiento.
Pausa después del número de pellet Función en desuso. Se puede utilizar para pausar la sesión de entrenamiento después de dispensar el pellet especificado.
Longitud de pausa (s) Duración de la pausa.
Distancia de alcance (mm) Registre la distancia por encima del mínimo sobre la cual el ratón debe alcanzar para recuperar el pellet. Cero de forma predeterminada.
Tamaño del acelerómetro y las matrices de tiempo Función expuesta con fines de depuración. Mantenga el valor predeterminado de 500.
Carpeta para contener registros Haga clic en el icono de carpeta para elegir dónde se guardan los datos recopilados.
Nombre del dispositivo Función LabVIEW que conecta hardware al software. El valor predeterminado es Dev1. Dependiendo de las conexiones USB, el hardware puede aparecer en el menú desplegable bajo otro número; elegir dispositivos hasta que uno funcione.
Botón de flecha, arriba a la izquierda Haga clic para ejecutar el programa, ya sea para una sesión de entrenamiento o para la calibración.
Botón de detención de la señal, arriba a la izquierda Detenga el programa prematuramente.

Tabla 2: Interfaz de software.

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Discussion

Nuestro auto-entrenador evalúa el alcance de las extremidades delanteras (prehensión) de forma automatizada. Para lograr este punto final, muchos de los parámetros diseñados para la tarea de prehensión del ratón, incluyendo la colocación de pellets, el tamaño del pellet y los criterios de entrenamiento, han sido iterados a lo largo de varios años y adaptados de protocolos anteriores2,5 ,6. El avance aquí es la automatización de la tarea utilizando un robot que permite la vivienda en jaula sin hogar. La carcasa de la jaula doméstica permite a los ratones mantener la calma y realizar la tarea con menos ansiedad. El entrenamiento no doméstico se asocia con un aumento del estrés que puede conducir al aumento del tiempo y a una menor precisión7,8,9. Demostramos aquí precisión que se asemeja a nuestros propios resultados con entrenamiento manual en jaula sano5,7,8. Aunque el entrenamiento en jaulas domésticas existe para la rata10,según nuestro conocimiento, este es el primer auto-entrenador que aprovecha el entrenamiento de ratones en su jaula doméstica.

Nuestro auto-entrenador incluye una plataforma ajustable en la que descansa una jaula ranurada y puede ser bajada o elevada a la altura adecuada para la alineación con un soporte de pellets de alimentos (también conocido como una tabla de buceo). Un sistema de dispensación de pellets coloca el pellet de alimentos en el soporte de la tabla de buceo. El soporte de pellets de alimentos tiene un conjunto de sensor de pellets de cebo que consiste en un sensor de objeto reflectante para detectar si un pellet de alimentos está presente o no en el soporte de la placa de buceo. Debido a los problemas de sensibilidad a la luz, el sensor de objeto reflectante se puede calibrar en la instalación para adaptarse al entorno de iluminación del laboratorio. La jaula de cada ratón se coloca en el auto-entrenador de tal manera que el borde interior del pellet está en línea con el borde exterior de la ranura de la puerta de la jaula, correspondiente al paso 2.3.4 del procedimiento manual detallado anteriormente. Dos sensores de pellets perdidos orientados en direcciones opuestas en un embudo debajo del soporte de pellets de la tabla de buceo detectan la caída de pellets. Una ventaja de emplear dos sensores de pellets perdidos es que garantiza una alta precisión de detección para varios pellets de alimentos de diferentes tamaños y formas. Ambos sensores de pellets perdidos consisten en un foto-interruptor transmisivo estándar con un diseño de orificio pasante, para detectar el movimiento de un pellet que cae sin necesidad de contacto.

El software consiste en un programa que ejecuta el auto-entrenador y recopila datos sobre éxitos y fracasos. La entrada del usuario consiste en la ubicación del archivo en la que se registran los datos, cuántos pellets se dispensan en una sesión de entrenamiento, una opción para pausar la sesión de entrenamiento después de dispensar un pellet en particular, un campo para registrar la mayor distancia (si existe) a través de la cual el ratón debe alcanzar, y un campo para controlar el tamaño de matriz utilizado en los cálculos del programa (que puede ser ignorado durante el uso normal). Además, el software permite al usuario ajustar el sensor de objetos reflectantes de la placa de buceo con el fin de recalibrar la sensibilidad a la luz según sea necesario. Se muestra una salida de cada versión de prueba al usuario, así como se registra y se guarda en un archivo de registro para su posterior recuperación.

Un solo ensayo consiste en el tiempo de un solo pellet de alimento según el tablero de buceo hasta que se elimina mediante la acción del ratón. Si un pellet sale de la tabla de buceo según lo determinado por el sensor de pelletdes de cebo y el pellet se detecta cayendo a través del embudo poco después por cualquiera de los sensores de pellets perdidos, se registra como un ensayo fallido por el software. Si el sensor de pellets de cebo determina que el pellet sale de la tabla de buceo, pero ningún objeto que cae es detectado por ninguno de los sensores de pellets perdidos, se supone que ha sido tirado en la jaula por el ratón y se cuenta como un ensayo exitoso.

Esta formulación se utiliza porque es útil diseñar un ensayo conductual en el que la tarea realizar directamente, en lugar de indirectamente, proporciona la recompensa. De esta manera, no hay ambiguedad por parte del animal sobre cuál es la tarea (por ejemplo, tener hambre, localizar alimentos, conseguir comida, comer alimentos). Entre las muchas tareas que utilizan este paradigma, la tarea de prehensión se ha vuelto muy popular para tales evaluaciones. La tarea sólo requiere que un animal utilice una sola extremidad para alcanzar y agarrar un único alimento, que el animal posteriormente trae a su boca para su consumo. La tarea de prehensión evalúa un comportamiento que es muy similar a un comportamiento cotidiano utilizado por muchos mamíferos. Lo más importante es que la tarea de la prehensión se asemeja al comportamiento motor humano4. Esta generalización aumenta la expectativa de que los principios derivados de la evaluación preclínica del comportamiento son clínicamente aplicables en los estados de la enfermedad. Por ejemplo, las deficiencias en el uso experto de las extremidades anteriores y de las manos se ven en el accidente cerebrovascular, la enfermedad de Huntington, la enfermedad de Parkinson y la esclerosis múltiple. Por lo tanto, modelar los déficits de comportamiento y la posterior recuperación en ratones es invaluable para entender la recuperación humana y cómo podría fomentarse2,11,12,13.

Muchos aspectos del auto-entrenador propuestos aquí en gran medida benefician en gran medida el proceso de investigación. En primer lugar, la mayoría de los ensayos conductuales requieren que un experimentador entrene y supervise de cerca las sesiones diarias, que pueden ser costosas, laboriosas y prohibitivamente lentas. Nuestro auto-entrenador permite que los datos de comportamiento se recopilen independientemente de un experimentador. En segundo lugar, nuestro auto-entrenador se puede replicar para permitir que varios ratones sean entrenados y evaluados objetivamente, eficiente y simultáneamente, minimizando así el tiempo y el esfuerzo. En tercer lugar, el bajo costo del auto-trainer permite la replicación y el uso de múltiples auto-trainers simultáneamente para pruebas eficientes y a gran escala.

Cabe señalar que el punto crítico que requiere una supervisión cuidadosa es durante la fase de modelado de la formación. En particular, la principal debilidad de este protocolo es el riesgo de que el mal uso se fije en algunos ratones11. El protocolo tiene como objetivo imitar pruebas como la prueba de peldaño de escalera en que el éxito en la tarea proporciona la recompensa. Sin embargo, la tarea en sí todavía debe ser enseñada a los ratones en el paso 2.3 del protocolo, a diferencia de la prueba de peldaño de escalera. El concepto más probable que haga que un ratón tropiece en el aprendizaje de esta tarea es de extender una pata fuera de la jaula a usar la pata para agarrar realmente el pellet. En la primera sesión del paso 2.3.1, los ratones deben ser recompensados simplemente por extender una pata fuera de su jaula. Sin embargo, en los próximos días, los investigadores deben tener cuidado de recompensar a los ratones menos por simplemente extender la pata, y más por extender la pata y tocar el pellet, como describimos en el paso 2.3.3.

Tenga en cuenta que aproximadamente el 5% de los ratones no progresarán más allá de esta etapa, por lo general debido a la extensión limitada de sus dígitos para tirar del pellet de alimentos. Estos ratones fallarán con una o ambas patas con poca consideración de la ubicación real del pellet, proporcionando poco o ningún dato útil. Para minimizar el potencial de un ratón de fracaso en esta etapa, se recomienda encarecidamente al retirar el pellet con las pinzas durante el proceso de aprendizaje. En particular, el ratón debe ser recompensado con alimentos no sólo cuando se extiende una pata, sino también cuando esa pata se agarra el pellet y aplica suficiente fuerza suficiente para la satisfacción del investigador. Un riesgo similar a un posible fracaso en esta etapa es planteado por los ratones que utilizan su lengua para lamer pellets hacia ellos. Cuando entrenen ratones que tienden a lamer, coloque el pellet más lateralmente lejos de la ranura. A los ratones les resultará difícil alcanzar con la lengua a una mayor distancia lateral, pero el rango de movimiento del brazo y la pata son más capaces de cerrar la distancia.

Nuestro protocolo descrito se extiende fácilmente a diferentes entornos de laboratorio o diferentes métodos de recopilación de datos. El auto-entrenador, por ejemplo, es muy útil como un dispositivo de ahorro de mano de obra, pero no es estrictamente necesario para la recopilación de datos, ya que se pueden proporcionar pellets y los éxitos / fallos se pueden registrar a mano. Los alcances individuales también se pueden clasificar en función de información más detallada que simplemente el éxito/fracaso, por ejemplo considerando el ángulo de aproximación de cada ratón, el número de intentos de alcance que no tocan el pellet, o la mecánica de la recuperación moción, que ha recibido más atención en los últimos años14. La capacidad del animal para recuperar un pellet es sólo una medida. Usando hardware adicional, también podremos medir la velocidad, el ángulo y la trayectoria de los movimientos de las extremidades del animal. Esta cinemática es un aspecto importante del aprendizaje motor antes y después de una lesión neurológica. Para ello, actualmente estamos incorporando varios medios novedosos para analizar la locomoción y la cinemática de la acción de agarre del ratón. Estamos explorando el uso de cámaras de alta velocidad para obtener mediciones cinemáticas de los transductores de presión y acelerómetros de presión de agarre y acelerómetros al soporte de pellets de alimentos para medir los datos de fuerza y masa asociados con el agarre. Estas nuevas características mejorarán la funcionalidad del auto-entrenador para recopilar datos significativos pasados un simple pase o prueba fallida y ayudar a ilustrar la marcha de la comprensión del ratón a través de la progresión de la enfermedad. En el futuro, utilizaremos la tarea de prehensión asistida por robot como una plataforma para evaluar el tipo, la dosis y el momento de la rehabilitación después de una lesión neurológica. En el futuro, continuaremos mejorando la tarea, con refinamientos para ayudar a disminuir los comportamientos incorrectos y mejorar la tasa de adquisición de tareas y el tiempo de entrenamiento.

En resumen, hemos desarrollado un nuevo auto-entrenador para evaluar la habilidad de prehensión de las extremidades anteriores superiores en ratones. La tarea requiere que los ratones lleguen a su pata a través de una hendidura, agarren un pequeño pellet de comida y tiren del pellet en la dirección de su cuerpo para que puedan comer el pellet. La configuración de la tarea está limitada mecánicamente para asegurar el uso dominante de la pata. Los ratones se pueden entrenar rápida y simultáneamente, con sólo el proceso de modelado que requiere entrada manual. La prueba se puede administrar de manera eficiente y analizarse automáticamente. Este ensayo de comportamiento de alto rendimiento cuantifica la tasa de éxito y se modifica fácilmente para el análisis futuro de la cinemática y la dinámica de fuerza.

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Disclosures

Dan Tasch y Uri Tasch de Step Analysis, LLC han fabricado un dispositivo de auto-entrenador con el pago de Richard J. O'Brien y Steven R. Zeiler.

Acknowledgments

El dispositivo de auto-entrenamiento fue construido por Jason Dunthorn, Uri Tasch y Dan Tasch en Step Analysis, LLC, con soporte de entrada de diseño e instrucciones proporcionadas por Robert Hubbard, Richard O'Brien y Steven Zeiler.

Teresa Duarte del Centro Champalimaud para Lo Desconocido proporcionó valiosas ideas sobre cómo describir y categorizar las acciones de alcance del ratón.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ABS Filament Custom 3D Printed N/A utilized for pellet holder, frame, arm and funnel
ABS Sheet McMaster-Carr 8586K581 3/8" thickness; used for platform compononents, positioning stand guides and base
Adruino Mini Adruino A000087 nano version also compatiable as well as other similar microcontrollers
Bench-Top Adjustable-Height Positioning Stand McMaster-Carr 9967T43 35 lbs. load capacity
Clear Acrylic Round Tube McMaster-Carr 8532K14 ID 3/8"
Low-Carbon Steel Wire McMaster-Carr 8855K14 0.148" diameter
Pellet Dispenser Lafayette Instrument: Neuroscience 80209-45 with 45 mg interchangeable pellet size wheel and optional stand
Photointerrupter Breakout Board  SparkFun BOB-09322 ROHS designed for Sharp GP1A57HRJ00F
Reflective Object Sensor Fairchild Semiconductor QRD1113 phototransistor output
Servo Motor SparkFun S8213 generic metal gear (micro size)
Transmissive Photointerrupter Sharp GP1A57HRJ00F gap: 10 mm, slit: 1.8 mm

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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