Overførsel af manipulerede tumor-associerede neutrofiler til tumor bærende mus for at studere deres angiogene potentiale in vivo

Cancer Research

Your institution must subscribe to JoVE's Cancer Research section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Her viser vi terapeutisk potentiale af anti-angiogen tumor-associerede neutrofiler efter deres overførsel til tumor bærende mus. Denne protokol kan bruges til at manipulere neutrofilaktiviteten ex vivo og til efterfølgende at evaluere deres funktionalitet in vivo i udviklingen af tumorer. Det er en hensigtsmæssig model til at studere potentielle neutrofilbaserede immunterapier.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Pylaeva, E., Spyra, I., Bordbari, S., Lang, S., Jablonska, J. Transfer of Manipulated Tumor-associated Neutrophils into Tumor-Bearing Mice to Study their Angiogenic Potential In Vivo. J. Vis. Exp. (149), e59807, doi:10.3791/59807 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Bidraget af neutrofiler til reguleringen af tumor bliver øget opmærksomhed. Disse celler er heterogene, og afhængigt af tumor Milieu kan besidde Pro-eller anti-tumor kapacitet. En af de vigtige cytokiner regulere neutrofile funktioner i en tumor sammenhæng er type I Interferoner. I nærværelse af Interferoner, neutrofiler få anti-tumor egenskaber, herunder cytotoksicitet eller stimulering af immunsystemet. Omvendt, fraværet af et interferon signalering resulterer i fremtrædende Pro-tumor aktivitet, karakteriseret med stærk stimulering af tumor angiogenese. For nylig kunne vi påvise, at proangiogene egenskaber af neutrofiler afhænger af aktivering af nicotinamid phosphoribosyltransferase (NAMPT) signalering pathway i disse celler. Hæmning af denne vej i tumor-associerede neutrofiler fører til deres potente anti-angiogen fænotype. Her viser vi vores nyetablerede model giver in vivo evaluering af tumorigent potentiale manipulerede tumor-associerede neutrofiler (tans). Kort, Pro-angiogen tumor-associerede neutrofiler kan isoleres fra tumor-bærende interferon-mangelfulde mus og repolariseret i anti-angiogen fænotype ved blokering af NAMPT signalering. Den angiogene aktivitet af disse celler kan efterfølgende evalueres ved hjælp af en aorta ringanalyse. Anti-angiogen TANs kan overføres til tumor-bærende vilde type modtagere og tumorvækst bør overvåges for 14 dage. På dag 14 mus er ofret, tumorer fjernet og skåret med deres vaskularisering vurderes. Samlet set, vores protokol giver et nyt værktøj til in vivo evaluere angiogen kapacitet af primære celler, såsom tumor-associerede neutrofiler, uden behov for at bruge kunstige neutrofilcellellinie modeller. Vc

Introduction

Type I Interferoner (IFNs) spiller en vigtig rolle i stimuleringen af vært svar til neoplasias, som manglen på type I IFN signalering resulterer i signifikant forhøjet tumorvækst1. En af de mekanismer, der er involveret i denne proces er reguleringen af tumorigent aktivitet af tumor-associerede neutrofiler, som styres af kolonistimulerende faktor 3 receptor (CSF3R) downstream signalering2. Kolonistimulerende faktor 3 (CSF3) eller granulocytkoloni stimulerende faktor, viste sig at aktivere signalering, der involverer nicotinamid phosphoribosyltransferase (nampt)3,4. NAMPT er et sats-begrænsende enzym for nicotinamid adenin dinucleotid syntese, som forbedrer glykolyse og regulerer DNA reparation, genekspression, og stress respons fremme kræftceller overlevelse og spredning5. Nampt er overudtrykt i flere kræfttyper, herunder kolorektal, æggestokkene, bryst, gastrisk, prostatakræft og gliomer6. NAMPT er afgørende ikke kun for tumorceller, men også for en bred vifte af andre celletyper, der er til stede i tumorer, såsom myeloide celler-det driver deres differentiering4, hæmmer apoptose og stimulere ekspression af flere cytokiner eller matrix-nedbrydende enzymer i makrofager7.

Tumor-associerede neutrofiler repræsenterer vigtige modulatorer af tumorvækst. TAN funktioner er stærkt afhængige af typen jeg IFN tilgængelighed, som disse cytokiner Prime anti-tumor aktivitet af neutrofiler. Tværtimod, fraværet af ifns understøtter tumorigent aktivering af disse celler, især deres Pro-angiogen egenskaber. Efter aftale med dette, mus mangelfuld i ifns udvikle betydeligt større og bedre vaskulariserede tumorer, som er stærkt infiltreret med Pro-tumoral/Pro-angiogen neutrofiler1,2,8, 9,10. Vigtigere, sådanne Pro-angiogen TANs viser forhøjet aktivitet af NAMPT, tyder sin væsentlige rolle i Pro-tumor polarisering af neutrofiler.

Nedbrydning af neutrofiler ved hjælp af Ly6G antistof eller hæmning af deres migration (CXCR2 antistof) resulterer i nedsat tumor angiogenesis, vækst, og metastase1,8. Ikke desto mindre er genererede monoklonale antistoffer immunogene, og deres administration er forbundet med en række livstruende bivirkninger11. Behandling med små molekyler, såsom NAMPT inhibitor FK866, at moduere neutrofile tumoriogenicitet, kunne bidrage til at undgå sådanne komplikationer. Desværre, farmakologisk systemisk hæmning af NAMPT, ved siden af sin terapeutiske virkning på tumorvækst, fører til alvorlige bivirkninger, herunder gastrointestinal toksicitet og trombocytopeni. Derfor er den systemiske anvendelse af nampt-hæmmere ikke gennemførlig12,13,14.

Af denne grund, foreslår vi her en protokol, hvor NAMPT aktivitet er blokeret direkte i isolerede Tanger. Sådanne anti-tumor neutrofiler er derefter adoptivt overføres til en tumor-bærende vært. Denne protokol vil hjælpe med at undgå systemiske toksiske bivirkninger af forbindelserne, mens dens virkning på målcellerne vil blive opretholdt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle procedurer, herunder animalske emner, er godkendt af de regulerende myndigheder: LANUV (Landesamt für natur, Umwelt und Verbraucherschutz NRW) og Regierungspräsidium Tübingen, Tyskland. Alle manipulationer skal udføres under sterile forhold (under laminar flow Hood) ved hjælp af sterile reagenser og instrumenter (sprøjter, sakse, pincet, engangs Scalpels, Petri skåle).

Bemærk: protokollens overordnede skema er vist i figur 1.

1. fremstilling af B16F10 melanom cellelinje

  1. Mycoplasma-negative celler, der dyrkes til en 90% flydende enkeltlags (ca. 10 x 106 celler/T75 kolbe), fremstilles i komplet iscove modificerede dulbecco's medium (imdmc: imdm + 10% føtal bovint serum (FBS) + 1% penicillin-streptomycin).
  2. Fjern mediet, og skyl cellerne med fosfat bufferet saltvand (PBS). Påfør 6 mL af en celle løsrivelse, der indeholder proteolytiske og kollagenolytiske enzymer (Se tabellen over materialer), og inkuber ved 37 °c i 2 min.
  3. Slå kolben forsigtigt for at mobilisere de resterende vedblivende celler fra bunden. Cellesuspensionen opsamles i 15 mL rør og centrifugeres ved 300 x g i 7 min. og 20 °c.
  4. Supernatanten fjernes, og pelleten opslæmmes godt i 1 mL PBS. 14 mL PBS og centrifuge (300 x g og 20 °c i 7 min.) tilsættes.
  5. Supernatanten fjernes, og pelleten opslæmmes i 1 mL PBS.
  6. Tæl cellerne, og resuspension dem til koncentrationen af 3 x 106/ml PBS (for trin 2) eller 6 x 106/ml PBS (for trin 6) til injektion. Hold cellerne på is i højst 30 min.

2. allogen tumor model i mus

  1. Brug 10 kvindelige Ifnar1-/- mus 8-12 uger gamle, der holdes under specifikt patogenfrie (SPF) betingelser.
    Bemærk: hunmus er at foretrække i en subkutan model af tumorvækst, da hannerne er mere aggressive og dermed tilbøjelige til at krænke tumor stedet, som påvirker tumorvækst.
  2. Barberer huden af musen på flanken med en elektrisk shaver, og Desinficer huden med væv våd med 70% ethanol.
  3. Saml de forberedte B16F10 melanom celler i en koncentration på 3 x 106/ml PBS (Se trin 1) i en 1 ml sprøjte og 0,4 x 19 mm nål. Injicer 100 mL af suspensionen subkutant.
    1. Bland cellerne godt før hver injektion. Brug nåle ikke mindre end 0,4 mm i diameter for ikke at forstyrre tumorceller.
  4. Placer op til 5 mus i et bur, og kontroller tumorstørrelse (længde, bredde og dybde) med en kaliber i 14 dage.
    Bemærk: ifølge dyre reglementet bør tumor størrelsen ikke overstige 15 mm i diameter, mus med større eller nekrotiske/åbne tumorer bør ofres på forhånd.
  5. På dag 14 ofrer musene i CO2 -kammeret.
  6. Desinficer huden med 70% ethanol og fjern tumorer med saks og pincet i en steril Petri skål. Hold tumorer i et 50 mL rør i komplet Dulbecco's modificerede Eagle medium (DMEMc: DMEM + 10% FBS + 1% penicillin-streptomycin) på is.

3. TAN isolation

  1. Placer tumorer i sterile 6-brønd plader, 5 tumorer per brønd. Skær tumorer i 2-3 mm stykker med steril saks.
    1. Fordøje med 1 mL dispase/collagenase D/DNase i opløsning (0,2 mg/0,2 mg/100 mg i 1 mL DMEMc) pr. tumor. Inkubér ved 37 °C, 5% CO2 i en fugtig inkubator, og bland med en 10 ml sprøjte uden nål hver 15 min 3 gange.
  2. For at fjerne ufordøjet fibre, mesh celler gennem 100 μm filtre i 15 mL rør (en brønd pr filter per tube). Tilsæt PBS til 15 mL, centrifugeglas ved 460 x g, 4 °c i 5 minutter, og Fjern supernatanten.
  3. Lyse erythrocytter med en lyse buffer (NH4CL 150 mm, KHCO3 10 mM, EDTA 0,1 mm, pH 7,3, 20 °c) ved at tilsætte 1 ml i hvert rør. Bland godt, og Kombiner opløsningen fra alle rør til en. Reaktionen stoppes efter 2 minutter med 11 mL iskold (4 °C) DMEMc.
  4. Centrifugeres ved 460 x g, 4 °c i 5 minutter, og supernatanten fjernes. Resuspension af pellet med 15 mL kold PBS. Centrifugeres ved 460 x g, 4 °c i 5 minutter, og supernatanten fjernes.
  5. Resuspension af pellet i 1 mL PBS. Tilsæt 3 mL af FC-blok-antistoffer (CD16/CD32-, Stock 0,5 mg/mL), og Inkuber på is i 15 minutter.
  6. Tilsæt antistoffer: 10 mL Ly6G-PE (bestand 0,2 mg/mL) og 10 mL CD11b-APC (bestand 0,2 mg/mL). Tilsæt 20 mL 6-Diamidin-2-phenylindol levedygtighed farvestof (DAPI, bestand 5 mg/mL) og inkubere på is i mørke i 30 min.
    Bemærk: en anden kombination af levedygtighed farvestoffer og fluorescerende konjugater af antistoffer kan anvendes.
  7. Tilsæt PBS op til 15 mL, centrifuge ved 460 x g, 4 °c i 5 minutter, og Fjern supernatanten.
  8. Resuspendere pellet i DMEMc til koncentrationen ca 10 x 106/ml, og holde på is.
  9. Sortér CD11b+ Ly6GHi Alive (dapi-negative) neutrofiler med en fluorescens-aktiveret celle sortering (gating-strategi, se figur 2).
    Bemærk: hold røret med cellesuspension og røret med DMEMc for sorteret celler ved 4 °C. Brug følgende optimale sorteringsindstillinger: en 70 mm dyse, en tærskel hastighed på maksimalt 22.000 hændelser/sekund og en strømningshastighed på 1-3.
  10. Kontrollér renheden af de sorterede neutrofiler ved hjælp af et flowcytometer for en anbefalet renhed på > 95%.
  11. Centrifuge sorteret neutrofiler ved 460 x g, 4 °c i 5 minutter, og Fjern supernatanten. Resuspendere de sorteres celler i DMEMc til koncentrationen af 1 x 106/ml.
    Bemærk: det forventede antal neutrofiler i 1 14-dages B16F10 tumor (10 mm diameter) er ca. 3 x 104 celler.

4. NAMPT hæmning i TANs in vitro

  1. Forbered FK866 (NAMPT inhibitor) bestand i dimethylsulfoxid (DMSO) i en endelig koncentration på 100 mM.
  2. Frø sorteret neutrofiler (trin 3,11) i 2 brønde af en 96-brønd U-bundplade (1,5 x 105 neutrofiler/brønd). Tilsæt FK866 i interventionen godt (endelig koncentration på 100 nM), og en tilsvarende mængde DMEMc med DMSO ind i kontrol godt. Inkubér i 2 timer ved 37 °C, 5% CO2 i en fugtig inkubator.
  3. Centrifugeres ved 460 x g, 4 °c i 5 minutter, og supernatanten fjernes. Resuspension i 200 mL PBS i hver brønd. Gentag 2 gange.
  4. Centrifugeres ved 460 x g, 4 °c i 5 minutter, og supernatanten fjernes. Resuspension i kommerciel endotel cellevækst medium (suppleret med 4 μl/ml endotel cellevækst supplement, 0,1 ng/ml rekombinant Human epidermal vækstfaktor, 1 ng/ml rekombinant Human grundlæggende fibroblast vækstfaktor, 90 μg/ml heparin og 1 μg/ml af hydrocortison) til en endelig koncentration på 0,2 x 106 celler/ml (i 0,75 ml) (for trin 5) eller i PBS til den endelige koncentration på 0,6 x 106 celler/mL (i 0,25 ml) (til trin 6).

5. vurdering af Tantans angiogene egenskaber ved hjælp af aorta ringanalysen

  1. Dissekere thorax aorta fra en mandlig C57BL/6j (WT) mus. Rengør og skær i 0,5 mm bredde ringe. Placer alle ringe i en brønd af en 24-brønd plade med 1 ml suppleret endotel cellevækst medium. Inkubér natten over ved 37 °C, 5% CO2 i en fugtig inkubator.
    Bemærk: brugen af unge (yngre end 8 uger) mandlige mus til aortadissektion er at foretrække, da de giver en mere robust angiogen respons15.
  2. Fyld brøndene af 96-godt flad bundplade med 50 μL opløst biliseret kælder membran matrix, lad gelen indstilles til 30 min i en 37 °C, 5% CO2 fugtig inkubator for at tillade matrixen at polymerisere. Forbered mindst 3 brønde pr. tilstand.
  3. Integrer ringene i solubilized kælder membran matrix ved at placere en aorta ring på toppen af det solide matrix lag, 1 ring i midten af hver brønd. Tilsæt endnu 50 μL opløst biliseret kælder membran matrix for at dække hver ring.
    1. Pladen placeres i en 37 °C, 5% CO2 fugtig inkubator i yderligere 30 minutter for at tillade Polymeriseringen af det andet matrix lag.
  4. Tilsæt 150 ml/godt suppleret endotel cellevækst medium og 2x104Ifnar1-/- tans (kontrol og FK866-behandlet) (trin 4,4).
  5. Pladen inkubates i 14 dage ved 37 °C, 5% CO2 i en fugtig inkubator.
  6. Billede ved hjælp af et standard fasekontrast-mikroskop og estimere endotel forgrening. Kvantitativ vurdering af fartøjs morpreuometriske og rumlige parametre, herunder forgrenings indeks kan udføres automatisk ved hjælp af billedbehandling program designet til videnskabelige billeder.
    Bemærk: repræsentative resultater er afbildet i figur 3.

6. adoptiv overførsel af behandlede neutrofiler i den allogene tumor model

  1. Forbered B16F10 melanom celler (trin 1,6) i PBS i en koncentration på 6 x 106 celler/ml.
  2. Forbered 2 typer af neutrofiler: FK866-behandlede neutrofiler og kontroller ubehandlet neutrofiler (trin 4,4) i PBS ved en koncentration på 6 x 105 celler/ml. Bland neutrofiler med B16F10 melanom celler (den endelige neutrofile til tumorceller ratio 1:10) at have 2 typer af celle blandinger.
  3. Tag 10 kvindelige WT-mus 8-12 uger gamle, 5 i hver gruppe. Barberer huden på flanken med en elektrisk shaver, og Desinficer med 70% ethanol.
  4. Injicer 100 μL af cellesuspensionen (trin 6,2) subkutant med en insulin sprøjte og en nål på 0,4 mm diameter til begge grupper af mus. Placer 1-5 mus fra samme gruppe i et bur.
  5. På dag 2, forberede 2 typer af neutrofiler: FK866-behandlede neutrofiler og kontrol ubehandlet neutrofiler (trin 4,4) i PBS i en koncentration 6 x 105 celler/ml. Injicer 100 μL cellesuspension (trin 6,4) i.v. ind i hale vene med en insulin sprøjte og en nål på 0,4 mm diameter til begge grupper af mus. Placer mus tilbage i buret.

7. tumor vækst måling, histologisk undersøgelse

  1. Overvåg tumorvækst hver anden dag. Evaluer Tumorens størrelse med kalibre og Beregn tumorvolumen med formlen V = 4/3 * π * (h * w2)/8 (h = højde, w = bredde, dybde = bredde).
  2. Offer mus på dagen 14 i CO2 kammer. Fjern tumorer og måle tumor vægte.
  3. Fryse tumorer i optimal skæring temperatur sammensatte i flydende nitrogen, og opbevares ved-80 °C.
  4. Tø prøverne til-20 °C og Forbered 5 mm sektioner ved hjælp af en kryotome. Lad kryosnittene tørre i 30 minutter ved 20 °C. Fastgør sektionerne i-20 °C kold acetone i 2 min og lad dem tørre i 30 minutter ved 20 °C.
  5. Blok med FC-blok antistoffer (CD16/CD32-, Stock 0,5 mg/mL 1:500) i PBS i 1 time ved 20 °C.
  6. Plet med kanin anti Mouse Laminin gamma antistof (1:1500 i PBS, 200 μL) for 1 t ved 20 °C. Vask med PBS tre gange.
  7. Bejdsning med sekundær ged anti-kanin antistof (bestand 0,5 mg/mL, 1:400 i PBS,), anti-mus αSMA (1:500 i PBS) og 2 μL DAPI (bestand 5 mg/mL, 1:100 i PBS) i et endeligt volumen af 200 μL af antistof opløsning. Inkuber i 1 time ved 20 °C i mørke. Vask med PBS tre gange.
  8. Tør slides i 20 minutter ved 20 °C i mørket. Monter med vandfrit monterings medium til mikroskopi og dæk med en dækseddel. Lad det tørre 1 t i 37 °C.
  9. Udfør mikroskopisk undersøgelse. Kvantificere vaskularisering ved at tælle det samlede antal (valgfrit område) af Laminin+ fartøjer og antallet (område) af SMA+ udviklede fartøjer.
    Bemærk: for at udføre billedanalyse, tage alle billeder under de samme betingelser (lys, kontrast, forstørrelse). I dette tilfælde er behandlingsparametrene faste, og billedbehandling bliver helt automatisk. Repræsentative resultater er afbildet i figur 4 og figur 5.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Ved hjælp af den beskrevne fremgangsmåde blev Ifnar1-/- neutrofiler isoleret fra tumorer og behandlet med nampt-hæmmer FK866 for 2 h. ubehandlet Ifnar1-/- neutrofiler blev brugt som kontrol. Behandlingens effektivitet blev evalueret ved hjælp af aorta Rings analysen, som afspejler de vigtigste trin i angiogenese (matrix nedbrydning, migration, spredning, reorganisering). Vi kunne påvise, at FK866-behandlede neutrofiler har en signifikant nedsat evne til at stimulere aorta gren dannelse, sammenlignet med ubehandlede celler (figur 3a, 3B). FK866-behandlede anti-angiogene neutrofiler blev injiceret subkutant i tumor bærende mus (ved dag 0 flanke og dag 2 i.v.). Vi kunne observere signifikant nedsat tumorvækst, sammenlignet med mus injiceres med ubehandlet Ifnar1-/- neutrofiler (figur 4a, 4b). Histologisk undersøgelse af de ekstraherede tumorer viste den betydelige undertrykkelse af angiogenese i tumorer isoleret fra mus behandlet med FK866-behandlede tans, sammenlignet med dem, der injiceres med ubehandlet Ifnar1-/- neutrofiler ( Figur 5a , B).

Figure 1
Figur 1. Protokollens opbygning. Trin 1. Fremstilling af B16F10 melanom cellelinje; 2. allogen tumor model i mus; 3. isolering af Tanger fra tumorer; 4. hæmning af NAMPT i TANs in vitro; 5. skøn over de angiogene egenskaber af TANs i aorta ring assay; 6. adoptiv overførsel af behandlede neutrofiler i den allogene tumor model; 7. tumor vækst overvågning, histologisk undersøgelse. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2. Gating strategi for TANs sortering. CD11b+ Ly6GHi Alive neutrofiler er sorteret fra tumorer med renhed ≥ 95%. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3. Undertrykkelse af de angiogene egenskaber af TANs efter FK866 behandling. Angiogene egenskaber af sorteret Ifnar1-/-tans behandlet med FK866 eller med medium blev anslået ved hjælp af aorta ringanalyse. Gren dannelse blev overvåget i løbet af 14 dage, repræsentative resultater på dag 14 er præsenteret (A). Behandling med FK866 reducerede signifikant antallet af endotelgrene (B). Data vises som median, interkvartil interval og min-max, * p < 0,05. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4. Retardering af tumorvækst efter adoptiv overførsel af FK866-behandlede neutrofiler. Indflydelsen af TANs på tumorvækst blev vurderet. TANs blev isoleret, behandlet med FK866 og injiceres i tumor bærende mus som beskrevet ovenfor. På dag 14 blev mus ofret, tumorer fjernet og analyseret. Ifnar1-/- TANs behandlet med FK866 versus kontrol blev sammenlignet. (A) tumorvækst blev målt, (B) tumor masse og (C) størrelse blev anslået. Data vises som median, interkvartil interval og min-max, * p < 0,05. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5. Undertrykt tumor vaskularisering efter adoptiv overførsel af FK866-behandlede neutrofiler. Tumorer blev isoleret som beskrevet ovenfor (fig. 4). Fartøjs modning blev vurderet ved hjælp af anti-SMA-antistoffer (modne beholdere) og anti-gamma Laminin (endotelceller). A) repræsentativ farvning af tumorer er vist: sma (grøn), Laminin (rød). Skala stænger: 50 μm. (B) kvantificering af tumor vaskularisering efter adoptiv overførsel af tans dyrket med FK866 (grøn) eller medium (rød) data vises som median, interkvartil interval og min-max, * p < 0,05. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Trods fremskridt i kirurgisk og farmakologisk kræftbehandling, vellykket behandling er fortsat en udfordring. Da immunceller er kendt for at spille en vigtig rolle i reguleringen af tumorvækst, bør der etableres nye metoder til at hæmme tumorigenicitet af sådanne celler. Her viser vi en ny tilgang til at undertrykke tumorvækst via adoptiv overførsel af anti-angiogen tumor-associerede neutrofiler. Selektiv målretning af Pro-angiogen NAMPT signalering i TANs, ved hjælp af FK866 inhibitor, forhindrer bivirkninger, som observeres ved systemisk FK866 behandling.

Den mest kritiske del af protokollen er behovet for at bruge nyisolerede primære neutrofiler. Neutrofiler er kort levende celler, undergår apoptose eller aktiveres under proceduren for isolation. Murin-neutrofiler skal opbevares i 4 °C-medier under alle isolations trin, herunder celle sortering. Isolering af neutrofiler bør foretages så hurtigt som muligt, og forsøget bør ikke afbrydes midlertidigt. Brug af FC-Block gør det muligt at reducere den uspecifikke farvning af cellerne med høj FC-receptor ekspression, ligesom NK-celler. Vi anbefaler også at minimere antallet af fluorescerende konjugerede antistoffer for at forenkle gating-strategien og for at undgå aktivering af neutrofiler på grund af antistof binding.

Den begrænsende trin i protokollen er isolering af levende neutrofiler fra tumorer på grund af en relativt lav mængde af disse celler i tumorer (ikke mere end 1% af enkelt levende celler i melanom). Dette kan kun være muligt ved hjælp af flow cytometri-baseret sortering. På samme tid, brug af blod neutrofiler for denne protokol bør undgås på grund af kun mindre regulering af NAMPT udtryk og deres lave funktionalitet, som er ændret på tumor væv ankomst16. Muligvis, for at bruge blod neutrofiler, de bør tidligere aktiveres ved hjælp af tumor-afledte vækstfaktorer.

For at undgå neutrofile apoptose foreslås kort behandling med FK866 (2-4 h), da det ikke har nogen indflydelse på levedygtigheden af TANs, mens langvarig behandling inducerer neutrofile apoptose16. I summen, protokollen demonstrerer potentialet i ex vitro manipulerede anti-angiogen neutrofiler til funktionelt undertrykke tumorvækst i mus melanom tumor model.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Vores arbejde blev støttet af tilskud fra Deutsche Krebshilfe, Tilskudsnummer: 111647 og det tyske Forskningsråd (DFG), Tilskudsnummer: JA 2461/2-1.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
15 ml tubes Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany 62,554,502
50 ml tubes Cellstar, Greiner Bio One International GmbH, Frickenhausen, Germany 227261
5ml / 10ml / 25ml sterile tipps for the automatic pipette Cellstar, Greiner Bio One International GmbH, Frickenhausen, Germany 6006180 / 607180 / 760180
6 well flat-bottom cell culture plates Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany 833,920
96 well flat-bottom cell culture plates Cellstar, Greiner Bio One International GmbH, Frickenhausen, Germany 655180
96 well U-bottom cell culture plates Cellstar, Greiner Bio One International GmbH, Frickenhausen, Germany 65018
AMG EVOS fl digital inverted microscope AMG, Bothel, U.S.
anti-mouse CD11b BD Pharmigen, Becton Dickinson, Franklin Lakes, U.S. 553312 clone M1/70, APC-conjugated, 0.2mg/mL
anti-mouse Ly6G BioLegend, California, U.S. 127608 clone 1A8, PE-conjugated, 0.2mg/mL
BD FACS AriaII BD Biosciences, Becton Dickinson, Franklin Lakes, U.S. cell sorter
Caliper Vogel Germany, Kevelaer, Germany
Casy cell counter Innovatis, Roche Innovatis AG, Bielefeld, Germany
Cell Trics 50µm / 100 µm sterile filters Sysmex Partec GmbH, Goerlitz, Germany 04-004-2327 / 04-004-2328
Centrifuge Rotina 420 R Andreas Hettich, Tuttlingen, Germany 4706
Collagenase D Sigma-Aldrich/Merck, Darmstadt, Germany 11088858001
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dilactate) BioLegend, California, U.S. 422801 Stock: 5mg/ml
Dispase I Sigma-Aldrich/Merck, Darmstadt, Germany D4818-2MG
DMEM Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, U.S. 41966-029 DMEM complete: DMEM + 10% FBS + 1% penicillin-streptomycin
DMSO (Dimethylsufoxide) WAK-Chemie Medical GmbH, Steinbach, Germany WAK-DMSO-10 CryoSure-DMSO
DNase I Sigma-Aldrich/Merck, Darmstadt, Germany DN25-100MG
DPBS Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, U.S. 14190-094
Endothelial cell growth medium PromoCell, Heidelberg, Germany c-22010
FBS (Fetal Bovine Serum) Biochrom, Berlin, Germany S0115
Fc-block (Anti-mouse CD16/32) BD Pharmingen, Becton Dickinson,Becton Dickinson, Franklin Lakes, U.S. 553142 clone 2.4G2, Stock: 0.5mg/mL
FK 866 hydrochloride Axon Medchem, Groningen, Netherlands Axon 1546 Stock: 100 mM
Goat Anti-Rabbit IgG H&L Abcam, Cambridge, U.K. ab97075 Cy3-conjugated, Stock: 0.5 mg/mL
Heracell 240i CO2 Incubator Thermo Fisher Scientific, Waltham, U.S. 51026334
IMDM Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, U.S. 12440-053 IMDM complete: IMDM + 10% FBS + 1% penicillin-streptomycin
Isis GT420 shaver B. Braun Asculap, Suhl, Germany 90200714
Matrigel Matrix basement membrane Corning Life Sciences, Amsterdam, Netherlands 7205011
Microtome Cryostat Microm HM 505 N Microm International GmbH, Walldorf, Germany
Monoclonal Anti-Actin, α-Smooth Muscle Sigma-Aldrich/Merck, Darmstadt, Germany F3777 FITC-conjugated, no information about stock concentration
Needles 0.4 mm x 16 mm BD Microlance, Becton Dicson, Becton Dickinson, Franklin Lakes, U.S. 302200
Neomount Merck, Darmstadt, Germany HX67590916
Normal goat serum Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, U.S. 005-000-121
Penicillin Streptomycin Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, U.S. 15140-122
Pipetus automatic pipette Hirschmann Laborgeräte, Eberstadt, Germany 9907200
ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, U.S. P36935
rabbit anti mouse Laminin gamma 1 chain Immundiagnostik, Bensheim, Germany AP1001.1 No information about stock concentration
StemPro Accutase Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, U.S. A1105-01
Sterile disposal scalpel (no. 15) MedWare, Naples, U.S. 120920
Syringes 1 ml BD Plastipak, Becton Dickinson, Franklin Lakes, U.S. 303172
Syringes 10 ml BD Discardit II, Becton Dickinson, Franklin Lakes, U.S. 309110
T75 sterile cell culture flasks Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany 833,911,302
Tissue-Tek O.C.T. Compound Sakura Finetek, Torrance, U.S. 4583
Zeiss AxioObserver.Z1 Inverted Microscope with ApoTome Optical Sectioning Carl Zeiss, Oberkochen, Germany

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jablonska, J., Leschner, S., Westphal, K., Lienenklaus, S., Weiss, S. Neutrophils responsive to endogenous IFN-beta regulate tumor angiogenesis and growth in a mouse tumor model. Journal of Clinical Investigation. 120, (4), 1151-1164 (2010).
  2. Andzinski, L., Wu, C. F., Lienenklaus, S., Kröger, A., Weiss, S., Jablonska, J. Delayed apoptosis of tumor associated neutrophils in the absence of endogenous IFN-β. International Journal of Cancer. 136, 572-583 (2015).
  3. Rongvaux, A., et al. Pre-B-cell colony-enhancing factor, whose expression is upregulated in activated lymphocytes, is a nicotinamide phosphoribosyltransferase, a cytosolic enzyme involved in NAD biosynthesis. European Journal of Immunology. 32, 3225-3234 (2002).
  4. Skokowa, J., et al. NAMPT is essential for the G-CSF-induced myeloid differentiation via a NAD(+)-sirtuin-1-dependent pathway. Nature Medicine. 15, 151-158 (2009).
  5. Yaku, K., Okabe, K., Hikosaka, K., Nakagawa, T. NAD Metabolism in Cancer Therapeutics. Frontiers in Oncology. 8, 622 (2018).
  6. Audrito, V., et al. Extracellular nicotinamide phosphoribosyltransferase (NAMPT) promotes M2 macrophage polarization in chronic lymphocytic leukemia. Blood. 125, 111-123 (2015).
  7. Brentano, F., et al. Pre-B cell colony-enhancing factor/visfatin, a new marker of inflammation in rheumatoid arthritis with proinflammatory and matrix degrading activities. Arthritis & Rheumatology. 56, 2829-2839 (2007).
  8. Jablonska, J., Wu, C. -F., Andzinski, L., Leschner, S., Weiss, S. CXCR2-mediated tumor associated neutrophilrecruitment is regulated by IFN-beta. International Journal of Cancer. 134, 1346-1358 (2014).
  9. Andzinski, L., et al. Type I IFNs induce anti-tumor polarization of tumor associated neutrophils in mice and human. International Journal of Cancer. 138, 1982-1993 (2016).
  10. Wu, C. -F., et al. The lack of type I interferon induces neutrophil-mediated pre-metastatic niche formation in the mouse lung. International Journal of Cancer. 137, 837-847 (2015).
  11. Hansel, T. T., Kropshofer, H., Singer, T., Mitchell, J. A., George, A. J. The safety and side effects of monoclonal antibodies. Nature Reviews Drug Discovery. 9, (4), 325-338 (2010).
  12. Hasmann, M., Schemainda, I. FK866, a highly specific noncompetitive inhibitor of nicotinamide phosphoribosyltransferase, represents a novel mechanism for induction of tumor cell apoptosis. Cancer Research. 63, 7436-7442 (2003).
  13. Holen, K., Saltz, L. B., Hollywood, E., Burk, K., Hanauske, A. R. The pharmacokinetics, toxicities, and biologic effects of FK866, a nicotinamide adenine dinucleotide biosynthesis inhibitor. Investigational New Drugs. 26, 45-51 (2008).
  14. von Heideman, A., Berglund, A., Larsson, R., Nygren, P. Safety and efficacy of NAD depleting cancer drugs: results of a phase I clinical trial of CHS 828 and overview of published data. Cancer Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 65, 1165-1172 (2010).
  15. De Rossi, G., Scotland, R., Whiteford, J. Critical Factors in Measuring Angiogenesis Using the Aortic Ring Model. Journal of Genetic Syndromes and Gene Therapy. 4, (5), (2013).
  16. Pylaeva, E., et al. NAMPT signaling is critical for the proangiogenic activity of tumor-associated neutrophils. International Journal of Cancer. 144, (1), 136-149 (2019).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics