Низкозатратный анализ gait для поведенческого фенотипирования моделей мыши нервно-мышечного заболевания

Behavior

Your institution must subscribe to JoVE's Behavior section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Анализ следа является недорогой альтернативой оцифрованных программ анализа походки для исследователей, количественно оценивающих аномалии движения у мышей. Из-за своей скорости, простоты и продольного потенциала, он идеально подходит для поведенческого фенотипирования моделей мыши.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Wertman, V., Gromova, A., La Spada, A. R., Cortes, C. J. Low-Cost Gait Analysis for Behavioral Phenotyping of Mouse Models of Neuromuscular Disease. J. Vis. Exp. (149), e59878, doi:10.3791/59878 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Измерение передвижения животных является распространенным поведенческим инструментом, используемым для описания фенотипа данной болезни, травмы или модели наркотиков. Недорогой метод анализа походки, показанный здесь, является простой, но эффективной мерой аномалий походки в моделях морин. Следы анализируются, покрасив ноги мыши нетоксичными моющиеся краски и позволяя субъекту пройти через туннель на листе бумаги. Конструкция испытательного туннеля использует естественное поведение мыши и их близость к небольшим темным местам. Длина шага, ширина шага, и распространение носов каждой мыши легко измерены с помощью линейки и карандаша. Это устоявшийся и надежный метод, и он генерирует несколько метрик, которые аналогичны цифровым системам. Этот подход является достаточно чувствительным, чтобы обнаружить изменения в шаге на ранних стадиях презентации фенотипа, и из-за его неинвазивного подхода, он позволяет тестирование групп по всей продолжительности жизни или фенотипической презентации.

Introduction

Локомотив требует сложной неврологической и опорно-двигательной координации, а дефицит в одном аспекте двигательных путей может привести к наблюдаемым аномалиям походки1,2. Анализ Gait является критическим инструментом для исследователей тестирования моделей мыши, поскольку он предоставляет количественные поведенческие данные о том, как данное заболевание, травмы или наркотики влияет на движение животного3. Тем не менее, оцифрованный анализ походки требует покупки беговой дорожки, камеры и связанного с ними программного обеспечения, которое может быть непомерно дорогим для исследователей. Анализ Gait часто используется с перерывами для отслеживания продольных изменений в двигательной функции, следовательно, это может быть трудно оправдать расходы, если спорадически используется4. Хотя оцифрованный анализ может обеспечить более подробные метрики походки, чем простой анализ следа,эти более сложные меры не всегда необходимы или актуальны для характеристики поведенческого фенотипа 5.

Здесь мы представляем недорогой ручной метод анализа следа как быстрая и чувствительная альтернатива оцифрованным программам анализа походки6,7. Ручной анализ следа было продемонстрировано для того чтобы обнаружитьзначительно разницы походки в множестве моделей заболевания murine 4,7,8,9,10,11 ,12,13,14,15,16,17, и, по крайней мере в одном случае, этот недорогой метод определил изменения в походке, что не были обнаружены общей оцифрованных походка анализа программы12. Общая стоимость материалов является номинальной, и она может быть легко адаптирована к другим моделям исследований грызунов.

Хотя существует много различных метрик походки, из которых данные могут быть взяты, метод, который мы описываем, фокусируется на трех конкретных метриках: длина шага, ширина шага (также также"ширина трека) и спред. Важно отметить, что параметры, которые должны быть оценены, должны определяться на основе модели за моделью. Этот метод анализа походки не предназначен для измерения когнитивных функций, и не рекомендуется для исследований, которые требуют сложных биомеханических измерений походки16.

Мы представляем поведенческие данные из когорты до- и постсимптоматических мышей моделирования X-связанных спинальной и бульбарной мышечной атрофии (SBMA), нервно-мышечное заболевание характеризуется дегенерацией моторных нейронов и мышечной атрофии. Эти мыши развивают прогрессивный дефицит в походке, которые совпадают с началом других заболеваний конкретных фенотипов. Это демонстрирует обоснованность и специфичность этого метода и подтверждает, что он может надежно различать пораженных и не затронутых животных.

Экспериментальные мыши в этом исследовании были 2,5 (досимптоматические) и 9-месячный (пост-симптоматический) BAC fxAR121 трансгенных мышей на фоне C57BL/6 (nexptNo 12). Эта модель была создана в нашей лаборатории и была полностью охарактеризована как мощная модель мыши SBMA9. Нетрансгенные пометы использовались в качестве элементов управления (nctrlNo8). SBMA является секс-ограниченное заболевание, которое полностью проявляется только у мужчин, поэтому мышей мужского пола были использованы исключительно для этого исследования. На этапах планирования, исследователи должны принимать во внимание соображения Национальных институтов здравоохранения о сексе в качестве биологической переменной, чтобы определить размеры группы и состав18.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Все испытания, проведенные с мышами, были рассмотрены и одобрены Институциональным комитетом по уходу и использованию животных (IACUC) Университета Дьюка. Персонал, ответственный за тестирование и скоринга должны быть ослеплены генотип животных или экспериментальное состояние до походки анализ и скоринга документов была завершена для всей когорты.

1. Проверка подготовки материала

  1. Проведение испытаний с туннелем, построенным из 3 предварительно вырезать прозрачные акриловые панели, которые 0,375 дюйма толщиной. Соберите туннель путем склеивания панелей вместе с герметиком, который специально связывает акрил и не будет излучать запахи при сушат.
    1. Для стандартных мышей C57BL/6 используйте следующие измерения туннеля: 2.5 дюйма в ширину, 3 дюйма высокой и 13 дюйма. Мыши должны быть в состоянии комфортно пройти через туннель и принять достаточно шагов (No gt;4), так что походка может быть измерена.
  2. Постройте целевую камеру с предварительно вырезанными серыми акриловыми панелями толщиной 0,375 дюйма, склеенными вместе с тем же герметиком, который использовался в туннеле. Внутренние измерения камеры 4 дюйма в ширину, 4 дюйма длиной и 3 дюйма. Матч открытия этой камеры к открытию туннеля (2,5 дюйма шириной х 3,0 дюйма. Поскольку мыши, естественно, предпочитают затемненные пространства хорошо освещенным пространствам, используйте материал, который непрозрачный и темный цвет.
  3. Используйте бумагу для отслеживания шагов, которые толстые и гладкие (акварельная бумага работает хорошо). Вырезать отдельные полосы бумаги, чтобы быть немного шире и длиннее, чем ширина и длина туннеля. При использовании туннельных размеров, описанных здесь, вырежьте бумаги до 15 дюйма, длиной на 3,5 дюйма.
  4. Используйте два контрастных цвета (например, зеленый и фиолетовый) нетоксичных моющихся водяных красок. Назначай один цвет для задних конечностей, второй для передних конечностей. Мыши будут лизать оставшуюся краску с ног после тестирования, поэтому выбранная краска должна быть полностью нетоксичной.
  5. Используйте две круглые бочковые кисти, по одной для каждого цвета краски (0,5 см в диаметре, конические/ остроконечные наконечники кисти).
  6. Выберите линейку с маркировкой до миллиметров, а калибровку с измерениями до 0,1 мм. Карандаш рекомендуется написать на скоринговых бумагах.
  7. Дополнительно: Для животных с высокой тревожностью или низкой мотивацией, обеспечить поведенческий стимул в камере цели. Это может включать в себя небольшое количество стерилизованных семян подсолнечника (помещается в домашнюю клетку за 2 дня до тестирования, чтобы позволить привыкание). В день тестирования, место семена подсолнечника внутри цели камеры поощрять мышей ходить через без остановки.

2. Сбор данных

  1. Если тестирование проводится в отдельной комнате, акклиматизировать мышей в новую комнату в течение 30 минут, а затем начать поведенческие анализы. Кроме того, потому что мыши, естественно, ночные, убедитесь, что все мыши полностью проснулся и оповещения, по крайней мере 5 минут до тестирования.
  2. Подготовьте настройку тестирования, позиционируя туннель над бумагой и пометив бумагу идентификатором мыши и датой тестирования. Расположите целевую камеру в конце туннеля, соединяя оба открытых конца. Добавить семена подсолнечника в конце туннеля (внутри камеры цели) для мотивации, если это необходимо.
  3. Удалите мышь, чтобы быть проверены из клетки и сцепление его твердо его потертости, убедившись, что сцепление хвост, чтобы стабилизировать движение задних конечностей.
  4. Краска передних лап, чтобы вся сторона всех ног и центр стопы полностью покрыты краской. Повторите это с контрастным цветом краски на задних лапах. Протрите любую краску, что мышь попадает на другие части тела с чистой влажной тканью, чтобы предотвратить пятна, которые могут помешать сбору данных.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Обработка мышью должна быть выполнена опытными исследователями для того чтобы свести к минимуму усилие животного.
  5. Поместите мышь в начале туннеля и позволить ей пройти весь путь в цель камеры, а затем получить мышь, аккуратно стереть ноги с водой смоченной тканью, и вернуть его в свою домашнюю клетку.
  6. Разрешить бумагу со следами, чтобы высохнуть полностью, прежде чем забил. Протрите испытательный полигон и туннель с этанолом или эквивалентным решением для очистки между каждым животным.

3. Критерии оценки

  1. Используйте шаги, которые постоянно расположены с четкими, не размазанные следы для скоринга. Рисунок 1B является хорошим примером последовательности следов, которые могут быть забиты. Для того, чтобы генерировать достаточные данные скоринга, должно быть не менее 2 последовательных шагов от каждой ноги, но 4-6 шагов на ногу рекомендуется. Не включайте первый и последний следы на бумаге, так как они вряд ли представляют собой нормальную походку, потому что мышь меняет скорость ходьбы.
  2. Используйте длину шага, ширину шага, и спред носка как 3 по-разному измерения походки которые можно проанализировать используя этот метод.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Длина и ширина шага требуют четких последовательных отпечатков, где область стопы хорошо определена в краске. Toe распространение не требует последовательных отпечатков для скоринга, только четкие отпечатки первого и последнего пальцев на одной ноге. Однако, если данный след не включен в измерения длины или ширины шага, он не может быть забит для распространения носовой части. Все три измерения оцениваются в сантиметрах.
    1. Определите длину шага как расстояние между двумя последовательными следами, созданными одной и той же ногой (т.е. одним шагом)(рисунок 1А, 1B).
      1. С помощью карандаша, нарисуйте 2-4 мм круг вокруг передний фут области обоих передних следов (определяется назначенным цветом выше) в один шаг и провести линию между ними с помощью линейки.
      2. Запись расстояния между двумя отпечатками от середины каждого круга (т.е. центр каждой подножки) как Right-Fore 1 (RF1) или Left-Fore 1 (LF1).
      3. Повторите для всех шагов, которые могут быть забиты (RF2, LF2, RF3, LF3 и так далее).
      4. Повторите для правой и левой задних конечностей следы.
      5. Средние все отдельные записанные расстояния шага для каждой конечности. Для статистического анализа отдельные члены когорты могут быть усреднена вместе.
    2. Определите ширину шага как меру расстояния между левыми и правыми передними конечностями или задними конечностями(рисунок 1А, 1B).
      1. Чтобы оценить это расстояние, нарисуйте и измерьте линию из обведенного переднего края одной задней конечности, которая пересекается перпендикулярно линии длины шага на контралатеральной задней конечности.
      2. Повторите это для всех задних конечностей отпечатки, которые могут быть забиты, а затем в среднем измерений. Метод расчета ширины шага одинаков для передних и задних конечностей.
    3. Определите распространение ног как расстояние между первым и последними носами на одном переднего или заднего лимбном следе(рисунок 1А, 1B).
      1. Используйте калиперы для измерения расстояния между кончиком первого пальца печати и кончиком последнего пальца печати.
      2. Повторите для всех задних конечностей отпечатки, которые могут быть забиты и среднего измерений. Метод расчета для спреда носик одинаков для передних и задних конечностей.
  3. Если бумага не может быть забита, дайте животному отдохнуть в течение 10 минут, прежде чем попробовать еще раз.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

При достаточном количестве животных, эта процедура способна обнаруживать различия походки между генотипами мыши, в пределах одного и того же штамма с течением времени. На рисунке 1B показаны репрезентативные следы изображений следов, собранных в нашей лаборатории, с помощью мышиной модели X-связанной спинальной и бульбарской мышечной атрофии (SBMA), нейродегенеративного расстройства, поражающего нижние моторные нейроны и скелетные мышцы. Мы ранее сообщали, что мужчины BAC fxAR121 трансгенных мышей развивать значительную потерю веса, нарушения в силе сцепления, и укороченная длина шага в пост-симптоматический возраст по сравнению с нетрансгенных littermate контролирует9.

Здесь мы представляем результаты анализа походки из когорты досимптоматических (2,5 месяца) и постсимптоматических (9 месяцев) BAC fxAR121 трансгенных и littermate контроля мышей(рисунок 2). До начала болезни, BAC fxAR121 трансгенных мышей отображать аналогичные длины шага, ширина шага, и ноги распространения по сравнению с их littermate не-трансгенных элементов управления. После начала болезни, BAC fxAR121 трансгенных мышей дисплей значительно короче длина шага (pпередних0,001, рзадняя конечность0,009) (Рисунок 2A). Подобный продольный анализ не выявил различий в ширине шага ни в одном из проверенных возрастов (р2,5 months0,709, р9 месяцев0,204) (рисунок2B). Постсимптомные BAC fxAR121 трансгенных мышей также имеют значительно более узкие задние носы распространения (p '0.01), чем возрастные littermate контроля(рисунок 2C). МЫШИ BAC fxAR121 моделируют нервно-мышечное заболевание, которое в первую очередь поражает задние конечности, поэтому подробные показатели походки передних конечностей не были собраны. Мы призываем исследователей, использующих этот метод анализа походки, рассмотреть фенотип своих моделей мыши и выбрать передний или задние конечности походки метрик соответственно.

Figure 1
Рисунок 1: Меры анализа gait и устранения неполадок.
A. Схематическое представление анализа походки на мышах, изображая длину шага, ширину шага, и информацию распространения носов. B. Представитель пример походки анализа последовательности следа, которые могут быть забиты, изображая измерения всех трех параметров. C. Представитель примеры проблемных последовательности анализа походки след, которые не могут быть забиты. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 2
Рисунок 2: SBMA BAC fxAR121 трансгенных мышей обладают прогрессивным, нейродегенеративной походкой фенотипа, который может быть обнаружен с помощью анализа походки.
A. Несмотря на отсутствие различий в досимптоматическом возрасте (2,5 месяца, nctlNo11, nexptNo12), мыши BAC fxAR121 развивают значительно уменьшенную длину шага по сравнению с их нетрансгенным контролем littermate на постсимптомных стадиях (9 месяцев, nctlNo8, nexptNo12). B. В любом возрасте не было обнаружено изменений ширины шага. C. Симптоматические SBMA BAC fxAR121 трансгенных мышей дисплей значительно сократили задний конечности ног распространения по сравнению с не-трансгенных littermate контроля. НЗ 8-12/группа. ANOVA с пост-хо-тюк-тест Омсий; 0,05, стр. л.с.; 0,01. Бары ошибок представляют SEM. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Используя недорогой метод анализа походки, описанный выше, мы показываем успешное выявление нескольких параметров дисфункции походки в постсимптомном возрасте в мышиной модели BAC fxAR121 SBMA. Уменьшение длины шага согласуется с предыдущими исследованиями SBMA моделей мыши и человеческих пациентов9. Мы также впервые показываем, что существуют значительные различия в задних конечностях, распространяемых у симптоматических мышей SBMA по сравнению с нетрансгенными элементами управления пометом. Интересно, что снижение распространения заднего носима может быть вызвано слабостью в мышцах лапового разгибателя, герметичностью в мышцах сгибателя лап или плохой иннервации нерва2,19, что также согласуется с этиологией SBMA.

Мыши должны легко бежать к цели камеры из-за их естественного поведенческого предпочтения для небольших темных пространств, но некоторые мыши не могут непрерывно двигаться через туннель. Если мышь прыгает, останавливается или разворачивается в туннеле (см. примеры на рисунке 1C),повторите результаты после периода отдыха на новой скоринговой бумаге. Результаты могут быть спасены, если мышь останавливается в самом начале туннеля, так как она часто может быть мягко подталкивается в беге к цели поле.

Применение слишком много или слишком мало краски на ноги мыши может привести к непригодным результатам. Избыток краски может привести к размытым или искаженным отпечаткам, в то время как недостаточная краска может привести к слабым или неопределимым отпечаткам(рисунок 1C). В любом случае повторите асссена на чистой скоринговой бумаге, чтобы предотвратить неточные измерения.

Очень молодые мыши (Злт;3 месяца) с большей вероятностью прыгают вперед в туннеле, в то время как пожилые (Nogt;8 месяцев) или очень фенотипические мыши, скорее всего, остановят или сопротивляются движению вперед полностью. Добавление поведенческого стимула (семена подсолнечника) в целевую камеру может помочь уменьшить частоту проблемного поведения, поощряя немотивированных мышей пройти туннель без остановки.

Размеры туннелей должны отражать размеры объекта; при использовании мышей, которые значительно больше или меньше, чем средняя лабораторная мышь (из-за возраста, диеты или генетических мутаций), мы рекомендуем изменить размеры туннеля и камеры цели, чтобы соответствовать размеру животного. В туннеле, мыши должны быть в состоянии ходить комфортно по прямой линии, но должны иметь некоторые трудности поворота вокруг, чтобы препятствовать такому поведению. Камера цели должна сопрягать высоту тоннеля и мыши должны приспосабливать удобно внутри камеры.

Исследователи, которые используют метод отсечения ног идентификации для своих мышей не может быть в состоянии собрать данные о спреда ног, но другие меры походки, как длина шага и ширина шага все еще могут быть собраны. Отсечение ног не оказывает существенного влияния на походку у мышей до тех пор, пока не более двух ног обрезаны на мышь20.

Этот метод анализа походки не отражает когнитивные функции, поэтому он не должен использоваться в качестве меры познания. Другие, намеревающиеся использовать этот метод следует рассмотреть нервно-мышечных групп, пострадавших в их модели мыши, а затем выбрать передние или задние конечности метрик соответственно. Этот метод анализа походки не рекомендуется для исследователей, которые изучают болевые реакции, требующие инъекций подножки, или для исследований, требующих биомеханических мер передвижения, которые не могут быть описаны только следами, как временные измерения конечностей движения или совместного вращения21.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgments

Авторы хотели бы поблагодарить A.M. за помощь в идентификации животных. Эта работа была поддержана грантами Национальных институтов здравоохранения США (R01 7 RF1 AG057264 до A.R.L.S. и C.J.C. и R01 NS100023 до A.R.L.S.) и Ассоциацией мышечной дистрофии (Основные исследования Грант A.R.L.S., Развитие Грант в C.J.C.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Caliper n/a n/a must have markings down to 0.1 mm
Craft Glue E6000 n/a
Footprint Paint (Tempera Paint) Artmind n/a must be non-toxic
Round Barrel Paintbrushes Symply Simmons n/a 0.5 cm diameter
Ruler n/a n/a must have markings down to millimeters
Scoring Paper (Watercolor Pads) Canson n/a cut to size
Tunnel and Goal Chamber Interstate Plastics n/a cut to size

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Clarke, K. A., Still, J. Development and consistency of gait in the mouse. Physiology & Behavior. 73, (1-2), 159-164 (2001).
  2. Mendes, C. S., et al. Quantification of gait parameters in freely walking rodents. BMC Biology. 13, 50 (2015).
  3. Carter, R. J., Morton, J., Dunnett, S. B. Motor coordination and balance in rodents. Current Protocols in Neuroscience. Chapter 8 Unit 8 (2001).
  4. Tillerson, J. L., Caudle, W. M., Reveron, M. E., Miller, G. W. Exercise induces behavioral recovery and attenuates neurochemical deficits in rodent models of Parkinson's disease. Neuroscience. 119, (3), 899-911 (2003).
  5. Pallier, P. N., Drew, C. J., Morton, A. J. The detection and measurement of locomotor deficits in a transgenic mouse model of Huntington's disease are task- and protocol-dependent: influence of non-motor factors on locomotor function. Brain Research Bulletin. 78, (6), 347-355 (2009).
  6. Sugimoto, H., Kawakami, K. Low-cost Protocol of Footprint Analysis and Hanging Box Test for Mice Applied the Chronic Restraint Stress. Journal of Visualized Experiments. (143), (2019).
  7. Carter, R. J., et al. Characterization of progressive motor deficits in mice transgenic for the human Huntington's disease mutation. Journal of Neuroscience. 19, (8), 3248-3257 (1999).
  8. Barlow, C., et al. Atm-deficient mice: a paradigm of ataxia telangiectasia. Cell. 86, (1), 159-171 (1996).
  9. Cortes, C. J., et al. Muscle expression of mutant androgen receptor accounts for systemic and motor neuron disease phenotypes in spinal and bulbar muscular atrophy. Neuron. 82, (2), 295-307 (2014).
  10. D'Hooge, R., et al. Neuromotor alterations and cerebellar deficits in aged arylsulfatase A-deficient transgenic mice. Neuroscience Letters. 273, (2), 93-96 (1999).
  11. Fernagut, P. O., Diguet, E., Labattu, B., Tison, F. A simple method to measure stride length as an index of nigrostriatal dysfunction in mice. Journal of Neuroscience Methods. 113, (2), 123-130 (2002).
  12. Guillot, T. S., Asress, S. A., Richardson, J. R., Glass, J. D., Miller, G. W. Treadmill gait analysis does not detect motor deficits in animal models of Parkinson's disease or amyotrophic lateral sclerosis. Journal of Motor Behavior. 40, (6), 568-577 (2008).
  13. Harper, S. Q., et al. RNA interference improves motor and neuropathological abnormalities in a Huntington's disease mouse model. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, (16), 5820-5825 (2005).
  14. Lin, C. H., et al. Neurological abnormalities in a knock-in mouse model of Huntington's disease. Human Molecular Genetics. 10, (2), 137-144 (2001).
  15. Sopher, B. L., et al. Androgen receptor YAC transgenic mice recapitulate SBMA motor neuronopathy and implicate VEGF164 in the motor neuron degeneration. Neuron. 41, (5), 687-699 (2004).
  16. Tillerson, J. L., Caudle, W. M., Reveron, M. E., Miller, G. W. Detection of behavioral impairments correlated to neurochemical deficits in mice treated with moderate doses of 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine. Experimental Neurology. 178, (1), 80-90 (2002).
  17. Wheeler, V. C., et al. Early phenotypes that presage late-onset neurodegenerative disease allow testing of modifiers in Hdh CAG knock-in mice. Human Molecular Genetics. 11, (6), 633-640 (2002).
  18. Clayton, J. A., Collins, F. S. Policy: NIH to balance sex in cell and animal studies. Nature. 509, (7500), 282-283 (2014).
  19. Maricelli, J. W., Lu, Q. L., Lin, D. C., Rodgers, B. D. Trendelenburg-Like Gait, Instability and Altered Step Patterns in a Mouse Model for Limb Girdle Muscular Dystrophy 2i. PLoS One. 11, (9), e0161984 (2016).
  20. Castelhano-Carlos, M. J., Sousa, N., Ohl, F., Baumans, V. Identification methods in newborn C57BL/6 mice: a developmental and behavioural evaluation. Lab Animals. 44, (2), 88-103 (2010).
  21. Lakes, E. H., Allen, K. D. Gait analysis methods for rodent models of arthritic disorders: reviews and recommendations. Osteoarthritis Cartilage. 24, (11), 1837-1849 (2016).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics