Bruk av frosset vev i kometanalysen for evaluering av DNA-skade

* These authors contributed equally
Genetics

Your institution must subscribe to JoVE's Genetics section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Denne protokollen beskriver flere prosedyrer for å forberede frosne vevsprøver av høy kvalitet på tidspunktet for necropsy for bruk i kometanalysen for å vurdere DNA-skade: 1) hakket vev, 2) skrapte epitelceller fra mage-tarmkanalen, og 3) cubed vev prøver, som krever homogenisering ved hjelp av en vevshakkingsenhet.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Hobbs, C. A., Recio, L., Winters, J., Witt, K. L. Use of Frozen Tissue in the Comet Assay for the Evaluation of DNA Damage. J. Vis. Exp. (157), e59955, doi:10.3791/59955 (2020).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Kometanalysen blir stadig mer populært som et middel til å vurdere DNA-skade i kultiverte celler og vev, spesielt etter eksponering for kjemikalier eller andre miljøstressfaktorer. Bruk av kometanalysen i regulatorisk testing for gentoksisk potensial hos gnagere har blitt drevet av vedtakelsen av en testlinje for organisasjon for økonomisk samarbeid og utvikling (OECD) i 2014. Kometanalyselysbilder er vanligvis tilberedt av friskt vev på tidspunktet for necropsy; Frysing av vevsprøver kan imidlertid unngå logistiske utfordringer forbundet med samtidig fremstilling av lysbilder fra flere organer per dyr og fra mange dyr per studie. Frysing gjør det også mulig å sende prøver fra eksponeringsanlegget til et annet laboratorium for analyse, og lagring av frosset vev forenkler å utsette en beslutning om å generere DNA-skadedata for et gitt organ. Alkaliinkometanalysen er nyttig for å oppdage eksponeringsrelaterte DNA-dobbelt- og enkelttrådpauser, alkali-labile lesjoner og strandbrudd forbundet med ufullstendig DNA-eksisjonsreparasjon. DNA-skader kan imidlertid også skyldes mekanisk klipping eller feil prøvebehandlingsprosedyrer, noe som forvirrer resultatene av analysen. Reproduserbarhet i innsamling og behandling av vevsprøver under necropsies kan være vanskelig å kontrollere på grunn av varierende laboratoriepersonell med varierende nivåer av erfaring i høsting av vev for kometanalysen. Å forbedre konsistensen gjennom oppfriskningsopplæring eller distribusjon av mobile enheter bemannet med erfarne laboratoriepersonell er kostbart og kan ikke alltid være mulig. For å optimalisere konsekvent generering av prøver av høy kvalitet for analyse av kometanalyse, ble en metode for homogenisering av blitsfrosne kuber av vev ved hjelp av en tilpasset vevssertifiseringsenhet evaluert. Prøver utarbeidet for kometanalysen ved denne metoden sammenlignet gunstig i kvalitet til friske og frosne vevsprøver tilberedt ved å hakke under necropsy. Videre ble lav baseline DNA skade målt i celler fra frosne terninger av vev etter langvarig lagring.

Introduction

Kometanalysen brukes i økende grad som et middel til å evaluere DNA-skade i kultiverte celler og vev utsatt for kjemikalier eller andre miljøstressfaktorer1. Analysen kan oppdage DNA dobbel- og enkelt-strand pauser, alkali-labile lesjoner, og single-strand pauser forbundet med ufullstendig DNA reparasjon. Det internasjonale rådet for harmonisering av tekniske krav til legemidler for human bruk (ICH) retningslinje for farmasøytisk testing anbefaler en DNA strand brudd analyse som kometanalysen som en andre test for å supplere gnagererytrocytt mikronukleusanalyse for vurdering in vivo genotoxicity og som en oppfølgingstest for å vurdere handlingsmåte i målorganer av tumorinduksjon2. Det europeiske mattilsynet (EFSA) anbefaler in vivo kometanalysen som en passende oppfølgingstest for å undersøke relevansen av et positivt resultat i en in vitro gentoksisitetstest3. I 2014 ble en OECD-testretningslinje godkjent for gnagerkometanalysen, og dermed øke akseptabiliteten av analysen for bruk i regulatorisk testing av gentoksisk potensial. Analysen er basert på elektroforetisk separasjon av avslappede DNA-løkker og fragmenter som migrerer fra nukleoider av lysed celler. I utgangspunktet er enkeltceller innebygd i agarose som har blitt lagdelt på mikroskoplysbilder. Lysbilder blir deretter nedsenket i lysisbuffer etterfulgt av en alkalisk (pH> 13) løsning, noe som gjør at det tett kveilet kjernefysiske DNA kan slappe av og slappe av. Lysbilder plasseres deretter i et elektrisk felt, noe som stimulerer migrering av negativt ladet DNA mot anoden, og skaper bilder som ligner kometer; den relative mengden DNA i komethalen sammenlignet med komethodet er direkte proporsjonal med mengden DNA-skade; DNA-innhold i halen kvantifiseres vanligvis ved hjelp av programvare for digital bildebehandling.

Fordi kometanalysen oppdager fragmentert DNA, kan nøyaktig kvantifisering av eksponeringsindusert DNA-skade bli forvirret av kromatinfragmentering forbundet med nekrose eller apoptose som følge av behandlingsindusert cytotoksisitet eller stress. Videre kan DNA-skade oppstå som følge av mekanisk klipping eller feil prøvebehandling4. Betydningen av å opprettholde høstet vev kjølt før lysbildeforberedelse for å minimere baseline nivået av DNA-skade har tidligere blitt vist5,6. Mange laboratorier forbereder kometanalyse lysbilder fra friskt vev; Dette kan imidlertid være logistisk utfordrende når du forbereder lysbilder fra flere vevstyper per dyr i en studie med et stort antall dyr. Videre presenterer dette et problem når lysbildeforberedelse og analyse skal oppstå ved et eksternt laboratorium, noe som krever forsendelse av prøver. For eksempel inkluderer US National Toxicology Program kometanalysen som en del av sitt genetiske toksikologitestprogram (https://ntp.niehs.nih.gov/testing/types/genetic/index.html) og inkluderer noen ganger analysen i 28 eller 90 dagers toksisitetsstudier for gjentatt dosering; Dette nødvendiggjør innsamling av vev ved in-life laboratorium og overføring av prøver til et annet laboratorium for analyse. For å oppnå dette, blir vevsstykker hakket, og / eller epitelceller i mage-tarmkanalen skrapes og cellulære suspensjoner blir flash frosset og lagret i en fryser for etterfølgende forsendelse og lagring av mottakslaboratoriet til analyse7. Riktig håndtering av prøver er avgjørende for å skaffe data av høy kvalitet ved hjelp av frosset vev; Reproduserbar manipulering av vevsprøver under necropsies utført av stadig skiftende personell er imidlertid vanskelig å kontrollere, spesielt ved laboratorier i livet som ikke rutinemessig høster vev for kometanalysen. Oppfriskningsopplæring av necropsy ansatte eller bruk av en mobil enhet bemannet av erfarne laboratoriepersonell for å samle friske eller frosne vevprøver er ofte for kostbart, ikke mulig, eller rett og slett undervurdert.

For bedre å sikre konsekvent generering av høykvalitets vevsprøver for overføring til et eksternt sted for kometanalyseanalyse, ble nytten av en publisert metode6 av vevsbevaring fra flashfrosne kuber av vev utforsket. I denne metoden lastes frosne terninger av vev inn i en rustfritt stål vev skrinsenhet (Figur 1) som er plassert i et mikrocentrifugerør som inneholder kald buffer. Kuben av vev blir deretter presset gjennom et lite målernett på enden av enheten. Gjentatte ganger tvinge vev suspensjon gjennom mesh silen i begge retninger flere ganger resulterer i en relativt ensartet encellede suspensjon. Prøver utarbeidet av denne metoden sammenlignet gunstig i kvalitet til både friske og frosne vevsprøver utarbeidet ved hakking. Som en ekstra fordel, i motsetning til hakkede prøver, kan vevskuber lagres frosset i lengre perioder og fortsatt gi resultater av høy kvalitet i kometanalysen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Vev ble høstet under gjennomføring av studier utført ved AAALAC-akkrediterte anlegg ved NTP kontraktlaboratorier i samsvar med Good Laboratory Practice forskrifter (21 CFR Part 58) og dyrebrukprotokoller godkjent av Institutional Animal Omsorgs- og bruksutvalget (IACUC) ved hvert laboratorium.

1. Vevshøsting og -behandling

MERK: Det er nyttig å forberede dupliserte prøverør (f.eks. lever) eller overføre omtrent halvparten av en prøve til et annet oppbevaringsrør (f.eks. tolvfingertarm, mage) for å muliggjøre reanalyse, om nødvendig. For å minimere potensiell prøve-til-prøve variabilitet for tarmkanalen vev, anbefales det at forsiktighet tas for å prøve samme region av vev i forhold til magen for hvert dyr, og en prøve deles for å generere dupliserte prøver. Plasttang anbefales for overføring av klebrig vev som hjernen. Som et alternativ kan hakket, skrapt eller homogenisert vevpreparater filtreres for å oppnå homogene encellede suspensjoner ved hjelp av en 40 μm cellesil festet til et konisk rør.

  1. Fjern eventuelt vedlagt tilkoblingsvev, organer og rusk fra organ(er) av interesse. Umiddelbart etter fjerning, swish orgelet kraftig i en mellomstor veiebåt som inneholder ~ 7 ml kald nylaget mincing løsning (Mg++, Ca++ og fenol rødfri Hank balansert salt løsning, 10% v / v DMSO, og 20 mM EDTA pH 7.5) for å fjerne gjenværende blod og rusk.
  2. Overfør hvert organ til en annen ren veiebåt som inneholder tilstrekkelig (~ 7 ml) kald mincing løsning for å opprettholde vevet nedsenket, på is, inntil videre behandling.
  3. Fjern en del av hvert organ av interesse og plasser den i en innebyggingskassett. Fiks i 10% nøytral bufret formalin, trim og parafin embed i henhold til laboratoriets standardprosedyrer for mulig fremtidig histopatologievaluering.
  4. For leveren, kutt en 5 mm langsgående del av venstre flike og forsiktig swish i ~ 7 ml kald mincing løsning. Plasser vevsstripen i en ren mellomstor veiebåt som inneholder ~ 7 ml kald mincingløsning og hold på is til den er klar til å behandle videre (trinn 1.8 eller 1.11).
  5. For tolvfingertarmen, kutt en 10 mm del av tolvfingertarmen proksimal til magen. Bruk en 21–25 G nål, skyll for å fjerne rusk og bakterier.
    1. Sett nålen inn i den ene enden av tolvfingertarmen og skyll med 1 ml kald mincingoppløsning.
    2. Skyll den andre retningen ved å vende tolvfingertarmen over og gjenta med en annen 1 ml mincing løsning. Kast nålen.
    3. Skjær tolvfingertarmen åpen og skyll den i ~ 7 ml mincing løsning før du legger den inn i en mellomstor veiebåt som inneholder ~ 7 ml ren mincing løsning; opprettholdes på is til du er klar til å behandle videre (trinn 1.8 eller 1.11).
  6. For hjernen kan det være nyttig å først dele hjernen inn i to halvkuler; en halvkule kan lagres for mulig histopatologi (se trinn 1.2).
    1. Dissekere hjerneregionen (e) av interesse og forsiktig swish i ~ 7 ml kald mincing løsning.
    2. Overfør vev(er) til en ren mellomstor veiebåt som inneholder ~ 7 ml kald mincing løsning og opprettholde på is til klar til å behandle videre (trinn 1.8 eller 1.11; merk at små regioner som lillehjernen og hippocampus kanskje ikke krever ytterligere trimming).
  7. For magen
    1. Fjern og kast formagen. Klipp åpne kjertelmagen og vask deg fri fra mat ved hjelp av ~ 7 ml kald mincing buffer i en mellomstor veiebåt.
    2. Fjern en 5 mm stripe av kjertel mageproksimal til tolvfingertarmen for fiksering for mulig histopatologievaluering (se trinn 1.2).
    3. Plasser den gjenværende magen i ~ 7 ml kald mincing buffer i en mellomstor veiebåt og rug på is i 15-30 min.
      MERK: Dette inkubasjonstrinnet er kanskje ikke nødvendig; dette trinnet ble inkludert i JaCVAM valideringsprotokollen, men er ikke nevnt i OECDstestretningslinje 8,9.
    4. Overfør magen til et rent stykke parafin (eller Petriskål eller veiebåt) og skrap forsiktig overflateepitelet to eller flere ganger ved hjelp av et skalpellblad eller en polytetrafluoroethene (PTFE) skraper for å fjerne rusk. Plukk opp mageslimhinnen med tang og skyll med 1 ml kald mincing buffer ved hjelp av et rør. Overfør magevevet til en ren overflate eller tallerken.
    5. Skrap forsiktig mageepitelet 4–5 ganger (mer, om nødvendig) i mincing-oppløsning (vanligvis 250 μL/mus eller 500-1000 μL/rotte) med baksiden av et skalpellblad eller PTFE-skraper for å frigjøre cellene. Eventuelt skyll vev med et omtrent likt volum av mincing løsning for å gjenopprette flere celler. Samle mincing løsningen som inneholder frigjorte celler ved hjelp av et rør og overføre til en mikrocentrifuge rør på is.
  8. For kjøttdeigsprøver, kutt en 3–4 mm del av lever- eller hjernevevet eller ~5 mm duodenum og overfør til en merket 1,5 eller 2,0 ml mikrocentrifugerør som inneholder 1 ml kald mincingløsning. Hakk raskt (≤30 s) med hakkingsaks til den er finspredt, samtidig som prøven er kald. Prøven skal se litt overskyet ut; Det er imidlertid vanlig for noen stykker å forbli som vil bosette seg til bunnen av røret.
  9. For å bruke vevet friskt, vedlikehold rør som inneholder hakket vev eller skrapte epitelceller på is; bruk vevet til å klargjøre kometlysbilder innenfor ca. 1 h etter innhøsting (beskrevet i avsnitt 2).
  10. For frysing av vevsprøvene, umiddelbart etter hakking eller innsamling av skrapte epitelceller
    1. Fest rørlokket og slipp røret i en Dewar kolbe som inneholder flytende nitrogen; rørkan opprettholdes i flytende nitrogen så lenge necropsy (≤3 h).
    2. Hent rør ved hjelp av en øse og legg på tørris for å sortere. Overfør rør til en fryseboks på tørris og oppbevar esken i en fryser på -80 °C.
  11. For å forberede frosne terninger av vev, kutt flere små biter av vev (≤ 4 mm i diameter og ~ 6 mm i lengde; Figur 1).
    1. Slipp dem individuelt direkte inn i en mellomstor veiebåt eller annet egnet fartøy som inneholder flytende nitrogen.
    2. Vent noen sekunder på at bitene fryser helt og overfører individuelle frosne vevskuber til et merket mikrocentrifugerør eller kryotube som opprettholdes på tørris; ikke la brikkene klumpe seg sammen under fryseprosessen.
    3. Overfør rør til en fryseboks på tørris og oppbevar esken i en fryser på -80 °C.

2. Glideklargjøring

  1. For hakket/skrapt vev
    1. Vedlikehold rør som inneholder friskt vev på våtis.
    2. Legg rør av frosset vev inn i et romtemperaturvannbad til prøvene er helt tint, samtidig som de sørger for at de holdes kalde. Overfør rørene umiddelbart på is.
    3. Umiddelbart før uttak av celler for overføring til agarose (trinn 2.3), bland hver cellesuspensjon forsiktig; for ikke-filtrerte prøver, la store biter til å bosette seg til bunnen av røret. Vedlikehold alle rør på is til det er klargjort lysbilder for alle prøver.
  2. For cubed vev
    1. Hent rør som inneholder vevskuber fra 80 °C-fryseren og hold på tørris til glideklargjøring.
    2. Aliquot 1 ml Merchantmedium (0,14 M NaCl, 1,47 mM KH2PO4,2,7 mM KCl, 8,1 mM Na2HPO4,10 mM NaEDTA, pH 7.4) eller mincing løsning i en merket 1,7 ml mikrocentrifuge rør for hver prøve og opprettholde på is.
    3. Arbeide raskt for å unngå vev tining, plassere en kube av vev i den åpne enden av en romtemperatur vev mincing enhet (Figur 1). Flere vevstykker kan brukes; om nødvendig kan det frosne vevet kuttes eller knekkes i mindre biter ved hjelp av en kald mørtel og pestle for å redusere kubestørrelsen for å passe inn i enheten.
    4. Sett raskt inn et størrelsesmatchet sprøytestempel i enheten for å skyve vevet til nettingenden som deretter skal plasseres i mikrocentrifugerøret som inneholder kald mincingløsning; unngå å tvinge væsken til å overflyte røret. Senk nettenden av enheten i ca. 5–10 i den kalde hakkeløsningen slik at vevet kan tinehelt.
    5. Trykk stempelet helt ned til celler ses ekstruderende gjennom nettporene. Trekk deretter stempelet opp ca. 2,5 cm og trykk ned igjen helt. gjenta prosessen flere ganger til hakkeløsningen blir turbid.
    6. Om nødvendig kan prøven konsentreres for å øke celletettheten ved nedkjølt sentrifugering i 5 min ved 1100 o/min og fjerning av en del av supernatanten.
    7. Gjenta prosessen for alle prøver ved hjelp av en ren vevshakkeenhet for hver prøve.
  3. Overfør 50 μL cellesuspensjon til et rør som inneholder 450 μL på 0,5 % lavt smeltepunkt agarose ved 37 °C.
    MERK: Volumene kan justeres, men mengden agarose skal være ≤1 %.
  4. Klargjør og score lysbilder som beskrevet tidligere10,11.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Studie 1
Leveren ble høstet fra to kohorter av mannlige Sprague Dawley rotter administrert maisolje i 4 dager, forskjøvet med en uke. Lysbilder ble tilberedt av nyhakket vev, frosset hakket vev og frosset cubed vev behandlet i Merchant medium eller mincing løsning ved hjelp av vev mincing enheten. Frosne vev hentet fra dyr fra den første kohorten ble evaluert etter fryselagring i ~ 3,5 måneder. Frosne vev hentet fra dyr fra den andre kohorten ble evaluert etter lagring i ~ 6 måneder. Kometer som viser den karakteristiske "pinnsvin" morfologi, som indikerer tungt skadede celler (av usikker etiologi som kan omfatte cytotoksisitet eller mekanisk stress), ble ikke inkludert i scoring av % hale DNA; prosentandelen av pinnsvin, identifisert utelukkende ved visuell inspeksjon av morfologi, ble tabulert separat i henhold til OECD TG 4899. Gjennomsnittlig % hale DNA resultater for dyrene i de to kohortene (basert på scoring 100 celler / dyr) er oppsummert i figur 2A. Alle metodene ved hjelp av frosset vev produserte verdier høyere, men ikke alltid statistisk annerledes, enn friskt vev. Tatt i betraktning at den anbefalte øvre grensen for % hale DNA i frisk rotte lever er 6%9, disse resultatene viser at noen av disse metodene kan fungere bra for evaluering av frosset vev. Mincing løsning utført minst like så vel som Merchant medium; siden sistnevnte er mer tidkrevende å forberede, ble mincing løsning valgt for påfølgende studier. Det var ingen statistisk signifikante forskjeller i skade i vev fra den andre dyrekohorten som hadde blitt lagret frosset i ~ 6 måneder før behandling sammenlignet med vevet fra den første kohorten behandlet etter ~ 3,5 måneders lagring. Samlet sett var de % pinnsvinene parallelt med % hale-DNA, selv om de % pinnsvinene i det frosne vevet i forhold til friskt vev var mer variabelenn for % hale DNA (Figur 2B). Verdiene for disse endepunktene i det friske vevet gir en grunnlinje som DNA-skaden artefactually introdusert av frysemetodene kan måles.

Studie 2
Kvinnelige B6C3F1 mus ble administrert normal saltvann eller mutagen, etyl metansulfonat (EMS) ved 200 mg/kg/dag i normal saltvann i tre dager. Vev ble høstet 3 timer etter den endelige doseadministrasjonen og behandlet frisk i kometanalysen. Ekstra vev ble flash frosset etter å ha blitt hakket i mincing løsning eller samlet som kuber. Cubed prøver ble senere behandlet i mincing løsning ved hjelp av sil enheten umiddelbart før utarbeidelse av komet lysbilder. På forutsetning av at celler som viser pinnsvinmorfologi representerer celler i den høye enden av kontinuumet av kjemisk-indusert DNA-skade, ble pinnsvin som er scorable av bildeprogramvaren inkludert i den automatiserte scoringen av % hale DNA. % hale DNA-resultater (basert på scoring 150 celler / dyr) er oppsummert i figur 3. Levervev frosset som kuber og deretter behandlet ved hjelp av vev senkenheten gitt resultater svært lik de som er oppnådd for nyhakket vev. % hale DNA-verdiene var noe høyere for det frosne hakket vevet, men baselineverdiene for det frosne hakket vevet var under 6 %, som anbefalt for frisk rottelever i OECD-testretningslinjen for kometanalysen9. En statistisk signifikant økning i EMS-indusert DNA-skade ble målt i vevsprøver behandlet av alle tre metodene.

Studie 3
Deler av levervevet samlet inn fra kvinnelige B6C3F1 mus i en 90 dagers toksisitetsstudie av en test kjemisk utført av et eksternt laboratorium ble hakket eller skåret i terninger, flash frosset, og sendt over natten på tørris til dette laboratoriet for analyse. Hakket vev ble analysert etter ~ 2 måneder med fryselagring (figur 4). Celler som dukket opp ved visuell inspeksjon for å være pinnsvin, men var scorable av bildeprogramvaren ble inkludert i % hale DNA målinger (150 celler scoret / dyr). Antall pinnsvin (enten skalerbare eller ikke-skalerbare) identifisert utelukkende ved visuell inspeksjon av morfologi i totalt 150 celler / dyr ble tabulert separat for å gi informasjon om frekvensen av disse svært skadede cellene. Samlet sett var DNA-skader (målt som % hale DNA) i frosset hakket vev høyt på tvers av alle dosegruppene med betydelig dyr til dyrvariabilitet, inkludert i kjøretøykontrollgruppen. Dna-resultatene for % hale korrelert med % pinnsvin (kun identifisert på grunnlag av morfologi), noe som indikerer at pinnsvin bidro vesentlig til det høye nivået av DNA-skader som ble observert i disse prøvene. Basert på det høye bakgrunnsnivået av DNA-skader målt i hakket vev, ble frosset cubed vev senere analysert etter ~ 22 måneders lagring (Figur 4). Både DNA-skader og % pinnsvin var svært lave i blitsfrosset cubed vev som hadde blitt utarbeidet parallelt med hakkede vevsprøver. Dermed var de svært skadede cellene reflektert av pinnsvinmorfologien i hakkede vevsprøver helt klart ikke et resultat av en biologisk prosess, men ble sannsynligvis introdusert av mekanisk forstyrrelse og / eller vevoppvarming under mincing prosedyren før bli flash frosset; disse dataene ble ansett for å være upålitelige. Heldigvis ga analysen av frosset cubed vev et klart resultat, nemlig mangelen på DNA-skaderespons i leveren av kvinnelige mus etter tre måneders eksponering for testkjemikaliet. Resultatene fra denne case-studien eksemplifiserer risikoen forbundet med fremstilling av hakket vev av et relativt uerfarent laboratorium og viser nytten av den frosne cubed vevmetoden for å omgå dette problemet.

Figure 1
Figur 1: Vevshakkingsenhet og stempel som brukes til å forberede en enkelt cellesuspensjon fra frosset vev. Prototypen (4,5 mm indre diameter, 0,4 mm mesh størrelse) ble vennlig levert av Dr. Gunnar Brunborg (NorGenotech, Oslo, Norge). Panelet til høyre gir et eksempel på en passende størrelse kube av vev for bruk med enheten. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Sammenligning av DNA-skader målt i friske og frosne hakket og homogeniserte museleverprøver. Leveren ble høstet fra to forskjøvet kohorter (n = 5/gruppe/kohort) av mannlige Sprague Dawley rotter administrert maisolje i 4 dager. Lysbilder ble tilberedt av nyhakket vev, frosset hakket vev og frosset cubed vev behandlet i Merchant medium eller mincing løsning ved hjelp av vev mincing enheten. Frosne vev ble analysert ~ 3,5 og 6 måneder etter necropsy for kohorter 1 og 2, henholdsvis. Kometer klassifisert som pinnsvin basert på morfologi ble ikke inkludert i scoring av % hale DNA. (A) Kohort gjennomsnittlig % hale DNA resultater. (B) Kohort gjennomsnittlig % pinnsvin resultater. Feilfelt gjenspeiler standardavvik. Statistiske analyser ble utført for å sammenligne frosne vev med friskt vev for hver kohort og for å sammenligne resultatene mellom de to kohortene for hver vevsforberedelsesmetode. *Statistisk forskjellig (p < 0,05) fra ferskt hakket vev i samme kohort ved hjelp av studentens t-test; #statistically forskjellige (p < 0,05) fra ferskhakket vev i samme kohort ved hjelp av Mann-Whitney-testen for ikke-normalt distribuerte data; ¥ statistisk forskjell (p < 0,05) mellom kohorter ved hjelp av studentens t-test. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Sammenligning av DNA-skade indusert av EMS i levervev behandlet av ulike prosedyrer. Gjennomsnittlig % hale DNA for kvinnelige B6C3F1 mus administrert kjøretøy eller 200 mg/kg/dag EMS i tre dager (n = 5/gruppe). Lever ble høstet 3 h etter den endelige doseadministrasjonen og behandlet frisk i kometanalysen. Ekstra levervev ble flash frosset etter å ha blitt hakket i mincing løsning eller samlet som kuber; kuberte prøver ble homogenisert ved hjelp av vevshakkeenheten umiddelbart før klargjøring av kometlysbilder. For å sikre at celler i den høye enden av kontinuumet av EMS-indusert DNA-skade ikke ble utelukket fra analysen, ble kometer som ved visuell inspeksjon syntes å møte morfologisk beskrivelse av pinnsvin, men ble funnet å være scorable av bildeprogramvaren ble inkludert. Feilfelt gjenspeiler standardavvik. En student t-test ble brukt til å sammenligne mengden DNA-skade hos dyr utsatt for EMS mot at i kjøretøyet kontroll dyr for hver prøve forberedelse metode. *Statistisk signifikant økning ved p < 0,05. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4. Case studie viser nytte av frossen kube metode og høy kvalitet data innhentet etter langvarig lagring. Deler av levervevet samlet inn fra kvinnelige B6C3F1 mus utsatt for ulike konsentrasjoner av en test kjemisk i ~ 90 dager (n = 5 / gruppe) ble hakket eller skåret i terninger og blits frosset på in-life laboratorium og deretter sendt til dette laboratoriet for analyse. Hakket vev ble analysert etter ~ 2 måneder med lagring; på grunn av den dårlige kvaliteten på dataene, ble frosset cubed vev senere analysert etter ~ 22 måneders lagring. For å sikre at celler i den høye enden av kontinuumet av kjemisk indusert DNA-skade ikke ble utelukket fra analysen, ble data fra skalerbare celler som ved visuell inspeksjon syntes å være pinnsvin, inkludert. (A) Gruppe gjennomsnittlige % hale DNA resultater. Sammenlignet med hakket vev ble resultatene av høy kvalitet hentet fra frosset cubed vev, selv etter langvarig lagring. (B) Gruppe gjennomsnittlige % pinnsvin resultater. Dårlig mincing teknikk er tydelig fra den omfattende ikke-biologiske DNA-skaden observert som pinnsvinkometer i hakkede vevsprøver. Feilfelt gjenspeiler standardavvik. En ANOVA med Dunnetts test ble brukt til å evaluere for en positiv respons på testkjemikaliet for hver prøveklargjøringsmetode. Det var ingen statistisk signifikante (p < 0,05) dosegrupper oppdaget for noen av metodene. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: DNA-skader målt i frosset rottehjernevev. Kometanalyseresultater er gitt for frosne hakket eller cubed vev som representerer flere forskjellige regioner i hjernen til mannlige og kvinnelige Sprague Dawley rotter. Data (generert av inkludert skalerbare pinnsvinkometer) ble samlet over flere studier; n = totalt antall hjernevev evaluert for hver prøveklargjøringsmetode. Feilfelt gjenspeiler standardavvik. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Som vist tidligere7,12,13, riktig håndtert flash frosset hakket vev gir gode resultater i kometanalysen. Faktisk er baseline % hale DNA-verdier for frossen hakket rotte og muselever tilberedt i laboratoriet vårt vanligvis ≤6%, som anbefalt av OECD test retningslinje9 for nyhakket rotte leverprøver. Gode resultater har blitt oppnådd av flere laboratorier ved hjelp av en rekke vevstyper som har blitt hakket og lagret frosset; på samme måte har blitsfrosne epitelceller skrapt fra organer i mage-tarmkanalen blitt brukt med hell i kometanalysen7,,12,,13,14. Frosset hakket/skrapt vev ser ut til å være relativt stabilt i minst flere måneder. Metoden benytter homogenisering av flash frosne kuber av leveren ved hjelp av en vev senkenhet opprinnelig beskrevet av Jackson et al.6, gir resultater i kometanalysen minst sammenlignbare og vanligvis bedre (dvs. lavere baseline nivåer av DNA skade) enn de som er oppnådd for frosne hakket lever. Denne metoden gjelder også for andre vevstyper6; i vår erfaring har gode resultater på samme måte blitt oppnådd ved hjelp av frossen cubed duodenum (data ikke vist) og hjernevev (Figur 5). Siktenheten kan imidlertid ikke være egnet for homogenisering av alle vevstyper. I en pilotstudie fant vi at muskelhjertevev ikke lett kunne tvinges gjennom silenheten, noe som resulterte i dårlig cellegjenoppretting; i stedet, hakke vevet umiddelbart etter tining gitt celle suspensjoner med baseline % hale DNA verdier sammenlignbare med de hakket før flash frysing (data ikke vist). Spesielt når det håndteres riktig under necropsy (dvs. holdt kaldt og fuktig; blits frosset som individuelle stykker og ikke tillatt å delvis tine), flash frosset cubed vev har gitt svært lav baseline DNA skade selv etter ca to år med fryser lagring (Figur 4).

Bruk av enten frosne cellesuspensjoner eller cubed vev i kometanalysen gir flere fordeler over friskt vev, inkludert: 1) tilrettelegging av samtidig innsamling av flere vevstyper for kometanalyse; 2) tilrettelegging av vevsamling ved et laboratorium i livet og overføring av prøver til et annet laboratorium for analyse; 3) bekvemmelighet å utsette en beslutning om å analysere et gitt vev i flere måneder. Selv om homogenisering av frosset vev på tidspunktet for lysbildeforberedelse er mer tungvint enn å hakke friskt vev på tidspunktet for innhøstingen, gir bruk av frosset cubed vev flere ekstra fordeler som inkluderer: 1) ingen krav til personell trent i kometanalysen (f.eks. mobilenhet) eller spesialiserte forsyninger / reagenser ved necropsy; 2) mindre mulighet for tekniske feil (f.eks. prøveoppvarming; utilstrekkelig frigjøring av celler; sub-optimal vevsprøvestørrelse) under necropsy; 3) minimal mulighet til å innføre mekanisk DNA-skade under prøvebehandling (f.eks. hakking skjær); og 4) lav DNA-skade ved baseline, selv etter langvarig lagring.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Dette arbeidet ble støttet av Intramural Research Program av NIH, National Institute of Environmental Health Sciences (NIEHS) under kontrakt HHSN273201300009C; Men uttalelsene, meningene eller konklusjonene som finnes deri, representerer ikke nødvendigvis uttalelsene, meningene eller konklusjonene til NIEHS, NIH eller USAs regjering.

Acknowledgments

Forfatterne står i gjeld til Lincoln Martin og Kelley Owens for ekspert teknisk assistanse forbereder og scoring komet lysbilder og Dr. Carol Swartz for å utføre statistiske analyser. Forfatterne anerkjenner også støttende bidrag fra medlemmer av gentoksikologi, undersøkende toksikologi og necropsy programmer ved ILS.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cryovials Corning Costar 430488
Dental Wax Sheets Electron Microscopy Sciences 72670
Dissecting (Mincing) Micro Scissors Fisher Scientific 08-953-1B
DMSO Sigma-Aldrich D8418
Hank's Balanced Salt Solution Gibco 14175-079
KCl Teknova P0315-10
KH2PO4 Sigma-Aldrich P9791
Low Melting Point Agarose Lonza 50081
Microfuge Tubes (1.7 mL) Corning 3207
Na2EDTA Sigma-Aldrich E5134
Na2HPO4 Sigma-Aldrich S7907
NaCl Sigma-Aldrich S6191
Neutral Buffered Formalin Leica 600
Scalpel Blades Miltex 4-110
Syringe Plunger (1 mL) Fisher Scientific or Vitality Medical 14-826-88; 8881901014 Becton Dickinson or Monoject tuberculin syringe
Tissue Mincing Device NorGenoTech (Oslo, Norway) None Small variability in diameter observed which can affect snuggness of plunger.
Tweezers, plastic Trade Winds Direct DF8088N Reinforced nylon, nonsterile, blunt tip, autoclavable; tradewindsdirect.com
Weigh Boats Krackler Scientific/Heathrow Scientific 6290-14251B

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. van der Leede, B. J., et al. Performance and data interpretation of the in vivo comet assay in pharmaceutical industry: EFPIA survey results. Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 775-776, 81-88 (2014).
  2. ICH. International Conference on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use (ICH) S2(R1): Guidance on Genotoxicity Testing and Data Interpretation for Pharmaceuticals Intended for Human Use. ICH. (2012).
  3. EFSA. Scientific opinion on genotoxicity testing strategies applicable to food and feed safety assessment. EFSA Journal. 9, (9), 2379 (2011).
  4. Lorenzo, Y., Costa, S., Collins, A. R., Azqueta, A. The comet assay, DNA damage, DNA repair and cytotoxicity: hedgehogs are not always dead. Mutagenesis. 28, (4), 427-432 (2013).
  5. Guerard, M., Marchand, C., Plappert-Helbig, U. Influence of experimental conditions on data variability in the liver comet assay. Environmental and Molecular Mutagenesis. 55, (2), 114-121 (2014).
  6. Jackson, P., et al. Validation of freezing tissues and cells for analysis of DNA strand break levels by comet assay. Mutagenesis. 28, (6), 699-707 (2013).
  7. Recio, L., Kissling, G. E., Hobbs, C. A., Witt, K. L. Comparison of Comet assay dose-response for ethyl methanesulfonate using freshly prepared versus cryopreserved tissues. Environmental and Molecular Mutagenesis. 53, (2), 101-113 (2012).
  8. Uno, Y., et al. JaCVAM-organized international validation study of the in vivo rodent alkaline comet assay for detection of genotoxic carcinogens: II. Summary of definitive validation study results. Mutation Research/Genetetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 786-788, 45-76 (2015).
  9. OECD. OECD Guideline for the Testing of Chemicals: In Vivo Mammalian Alkaline Comet Assay. OECD. 489, (2016).
  10. Hobbs, C. A., et al. Comet assay evaluation of six chemicals of known genotoxic potential in rats. Mutation Research/Genetetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 786-788, 172-181 (2015).
  11. Ding, W., Bishop, M. E., Lyn-Cook, L. E., Davis, K. J., Manjanatha, M. G. In Vivo Alkaline Comet Assay and Enzyme-modified Alkaline Comet Assay for Measuring DNA Strand Breaks and Oxidative DNA Damage in Rat Liver. Journal of Visualized Experiments. (111), 53833 (2016).
  12. Hobbs, C. A., Chhabra, R. S., Recio, L., Streicker, M., Witt, K. L. Genotoxicity of styrene-acrylonitrile trimer in brain, liver, and blood cells of weanling F344 rats. Environmental and Molecular Mutagenesis. 53, (3), 227-238 (2012).
  13. Hobbs, C. A., et al. Comprehensive evaluation of the flavonol anti-oxidants, alpha-glycosyl isoquercitrin and isoquercitrin, for genotoxic potential. Food and Chemical Toxicology. 113, 218-227 (2018).
  14. Pant, K., et al. Vehicle and positive control values from the in vivo rodent comet assay and biomonitoring studies using human lymphocytes: historical database and influence of technical aspects. Environmental and Molecular Mutagenesis. 55, (8), 633-642 (2014).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics