Karakterisering av In Vitro differensiering av humane primære keratinocytter ved RNA-Seq Analyse

I denne protokollen beskriver vi en prosedyre som inneholder to deler. Først en monolayer 2D keratinocytt differensiering metode in vitro ved kontakthemming. For det andre, dens molekylære karakterisering av RNA-seq.

2D in vitro differensieringsmetoden er enkel og enkel å utføre. Den kan brukes til å studere epidermal differensiering, spesielt når et stort antall celler er nødvendige. For eksempel, i epigenomisk analyse.

Den detaljerte RNA-seq analyserørledningen er klar og gjennomsiktig for forskere med grunnleggende bioinformatikk ferdigheter, og den kan brukes til enhver bulk RNA-seq analyse. Når du utfører differensieringsprotokollen for aller første gang, må du huske på at såetettheten kan være vanskelig. Prøv ut flere seeding tettheter for å finne ut hvilken som fungerer best med cellelinjen.

Begynn med å forberede keratinocytt vekst medium eller KGM og 500 milliliter hver av spredning medium og differensiering medium i henhold til manuskript retninger. Frø primære keratinocytter med en tetthet på 5 til 20, 000 celler per centimeter kvadrert og legge nok spredning medium for å dekke cellene. To dager etter såing oppdaterer du cellene med spredningsmediet.

Sjekk cellene regelmessig under mikroskopet og oppdater medium annenhver dag. Når cellene når 90% samløpet, indusere differensiering ved å endre mediet til differensieringsmediet. Hvis du vil samle celler for ytterligere RNA-analyser, vasker du cellene to ganger med DPBS og legger deretter til lysisbuffer.

Samle celler på differensieringsdager null, to, fire og syv. Etter RNA-isolasjon vil dobbelttrådet cDNA bli konvertert og RNA-seq biblioteker vil bli forberedt for neste generasjons sekvensering. Etter sekvenseringen vil sekvensen leses lastes ned og tilordnes til det menneskelige genomet.

Etter at du har lastet ned og installert R-pakker, genererer du kontotabellen fra readspergene.out. tabulatorfiler og skrive en eksempeldatafil som inneholder alle filnavn, differensieringsdagen og andre relevante eksempeldata. Se tilleggskodingsfilene for eksempel.

Bruk deretter telletabellen og eksempeldataene til å generere et deseq2-objekt som inneholder både countable- og eksempeldataene. For normalisering av genuttrykk normaliserer du telletabellen i deseq2-objektet ved hjelp av enten deseq2RLD eller VST-normalisering. Mens RLD normalisering foretrekkes, er VST normalisering mye raskere.

Bruk dist-funksjonen i R til å tegne inn utvalgsavstanden basert på de normaliserte lesetallintensitetene, og utfør deretter hclust-klynger basert på prøveavstand. Deretter plotter du varmekartet ved hjelp av pheatmap-funksjonen. Til slutt genererer du en prinsippkomponentanalyse eller PCA-plott av de normaliserte lesetallintensitetene ved hjelp av plotPCA-funksjonen til deseq2.

PCA fungerer som et verktøy i utforskende dataanalyse og kan brukes til å visualisere avstand og tilkobling mellom ulike prøver. Utfør svært variabel genuttrykksanalyse med rowVars-funksjonen som trekker ut de 500 mest variable genene ved å bestille på variansen mellom prøver fra forskjellige tidspunkter. Disse genene har det høyeste standardavviket av normalisert intensitet over dager med differensiering.

Utfør k-means-klynger på de svært variable genene for å gruppere dem etter ulike uttrykksmønstre. Visualiser genene i et varmekart med pheatmap-pakken. Intensiteten som er plottet i varmekartet er deseq2 normalisert intensitet med medianverdien trukket fra.

Generer en liste over uttrykte bakgrunnsgener som inkluderer alle gener med mer enn 10 tellinger i en enkelt prøve og lag en liste med gener fra hver klynge. Til slutt utfører du Gene Ontology-analyse ved hjelp av GOrilla. Bruk bakgrunnsgenlisten som bakgrunnssett og listen over de svært variable genene i klynger som målsett, og klikk deretter på søkberikede GO-termer.

Alternativt kan mer avanserte R-brukere bruke pakken clusterProfiler til å automatisere GO term enrichment analyse. Keratinocyte linjer avledet fra fem personer ble brukt til differensiering i RNA-seq analyser. Hovedkomponentanalyse viste at keratinocytter som gjennomgikk differensiering hadde koblet sammen, men tydelige generelle genuttrykksprofiler.

Svært variable gener ble gruppert for å visualisere genuttrykksdynamikk og mønstre under differensiering. Hver klynge av gener var representert ved keratinocytt differensiering kjennetegn gener og Gene Ontology merknad viste en klar forskjell i genfunksjoner. I det andre eksperimentet ble cellemorfologi og genuttrykksforskjeller sammenlignet mellom keratinocytter fra sunne kontroller og cellelinjer avledet fra pasienter som bærer P63 mutasjoner.

Hovedkomponentanalyse viste at kontrollcellelinjene tydelig fulgte et differensieringsmønster, men genuttrykksmønsteret til muterte celler under differensiering forblir i stor grad lik det for prolifererende eller udifferensierte celler. I klyngeanalysen ble gener i klynge en nedregulert i kontrollceller og delvis nedregulert i pasientceller som fraktet R204W- og R279H-mutasjoner, men forble høye i celler som bærer R304W. Disse genene spiller sannsynligvis roller i cellespredning som vist ved Gene Ontology analyse.

Klynge to gener ble først introdusert og deretter nedregulert i kontrollceller. Disse genene er sannsynligvis involvert i keratinocytt differensiering som epidermal differensiering og keratiniseringsfunksjoner ble svært beriket for denne klyngen. Gener i klynge tre ble bare indusert på slutten av differensiering i kontrollceller som indikerer at de kan spille en rolle i det ytterste laget av epidermis.

Når du analyserer RNA-seq-data, er det viktig å vite på forhånd hva du kan forvente. Dette vil hjelpe deg både med å tolke kvalitetskontroll og PCA-plottet og i vurderingen av om resultatene gir mening. Våre metoder kan brukes til å studere gentranskripsjon både i epidermal biologi så vel som i andre biologiske systemer.