Modelo Calvarial de Aumento Óseo en Conejo para Evaluación del Crecimiento Óseo y Neovascularización en Materiales de Sustitución Ósea

Bioengineering

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Summary

Aquí presentamos un protocolo quirúrgico en conejos con el objetivo de evaluar materiales de sustitución ósea en términos de capacidades de regeneración ósea. Mediante el uso de cilindros PEEK fijados en cráneos de conejo, osteoconducción, osteoinducción, osteogénesis y vasculogénesis inducidas por los materiales pueden evaluarse ya sea en animales vivos o eutanasiados.

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Marger, L., Barone, A., Martinelli-Kläy, C. P., Schaub, L., Strasding, M., Mekki, M., Sailer, I., Scherrer, S. S., Durual, S. Calvarial Model of Bone Augmentation in Rabbit for Assessment of Bone Growth and Neovascularization in Bone Substitution Materials. J. Vis. Exp. (150), e59976, doi:10.3791/59976 (2019).

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Abstract

El principio básico del modelo calvarial de conejo es cultivar nuevo tejido óseo verticalmente en la parte superior de la parte cortical del cráneo. Este modelo permite la evaluación de materiales de sustitución ósea para la regeneración ósea oral y craneofacial en términos de crecimiento óseo y apoyo de neovascularización. Una vez que los animales son anestesiados y ventilados (intubación endotraqueal), cuatro cilindros de cetona de éter de poliéter (PEEK) se atornillan sobre el cráneo, a ambos lados de la mediana y coronal suturas. Se perforan cinco agujeros intramedulares dentro del área ósea delimitada por cada cilindro, lo que permite la afluencia de células de médula ósea. Las muestras de material se colocan en los cilindros que luego se cierran. Finalmente, se sutura el sitio quirúrgico, y los animales se despiertan. El crecimiento óseo puede evaluarse en animales vivos mediante microtomografía. Una vez que los animales son eutanasiados, el crecimiento óseo y la neovascularización pueden evaluarse mediante microtomografía, inmunohistología e inmunofluorescencia. Como la evaluación de un material requiere la máxima estandarización y calibración, el modelo calvarial parece ideal. El acceso es muy fácil, la calibración y la estandarización se facilitan mediante el uso de cilindros definidos y se pueden evaluar cuatro muestras simultáneamente. Además, se puede utilizar una tomografía viva y, en última instancia, se puede prever una gran disminución de animales a eutanasiar.

Introduction

El modelo calvarial de aumento óseo fue desarrollado en los años 90 con el objetivo de optimizar el concepto de regeneración ósea guiada (GBR) en el dominio quirúrgico oral y craneofacial. El principio básico de este modelo es cultivar nuevo tejido óseo verticalmente en la parte superior de la parte cortical del cráneo. Para ello, un reactor (por ejemplo, titanio -dome, -cilindro o -jaula) se fija en el cráneo para proteger la regeneración ósea llevada a cabo por un injerto (por ejemplo, hidrogel, sustituto óseo, etc.). Con la ayuda de este modelo, jaulas de titanio o cerámica1,2,3,4,5,6, membranas GBR7,8,9 ,10, factores osteogénicos11,12,13,14,15,16,17, hueso nuevo suplentes12,16,17,18,19,20,21,22,23 , 24 , 25 , 26 , 27 , 28 , 29 o el mecanismo de neovascularización durante el proceso de regeneración ósea30 se evaluaron.

Desde un punto de vista traslacional, el modelo calvarial representa un defecto de una pared que se puede comparar con un defecto de clase IV en la mandíbula31. El objetivo es cultivar hueso nuevo por encima de una zona cortical, sin ningún apoyo lateral de las paredes óseas endógenas. Por lo tanto, el modelo es extremadamente estricto y evalúa el potencial real de la osteoconducción vertical sobre la parte cortical del hueso. Si el modelo descrito en el presente documento se dedica principalmente a la evaluación de la osteoconducción en sustitutos óseos, también se puede evaluar la osteogénesis y/o la osteoinducción, así como la vasculogénesis1,2,3, 4,5,6,7,8,9,10,11,12,13 ,14,15,16,17,18,19,20,21,22 ,23,24,25,26,27,28,29,30.

Esencialmente por razones éticas, prácticas y económicas, el modelo calvarial fue desarrollado en el conejo en el que el metabolismo óseo y la estructura son bastante relevantes en comparación conel humano 32. De las 30 referencias citadas anteriormente, el 80% utilizó el conejo calvarial modelo1,2,3,4,5,6,7,8 ,9,10,11,12,13,14,15,17,22, 23,26,27,28,29,30,33, demostrando así la relevancia de este modelo animal. En 2008, el grupo Busenlechner transfirió el modelo calvarial al cerdo, para permitir la comparación de ocho sustitutos óseos simultáneamente20 (en comparación con dos sustitutos óseos con el conejo). Por otro lado, nuestro grupo transfirió el modelo calvarial de conejo a las ovejas. En resumen, las cúpulas de titanio se colocaron en cráneos de oveja para caracterizar la osteoconducción de un nuevo sustituto óseo impreso en 3D. Estos estudios nos permitieron desarrollar y dominar el modelo calvarial y su análisis16,21.

Los tres últimos estudios citaron16,20,21, junto con varias otras investigaciones12,17,18,19,22, 23,24,26,27,28,29, confirmó el gran potencial del modelo calvarial como cribado y caracterización Modelo. Sin embargo, a pesar de que los resultados obtenidos fueron bastante satisfactorios, también señalaron algunas limitaciones: (1) El uso de cúpulas de titanio, que impidieron la difusión de rayos X y a su vez el uso vivo de micro-CT. Estos no pudieron ser eliminados antes del procesamiento histológico, obligando a los investigadores a incrustar las muestras en resina de poli(metilmetacrilato) (PMMA). Por lo tanto, los análisis resultantes se limitaron en gran medida a la topografía. (2) Altos costos financieros, especialmente debido al costo de los animales, y los costos relacionados con la logística, el mantenimiento y la cirugía de los animales. (3) Dificultades para obtener aprobaciones éticas para animales grandes.

26 mejoró en gran medida el modelo del conejo. Las cúpulas de titanio fueron reemplazadas por cilindros closables que podían llenarse con un volumen constante de material. Cuatro de estos cilindros fueron colocados en cráneos de conejo. Al finalizar, los cilindros podían retirarse para que las biopsias estuvieran libres de metales, introduciendo mucha más flexibilidad en cuanto al procesamiento de muestras. El modelo calvarial de conejo se volvió atractivo para pruebas simultáneas con menores costos, fácil manejo de animales y facilitación del procesamiento de muestras. Aprovechando estos desarrollos recientes, hemos mejorado aún más el modelo reemplazando el titanio por PEEK para producir cilindros, permitiendo así la difusión de rayos X y el uso de microtomografía en animales vivos.

En este artículo, describiremos los procesos de anestesia y cirugía y mostraremos ejemplos de salidas que se pueden obtener utilizando este protocolo, es decir, histología (inmuno), histomorfometría, microtomografía en vivo y ex vivo para evaluar los mecanismos del hueso regeneración y cuantificar la nueva síntesis ósea apoyada por materiales sustitutivos óseos.

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Protocol

De conformidad con los requisitos legales suizos, el protocolo fue aprobado por un comité académico y supervisado por las agencias veterinarias cantonales y federales (autorizaciones no GE/165/16 y GE/100/18).

1. Dispositivos y animales específicos

  1. Cilindros
    1. Cilindros de máquina con pestañas estabilizadoras laterales de PEEK para tener un diámetro interior de 5 mm, diámetro exterior de 8 mm y una altura de 5 mm (Figura1).
    2. Tapas PEEK de la máquina con un diseño que permite sujetar con precisión en la parte superior del cilindro (espesor 1 mm).
    3. Esterilice los cilindros y tapas PEEK autoclaveantes antes de la cirugía.
  2. Tornillos
    1. Utilice microtornillos autoperforantes (hechos de titanio puro comercial (grado 5)) para fijar los cilindros (1,2 mm de diámetro, 4 mm de longitud). Esterilice autoclave antes de la cirugía.
  3. Animales
    1. Compra conejos blancos de Tres meses de edad de Nueva Zelanda (hombres o mujeres), con un peso de 2,5 kg cada uno.
      NOTA: Obtenemos conejos criando en la Universidad de Ginebra.

2. Cirugía

  1. Bandeja quirúrgica
    1. Mantenga los bisturíes, tijeras, dos fórceps, el elevador periosteal, jeringas (1, 2, 5, 50 ml), motor quirúrgico, fresas quirúrgicas redondas (0,8 mm de diámetro), agujas, solución salina estéril, cuatro cilindros, ocho tornillos y destornillador listo.
  2. Tratamiento preclínico
    1. Aclimatar a los animales una semana antes de la cirugía.
    2. Proporcionar un antibiótico profiláctico diariamente (5-10 mg/kg por vía oral (PO)) a partir de 2 h antes de la cirugía hasta 3 días después de la cirugía.
  3. Anestesia e intubación
    1. Sedar a los animales mediante inyección intramuscular (IM) de ketamina (25 mg/kg, 50 mg/ml, 0,5 ml/kg) + xilazina (3 mg/kg, 20 mg/ml, 0,15 ml/kg). Espere 20 minutos para que los animales duerman
      profundamente (atonía muscular completa).
      NOTA: Esta premedicación permitirá un proceso de intubación simple, rápido e indoloro. La analgesia profunda y la anestesia se inducen como se describe en el paso 2.3.8.
    2. Coloque una cánula intravenosa (IV) en la vena marginal del oído y manténgala cerrada hasta que se complete la intubación.
      NOTA: Esta línea IV servirá para perfumar fentanilo y propofol para la analgesia profunda y la anestesia, respectivamente (ver paso 2.3.8).
    3. Mantener la anestesia suministrando 5% de sevoflurano en oxígeno puro hasta que se realice la intubación.
      NOTA: Este paso es necesario sólo si el animal muestra signos de despertar (movimientos oculares, contracciones musculares).
    4. Anestetiza la tráquea localmente pulverizando 10% lidocaína. Coloque el conejo en posición propensa y mantenga su cabeza en extensión vertical.
    5. Deslice el primer tubo endotraqueal de pequeño diámetro (2,5 mm) en la tráquea del conejo hasta que se pueda oír el flujo de aire en el tubo. Esto abrirá la laringe y facilitará la inserción del tubo definitivo.
    6. Inserte una guía (catéter de intubación) en el tubo para fijar la posición del tubo en la tráquea. Retire el tubo de diámetro pequeño y deslice el tubo endotraqueal definitivo (4,9 mm) en la guía.
    7. Retire la guía e infle el globo al final del tubo endotraqueal para sellar y bloquear el dispositivo en la tráquea. El tubo permanecerá en su lugar, pero se puede asegurar mediante el uso de un cordón atado alrededor de la frente.  Ventilar inmediatamente (7 ml/kg, frecuencia de 40/min) al animal con 3% de sevoflurano en oxígeno puro.
    8. Perfumar continuamente (vena del oído) fentanilo (0,01 mg/ml, 2-4 ml/h) para inducir analgesia, 2-4 mg/kg de (2%) propofol (20 mg/ml, 4-8 mL/h) para inducir anestesia, y 4 ml/kg/h de acetato de Ringer para mantener afecciones isovolumétricas.
    9. Coloque una sonda de temperatura rectal. También monitorear la función cardíaca, la temperatura y la saturación de oxígeno durante todo el proceso.
    10. Controlar la profundidad de la anestesia mediante el control de la respiración autónoma; si el animal muestra signos de respiración autónoma, dispensar un pequeño bolo de propofol y fentanilo.
  4. Preparación del sitio
    1. Coloque el conejo sobre una almohadilla calentada (39 oC) cubierta por una almohadilla de colchón (para evitar quemaduras) en la mesa de cirugía. Afeitar el cuero cabelludo.
    2. Aplicar un gel lubricante sobre los ojos para evitar la irritación y la sequedad. Desinfectar el sitio frotando la piel con yodo povidona (10%). A continuación, cubrir el conejo con una cortina quirúrgica estéril y cortar un área de acceso para el cráneo.
    3. Desinfectar el sitio quirúrgico con yodo povidona (10%) por segunda vez. Aplicar un gel lubricante sobre los ojos para evitar la irritación y la sequedad.
    4. Prepare una mesa cubierta (cortina estéril) en la que colocar la bandeja quirúrgica completa.
  5. Apertura del sitio quirúrgico
    1. Anestetiza localmente con una inyección subcutánea (SC) de lidocaína 2% (1 ml) en el cráneo.
    2. Incise a través de la piel (con un bisturí) a lo largo de la línea sagital calvarial, desde las órbitas hasta la protuberancia occipital externa (4 cm de longitud). Asegúrese de que el periosteum esté inciso.
    3. Elevar suavemente el periiosteum (con un elevador periosteal) a ambos lados de la incisión. Enjuague el sitio con solución salina estéril.
  6. Colocación del cilindro
    1. Localice las suturas medianas y coronales en el cráneo (Figura2A,B). Tenga en cuenta que estas líneas anatómicas forman una cruz. Los cilindros se colocarán en cada uno de los cuadrantes definidos por la cruz, asegurando que el borde del cilindro no esté sobre la sutura (Figura2C).
    2. Coloque el primer cilindro en el cuadrante superior izquierdo (hueso frontal izquierdo) e intente colocar el dispositivo plano. Fijar en la posición con fuerte presión de la mano y atornillar un micro-tornillo, hasta que se sienta la resistencia. Asegúrese de que el cabezal del tornillo esté al ras con la superficie de la pestaña del cilindro.
    3. Repita el mismo procedimiento en la otra pestaña para fijar el cilindro firmemente en el cráneo. Asegúrese de que el cilindro esté fijado herméticamente al hueso.
    4. Repita el procedimiento en el cuarto superior derecho (hueso frontal derecho), el cuarto inferior izquierdo (hueso parietal izquierdo) y el cuarto inferior derecho (hueso parietal derecho).
  7. Perforación ósea de 5 agujeros intramedulares dentro del área circunscrita por los cilindros (Figura 1)
    1. Taladre un agujero intramedular bajo riego salino (0,8 mm de diámetro, 1 mm de profundidad) con una fresa redonda en el hueso, en el centro del área circunscrita por el cilindro. Asegúrese de que aparezca sangrado.
    2. Taladre dos agujeros intramedulares más a lo largo del eje pasando a través de los dos tornillos de pestaña, en los bordes internos del cilindro. A lo largo del hacha perpendicular, taladre dos agujeros intramedulares más en los bordes internos del cilindro. Asegúrese de que aparezca sangrado.
    3. Repita la operación dentro de los otros tres cilindros.
  8. Cilindros de llenado con muestras de material y tapón (Figura 3)
    1. Prepare el material sustitutivo óseo deseado de acuerdo con las instrucciones del fabricante o las especificaciones del material.
    2. Llene el primer cilindro hasta el borde con la muestra de material y cierre el cilindro ajustando la tapa. Repita el proceso en los otros 3 cilindros.
  9. Cierre del sitio quirúrgico
    1. Cierre la piel por encima de los cilindros con una sutura intermitente no resorbable.
    2. Aplique un apósito pulverizable sobre la herida.

3. Tratamiento postquirúrgico

  1. Detener el suministro de analgesia y anestesia (propofol y fentanilo detención de perfusión) y comprobar la recuperación de la respiración autónoma.
  2. Detenga la ventilación una vez que el animal haya recuperado la respiración autónoma. Mantenga al animal bajo oxígeno puro antes de despertar completo.
  3. Inyectar clorhidrato de buprenorfina SC (0,02 mg/kg, 0,03 mg/ml, 0,67 ml/kg) y repetir la inyección cada 6 h durante 3 días como analgesia postquirúrgica.
  4. Transfiera al animal a su alojamiento habitual con agua y alimentación completa.
  5. Retire las suturas después de unos 10 días de cicatrización de heridas.

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Representative Results

El modelo descrito en este documento está dedicado a la evaluación de la osteoconducción en sustitutos óseos. También se puede evaluar la osteogénesis y la osteoinducción de los sustitutos óseos (pre-)celularizados o cargados con moléculas bioactivas, así como la vasculogénesis1,2,3,4, 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27 , 28 , 29 , 30. Se puede utilizar un estudio cinético, desde 3 días hasta 3 meses después de la cirugía dependiendo de los mecanismos y salidas a analizar. Una línea de tiempo clásica que permite descripciones en la madrugada y media es: 2, 4, 6, 8 y 12 semanas. Tenga en cuenta que un mínimo de 6 muestras por punto de tiempo es obligatorio para obtener resultados significativos. Cada muestra a ser probada debe colocarse al menos una vez en cada posición en el cráneo por punto de tiempo (asignación aleatoria). Por último, las muestras falsas (por ejemplo, cilindros llenos de sangre coagulada) deben incluirse en el protocolo34.

Una vez completada la cirugía, el crecimiento óseo puede ser monitoreado en diferentes momentos mediante el uso de tomografía ósea en animales vivos. Un ejemplo se muestra en la Figura 4A,B. Un análisis adicional requiere que los animales sean sacrificados (inyección intravenosa letal de 150 mg/kg de pentobarbital (100 mg/ml). Después de la eutanasia, las muestras se seccionan y los cilindros se retiran cuidadosamente (Figura5). Las biopsias se fijan con una solución de solución salina tamponada con fosfato y un 4% de formaldehuro. El crecimiento óseo puede evaluarse mediante microtomografía (Figura4 C,D). Las muestras también se pueden procesar para la tinción histológica (inmune). El análisis histomorfométrico y las tinciones específicas son posibles para completar el análisis más específicamente (Figura6).

Figure 1
Figura 1: Especificaciones de los cilindros PEEK. Se perforaron dos orificios (0,8 mm de diámetro) en las pestañas estabilizadoras laterales para atornillar. Las posiciones de los 5 agujeros intramedulares (0,8 mm de diámetro) que se perforarán en el cráneo dentro del área delimitada por el cilindro se marcan con círculos rojos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Imagen representativa del cráneo del conejo y colocación de los cilindros. Imágenes que muestran la mediana y coronal suturas en el cráneo del conejo descongranando los huesos parietales y frontales izquierdo-derecho (A,B). Colocación de los cilindros a ambos lados de las suturas (C). Barras de escala de 5 mm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Imagen representativa de los cilindros fijos, llenados y tapados. Imagen que muestra cuatro cilindros fijados en el cráneo de un conejo con tornillos de titanio. Dentro del área delimitada por cada cilindro, se perforaron 5 orificios intramedulares (0,8 mm de diámetro, 1 mm de profundidad) bajo riego con una fresa redonda para permitir la migración de células óseas. Los cilindros se llenaron con diferentes muestras sustitutivas óseas (volúmenes calibrados) antes del taponamiento (solo se muestra un cilindro cerrado). Barra de escala de 5 mm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Imágenes representativas del análisis microtomográfico (micro-CT). Con el objetivo final de evaluar el crecimiento óseo realizado por sustitutos óseos, 4 cilindros se fijaron en un cráneo de conejo con tornillos de titanio y se llenaron con materiales sustitutivos de hueso. (A) Imágenes en vivo: escaneo transversal bidimensional (14 min, 99 kV/88 a a con una resolución de 20 m) de un cilindro a las 12 semanas. (B) reconstrucción tridimensional (3D) a partir del análisis micro-CT vivo a las 4 semanas (círculos rojos: sustitutos óseos en cilindros; flecha roja: control en el que el cilindro está lleno de sangre coagulada). (C,D) Después de la eutanasia (12 semanas), los cilindros se retiraron antes de la fijación y el análisis de micro-CT. (C) Escaneo transversal 2D (57 min, 99 kV/88 áA con una resolución de 10 m) de un cilindro y reconstrucción 3D del hueso nuevo total en el cilindro (D). Se muestran partículas sustitutivas óseas (rojas), hueso nuevo (verde) y lecho óseo (amarillo). Barras de escala de 2 mm Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: Imágenes representativas de una biopsia a las 4 semanas. Después de la eutanasia (4 semanas), las muestras fueron seccionadas por bloques y los cilindros fueron retirados antes de la fijación en 4% de formalina, análisis de micro-CT y procesamiento histológico. Barra de escala de 5 mm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 6
Figura 6: Imágenes representativas de las secciones (inmunes) histológicas. Con el objetivo final de evaluar el crecimiento óseo y la neovascularización llevada a cabo por sustitutos óseos, 4 cilindros se fijaron en un cráneo de conejo con tornillos de titanio y se llenaron con sustitutos óseos. Después de la eutanasia (12 semanas), los cilindros se retiraron antes de la fijación y el procesamiento histológico. (A) Tinción Masson-Goldner (50x): sustituto óseo aparece como partículas malva rodeadas de hueso nuevo en verde. (B) Las rodajas fueron escaneadas y procesadas para la extracción digital de material sustitutivo óseo para que el nuevo hueso (rojo) pudiera cuantificarse fácilmente. (C) Inmunomanchación de CD31 (flechas), un marcador típico de células endoteliales y el proceso de neovascularización. (D) Tinción inmunofluorescente (verde) de una zona altamente neovascularizada en la que algunos capilares nuevos expresan altamente CD31 (flecha). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

El modelo descrito en este documento es simple y debe desarrollarse con bastante facilidad siempre y cuando se sigan todos los pasos y el equipo sea adecuado. Como el protocolo descrito es un método quirúrgico, todos los pasos parecen críticos y deben seguirse correctamente. Es fundamental ser entrenado para experimentos con animales, especialmente en el manejo de conejos y la anestesia. No dude en pedir ayuda anestesista y veterinaria profesional. Es fundamental insistir en el monitoreo visual diario de los animales antes y después de la eliminación de la sutura. Incluso si la piel del cráneo es gruesa, abundante y suelta, la fijación de los cilindros induce grandes tensiones. Si las suturas se retiran demasiado pronto, la herida podría reabrirse y requerirá una semana más de sutura y un nuevo tratamiento antibiótico. En caso de dehiscencia fuera de la línea de la herida, el cirujano tendrá que considerar si la sutura es posible o no. De lo contrario, tendrá que tenerse en cuenta el rechazo de la muestra.

Además de los pasos críticos descritos en la sección de protocolo, los detalles siguientes pueden ser útiles en la implementación adecuada de este protocolo. Desde un punto de vista técnico, como los conejos utilizados son jóvenes y pequeños, es importante utilizar una intubación de dos pasos, como se describe en el protocolo. El segundo (y final) tubo es demasiado grande para ser utilizado en la primera intubación, y hay un riesgo real de "manera equivocada" que puede ser perjudicial o incluso fatal.
Dependiendo de los materiales analizados, puede ser interesante tomar alguna muestra de sangre fresca de la línea de oído IV que ya está colocada. Esto podría proporcionar un buen método para pre-infundir el material sustituto óseo con células naturales y factores de crecimiento. La sangre recién coagulada también puede proporcionar una muestra de farsa ideal.

La forma en que se perforan los agujeros intramedulares debe ser muy útil para el procesamiento histológico futuro y el análisis histomorfométrico. En efecto, siempre y cuando los agujeros estén (i) en el mismo lugar, (ii) las biopsias están orientadas de manera similar y (iii) el proceso de corte está estandarizado (es decir, el mismo espesor, mismo nivel de corte), los campos que se evalúan son equivalentes y su comparación es muy Pertinente. Como cuestión de estandarización, puede ser de interés real calibrar el volumen-cantidad de material para llenar el cilindro, y prepararlo de antemano, de una manera estéril.

Desde un punto de vista científico, dependiendo de los productos o hipótesis probadas, puede ser importante evitar colocar los cilindros en las suturas óseas. Algunas células madre específicas están presentes en estas estructuras35,diferentes de las células madre óseas mesenquimales que participan en los mecanismos de osificación intramembranosa, es decir, el proceso de regeneración ósea encontrado en el área orofacial. Por lo tanto, puede ocurrir un sesgo real en caso de extravío.

Una de las principales ventajas del modelo calvarial es el uso de microtomografías vivas mediante la cual se puede seguir el crecimiento óseo en un solo animal como estudio longitudinal. Esta estrategia puede reducir en gran medida el número de animales eutanasiados y, por lo tanto, respetar la "regla 3R"36. Dependiendo del dispositivo microtomográfico utilizado (resolución, espacio disponible para el animal), se producirán variaciones en términos de estrategia de anestesia (IV, gas, etc.), así como en la resolución de la imagen y la relevancia del análisis resultante.
Utilizamos habitualmente un microtomografo dedicado a experimentos con animales (por ejemplo, Quantum GX) para controles de rutina. Un experimento típico comienza con una sedación, como se describe en el paso 2.3.1. La anestesia se mantiene entonces con 2% de isoflurano en oxígeno puro. Esto permite que el animal respire tranquilamente durante un tiempo de escaneo de unos 14 min (99 kV/88 a con una resolución de 20 m); esto es suficiente para comprobar los parámetros básicos (injerto, fijación del cilindro, análisis semicuantitativo del crecimiento óseo, etc.). Cuando se busca un análisis cualitativo y cuantitativo preciso, se necesitará una afinación muy fina del tiempo de escaneo, resolución, anestesia y posicionamiento animal.

Los modelos existentes desarrollados para la evaluación de la osteoconducción, osteogénesis, osteoinducción, así como vasculogénesis, son numerosos, especialmente en el campo orofacial. Debido a consideraciones éticas y económicas, nuestro propósito se limitará a los animales de conejo o más pequeños. Aparte del cráneo, los lugares en los que se puede probar el material son la mandibulla37,38,39,40,41,42,43, 44,45,46,47, el diastema48 o las cavidades incisivas (después de la extracción de los dientes)49,50,51. Se pueden utilizar ratas, ratones, conejillos de indias y conejos para cada uno de los modelos descritos a continuación. Brevemente, se perfora un defecto crítico (o un zócalo es creado por extracción incisiva), lleno con la muestra de material y luego cubierto por una membrana. Aparte del hecho obvio de que sólo dos muestras se pueden probar en cada uno de estos lugares (una muestra por lado de la mandíbula o por zócalo incisivo), los procedimientos quirúrgicos también son en gran medida más difíciles e invasivos. Los accesos al sitio son limitados y si uno está usando ratas o ratones, la dificultad aumenta aún más por el tamaño de los animales. Por último, el tamaño crítico de los defectos (es decir, dimensiones que no permiten una regeneración ósea espontánea) no está bien definido y varía de un animal a otro.
Además de estas generalidades, pueden surgir restricciones específicas dependiendo de la ubicación anatómica sometida al defecto y al análisis posterior. Como ejemplo, en el modelo mandibular, las raíces dentales están presentes dentro del defecto. Esto puede interferir con el material y modificar el proceso de regeneración ósea. El defecto podría colocarse más dismenadamente en el ramo, pero en ese caso, el hueso sería muy delgado (dos corticales colocados con un espacio medular extremadamente delgado) y el volumen de defecto resultante puede ser demasiado pequeño45,46, 47. Habida cuenta de estos ejemplos de limitaciones y en función del modelo, pueden preverse grandes desviaciones en términos de volumen de material a probar, calidad y cantidad de los datos recopilados.

Como la evaluación de un material requiere un máximo de estandarización y calibración, el modelo calvarial parece ideal. El acceso es muy fácil, la calibración y la estandarización se facilitan mediante el uso de cilindros definidos y 4 muestras pueden evaluarse simultáneamente. Además, se puede utilizar una tomografía viva y finalmente se puede prever una gran disminución de animales a eutanasiar.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Los autores están en deuda con Geistlich AG (Wolhusen, CH) y la fundación Osteología (Lucerne, CH) (concesión no 18-049) por su apoyo, así como Con El Global D (Brignais, FR) para el suministro de los tornillos. Un agradecimiento particular va a dr. B. Schaefer de Geistlich. También estamos agradecidos a Eliane Dubois y Claire Herrmann por su excelente procesamiento histológico y sus valiosos consejos. Por último, reconocemos calurosamente a Xavier Belin, Sylvie Roulet y a todo el equipo de Pr Walid Habre, "cirugía experimental Dpt", por su notable asistencia técnica.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Drugs
Enrofloxacine Baytril 10% Bayer Antibiotic
Fentanyl Bischel For analgesia
Ketalar 50mg/ml Pfizer Ketamine for anesthesia
Lidohex Bichsel Lubricating gel for the eyes
Opsite Smith and Nephew 66004978 Sprayable dressing
Povidone iodine 10%, Betadine Mundipharma anti-infective agent
Propofol 2% Braun 3538710 For anesthesia
Rapidocain 2% sintetica Local anesthesia
Ringer-acetate Fresenius Kabi Volume compensation
Rompun 2% Bayer Xylazin for anesthesia
Sevoflurane 5% Abbvie For anesthesia
Sterile saline Sintetica
Temgesic Reckitt Benckiser Buprenorphine hydrochloride, analgesia
Thiopental Inresa Ospediala For anesthesia
Xylocaine 10% spray Astra Zeneca For intubation
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Fresenius Vial pilot C Imexmed Infusion pump
Heated pad Harvard Apparatus
Suction dominant 50 Medela
Suction tubing Optimus Promedical 80342.2
Surgical motor Schick dental Qube Drilling of intramedullary holes
Ventilation Maquet Servo1
Name Company Catalog Number Comments
Material
Cylinders and caps Boutyplast Customized composition: PEEK (poly ether ether ketone)
Manual self-retaining shaft GlobalD ACT1K
Mobile handle for self-retaining shaft GlobalD MTM
Self- drilling screws GlobalD VA1.2KL4 cross-drive screws composed by Titanium grade5, ISO 5832-3
Name Company Catalog Number Comments
Surgical tray
Endotracheal tube Shiley diameter 2,5mm Covidien 86233 For intubation
Endotracheal tube Shiley diameter 4,9mm Covidien 107-35G For intubation
Ethicon prolene 4-0 Ehticon 8581H Non-resorbable suture
Forceps Marcel Blanc BD027R 145 mm
Intubation catheter Cook medical Guide for intubation
Needlle holder Marcel Blanc BM008R
Needles BD Microlance3 Becton Dickinson 300300/304622 26G; 18G
Periosteal HU-Friedy P9X
Round surgical burs Patterson 78000 0.8 mm in diameter, Drilling of intramedullary holes
Scalpel Swann-Morton n°10 and n°15
Scissors Marcel Blanc 00657 180 mm
Syringes Omnifix Braun 4616057V 5ml, 10ml and 50ml
Venflon G22 Braun 42690985-01 Vasofix safety for the ear iv line

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