Modèle calvarial de l'augmentation osseuse dans le lapin pour l'évaluation de la croissance osseuse et la néovascularisation dans les matériaux de substitution osseuse

Bioengineering

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Summary

Ici, nous présentons un protocole chirurgical chez les lapins dans le but d'évaluer les matériaux de substitution osseuse en termes de capacités de régénération osseuse. En utilisant des cylindres PEEK fixés sur des crânes de lapin, l'ostéoconduction, l'ostéoinduction, l'ostéogenèse et la vasculogenèse induites par les matériaux peuvent être évalués soit sur des animaux vivants ou euthanasiés.

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Marger, L., Barone, A., Martinelli-Kläy, C. P., Schaub, L., Strasding, M., Mekki, M., Sailer, I., Scherrer, S. S., Durual, S. Calvarial Model of Bone Augmentation in Rabbit for Assessment of Bone Growth and Neovascularization in Bone Substitution Materials. J. Vis. Exp. (150), e59976, doi:10.3791/59976 (2019).

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Abstract

Le principe de base du modèle calvarial de lapin est de cultiver de nouveaux tissus osseux verticalement au-dessus de la partie corticale du crâne. Ce modèle permet l'évaluation des matériaux de substitution d'os pour la régénération orale et craniofacial d'os en termes de croissance d'os et de soutien de neovascularization. Une fois que les animaux sont anesthésiés et ventilés (intubation endotrachéale), quatre cylindres faits de cétone d'éther de polyéther (PEEK) sont vissés sur le crâne, des deux côtés de la médiane et des sutures coronales. Cinq trous intramédullaires sont percés dans la zone osseuse délimitée par chaque cylindre, ce qui permet l'afflux de cellules de moelle osseuse. Les échantillons de matériaux sont placés dans les cylindres qui sont ensuite fermés. Enfin, le site chirurgical est suture, et les animaux sont réveillés. La croissance osseuse peut être évaluée sur des animaux vivants en utilisant la microtomographie. Une fois que les animaux sont euthanasiés, la croissance osseuse et la néovascularisation peuvent être évaluées en utilisant la microtomographie, l'histologie immunitaire et l'immunofluorescence. Comme l'évaluation d'un matériau nécessite une standardisation et un étalonnage maximaux, le modèle calvarial semble idéal. L'accès est très facile, l'étalonnage et la normalisation sont facilités par l'utilisation de cylindres définis et quatre échantillons peuvent être évalués simultanément. En outre, la tomographie vivante peut être utilisée et, en fin de compte, une forte diminution des animaux à euthanasier peut être anticipée.

Introduction

Le modèle calvarial de l'augmentation osseuse a été développé dans les années 90 dans le but d'optimiser le concept de régénération osseuse guidée (GBR) dans le domaine chirurgical oral et craniofacial. Le principe de base de ce modèle est de cultiver de nouveaux tissus osseux verticalement sur le dessus de la partie corticale du crâne. Pour ce faire, un réacteur (p. ex. titane-dôme, -cylindre ou cage) est fixé sur le crâne pour protéger la régénération osseuse effectuée par une greffe (p. ex. hydrogel, substitut osseux, etc.). A l'aide de ce modèle, cages en titane ou céramique1,2,3,4,5,6, GBR membranes7,8,9 ,10, facteurs ostéogéniques11,12,13,14,15,16,17, nouvel os remplaçants12,16,17,18,19,20,21,22,23 , 24 Ans, états-unis , 25 Annonces , 26 Annonces , 27 Annonces , 28 Annonces , 29 ou le mécanisme de la néovascularisation pendant le processus de régénération d'os30 ont été évalués.

D'un point de vue translationnel, le modèle calvarial représente un défaut d'un mur qui peut être comparé à un défaut de classe IV dans la mâchoire31. L'objectif est de cultiver de nouveaux os au-dessus d'une zone corticale, sans aucun soutien latéral des parois osseuses endogènes. Le modèle est donc extrêmement rigoureux et évalue le potentiel réel de l'ostéoconduction verticale sur la partie corticale de l'os. Si le modèle décrit ci-dessus est principalement dédié à l'évaluation de l'ostéoconduction chez les substituts osseux, l'ostéogenèse et/ou l'ostéoinduction peuvent également être évalués, ainsi que la vasculogenèse1,2,3, 4,5,6,7,8,9,10,11,12,13 ,14,15,16,17,18,19,20,21,22 ,23,24,25,26,27,28,29,30.

Essentiellement pour des raisons éthiques, pratiques et économiques, le modèle calvarial a été développé dans le lapin dans lequel le métabolisme osseux et la structure sont tout à fait pertinents par rapport à l'homme32. Sur les 30 références citées ci-dessus, 80% ont utilisé le modèle calvarial lapin1,2,3,4,5,6,7, 8 ,9,10,11,12,13,14,15,17,22, 23,26,27,28,29,30,33, démontrant ainsi la pertinence de ce modèle animal. En 2008, le groupe Busenlechner a transféré le modèle calvarial au porc, pour permettre la comparaison de huit substituts osseux simultanément20 (par rapport à deux substituts osseux avec le lapin). D'autre part, notre groupe a transféré le modèle calvarial de lapin aux moutons. En bref, des dômes de titane ont été placés sur des crânes de mouton pour caractériser l'ostéoconduction d'un nouveau substitut d'os imprimé en 3D. Ces études nous ont permis de développer et de maîtriser le modèle calvarial et son analyse16,21.

Les trois dernières études ont cité16,20,21, ainsi que plusieurs autres enquêtes12,17,18,19,22, 23,24,26,27,28,29, a confirmé le grand potentiel du modèle calvarial comme un dépistage et la caractérisation modèle. Cependant, même si les résultats obtenus étaient assez satisfaisants, ils ont également souligné quelques limites : (1) L'utilisation de dômes de titane, qui empêchaient la diffusion des rayons X et, à leur tour, l'utilisation de micro-CT en direct. Ceux-ci ne pouvaient pas être enlevés avant le traitement histologique, forçant les chercheurs à intégrer les échantillons dans la résine poly (méthyle méthylique) (PMMA). Les analyses qui en ont résulté se sont donc largement limitées à la topographie. (2) Coûts financiers élevés, en particulier en raison du coût des animaux, et les coûts liés à la logistique, l'entretien et la chirurgie des animaux. (3) Difficultés à obtenir des approbations éthiques pour les grands animaux.

Une étude récente de Polo, et coll.26 a largement amélioré le modèle sur le lapin. Les dômes en titane ont été remplacés par des cylindres closables qui pouvaient être remplis d'un volume constant de matériaux. Quatre de ces cylindres ont été placés sur des crânes de lapin. À l'achèvement, les cylindres pouvaient être enlevés de sorte que les biopsies étaient sans métal, introduisant beaucoup plus de flexibilité en ce qui concerne le traitement de l'échantillon. Le modèle calvarial de lapin est devenu attrayant pour l'essai simultané avec des coûts inférieurs, la manipulation facile d'animal et la facilitation du traitement d'échantillon. Profitant de ces développements récents, nous avons encore amélioré le modèle en remplaçant le titane par PEEK pour produire des cylindres, permettant ainsi la diffusion des rayons X et l'utilisation de la microtomographie sur les animaux vivants.

Dans cet article, nous décrivons les processus d'anesthésie et de chirurgie et montrerons des exemples de sorties qui peuvent être obtenues en utilisant ce protocole, c.-à-d., (immuno-) histomorphometry, microtomographie vivante et ex vivo pour évaluer les mécanismes de l'os la régénération et quantifient la nouvelle synthèse d'os soutenue par des matériaux de remplacement d'os.

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Protocol

Conformément aux exigences légales suisses, le protocole a été approuvé par un comité académique et supervisé par les agences vétérinaires cantonales et fédérales (autorisations n'GE/165/16 et GE/100/18).

1. Dispositifs et animaux spécifiques

  1. Cylindres
    1. Cylindres de machine avec onglets stabilisateurs latéraux hors de PEEK pour avoir un diamètre intérieur de 5 mm, un diamètre extérieur de 8 mm et une hauteur de 5 mm (Figure 1).
    2. Casquettes PEEK de machine avec une conception permettant de clip précisément sur le dessus du cylindre (épaisseur 1 mm).
    3. Stériliser les cylindres et les bouchons PEEK en autoclantant avant la chirurgie.
  2. Vis
    1. Utiliser des vis micro-perforantes (faites de titane pur commercial (catégorie 5)) pour fixer les cylindres (1,2 mm de diamètre, 4 mm de longueur). Stériliser en autoclant avant la chirurgie.
  3. Animaux
    1. Achetez des lapins blancs néo-zélandais de trois mois (mâles ou femelles), pesant 2,5 kg chacun.
      REMARQUE : Nous avons obtenu des lapins en nous reproduisant à l'Université de Genève.

2. Chirurgie

  1. Plateau chirurgical
    1. Gardez les scalpels, les ciseaux, deux forceps, l'ascenseur périosteal, les seringues (1, 2, 5, 50 ml), le moteur chirurgical, les burs chirurgicaux ronds (0,8 mm de diamètre), les aiguilles, la saline stérile, quatre cylindres, huit vis et le tournevis.
  2. Traitement préclinique
    1. Acclimater les animaux une semaine avant la chirurgie.
    2. Fournir un antibiotique prophylactique tous les jours (5 à 10 mg/kg par la bouche (PO)) à partir de 2 h avant la chirurgie jusqu'à 3 jours après la chirurgie.
  3. Anesthésie et intubation
    1. Sédatez les animaux par injection intramusculaire (IM) de kétamine (25 mg/kg, 50 mg/mL, 0,5 ml/kg) - xylazin (3 mg/kg, 20 mg/mL, 0,15 ml/kg). Attendez 20 min pour que les animaux dorment
      profondément (atonie musculaire complète).
      REMARQUE : Cette prémédication permettra un processus d'intubation simple, rapide et indolore. L'analgésie profonde et l'anesthésie sont induites comme décrit dans l'étape 2.3.8.
    2. Placez une canule intraveineuse (IV) dans la veine marginale de l'oreille et gardez-la fermée jusqu'à ce que l'intubation soit terminée.
      REMARQUE : Cette ligne IV servira à perséminer le fentanyl et le propofol pour l'analgésie profonde et l'anesthésie, respectivement (voir l'étape 2.3.8).
    3. Maintenir l'anesthésie en fournissant 5% de sevoflurane en oxygène pur jusqu'à ce que l'intubation soit effectuée.
      REMARQUE : Cette étape n'est nécessaire que si l'animal montre des signes d'éveil (mouvements oculaires, contractions musculaires).
    4. Anesthésiez la trachée localement en pulvérisant 10% de lidocaïne. Placez le lapin en position couchée et maintenez sa tête en extension verticale.
    5. Faites glisser le premier tube endotrachéal de petit diamètre (2,5 mm) dans la trachée du lapin jusqu'à ce que le flux d'air puisse être entendu dans le tube. Cela ouvrira le larynx et facilitera l'insertion du tube définitif.
    6. Insérer un guide (cathéter d'intubation) dans le tube pour fixer la position du tube dans la trachée. Retirez le tube de petit diamètre et faites glisser le tube endotrachéal définitif (4,9 mm) sur le guide.
    7. Retirez le guide et gonflez le ballon à l'extrémité du tube endotrachéal pour sceller et bloquer l'appareil dans la trachée. Le tube restera en place, mais il peut être sécurisé en utilisant une dentelle attachée autour du front.  Immédiatement ventiler (7 mL/kg, fréquence de 40/min) l'animal avec 3% de sevoflurane en oxygène pur.
    8. Perfil en continu (veine d'oreille) fentanyl (0,01 mg/mL, 2 x 4 ml/h) pour induire une analgésie, 2 à 4 mg/kg de (2 %) propofol (20 mg/mL, 4 à 8 ml/h) pour induire une anesthésie, et 4 mL/kg/h d'acétate de Ringer pour maintenir des conditions iso-volumetriques.
    9. Placez une sonde de température rectale. Surveillez également la fonction cardiaque, la température et la saturation en oxygène pendant tout le processus.
    10. Contrôler la profondeur de l'anesthésie en surveillant la respiration autonome; si l'animal montre des signes de respiration autonome, distribuez un petit bolus de propofol et de fentanyl.
  4. Préparation du site
    1. Placer le lapin sur un coussinchal chauffé (39 oC) recouvert d'un matelas (pour éviter les brûlures) sur la table de chirurgie. Raser le cuir chevelu.
    2. Appliquer un gel lubrifiant sur les yeux pour éviter l'irritation et la sécheresse. Désinfecter le site en frottant la peau avec de l'iode de povidone (10%). Ensuite, drapez le lapin avec un drapé chirurgical stérile et découpez une zone d'accès pour le crâne.
    3. Désinfecter le site chirurgical avec de l'iode de povidone (10%) pour la deuxième fois. Appliquer un gel lubrifiant sur les yeux pour éviter l'irritation et la sécheresse.
    4. Préparer une table drapée (drapé stérile) sur laquelle placer le plateau chirurgical complet.
  5. Ouverture du site chirurgical
    1. Anesthésiez localement avec une injection sous-cutanée (SC) de lidocaïne 2% (1 mL) sur le crâne.
    2. Inciser à travers la peau (avec un scalpel) le long de la ligne sagittale calvariale, des orbites à la protubérance occipitale externe (4 cm de longueur). Assurez-vous que le périosteume est incisé.
    3. Élever doucement le périosteume (avec un ascenseur périosteal) des deux côtés de l'incision. Rincer le site avec saline stérile.
  6. Placement de cylindre
    1. Localiser les sutures médianes et coronaux sur le crâne (Figure 2A, B). Notez que ces lignes anatomiques forment une croix. Les cylindres seront placés dans chacun des quadrants définis par la croix, en veillant à ce que le bord du cylindre ne soit pas au-dessus de la suture (Figure 2C).
    2. Placez le premier cylindre sur le quadrant supérieur gauche (os frontal gauche) et essayez de poser l'appareil à plat. Fixez-le en position avec une forte pression de la main et visez une microvis, jusqu'à ce que la résistance soit ressentie. Assurez-vous que la tête de vis est rincée avec la surface de l'onglet cylindre.
    3. Répétez la même procédure sur l'autre onglet pour fixer le cylindre fermement sur le crâne. Assurez-vous que le cylindre est hermétiquement fixé à l'os.
    4. Répétez la procédure sur le quart supérieur droit (os frontal droit), le quart inférieur gauche (os pariétal gauche) et le quart inférieur droit (os pariétal droit).
  7. Forage osseux de 5 trous intramédullaires dans la zone circonscrite par les cylindres (Figure 1)
    1. Percer un trou intramédullaire sous irrigation saline (0,8 mm de diamètre, 1 mm de profondeur) avec une bur ronde sur l'os, au centre de la zone circonscrite par le cylindre. Assurez-vous que le saignement apparaît.
    2. Percer deux autres trous intramédullaires le long de l'axe en passant par les deux vis d'onglet, aux bords intérieurs du cylindre. Le long de la hache perpendiculaire, percer deux autres trous intramédullaires aux bords intérieurs du cylindre. Assurez-vous que le saignement apparaît.
    3. Répétez l'opération dans les trois autres cylindres.
  8. Cylindres de remplissage avec des échantillons de matériaux et plafonnement (figure 3)
    1. Préparer le matériau de substitution osseux désiré selon les instructions du fabricant ou les spécifications du matériau.
    2. Remplissez le premier cylindre à ras bord avec l'échantillon de matériau et fermez le cylindre en ajustant le bouchon. Répétez le processus dans les 3 autres cylindres.
  9. Fermeture du site chirurgical
    1. Fermez la peau au-dessus des cylindres à l'aide d'une suture intermittente non résorbable.
    2. Appliquer un pansement pulvérisable sur la plaie.

3. Traitement post-chirurgical

  1. Arrêtez l'analgésie et l'anesthésie (arrêt de perfusion de propofol et de fentanyl) et vérifiez la récupération de la respiration autonome.
  2. Arrêtez la ventilation une fois que l'animal a retrouvé une respiration autonome. Maintenir l'animal sous oxygène pur avant le réveil complet.
  3. Injecter de la buprénorphine hydrochlorure SC (0,02 mg/kg, 0,03 mg/mL, 0,67 ml/kg) et répéter l'injection toutes les 6 h pendant 3 jours comme analgésie post-chirurgicale.
  4. Transférer l'animal dans son logement habituel avec de l'eau et une alimentation complète.
  5. Enlever les sutures après environ 10 jours de cicatrisation de la plaie.

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Representative Results

Le modèle décrit ci-dessus est consacré à l'évaluation de l'ostéoconduction chez les substituts osseux. L'ostéogenèse et l'ostéoinduction de substituts osseux (pré-)cellulaires ou chargés de molécules bioactives peuvent également être évaluées, ainsi que la vasculogenèse1,2,3,4, 5 Annonces , 6 Annonces , 7 Annonces , 8 Annonces , 9 (en) , 10 Ans et plus , 11 Ans, états-unis ( , 12 Ans, états-unis , 13 (en) , 14 (en) , 15 Annonces , 16 Annonces , 17 Annonces , 18 ans, états-unis qui , 19 ans, états-unis qui , 20 Ans, états-unis , 21 Ans, états-unis , 22 Ans , 23 Ans, états-unis , 24 Ans, états-unis , 25 Annonces , 26 Annonces , 27 Annonces , 28 Annonces , 29 Ans et plus , 30. Une étude cinétique peut être utilisée, de 3 jours à 3 mois après la chirurgie selon les mécanismes et les extrants à analyser. Une chronologie classique permettant des descriptions au début et à la mi-temps est: 2, 4, 6, 8 et 12 semaines. Notez qu'un minimum de 6 échantillons par point de temps est obligatoire pour obtenir des résultats significatifs. Chaque échantillon à tester doit être placé au moins une fois dans chaque position sur le crâne par point de temps (allocation aléatoire). Enfin, les échantillons fictifs (p. ex., les cylindres remplis de sang coagulé) doivent être inclus dans le protocole34.

Une fois la chirurgie terminée, la croissance osseuse peut être surveillée à différents moments en utilisant la tomographie osseuse sur les animaux vivants. Un exemple est indiqué dans la figure 4A,B. Une analyse supplémentaire exige que les animaux soient sacrifiés (injection intraveineuse létale de 150 mg/kg de pentobarbital (100 mg/mL). Après l'euthanasie, les échantillons sont sectionnés et les cylindres sont soigneusement enlevés (figure 5). Les biopsies sont fixées avec une solution de saline tamponnée de phosphate et de 4% de formaldéhyde. La croissance osseuse peut ensuite être évaluée à l'aide de la microtomographie (figure 4 C,D). Les échantillons peuvent également être traités pour la coloration histologique (immune-). L'analyse histomorphométrique et les colorations spécifiques sont alors possibles pour compléter l'analyse plus spécifiquement (figure 6).

Figure 1
Figure 1 : Spécifications des cylindres PEEK. Deux trous (0,8 mm de diamètre) ont été forés sur les onglets de stabilisation latérales pour la vissage. Les positions des 5 trous intramédullaires (0,8 mm de diamètre) à percer sur le crâne dans la zone délimitée par le cylindre sont marquées à l'aide de cercles rouges. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2
Figure 2 : Image représentative du crâne de lapin et placement des cylindres. Photos montrant les sutures médianes et coronales sur le crâne du lapin délimitant les os pariétals gauche-droite et frontales (A,B). Placement des cylindres des deux côtés des sutures (C). Barres d'échelle de 5 mm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3
Figure 3 : Image représentative des cylindres fixes, remplis et capés. Image affichant quatre cylindres fixés sur le crâne d'un lapin avec des vis de titane. Dans la zone délimitée par chaque cylindre, 5 trous intramédullaires (0,8 mm de diamètre, 1 mm de profondeur) ont été forés sous irrigation avec un bur rond pour permettre la migration des cellules osseuses. Les cylindres étaient remplis de différents échantillons de substituts osseux (volumes calibrés) avant le plafonnement (un cylindre fermé n'est montré que). Barre d'échelle de 5 mm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 4
Figure 4 : Images représentatives de l'analyse microtomographique (micro-CT). Avec l'objectif final d'évaluer la croissance osseuse menée par des substituts osseux, 4 cylindres ont été fixés sur un crâne de lapin avec des vis en titane et remplis de matériaux de substitution osseuse. (A) Imagerie en direct : balayage transversal bidimensionnel (14 min, 99 kV/88 a avec une résolution de 20 m) d'un cylindre à 12 semaines. (B) reconstruction tridimensionnelle (3D) de l'analyse micro-CT en direct à 4 semaines (cercles rouges : substituts osseux dans les cylindres ; flèche rouge : contrôle dans lequel le cylindre est rempli de sang coagulé). (C,D) Après euthanasie (12 semaines), les cylindres ont été enlevés avant la fixation et l'analyse micro-CT. (C) balayage transversal 2D (57 min, 99 kV/88 a avec une résolution de 10 m) d'un cylindre et de la reconstruction 3D du nouvel os total dans le cylindre (D). Des particules de remplacement d'os (rouge), de nouveaux os (vert) et de lit d'os (jaune) sont montrées. Barres d'échelle de 2 mm Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 5
Figure 5 : Images représentatives d'une biopsie à 4 semaines. Après euthanasie (4 semaines), des échantillons ont été sectionnés par bloc et des cylindres ont été enlevés avant fixation dans la formaline de 4%, l'analyse micro-CT et le traitement histologique. Barre d'échelle 5mm. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 6
Figure 6 : Photos représentatives des sections (immunes)histologiques. Dans le but final d'évaluer la croissance osseuse et la néovascularisation menée par des substituts osseux, 4 cylindres ont été fixés sur un crâne de lapin avec des vis en titane et remplis de substituts osseux. Après l'euthanasie (12 semaines), les cylindres ont été enlevés avant fixation et traitement histologique. (A) Coloration Masson-Goldner (50x): substitut osseux apparaît comme des particules mauve entouré de nouvel os en vert. (B) Les tranches ont été numérisées et traitées pour l'extraction numérique de matériaux de substitution osseuse afin que le nouvel os (rouge) puisse être quantifié facilement. (C) Immunostaining of CD31 (arrows), un marqueur typique des cellules endothéliales et du processus de néovascularisation. (D) Coloration immunofluorescente (verte) d'une zone fortement néovascularisée dans laquelle certains nouveaux capillaires expriment fortement CD31 (flèche). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

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Discussion

Le modèle décrit ci-contre est simple et doit être développé assez facilement tant que toutes les étapes sont suivies et que l'équipement est adapté. Comme le protocole décrit est une méthode chirurgicale, toutes les étapes semblent critiques et doivent être suivies correctement. Il est essentiel d'être formé pour des expériences animales, en particulier dans la manipulation du lapin et l'anesthésie. N'hésitez pas à demander de l'aide professionnelle d'anesthésiste et vétérinaire. Il est essentiel d'insister sur la surveillance visuelle quotidienne des animaux avant et après l'enlèvement de la suture. Même si la peau du crâne est épaisse, abondante et lâche, la fixation des cylindres induit de grandes tensions. Si les sutures sont enlevées trop tôt, la plaie pourrait rouvrir et nécessitera une semaine de plus de suture et un nouveau traitement antibiotique. En cas de déhiscence hors de la ligne de la plaie, le chirurgien devra considérer si la suture est possible ou non. Si ce n'est pas le cas, il faudra envisager le rejet de l'échantillon.

En plus des étapes critiques décrites dans la section du protocole, les détails ci-dessous peuvent être utiles dans la mise en œuvre appropriée de ce protocole. D'un point de vue technique, comme les lapins utilisés sont jeunes et petits, il est important d'utiliser une intubation en deux étapes, comme décrit dans le protocole. Le deuxième tube (et final) est trop grand pour être utilisé en première intubation, et il existe un risque réel de «mauvaise voie» qui peut être délétère ou même fatale.
Selon les matériaux testés, il peut être intéressant de prélever un échantillon de sang frais de la ligne iv de l'oreille qui est déjà placée. Cela pourrait fournir une bonne méthode pour pré-infuser le matériau de substitution osseuse avec des cellules naturelles et des facteurs de croissance. Le sang fraîchement coagulé peut également fournir un échantillon de faux idéal.

La façon dont les trous intramédullaires sont percés devrait être très utile pour le traitement histologique futur et l'analyse histomorphométrique. En effet, tant que les trous sont (i) au même endroit, (ii) les biopsies sont orientées de la même façon et (iii) le processus de coupe est normalisé (c.-à-d., même épaisseur, même niveau de coupe), les champs qui sont évalués sont équivalents et leur comparaison est très pertinent. En matière de normalisation, il peut être d'un réel intérêt de calibrer le volume-quantité de matériau pour remplir le cylindre, et de le préparer à l'avance, d'une manière stérile.

D'un point de vue scientifique, selon les produits ou les hypothèses testées, il peut être important d'éviter de placer les cylindres sur des sutures osseuses. Certaines cellules souches spécifiques sont présentes dans ces structures35, différentes des cellules souches osseuses mésenchymales qui sont impliquées dans les mécanismes de l'ossification intramembrane, c'est-à-dire le processus de régénération osseuse rencontré dans la région orofacial. Par conséquent, un biais réel peut se produire en cas de mauvais placement.

L'un des principaux avantages du modèle calvarial est l'utilisation de la microtomographie vivante par laquelle la croissance osseuse peut être suivie sur un seul animal comme une étude longitudinale. Cette stratégie peut réduire en grande partie le nombre d'animaux euthanasiés et donc respecter la "règle 3R"36. Selon le dispositif de microtomographe utilisé (résolution, espace disponible pour l'animal), des variations se produiront en termes de stratégie d'anesthésie (IV, gaz, etc.), ainsi que dans la résolution de l'image et la pertinence de l'analyse résultante.
Nous utilisons régulièrement un microtomographe dédié aux expériences animales (p. ex., Quantum GX) pour des vérifications de routine. Une expérience typique commence par une sédation, telle que décrite à l'étape 2.3.1. L'anesthésie est alors maintenue avec 2% d'isoflurane en oxygène pur. Cela permet à l'animal de respirer calmement pendant un temps de balayage d'environ 14 min (99 kV/88 a avec une résolution de 20 m); cela est suffisant pour vérifier les paramètres de base (engraftment, fixation du cylindre, analyse semi-quantitative de la croissance osseuse, etc.). Lors de la recherche d'une analyse qualitative et quantitative précise, un réglage très fin du temps de numérisation, de la résolution, de l'anesthésie et du positionnement animal sera nécessaire.

Les modèles existants développés pour l'évaluation de l'ostéoconduction, de l'ostéogenèse, de l'ostéoinduction ainsi que de la vasculogenèse, sont nombreux, particulièrement dans le domaine orofacial. Pour des raisons éthiques et économiques, notre objectif sera limité aux lapins ou aux petits animaux. En dehors du crâne, les endroits dans lesquels le matériel peut être testé sont le mandibulla37,38,39,40,41,42,43, 44,45,46,47, le diastema48 ou les prises incisives (après extraction des dents)49,50,51. Des rats, des souris, des cobayes et des lapins peuvent être utilisés pour chacun des modèles décrits ci-dessous. En bref, un défaut critique est foré (ou une prise est créée par extraction incisive), rempli avec l'échantillon de matériau, puis recouvert d'une membrane. Outre le fait évident que seulement deux échantillons peuvent être testés dans chacun de ces endroits (un échantillon par côté mandibule ou par prise incisive), les procédures chirurgicales sont également largement plus difficiles et invasives. Les accès au site sont limités et si l'on utilise des rats ou des souris, la difficulté est encore augmentée par la taille des animaux. Enfin, la taille critique des défauts (c.-à-d. les dimensions qui ne permettent pas une régénération osseuse spontanée) n'est pas bien définie et varie d'un animal à l'autre.
Outre ces généralités, des contraintes spécifiques peuvent survenir en fonction de l'emplacement anatomique soumis au défaut et de l'analyse ultérieure. Par exemple, dans le modèle mandibulaire, les racines des dents sont présentes dans le défaut. Cela peut interférer avec le matériau et modifier le processus de régénération osseuse. Le défaut pourrait être placé plus distally sur le ramus, mais dans ce cas, l'os serait très mince (deux corticales apposées avec un espace médullaire extrêmement mince) et le volume de défaut résultant peut être trop petit45,46, 47. Compte tenu de ces exemples de limitations et selon le modèle, on peut prévoir d'importants écarts en termes de volume de matériaux à tester, de qualité et de quantité de données recueillies.

Comme l'évaluation d'un matériau nécessite un maximum de normalisation et d'étalonnage, le modèle calvarial semble idéal. L'accès est très facile, l'étalonnage et la normalisation sont facilités par l'utilisation de cylindres définis et 4 échantillons peuvent être évalués simultanément. En outre, la tomographie vivante peut être utilisée et enfin une forte diminution des animaux à euthanasier peut être anticipée.

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Disclosures

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Acknowledgments

Les auteurs sont redevables à Geistlich AG (Wolhusen, CH) et à la Fondation d'Ostéologie (Lucerne, CH) (subvention n '18-049) pour leur soutien, ainsi que Global D (Brignais, FR) pour la fourniture des vis. Un merci particulier au Dr B. Schaefer de Geistlich. Nous remercions également Eliane Dubois et Claire Herrmann pour leur excellent traitement histologique et leurs précieux conseils. Enfin, nous remercions chaleureusement Xavier Belin, Sylvie Roulet et toute l'équipe du Pr Walid Habre, "chirurgie expérimentale Dpt", pour leur remarquable assistance technique.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Drugs
Enrofloxacine Baytril 10% Bayer Antibiotic
Fentanyl Bischel For analgesia
Ketalar 50mg/ml Pfizer Ketamine for anesthesia
Lidohex Bichsel Lubricating gel for the eyes
Opsite Smith and Nephew 66004978 Sprayable dressing
Povidone iodine 10%, Betadine Mundipharma anti-infective agent
Propofol 2% Braun 3538710 For anesthesia
Rapidocain 2% sintetica Local anesthesia
Ringer-acetate Fresenius Kabi Volume compensation
Rompun 2% Bayer Xylazin for anesthesia
Sevoflurane 5% Abbvie For anesthesia
Sterile saline Sintetica
Temgesic Reckitt Benckiser Buprenorphine hydrochloride, analgesia
Thiopental Inresa Ospediala For anesthesia
Xylocaine 10% spray Astra Zeneca For intubation
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Fresenius Vial pilot C Imexmed Infusion pump
Heated pad Harvard Apparatus
Suction dominant 50 Medela
Suction tubing Optimus Promedical 80342.2
Surgical motor Schick dental Qube Drilling of intramedullary holes
Ventilation Maquet Servo1
Name Company Catalog Number Comments
Material
Cylinders and caps Boutyplast Customized composition: PEEK (poly ether ether ketone)
Manual self-retaining shaft GlobalD ACT1K
Mobile handle for self-retaining shaft GlobalD MTM
Self- drilling screws GlobalD VA1.2KL4 cross-drive screws composed by Titanium grade5, ISO 5832-3
Name Company Catalog Number Comments
Surgical tray
Endotracheal tube Shiley diameter 2,5mm Covidien 86233 For intubation
Endotracheal tube Shiley diameter 4,9mm Covidien 107-35G For intubation
Ethicon prolene 4-0 Ehticon 8581H Non-resorbable suture
Forceps Marcel Blanc BD027R 145 mm
Intubation catheter Cook medical Guide for intubation
Needlle holder Marcel Blanc BM008R
Needles BD Microlance3 Becton Dickinson 300300/304622 26G; 18G
Periosteal HU-Friedy P9X
Round surgical burs Patterson 78000 0.8 mm in diameter, Drilling of intramedullary holes
Scalpel Swann-Morton n°10 and n°15
Scissors Marcel Blanc 00657 180 mm
Syringes Omnifix Braun 4616057V 5ml, 10ml and 50ml
Venflon G22 Braun 42690985-01 Vasofix safety for the ear iv line

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