가벼운 외상성 뇌 손상을 가진 쥐의 해마에 있는 향상된 확산 화상 진찰

Neuroscience

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Summary

이 절차의 전반적인 목표는 가벼운 외상성 뇌 손상을 가진 쥐에 해마의 양적 미세 구조 정보를 얻는 것입니다. 이것은 파라메트릭 확산지도의 고급 확산 가중 자기 공명 영상 프로토콜 및 관심 영역 기반 분석을 사용하여 수행됩니다.

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Braeckman, K., Descamps, B., Vanhove, C. Advanced Diffusion Imaging in The Hippocampus of Rats with Mild Traumatic Brain Injury. J. Vis. Exp. (150), e60012, doi:10.3791/60012 (2019).

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Abstract

온화한 외상성 뇌 손상 (mTBI)는 취득한 두뇌 상해의 일반적인 모형입니다. 외상성 뇌 손상을 가진 환자는 엄청난 가변성 및 이질성 (나이, 성별, 외상의 모형, 그밖 가능한 병리 등)를 보여주기 때문에, 동물 모형은 임상 연구에 있는 한계인 요인을 해명에 있는 중요한 역할을 합니다. 그(것)들은 TBI 다음 상해 그리고 수리의 생물학 기계장치를 조사하기 위하여 표준화되고 통제된 설정을 제공합니다. 그러나 모든 동물 모델이 mTBI의 확산과 미묘한 특성을 효과적으로 모방하는 것은 아닙니다. 예를 들면, 일반적으로 사용되는 통제된 피질 충격 (CCI) 및 측량 타악기 상해 (LFPI) 모형은 두뇌를 드러내고 mTBI에서 일반적으로 보이지 않는 광범위한 초점 외상을 유도하기 위하여 개두엽을 이용합니다. 따라서 이러한 실험 모델은 mTBI를 모방하는 데 유효하지 않습니다. 따라서 mTBI를 조사하기 위해 적절한 모델을 사용해야 합니다. 쥐에 대 한 Marmarou 무게 드롭 모델 가벼운 외상을 유지 하는 환자에서 볼 수 있듯이 유사한 미세 구조 변경 및 인지 장애를 유도; 따라서 이 프로토콜에 대해 이 모델이 선택되었습니다. mTBI는 종종 단지 미묘하고 확산 부상을 유도하기 때문에 기존의 컴퓨터 단층 촬영 및 자기 공명 영상 (MRI) 검사는 일반적으로 가벼운 부상 다음 손상을 표시하지 않습니다. 확산 가중 MRI를 사용하면 뇌 조직의 미세 구조적 특성을 조사 할 수 있으며 가벼운 외상 후 현미경 변경에 대한 더 많은 통찰력을 제공 할 수 있습니다. 따라서, 본 연구의 목적은 온화하고 확산된 뇌 손상을 얻은 후 질병 진행을 추적하기 위해 선택된 관심 영역(즉, 해마)의 정량적 정보를 얻는 것이다.

Introduction

외상성 뇌 손상 (TBI)은 최근 몇 년 동안 더 많은 관심을 얻고있다, 이러한 뇌 손상은 평생인지, 신체적, 정서적, 사회적 결과를 초래할 수 있다는 것이 분명해짐에 따라 1. 이 증가 인식에도 불구 하 고, 가벼운 TBI (mTBI, 또는 뇌진탕) 여전히 종종 과소 보고 하 고 진단. MTBI는 침묵하는 전염병으로 언급되고, mTBI의 역사를 가진 개별은 약물 남용또는 정신 문제의 더 높은 비율을 보여줍니다 2. mTBI를 가진 몇몇 환자는 수시로 전통적인 컴퓨터 단층 촬영 (CT) 또는 자기 공명 화상 진찰 (MRI) 검사에 보이지 않는 상해의 확산 그리고 미묘한 본질 때문에 매년 진단되지 않습니다. 뇌 손상의 방사선 학적 증거의 이 부족은 미세 구조 변화에 더 민감한 확산 MRI와 같은 더진보 된 이미징 기술의 개발로 이어졌다 3.

확산 MRI는 미세 구조의 생체 매핑을 허용하고,이 MRI 기술은 TBI연구 4,5,6에서광범위하게 사용되어왔다. 확산 텐서에서 분수 이방성(FA) 및 평균 확산도(MD)가 계산되어 부상 후 미세 구조 조직의 변경을 정량화합니다. mTBI 환자에 있는 최근 검토는 FA에 있는 증가 및 차축 팽윤7의 표시일 수 있는 상해 다음 MD에 있는 감소. 반대로, MD의 증가와 FA의 감소는 또한 부종 형성, 축축성 변성, 또는 섬유 오정렬/중단따른 실치구조의 중단을 뒷받침하는 것으로 제안되고 있다 8. 이러한 혼합 된 사실 인정은 다른 유형의 충격 및 심각도 (예를 들어, 회전 가속, 무딘 힘 외상, 폭발 상해 또는 전자의 조합)에 의해 야기 된 mTBI의 유의한 임상 이질성에 의해 부분적으로 설명 될 수있다. 그러나, 현재 는 미세 구조 조직에 있는 변경을 뒷받침하는 근본적인 병리학 및 생물학/세포 기초에 관하여 명확한 합의가 없습니다.

동물 모델은 TBI에 이어 부상및 수리의 생물학적 메커니즘을 보다 자세하게 조사하기 위해 표준화되고 제어된 설정을 제공합니다. TBI에 대한 몇몇 실험 모델은 인간 TBI의 상이한 양상(예를 들어, 초점 대 회전력에의한 확산 외상) 9,10을나타낸다. 일반적으로 사용되는 동물 모델은 제어된 피질 충격(CCI) 및 측면 유체 타악기 손상(LFPI) 모델11,12를포함한다. 실험 적 매개 변수는 잘 제어 될 수 있지만,이 모델은 뇌를 노출하는 개두절제술을 사용합니다. 두개골 또는 두개골 골절은 일반적으로 mTBI에서 볼 수 없습니다; 따라서 이러한 실험 모델은 mTBI를 모방하는 데 유효하지 않습니다. Marmarou 등13에서 개발 한 충격 가속 모델은 헬멧에 의해 보호되는 쥐의 머리에 특정 높이에서 떨어지는 무게를 사용합니다. 이 동물 모델은 가벼운 외상을 유지하는 환자에서 볼 수 있듯이 유사한 미세 구조 변경 및 인지 장애를 유도합니다. 따라서, 이러한 마마루 중량 투하 모델은 확산 mTBI14,15에대한 이미징 바이오마커를 조사하는 데 적합하다.

이 보고서는 Marmarou 중량 투하 모델을 사용하여 mTBI 래트 모델에서 고급 확산 MRI의 적용을 보여줍니다. 먼저 도시된 것은 경증 및 확산 외상을 유도하는 방법, 및 확산 텐서 이미징(DTI) 모델을 이용한 분석이 제공된다. 특정 생물학적 정보는 보다 진보된 확산 모델[즉, 확산 쿠르토시스 이미징(DKI) 및 백색 물질 관 청렴성(WMTI) 모델]의 사용으로 얻어진다. 구체적으로, 온화한 외상이 가해지고 미세 구조적 변화는 기존의 T2 가중 MRI 및 고급 확산 이미징 프로토콜을 사용하여 해마에서 평가됩니다.

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Protocol

이 프로토콜은 겐트 대학교동물윤리위원회(ECD 15/44Aanv)의 승인을 받았으며, 모든 실험은 유럽연합 집행위원회의 지침(지침 2010/63/EU)에 따라 수행되었습니다.

1. 동물 준비 및 헬멧 부착

  1. 암컷 Wistar H 쥐 (± 250g 또는 12 주)를 무게와 이소플루란의 혼합물로 채워진 작은 유도 챔버에서 마취 (5%) O2를 1분 이상.
  2. 목에 0.05 mg/kg buprenorphine 피하로 쥐를 주입, 홈 케이지에 반환, 적어도 에 대한 선제 진통을 허용 30 분 효과를.
    참고 : 30 분 동안 기다리는 동안 수술 부위를 준비 할 수 있습니다.
  3. 가열 패드를 수술장 아래에 37°C로 보관합니다. 70% 에탄올로 소독된 수술장에 멸균수술기구를 놓습니다.
  4. 쥐를 유도 챔버에 다시 놓고 발이나 꼬리 핀치에 반응하지 않을 때까지 쥐를 마취시다.
  5. 수술 장에 쥐를 놓고 측면 꼬리 정맥에 카테터를 삽입하십시오. 다음으로, 쥐의 머리를 면도하고 여분의 털을 제거하고 두피와 나머지 수술 부위를 클로로액시드인으로 소독하십시오.
  6. 두피에 국소적으로 2% 리도카인의 100 μL을 주입합니다.
  7. 메스 크기 11을 사용하여 두개골을 노출하고 작은 가위로 여분의 막을 제거하십시오. 최대 1cm의 확산으로 안구 스페큘럼을 사용하여 피부를 철회하십시오.  또한, 골막이 더 이상 존재하지 않을 때까지 두개골을 가로 질러 멸균 면봉을 부드럽게 문질러 골막을 제거하십시오.
  8. 두개골에 티슈 접착제 한 방울과 헬멧 역할을하는 멸균 된 금속 디스크 (직경 10mm 및 두께 3mm)에 한 방울을 넣습니다. 디스크를 약 1/3 전에 접착제로 붙이고 브레그마 뒤에 3분의 2를 붙입니다. 접착제가 1분 동안 건조되도록 합니다.

2. 외상성 뇌 손상의 유도 (TBI)

  1. 특정 스프링 상수의 폼 매트리스가있는 맞춤형 침대에 쥐를 놓습니다 (재료 참조). 가능한 한 수평으로 헬멧으로 450g 황동 무게의 투명 플라스틱 튜브 바로 아래에 쥐를 배치합니다. 마취에서 쥐를 분리.
  2. 무게를 최대 1m까지 당기고 준비가 되면 놓습니다. 두 번째 실험자가 두 번째 충격을 방지하기 위해 충격 직후 플라스틱 튜브에서 쥐를 멀리 이동시키는 것이 있는지 확인하십시오.
    참고: 부상당한 쥐는 2.2단계를 제외하고 동일한 실험 절차(단계 1.1-2.7)를 받습니다.
  3. 마취에 쥐를 다시 부착하고 혈역학적 충격을 줄이기 위해 카테터를 통해 생리용액 1 mL (0.9 % NaCl)을 주입하십시오.
    참고 : 쥐가 충격으로 인해 잠시 호흡을 멈출 수 있습니다. 쥐가 호흡 반사를 장려하기 위해 2 s 후 자발적으로 호흡하지 않는 경우 부드럽게 흉부 압축.
  4. 헬멧을 두개골에서 부드럽게 당겨 제거합니다. 두개골과 피부에서 남아있는 접착제를 제거하고 수술 봉합사로 절개를 닫습니다. 멸균 어플리케이터 팁을 사용하여 국소 진통 젤을 바르고 있습니다.
  5. CT 스캐너의 침대에 쥐를 놓습니다. 스카우트 스캔을 사용하여 올바른 위치를 확인합니다. 시야를 조정하여 한 침대 위치 내에서 전체 머리의 이미징을 가능하게 합니다. 두개골 골절을 배제하기 위해 범용, 저용량 CT 스캔을 투여하십시오.
    참고 : 두개골 골절은 안락사를위한 기준이다.
  6. 쥐를 가열 패드(37°C)에 깨끗한 케이지에 놓습니다. 의식을 회복할 시간을 모니터링합니다. 쥐가 똑바로 앉을 수 있게 되면, 쥐는 홈 케이지로 되돌아갈 수 있습니다.
  7. TBI 유도 다음 날 0.05 mg/kg buprenorphine의 두 번째 복용량을 관리.

3. 확산 자기 공명 화상 진찰 (MRI)

참고 : 확산 가중 화상 진찰은 외상 유도 의 앞에 그리고 1 일 행해둡션.

  1. 이소플루란 (5%)의 혼합물로 채워진 작은 유도 챔버에서 쥐를 마취 및 O2. 쥐가 발이나 꼬리 핀치에 반응하지 않는 경우 500 mL / min의 유량으로 마취를 2 %로 줄입니다.
  2. 쥐를 치아 바 및 코 콘으로 머리 홀더에 놓고 마취를 전달하고 뇌의 중심이 사분면 볼륨 MRI 코일의 중심 수준에 도달 할 때까지 머리를 앞으로 밉습니다. 각막에 손상을 방지하기 위해 소량으로 눈에 윤활 연고를 적용하십시오. 스캔 하는 동안 움직임을 피하기 위해 테이프의 작은 조각으로 머리를 고정.
  3. 호흡을 모니터링하고 쥐를 따뜻하게 유지하기 위해 순환 따뜻한 물 가열 담요와 거품 랩으로 쥐를 커버하기 위해 쥐의 흉부 아래에 압력 패드를 놓습니다. 스캔하기 전에 호흡 모니터를 확인하여 신호가 소음 없이 선명하고 호흡 주기가 일관된지 확인합니다. 필요한 경우 압력 패드를 재배치합니다.
    참고: 호흡률은 1%-2% 사이에서 마취의 수준을 조정하여 1,200-1,700 ms 당 1 호흡 사이에서 유지되어야 합니다.
  4. 사분면 볼륨 코일을 머리 위로 밉합니다. 코일 공급업체가 제공한 지침에 따라 코일의 튜닝 및 매칭 커패시터를 적절한 주파수와 임피던스로 조정합니다. 스캐너 베드를 스캐너 보어로 전진하여 스캔을 시작합니다.
  5. 올바른 위치를 보장하기 위해 기본 3평면 정찰 스캔("트라이파일럿")을 획득합니다.
    1. 새 검사를 클릭하고 프로토콜 목록에서 트라이파일럿 시퀀스를 선택하여 트라이파일럿 시퀀스를 스캔 컨트롤에 로드합니다. 다음으로 신호등 버튼을 클릭하여 스캔을 시작합니다.
    2. 스캔이 완료되면 이미지 디스플레이에 스캔을 로드하고 1) 머리가 똑바로 누워 있고 2) 뇌가 자석과 코일의 중앙에 위치하도록 합니다. 필요한 경우 헤드 및/또는 스캐너 베드의 위치를 조정하고 새로운 트라이파일럿 스캔을 얻습니다.
  6. 자동화된 2차 심밍 프로토콜을 사용하여 로컬 자기장을 조정합니다: 3.5.1 단계에서 설명한 대로 2차 심 프로토콜을 스캔 제어에 로드합니다. 다음, Acq 탭을 클릭 | 현재 조정 | 분광계 제어 도구 창에서 로컬 필드 균질성에 대한 특정 조정 방법을 사용하여 자동 시밍을 시작합니다.
  7. 3.5.1 단계에서 설명한 대로 Refocused Echoes(RARE) 시퀀스를 사용하여 새로운 T2 빠른 이미징을 스캔 컨트롤에 로드합니다.
    1. 다음 매개 변수를 제외하고 기본 설정을 사용하여 T2 가중치 이미지 획득:
    2. 편집 스캔 탭을 열고 반복 시간(TR) 및 에코 시간(TE)을 각각 5,500ms 및 37ms로 조정합니다. 또한 시야와 매트릭스 크기를 수정하여 109 μm x 109 μm(기본 해상도 = 156μm x 156 μm)의 더 높은 평면 해상도를 허용합니다. 슬라이스 두께가 600 μm이고 슬라이스 수가 45로 설정되어 있고 희귀 계수가 8로 설정되어 있는지 확인합니다.
    3. 지오메트리 편집기의 열기를 열고 뇌의 구부와 소뇌를 포함한 올바른 위치에 슬라이스 패키지를 배치합니다.
  8. 3.5.1 단계에서 설명한 대로 B_DIFFUSION 폴더에서 3개의 새로운 에코 평면 확산 가중 스핀 에코 시퀀스(DtiEpi)를 스캔 제어 프로토콜에 로드합니다.
    참고: 3개의 상이한 확산 "쉘"을 사용하여, 확산 텐서이미징(DTI) 모델 4,16,확산 쿠르토시스 이미징(DKI) 모델17,및 백색 물질 관 청렴도(WMTI)모델(18)을 모두 추정할 수 있다. 이미징 셸17당최소 15개의 균등한 간격의 방향을 가진 최대 3000s/mm2의 가장 높은 b-값을 사용하여 세 가지 이상의 서로 다른 b-값을 사용하는 것이 좋습니다.
    1. 다음 설정 외에 기본 설정을 사용하여 확산 가중치 이미지(DWI)를 수집합니다.
    2. 스캔 편집 탭을 열고 지오메트리 탭 아래의 기하학적 매개변수를 조정합니다.
    3. 슬라이스 방향을 축으로 설정하고 슬라이스 수를 25로 설정하여 슬라이스 두께가 500 μm이고 슬라이스 거리가 600 μm입니다. 판독 방향을 왼쪽-오른쪽으로 수정합니다.
    4. 콘트라스트 탭을 클릭하여 에코 시간을 24ms로 조정하고 반복 시간을 6,250ms로 조정합니다.
    5. 대역폭을 250,000Hz로 설정하고 지방 억제를 켭니다. 평균 수를 1로 조정합니다.
    6. 리서치 탭을 클릭하고 평균(EPI 세그먼트)수를 4로 변경합니다.
    7. 연구 탭 내의 확산 탭을 클릭합니다.
      1. 첫 번째 셸의 경우 확산 방향 수를 32개, 두 번째 셸의 경우 46개, 세 번째 셸의 경우 64로 조정합니다.
      2. 사용자 지정 그라데이션 방향 파일로 그라데이션 방향을 조정합니다.
      3. 첫 번째 셸의 경우 B0 이미지 수를 5, 두 번째 셸의 경우 5개, 세 번째 셸의 경우 7개로 변경합니다.
      4. 첫 번째 셸의 경우 방향당 b 값을 800s/mm 2, 두 번째 셸의 경우 1500s/mm2, 세 번째 셸의 경우 2000s/mm2로 조정합니다.
        참고: DTI_SET_DIRECTIONS 매크로를 사용하여 확산 방향 입력을 예로 또는 자동으로 설정하여 사용자 지정 그라데이션 방향 파일로 그라데이션 방향을 수동으로 조정할 수 있습니다.
    8. 지오메트리 편집기를 열고 대뇌만 포함하는 전구와 소뇌 사이에 시야를 배치하여 아티팩트와 스캔 시간을 줄입니다. 채도를 클릭하고 스크롤 막대를 사용하여 원하는 위치에 밴드를 슬라이딩하여 아티팩트를 줄이기 위해 뇌 외부5mm의 6개의 채도 밴드를 배치합니다.
      참고 : 전구와 소뇌는 해부학 적 랜드 마크와 트라이 파일럿 스캔의 세 가지 이미지를 기반으로 식별 할 수 있습니다.
  9. 신호등 기호를 클릭하여 가져온 시퀀스를 가져옵니다. 위에서 설명한 파라미터의 설정을 사용하여, T2-RARE 스캔의 획득 시간은 제1 DWI 쉘의 15분, 제2 DWI 쉘의 15분, 제2 DWI 쉘의 21분 및 30분이다. 총 수집 시간은 약 80분(단일 수신기 채널 시스템에서)입니다.
  10. 스캐닝 프로토콜이 완료되면 스캐너 침대에서 동물을 제거하고 37°C의 가열 패드가 있는 깨끗한 케이지에 동물을 놓습니다. 의식을 되찾으면 동물을 홈 케이지로 되돌려 놓습니다.

4. 이미지 처리

참고: 다음 섹션에서는 확산 이미지의 처리가 MRtrix3, ExploreDTI19 및 Open 액세스 도구 상자인 Amide 소프트웨어20에 설명되어 있습니다. 그러나 전처리 단계는 다른 툴박스(예: FSL, MedInria, DTIStudio)에서 수행될 수 있다.

  1. 2dseq 파일을 내보내 수집 콘솔에서 수집한 데이터를 전송합니다.
  2. 2dseq 파일(원시 DWI 파일)을 MRtrix3의 표준 서식인 .mif 형식으로 변환하여 MRtrix3의 추가 전처리 단계를 허용합니다. 또한 셸의 다음 명령을 사용하여 세 개의 확산 셸을 연결합니다.
    convert_bruker pdata/1/2dseq ratID_T2.mih(T2 가중치 이미지의 경우)
    convert_bruker pdata/1/2dseq ratID_dwi1.mih(첫 번째 확산 쉘의 경우)
    convert_bruker pdata/1/2dseq ratID_dwi2.mih(두 번째 확산 쉘의 경우)
    convert_bruker pdata/1/2dseq ratID_dwi3.mih(세 번째 확산 쉘의 경우)
    mrcat ratID_dwi1.mif ratID_dwi2.mif ratID_dwi33.mif ratID_dwi.mif
  3. MRtrix321,22의DWIs에서 노이즈 보정 및 깁스 울림 보정을 수행합니다. 또한 다음 명령을 사용하여 수정된 DWI 이미지와 T2 이미지를 NIFTI 형식으로 변환합니다.
    dwidenoise ratID_dwi.mif ratID_dwi_denoised.mif
    mrdegibbs ratID_dwi_denoised.mif ratID_dwi_denoised_gr.mif
    mrconvert ratID_dwi_denoised_gr.mif ratID.nii
    mrconvert ratID_T2.mif ratID_T2.nii
  4. ExploreDTI에서 EPI, 모션 및 에디 전류 왜곡에 대한 보정을 수행합니다.
    1. DTI*.mat 파일 계산을 클릭하여 NIFTI 이미지를 .mat 파일로 변환 | 원시 데이터를 DTI*.mat 파일로변환합니다. 확산 텐서 추정을 계량선형및 b-값으로 NaN으로 변경합니다. 복셀 크기를 0.333 0.333 0.6, 비DWI 이미지 수를 17로, DWI 이미지 수를 142로, 매트릭스 크기를 105 105 25로 조정합니다.
      참고: B-값을 NaN으로 설정하면 ExploreDTI는 데이터 집합을 첨도 데이터 집합으로 간주합니다.
    2. 설정 탭을 클릭하여 EPI 보정 설정을 조정합니다(기본적으로 꺼져 있음). SM/EC/EPI 보정을 선택하고 다른 데이터에 등록하고 예를 클릭하여 EPI 보정(비강성)을수행합니다. 확산 데이터 세트에 해당하는 해부학 적 T2 이미지의 접미사를 지정합니다.
      참고: ExploreDTI는 왜곡되지 않은 해부학 적 이미지와 확산 이미지 사이의 이미지 등록을 사용하여 EPI 왜곡을 수정합니다.
    3. 플러그인 탭을 클릭하고 피사체 모션 및 EC/EPI 왜곡에 대한 수정을 선택하고 2.3단계에서 전처리된 확산 데이터 파일을 선택합니다. T2 이미지가 동일한 폴더에 있고 확산 데이터 파일 이름과 동일한 기준을 가지고 있는지 확인합니다(예: DWI의 경우 rat1.nii 및 해부학 이미지의 경우 rat1_T2.ni). 이 단계에서는 "네이티브"(*네이티브.mat) 및 "변환된" 파일(*trafo.mat)을 생성합니다.
  5. *.nii에 플러그인 및 내보내기 를 클릭하고 DTI 모델의 파라메트릭 맵을 선택하여 각 쥐에 대한 DTI 메트릭을 계산합니다: 분수 이방성 (FA), 평균 확산도 (MD), 방사형 확산도 (RD), 축 확산도 (AD; "가장 큰 이젠트가치 L1")로 표시됩니다.
  6. 또한 구도 모델(MK, AK 및 RK) 및 WMTI 모델(AWF, AxEAD, RadEAD 및 TORT)에 대한 파라메트릭 맵을 내보냅니다. 확산 이미지의 처리는 12개의 파라메트릭 맵(그림1, 도2, 3)을 생성하여 추가의 미세 구조 분석에 사용될 수 있다.
  7. MRtrix3을 사용하여 각 쥐의 해마에 대한 마스크 파일을 만듭니다.
    1. 도구ROI편집기를 클릭하여 MRtrix 뷰어에서 쥐의 FA 이미지를 로드합니다.
    2. "+" 버튼을 클릭하여 새 ROI를 만들고 편집을 눌러 해마를 포함하는 각 슬라이스에 ROI를 그립니다(그림 4). ROI가 그려진 원치 않는 영역을 지우려면 오른쪽 마우스 버튼을 누릅니다.
    3. ROI 그리기가 완료되면 저장 단추를 클릭하여 마스크 이미지를 저장합니다.
      참고 :이 마스크 파일은 해마 조직을 포함하는 값 1의 복셀이있는 이진 NIFTI 이미지 파일이 될 것이며 나머지 복셀은 0의 값을 갖습니다. 쥐에 걸쳐 해마의 영역을 표준화하기 위해, 파라메트릭 맵은 관심 의 미리 정의 된 영역과 연구 특정 템플릿과 공동 등록 할 수 있습니다23 또는 쥐 뇌 지도.
  8. 랫트의 해마의 확산 메트릭을 추출하려면, 4.6단계의 생성된 마스크 파일을 사용하고 아미드 소프트웨어를 엽니다.
    1. 쥐의 파라메트릭 맵과 마스크 이미지를 엽니다.
    2. 마스크 파일의 ROI를 Amide에 추가하려면 마스크 파일 이미지를 선택하고 | 편집을 클릭합니다. ROI 추가 | 3D 이속투어와 마스크 이미지에 표시된 ROI를 클릭합니다. ROI에 의미 있는 이름을 지정하고 이 볼륨에 값이 1인 복셀만 포함되어야 하는지 확인합니다.
    3. 해마의 확산 메트릭의 평균 값을 계산하려면 도구를 클릭 | ROI 통계를 계산하고 포함해야 하는 이미지와 ROI를 나타냅니다. 실행을클릭하면 추가 통계 분석에 사용할 수 있는 계산된 값으로 다른 화면이 나타납니다. 이 파일은 기본 데이터 형식(예: .xlsx 또는 .csv 파일)으로 저장하거나 복사할 수 있습니다.

5. 통계분석

참고: 다음 섹션에서는 SPSS 통계 24에서 확산 이미지의 처리를 설명합니다. 그러나 통계 분석은 다른 통계 도구 상자에서 수행할 수 있습니다.

  1. SPSS *.sav 파일에서 넓은 형식으로 데이터를 로드합니다.
  2. 각 시간대(즉, 기준선 또는 1일 후 부상)에 대한 두 그룹 간의 통계적 차이를 테스트하려면 | 비수측정 테스트 | 레거시 대화 | 2 독립적 인 샘플 테스트. 테스트해야 하는 변수를 로드하고 그룹(예: TBI 및 sham 그룹)을 지정합니다. Mann-휘트니 U를 테스트 유형으로 표시합니다.
  3. 각 그룹 내의 2개의 시점 간의 통계적 차이를 테스트하려면 데이터 파일을 분할해야 합니다. 데이터로 이동하여 파일을 분할하고 그룹 비교를나타냅니다. 그런 다음 분석, 비매개 테스트, 레거시 대화 상자, 2 관련 샘플 테스트를클릭하고 비교해야 하는 변수를 로드하고 Wilcoxon을 테스트 유형으로 표시합니다.
    참고: 여러 비교를 수정하기 위해 본페로니 보정을 사용하여 각 확산 모델에 대해 p-값이 조정됩니다[즉, p-값은 비교된 파라미터 수로 나눈 값(DTI 4, DKI 3 및 WMTI 4)]. 보다 구체적으로, p&0.0125는 DTI 및 WMTI 모델에 대해 중요한 것으로 간주되며, p< 0.016은 DKI 모델에서 중요한 것으로 간주됩니다.

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Representative Results

연구에서, 모든 TBI 랫트(n=10)는 충격에서 살아남았고 마취23에서분리된 후 15분 이내에 충격 및 마취로부터 회복할 수 있었다. CT 이미지에, 두개골 골절의 증거가 없었고 T2 이미지는 외상 후 1 일 타박상 부위에서 출혈, 확대 심실 또는 부종 형성과 같은이상을 나타내지 않았다 (그림 5). 따라서 해부학 적 이미지의 이러한 육안 검사에 기초하여 큰 초점 병변이 검출되지 않아 부상의 확산및 경미한 특성을 확인했습니다.

T2 영상과 확산 데이터 세트(단계 4.4) 사이의 공동 등록(non-rigid) 단계의 품질을 색 인코딩된 FA 맵에 T2 이미지의오버레이를 추가하여 조사하였다(도 6). 이어서, FA, MD, AD 및 RD 파라메트릭맵을 계산하고(그림 1) 아미드 소프트웨어에 로드하였다. FA 맵에 기초하여, 해마 구조를 포함하는 ROI가그려졌다(그림 4). 확산 메트릭의 통계 값은 관심 영역 내의 모든 복셀에 대해 평균으로 계산되었으며 추가 분석을 위해 각 DTI 메트릭의 평균 값을 내보냈습니다. DTI 메트릭의 이상값을 검사하여 확산 데이터의 또 다른 품질 검사를 수행할 수 있습니다. 예를 들어, 해마의 FA 값은 약 0.15여야 합니다. 따라서 <0.10(등방성 확산을 나타내는 값) 또는 >0.30(백색 물질에서 볼 수 있는 값)의 값은 생물학적으로 믿을 수 없는 값으로 간주될 수 있습니다. 이러한 데이터 포인트는 추가 분석에서 거부되어야 합니다. 또한, WMTI 모델의 AWF, AxEAD, RadEAD 및 TORT뿐만 아니라 확산 쿠르토시스 모델의 AK, RK 및 MK에대한 평균 값을 계산하였다(그림 2, 3).

우리의 연구에서, DTI 메트릭의 분석은 mTBI 그룹에서 의 영향에 따라 상당한 증가 FA 값 (p = 0.007), 감소 확산값 (MD 및 RD) (p = 0.007 및 p = 0.007, 각각)을 밝혔다(그림7). 이러한 RD 및 MD 감소는 sham 군과 유의하게 달랐다(p=0.005 및 p =0.004 각각). 확산 쿠르토시스 메트릭은 충격에 따른 RK(p= 0.005)의 현저한 감소를 보였지만AK 또는 MK의 변화는 없었다(그림 8). WMTI 모델을 사용하여, RadEAD(p=0.007) 및 TORT(p=0.007)는 충격 후 1일 mTBI 군에서 각각 유의한 감소 및 증가를 나타냈다(도9C,D). sham 그룹의 값은 큰 변화를 나타내지 않았습니다.

Figure 1
그림 1: 소수 항등도(FA), 평균 확산도(MD), 축 확산도(AD) 및 방사형 확산도(RD)에 대한 대표적인 파라메트릭 맵. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 2
그림 2: 평균 쿠르토시스(MK), 축 근쿠르(AK) 및 방사형 첨도(RK)에 대한 대표적인 파라메트릭 맵입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 3
그림 3: 축수 분획(AWF), 축방향 및 방사형 여분의 축방향 확산도(AxEAD, RadEAD) 및 비틀거림(TORT)에 대한 대표적인 파라메트릭 맵. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 4
그림 4: MRtrix3에서 마스크만들기. ROI는 해마의 부피를 포함하는 모든 슬라이스에 해마 주위에 그려지고, 볼륨은 마스크 파일로 저장됩니다. 이것은 개별적으로 또는 파라메트릭 맵의 각각을 공동 등록 할 수있는 연구 특정 템플릿 마스크 파일을 사용하여 각 쥐에 대해 수행 할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 5
도 5: CT 및 T2가 대표적인 mTBI 동물의 가중 이미지 1일 충격 후. CT 이미지(맨 위 행)에는 두개골 골절이 표시되지 않습니다. T2 가중 이미지(아래쪽 행)에서 출혈, 확대된 심실 또는 부종 형성이 없음을 입증하였다. 주의 사항, 부종 형성은 외과 적 개입에서 상처 부위 주변의 강렬한 영역으로 명확하게 볼 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 6
그림 6: ExploreDTI에서 EPI, 모션 및 에디 전류 보정에 대한 보정 후 해부학 적 이미지와 오버레이 된 확산 데이터 세트의 컬러 인코딩 된 FA 맵. 표시된 것은 왼쪽에 나쁜 수정 및 공동 등록과 오른쪽에 좋은 예입니다. 색상 인코딩이 올바른지 확인해야합니다 : 빨간색의 왼쪽 - 오른쪽 방향 (예 : 코퍼스 callosum), 녹색의 전방 후방 방향 및 파란색의 열등한 우수한 방향 (예 : cingulum). 또한 색상 인코딩된 FA 이미지는 해부학 적 이미지와 완벽하게 정렬되어야합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 7
도 7: sham(n=10) 및 mTBI 동물에 대한 해마의 확산 텐서 메트릭의 변화(n=10). 충격에 이어, mTBI 동물(B,D)에서 FA(A)의 현저한 증가와 평균 확산도(B) 및 방사형 확산도(D)가 현저한 감소하였다. mTBI 랫트에서 축 확산도(C)에 대해 유의한 차이는 관찰되지 않았다. 가짜 동물은 어떤 중요한 DTI 변화도 나타내지 않았다 (*p & 0.0125). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 8
도 8: sham(n=10) 및 mTBI 동물(n=10)에 대한 해마의 확산 쿠르토시스 메트릭의 변화. 충격에 이어, mTBI 동물의 RK(C)가 현저한 감소하였으나 AK(B) 또는 MK(A)에서는 변화가 없었다. 가짜 동물은 변경 사항을 표시하지 않았다 (*p & 0.0166). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 9
도 9: sham(n=10) 및 mTBI 동물에 대한 해마의 백색 물질 관 무결성 메트릭의 변화(n=10). 충격 에 이어, MTBI 동물의 RadEAD (C)에서 현저한 감소와 TORT (D)가 현저한 증가했지만 AWF 또는 AxEAD (A,B)에는 변화가 없었다. 가짜 동물은 변경 사항을 표시하지 않았다 (*p & 0.0125). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

mTBI는 CT와 기존 MRI 스캔에 이상을 보이지 않는 확산및 미묘한 부상의 결과이기 때문에 가벼운 외상 후 미세 구조 손상에 대한 평가는 여전히 도전과제로 남아 있습니다. 그러므로, 외상의 전체 범위를 구상하기 위하여 더 진보된 화상 진찰 기술은 필요합니다. TBI 연구에 있는 확산 자기 공명 화상 진찰의 응용은 확산 텐서 화상 진찰이 가장빈번히 이용되는 마지막 십년간 도중 더 많은 관심을 얻고 있습니다 5. DTI 모델의 한계는 뇌 미세 구조에 대한 정확한 가정이 아닌 가우시안 확산 프로세스의 가정입니다 (장벽 역할을하는 멤브레인이있는 축과 세포의 복잡한 네트워크로 구성됨), DTI 메트릭이 비특이적입니다. 기본 생물학적 미세 구조24. 확산 쿠르토시스 이미징은 DTI 모델의 연장이며 비가우시안 확산도(17)를 특성화하려고 시도한다. 이것은 조직 이질성 또는 복잡성에 관하여 추가 정보를 제공할 수 있습니다.

그러나 DTI 및 DKI 모델의 단점은 확산 신호의 표현일 뿐이며, 이는 확률적 물 변위 프로파일을 특징짓지만 미세구조 6에 만 국한되지 않는다는 것이다. 한편, 규강텐서에 기초한 백색물질 관 무결성 모델은 모델18에 선행 생물학적 정보(가정)를 통합하는 미세 구조 매핑 기술이다. 그것은 조직 구획에 확산 신호를 속성및 생물학적 특성을 더 직접적으로 평가할 수 있습니다. 이러한 생물물리학 모델은 따라서 mTBI 후에 이상을 기술하기 위한 새로운 정보를제공하고 이 비특이성 문제점 6을 극복할 수 있다. 이 3개의 다른 모형을 사용하여, 미세 구조 변경 및 생물학 프로세스는 Marmarou 중량 투하 모형을 사용하여 특히, mTBI 다음을 더 상세하게 가시화될 수 있었습니다.

Marmarou 무게 드롭 모델은 사용하기 쉽고 사소한 수술만 필요합니다. 그러나, 두 번째 실험자는 두 번째 충격 직후에 유리 관에서 쥐를 멀리 이동하여 두 번째 를 피하는 것이 좋습니다. 추가적으로, 그것은 때때로 충격 다음 쥐의 호흡 반사를 회복 하는 데 필요한. 약 80 분의 총 획득 시간을 가진 다소 긴 MRI 프로토콜은 가짜 및 mTBI 쥐 모두에 의해 잘 용납됩니다. 그러나, 스캐닝 도중, 동물이 너무 깊게 또는 가볍게 자고 있는 경우에 호흡 주기를 감시하고 마취를 조정하는 것이 중요합니다. 또한 쥐가 저체온증을 피하기 위해 완전히 깨어날 때까지 수집 도중과 후에 동물을 따뜻하게 유지하는 것이 중요합니다.

고급 확산 MRI에서, 운동 아티팩트는 가능한 한 많이 피해야한다. 스캔 하는 동안 움직임을 줄이기 위해 간단한 솔루션은 치아 바의 사용을 하 고 테이프 또는 두 개의 귀 바의 작은 조각으로 머리를 고정 하는 것입니다., 가능한 경우. 이것은 쥐가 숨을 쉴 때마다 머리가 위아래로 움직이지 않도록합니다.

고급 확산 MRI 프로토콜을 사용하여 획득한 이미지는 추가 분석을 위해 사용되기 전에 주로 다른 소프트웨어 도구를 사용하여 여러 (사전) 처리 단계를 거쳐야 합니다. 확산 가중치 이미지를 처리하기 위해 다른 소프트웨어 도구를 사용하는 단점은 각 도구가 자체 데이터 형식을 사용하여 그라데이션 방향 테이블을 인코딩한다는 것입니다. MRtrix3는 그라데이션 정보와 그라데이션 정보를 .mif 파일에 확산 가중치 이미지와 함께 저장하고 ExploreDTI는 별도의 파일(B-matrix)을 사용하여 그라데이션 방향을 저장합니다. 따라서 그라데이션 방향이 MRtrix3에서 ExploreDTI로 올바르게 전송되는지 확인하는 것이 중요합니다. 이 작업은 색상 인코딩된 FA 이미지(예: 빨간색의 왼쪽-오른쪽 방향,녹색의 전방 후방 방향, 파란색의 열등한 방향(예: cingulum)에서 색상 인코딩이 올바른지 확인하여 수행할 수 있습니다. 컬러 인코딩된 FA 이미지는 확산 가중 이미지와 구조적 T2-가중 이미지 사이의 비강성 공동 등록 프로세스의 품질을 확인하는 데 에도 사용할 수 있습니다.

ExploreDTI를 사용하여 DTI, DKI 및 WMTI 모델을 사용하여 파라메트릭 맵을 추출했습니다. DTI 모델은 MD, AD, RD 및 FA에 대한 파라메트릭 맵을 제공했으며 DKI 모델은 MK, AK 및 RK에 대한 파라메트릭 맵을 제공합니다. WMTI 모델의 네 가지 메트릭(즉, AWF, AxEAD, RadEAD, TORT)이 계산되었지만 ExploreDTI 내에서 차축 내 확산도(IAD)를 추출하는 것은 불가능했습니다. IAD는 WMTI 모델25의개발자가 제공하는 MATLAB 도구를 사용하여 얻을 수 있습니다. 이렇게 하려면 확산 가중치 이미지와 그라데이션 정보를 ExploreDTI에서 Matlab으로 다시 전송해야 합니다. 이 단계는 그라데이션 정보의 인코딩과 관련된 오류가 다시 발생하기 쉽습니다. 또한 첨도 텐서와 WMTI 매개 변수를 다시 추정하고 계산해야 합니다.

획득한 이미지의 전처리, 텐서의 추정 및 파라메트릭 맵의 계산에는 오랜 시간의 컴퓨팅 시간이 필요합니다. EPI, 모션 및 에디 전류에 대한 수정은 8개의 코어와 16GB RAM이 있는 서버에서 설정된 데이터당 ~40분이 필요합니다. ROI 분석을 사용하여, 해마 내의 평균 값은 충격 전후 1일 전과 1일 동안 계산되었다. DTI, DKI 및 WMTI 메트릭의 변화는 mTBI 그룹에서 정량화되었습니다. 그러나 WMTI 모델의 DKI 메트릭 및 AWF에서는 큰 주체 간 가변성이 관찰되어 sham 그룹과 mTBI 그룹 간의 기준값에 예기치 않은 차이가 발생했습니다. 이것은 조사된 지역 내의 생물학적으로 믿을 수 없는 값(이상값)을 포함하는 복셀의 결과일 가능성이 높으며 Amide의 평균 값을 계산하기 전에 향후 연구에서 필터링될 수 있습니다.

결론적으로, 이 프로토콜은 mTBI의 랫트 모델에서 해마의 미세 구조 변화를 조사하고 정량화하기 위한 고급 확산 MRI의 타당성을 입증한다. 3개의 상이한 확산 모델을 사용하여, mTBI 후 조건에 기여하는 근본적인 생물학적 과정에 대한 상보적인 정보를 얻을 수 있다. 이는 경미한 충격 후 초기 단계에서 특정 미세 구조 변화를 식별할 수 있을 정도로 민감할 수 있는 mTBI에 대한 바이오마커의 개발에서 한 걸음 앞으로 나아간 것을 나타낸다.

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Disclosures

저자는 공개할 이해상충이 없습니다.

Acknowledgments

저자는 연구 재단에 감사드립니다 - 플랑드르 (FWO) 이 작품을 지원하기위한 (부여 번호 : G027815N).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Induction of trauma
0.9% NaCl physiologic solution B Braun 394496
brass weight 450g custom made custom made diamter 18mm and 210 mm height
catheter Terumo Versatus-W 26G
ethilon II Ethicon EH7824 FS-3, 4-0, 3/8, 16mm
Matrass Foam to Size Type E
Plexiglas tube ISPA Plastics 416564 M1 PMMA XT GOO tube 25x19 mm (inner diamter 19 mm, minimal length of 1.50 m)
Preclinical CT scanner Molecubes X-cube
Steel helmet custom made custom made diameter 10 mm and 3 mm thickness
Vetbond Tissue Adhesive 3M 1469SB
Vetergesic (buprenorphin) EcuPhar VETERG20 0.05 mk/kg
Xylocaine 2% gel AstraZeneca Xylocaine 2% gel
Xylocaine (lidocain 2%) Aspen/AstraZeneca Xylocaine 2% gel 100 μl injection
Diffusion MRI
Preclinical MRI acquisition software Bruker Biospin MRI GmbH Z400_PV51_CENTOS55 ParaVision 5.1 MRI software
Preclinical MRI scanner Bruker Biospin MRI GmbH PharmaScan 70/16 7T MRI scanner
Quadrature volume coil Bruker Biospin MRI GmbH RF RES 300 1H 075/040 QSN TR Model No: 1P T13161C3
Small animal physiological monitoring unit Rapid Biomedical EKGHR02-0571-043C01 Unit for respiratory monitoring
Water-based heating unit Thermo Fisher Scientific Haake S 5P Model No: 1523051
Anaesthesia
Anaesthesia movable unit Veterenary technics BDO - Medipass, Ijmuiden
isoflurane: Isoflo Zoetis B506
Oxygen generator Veterenary technics 7F-3 BDO - Medipass, Ijmuiden
Diffusion image processing
Amide http://amide.sourceforge.net Version 1.0.5. Medical Imaging Data Examiner Toolbox (Loening AM, Gambhir SS, " AMIDE: A Free Software Tool for Multimodality Medical Image Analysis", Molecular Imaging, 2(3):131-137, 2003)
ExploreDTI http://www.exploredti.com Version 4.8.6 Toolbox for (pre-)processing and analysis of diffusion weighted MR images (Leemans A, Jeurissen B, Sijbers J, and Jones DK. ExploreDTI: a graphical toolbox for processing, analyzing, and visualizing diffusion MR data. In: 17th Annual Meeting of Intl Soc Mag Reson Med, p. 3537, Hawaii, USA, 2009)
MRtrix3 http://www.mrtrix.org Version 3.0_RC3-86-g4b523b41 Toolbox for (pre-)processing and analysis of diffusion weighted MR images

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References

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