轻度创伤性脑损伤大鼠海马学的高级扩散成像

Neuroscience

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Summary

这个程序的总体目标是获得轻度创伤性脑损伤大鼠海马的定量微结构信息。这是使用先进的扩散加权磁共振成像协议和基于兴趣区域的参数扩散图分析完成的。

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Braeckman, K., Descamps, B., Vanhove, C. Advanced Diffusion Imaging in The Hippocampus of Rats with Mild Traumatic Brain Injury. J. Vis. Exp. (150), e60012, doi:10.3791/60012 (2019).

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Abstract

轻度创伤性脑损伤 (mTBI) 是最常见的后天性脑损伤类型。由于创伤性脑损伤患者表现出巨大的变异性和异质性(年龄、性别、创伤类型、其他可能的病理等),动物模型在解开临床研究中局限性的因素方面发挥着关键作用。它们提供了一个标准化和受控的设置,以研究损伤的生物机制和TBI后的修复。然而,并非所有动物模型都有效地模仿了mTBI的漫射和微妙特性。例如,常用的受控皮质撞击 (CCI) 和横向流体撞击损伤 (LFPI) 模型利用颅骨切除术暴露大脑并引起广泛的焦部创伤,这在 mTBI 中并不常见。因此,这些实验模型对模拟mTBI无效。因此,应该使用适当的模型来调查 mTBI。大鼠的Marmarou降重模型导致类似的微结构改变和认知障碍,如在轻度创伤患者中看到;因此,此模型是为此协议选择的。传统的计算机断层扫描和磁共振成像 (MRI) 扫描通常显示轻度损伤后没有损伤,因为 mTBI 通常只引起细微和漫反射性损伤。通过扩散加权MRI,可以研究脑组织的微观结构特性,从而更深入地了解轻度创伤后的微观变化。因此,本研究的目标是获得选定感兴趣区域(即海马区)的定量信息,以跟踪轻度和扩散性脑损伤后的疾病进展。

Introduction

创伤性脑损伤(TBI)近年来越来越受到关注,因为很明显,这些脑损伤会导致终生认知、身体、情感和社会后果。尽管这种意识的提高,轻度TBI(mTBI,或脑震荡)仍然经常被少报和未确诊。MTBI被称为无声流行病,有mTBI病史的个人表现出较高的药物滥用率或精神问题2。由于损伤的漫不经其道和微妙性质,每年有一些 mTBI 患者未确诊,这在传统的计算机断层扫描 (CT) 或磁共振成像 (MRI) 扫描中通常不可见。这种脑损伤的放射性证据的缺乏导致了更先进的成像技术的发展,如扩散核磁共振成像,后者对微结构变化更敏感3。

扩散MRI允许在体内绘制微结构图,这种MRI技术在TBI研究4、5、6中得到了广泛的应用。从扩散张量中,计算小数各向异性(FA)和平均扩散率(MD),以量化损伤后微结构组织的变化。最近对 mTBI 患者的检查报告 FA 增加,受伤后 MD 减少,这可能表明斧肿胀7。相反,MD 的增加和 FA 的减少也被发现,并已被建议在水肿形成、斧头退化或纤维失调/中断8之后,在帕伦奇结构中造成破坏。这些混合的发现可以部分解释为mTBI由不同类型的冲击和严重性(例如,旋转加速度、钝力创伤、爆炸损伤或前者的组合)造成的显著临床异质性。然而,目前对于支撑微观结构组织变化的基本病理学和生物/细胞基础没有明确的共识。

动物模型提供了一个标准化和受控的设置,以更详细地研究损伤的生物机制和TBI后的修复。已经开发了几种TBI实验模型,代表了人类TBI的不同方面(例如,焦点与漫射创伤或旋转力造成的创伤)9,10。常用的动物模型包括受控皮质冲击(CCI)和横向流体打击损伤(LFPI)模型11,12。虽然实验参数可以很好地控制,但这些模型利用颅骨切除术来暴露大脑。颅骨或颅骨骨折在 mTBI 中并不常见;因此,这些实验模型对模拟 mTBI 无效。Marmarou等人13开发的冲击加速模型利用了从一定高度掉落到大鼠头部的重量,该模型由头盔保护。这种动物模型诱导类似的微结构改变和认知障碍,如在患有轻度创伤的患者中。因此,这种马尔马鲁降重模型适用于研究漫射mTBI14、15的成像生物标志物。

本报告演示了使用Marmarou降重模型在mTBI大鼠模型中应用先进的扩散MRI。首先演示如何诱发轻度和漫反射性创伤,然后使用扩散张量成像(DTI)模型进行分析。使用更先进的扩散模型[即扩散峰度成像(DKI)和白质道完整性(WMTI)模型]获得特定的生物信息。具体来说,使用传统的T2加权MRI和先进的扩散成像方案,在海马区进行轻度创伤和微结构变化评估。

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Protocol

该协议已获得根特大学动物伦理委员会(ECD 15/44Aanv)的批准,所有实验均按照欧盟委员会的准则(第2010/63/EU号指令)进行。

1. 动物准备和头盔附件

  1. 称一只雌性Wistar H大鼠(±250克或12周龄),并在充满旋索兰混合物(5%)的小感应室中麻醉和 O2至少 1 分钟。
  2. 在大鼠的颈部注射0.05mg/kg丁丙诺啡,将其送回家庭笼子,并让先发制人的麻醉至少30分钟生效。
    注:在30分钟的等待中,手术部位可以准备。
  3. 将加热垫保持在37°C的手术场下。将消毒手术器械放在用70%乙醇消毒的手术场上。
  4. 将大鼠放回感应室,对大鼠进行麻醉,直到它对爪子或尾巴捏合无反应。
  5. 将大鼠放在手术场上,并在侧尾静脉插入导管。接下来,刮掉大鼠的头,去除多余的毛皮,用氯西丁消毒头皮和手术区的其余部分。
  6. 在头皮中局部注射100 μL的2%利多卡因。
  7. 使用大小为 11 的手术刀进行中线切口,以暴露头骨,用小剪刀去除多余的膜。使用最大传播为 1 厘米的眼部斑点缩回皮肤。 此外,通过轻轻摩擦颅骨上的无菌棉芽,直到骨膜不再存在,去除穿孔。
  8. 在头骨上放一滴纸巾,在消毒金属盘上放一滴(直径为10毫米,厚度3毫米),作为头盔。在圆盘之前,将圆盘粘上大约三分之一,在胸膜后面粘上三分之二。让胶水干燥1分钟。

2. 创伤性脑损伤的诱导(TBI)

  1. 将大鼠放在定制的床上,用具有某些弹簧常数的泡沫床垫(参见材料表)。将大鼠直接放置在具有 450 g 黄铜重量的透明塑料管下,头盔尽可能水平。把老鼠从麻醉中分离下来。
  2. 将重量拉至 1 米,并在准备就绪时松开。确保第二个实验者在撞击后立即将大鼠从塑料管中移开,以防止第二次撞击。
    注:除步骤2.2外,假受伤的大鼠接受相同的实验程序(步骤1.1~2.7)。
  3. 将大鼠重新附着在麻醉中,通过导管注射1mL的生理溶液(0.9%NaCl),以减少血液动力学冲击。
    注:大鼠可能由于撞击而短暂停止呼吸。如果大鼠在2小时后不自发呼吸,请轻轻压缩胸部,以鼓励呼吸反射。
  4. 轻轻地从头骨上拉出头盔。从头骨和皮肤上去除任何残留的胶水,用手术缝合关闭切口。使用无菌施用器尖端涂抹局部麻醉凝胶。
  5. 把老鼠放在CT扫描仪的床上。使用侦察扫描确认正确位置。调整视场,使整个头部在一张床位置内成像。管理一般用途,低剂量CT扫描,以排除颅骨骨折。
    注:颅骨骨折是安乐死的主要原因。
  6. 将大鼠放在加热垫(37 °C)的干净笼子里。监控时间以恢复意识。一旦老鼠能够直立,老鼠就可以被送回家里的笼子里。
  7. 在TBI诱导后一天施用第二剂0.05mg/kg丁丙诺啡。

3. 扩散磁共振成像 (MRI)

注:扩散加权成像在创伤感应前后1天进行。

  1. 在充满亚夫兰混合物的小感应室中麻醉大鼠(5%)和 O2.当大鼠对爪子或尾巴捏合无反应时,将麻醉量降低至2%,流速为500 mL/min。
  2. 用牙棒和鼻锥将大鼠放在头部支架中,进行麻醉,然后向前滑动头部,直到大脑中心位于四合体积 MRI 线圈的中心水平。在眼睛上涂抹少量润滑膏,以防止角膜受到任何损伤。用一小块胶带固定头部,以避免在扫描过程中移动。
  3. 在大鼠胸部下方放置一个压力垫,以监测呼吸,用循环的温水加热毯和气泡包裹盖住大鼠,以保持大鼠温暖。在扫描之前,检查呼吸监测仪,以确保信号清晰且无噪音,并且呼吸周期一致。如有必要,重新定位压力垫。
    注:通过将麻醉水平调整在1%~2%之间,呼吸速率应保持在每1,200-1,700ms的1次呼吸之间。
  4. 将四合体积线圈滑过头部。根据线圈供应商提供的说明,将线圈的调谐和匹配电容器调整到适当的频率和阻抗。将扫描仪床推进到扫描仪孔中开始扫描。
  5. 获取默认的三平面侦察扫描("三翼"),以确保正确定位。
    1. 通过单击"新建扫描"并从协议列表中选择三位一体序列,将三位导器序列加载到扫描控制中。接下来,单击红绿灯按钮以开始扫描。
    2. 扫描完成后,在图像显示屏中加载扫描,并确保 1) 头部笔直,2) 大脑位于磁体和线圈的中心。如有必要,调整头部和/或扫描仪床的位置,并获取新的三边形扫描。
  6. 使用自动二阶闪闪发光协议调整本地磁场:如步骤 3.5.1 所述,将二阶微机协议加载到扫描控制中。接下来,单击"Acq"选项卡 |当前调整|在光谱仪控制工具窗口中对局部场均质性进行具体调整,以启动自动闪闪发光。
  7. 如步骤 3.5.1 所述,使用重新聚焦回声 (RARE) 序列将新的 T2 快速成像加载到扫描控件中。
    1. 使用默认设置获取 T2 加权图像,但以下参数除外:
    2. 打开"编辑扫描"选项卡,将重复时间 (TR) 和回声时间 (TE) 分别调整为 5,500 ms 和 37 ms。此外,修改视野和矩阵大小,以允许更高的平面内分辨率 109 μm x 109 μm(默认分辨率 = 156 μm x 156 μm)。确保切片厚度为 600 μm,切片数设置为 45,RARE 因子设置为 8。
    3. 打开几何编辑器,将切片包放置在正确的位置,包括大脑的球茎和小脑。
  8. 如步骤 3.5.1 所述,将 B_DIFFUSION 文件夹中的三个新的回声平面扩散加权自旋回波序列 (DtiEpi) 加载到扫描控制协议中。
    注:使用三种不同的扩散"壳",扩散张数成像(DTI)模型4、16、扩散峰度成像(DKI)模型17,白质道完整性(WMTI)模型18都可以估计。建议至少使用三个不同的 b 值,最高 b 值的最大值为 3000 s/mm 2,每个成像外壳17至少具有 15 个均匀间隔的方向。
    1. 除以下设置外,使用默认设置获取扩散加权图像 (DI):
    2. 打开"编辑扫描"选项卡并调整"几何"选项卡下的几何参数。将视野和矩阵大小调整为 105 x 105,以确保分辨率为 333 μm x 333 μm。
    3. 将切片方向设置为轴向,将切片数设置为 25,从而将切片厚度设置为 500 μm,将切片间距离设置为 600 μm。将读出方向修改为左-右。
    4. 单击"对比度"选项卡将回声时间调整为 24 毫秒,将重复时间调整为 6,250 毫秒。
    5. 将带宽设置为 250,000 Hz 并打开脂肪抑制。将平均值数调整为 1。
    6. 单击"研究"选项卡,将平均值(EPI 段)数更改为 4。
    7. 单击研究选项卡中的"扩散"选项卡。对三个扩散壳中的每一个分别执行此步骤。
      1. 将第一个壳体的扩散方向数调整为 32,第二个壳体调整为 46,第三个壳体调整 64 个。
      2. 使用自定义渐变方向文件调整渐变方向。
      3. 将第一个壳体的 B0 图像数更改为 5,将第三个壳体更改为 5 个,将 B0 图像数更改为 7。
      4. 将每个方向的 b 值调整为第一个壳体的 800 s/mm 2,第二个壳壳的 b 值为 1500 s/mm2,第三个壳体将 2000 s/mm 2 调整为 2000 s/mm2。
        注: 使用自定义渐变方向文件可以手动调整渐变方向,通过使用 DTI_SET_DIRECTIONS 宏将"输入扩散方向"设置为"是"或自动完成。
    8. 打开几何编辑器,将视场放在仅包含大脑的球茎和小脑之间,以减少伪影和扫描时间。在大脑外放置 6 个 5 mm 的饱和带,通过单击饱和度并使用滚动条滑动首选位置的色带来减少伪影。
      注:灯泡和小脑可以根据解剖地标和三人机扫描的三个图像来识别。
  9. 通过单击红绿灯符号获取导入的序列。使用上述参数的设置,T2-RARE 扫描的采集时间是 12 分钟,第一个 DWI 外壳为 15 分钟,第二个 DWI 外壳为 21 分钟,第三个外壳的采集时间为 30 分钟。总采集时间约为 80 分钟(在单个接收器通道系统上)。
  10. 完成扫描协议后,将动物从扫描仪床上取出,并将动物置于一个干净的笼子里,在37°C下放置一个带加热垫的笼子。当动物恢复意识时,将动物送回家庭笼子。

4. 图像处理

注:在以下各节中,在 MRtrix3、ExploreDTI19和阿米德软件20中介绍了扩散图像的处理,这些软件是开放式访问工具箱。但是,预处理步骤可以在其他工具箱中执行(例如,FSL、MedInria、DTIStudio)。

  1. 通过导出 2dseq 文件从采集控制台传输采集的数据。
  2. 将 2dseq 文件(原始 DWI 文件)转换为 .mif 格式,这是 MRtrix3 的标准格式,以允许在 MRtrix3 中进一步的预处理步骤。此外,使用 shell 中的以下命令将三个扩散壳串联:
    转换_布鲁克 pdata/1/2dseq ratID_T2.mih(对于 T2 加权图像)
    转换_布鲁克pdata/1/2dseq ratID_dwi1.mih(用于第一个扩散外壳)
    转换_布鲁克pdata/1/2dseq ratID_dwi2.mih(用于第二个扩散外壳)
    转换_布鲁克pdata/1/2dseq ratID_dwi3.mih(用于第三个扩散外壳)
    mrcat ratID_dwi1.mif ratID_dwi2.mif ratID_dwi3.mif ratID_dwi.mif
  3. 在 MRtrix321、22中对 DWY 执行噪声校正和吉布斯振铃校正。此外,使用以下命令将更正后的 DWI 图像和 T2 图像转换为 NIFTI 格式:
    dwide噪声 ratID_dwi.mif ratID_dwi_denoise.mif
    姆德吉布斯·拉迪德·德维·德诺姆德.米夫·拉迪德·德维·德格·格里夫
    mrconvert ratID_dwi_denoised_gr.mif ratID.nii
    mr 转换 ratID_T2.mif ratID_T2.nii
  4. 在"探索DTI"中对EPI、运动和涡流失真执行校正:
    1. 单击"计算 DTI_.mat 文件"将 NIFTI 图像转换为 .mat 文件 |将原始数据转换为 DTI_.mat 文件。将扩散张量估计更改为线性称重,将 b 值更改为 NaN。将体素大小调整为 0.333 0.333 0.6,将非 DWI 图像数调整为 17,将 DWI 图像数调整为 142,将矩阵大小调整为 105 105 25。
      注: 通过将 b 值设置为 NaN,ExploreDTI 会将数据集视为峰度数据集。
    2. 单击"设置"选项卡可调整 EPI 校正的设置(默认情况下关闭)。选择SM/EC/EPI 校正,也注册到其他数据?然后单击"是",执行 EPI 校正(非刚性)。指定与扩散数据集对应的解剖 T2 图像的后缀。
      注: 使用未失真的解剖图像和扩散图像之间的图像配准,探索DTI可校正EPI失真。
    3. 单击"插件"选项卡,选择主题运动和 EC/EPI 失真的校正,然后从步骤 2.3 中选择预处理的扩散数据文件。确保 T2 图像位于同一文件夹中,并且与扩散数据文件名具有相同的基础(例如,DWI 的 rat1.nii 和解剖图像的 rat1_T2.nii)。此步骤将生成"本机"(_native.mat)和"已转换"文件(_trafo.mat)。
  5. 通过单击"插件"并将内容导出到 *.nii并选择 DTI 模型的参数映射(分数各向异性 (FA)、均差率 (MD)、径向扩散率 (RD) 和轴向扩散率 (AD;表示为"最大值 L1")。
  6. 此外,导出峰度模型(MK、AK 和 RK)和 WMTI 模型(AWF、AxEAD、RadEAD 和 TORT)的参数映射。对扩散图像的处理将产生12个参数图(图1,图2,图3),可用于进一步的微观结构分析。
  7. 使用 MRtrix3 为每个大鼠的海马创建掩码文件。
    1. 通过单击工具和 ROI编辑器,在 MRtrix 查看器中加载大鼠的 FA 图像。
    2. 单击"+"按钮,然后按"编辑"来绘制包含海马的每个切片上的 ROI(图 4)。要从绘制的 ROI 中擦除不需要的区域,请按鼠标右键。
    3. 完成 ROI 的绘制后,单击"保存"按钮保存蒙版图像。
      注: 此掩码文件将是一个二进制 NIFTI 图像文件,体素值 1 包含海马组织,其余体素的值为 0。为了标准化大鼠海马区域,参数化图可以与具有预定义感兴趣的区域(划定23)或大鼠大脑图集的研究特定模板共同注册。
  8. 要提取大鼠海马的扩散指标,请使用步骤 4.6 创建的掩膜文件并打开 Amide 软件。
    1. 打开大鼠的参数化贴图和蒙版图像。
    2. 要将蒙版文件的 ROI 添加到阿米德,请选择蒙版文件图像,单击"编辑 |增加投资回报率 |3D 等值,然后单击蒙版图像中显示的 ROI。为 ROI 指定一个有意义的名称,并确认此卷应仅包含具有值为 1 的体素。
    3. 要计算海马中扩散指标的平均值,请单击"工具" |计算 ROI 统计信息并指示应包括的图像和 ROI。单击"执行"后,将弹出另一个屏幕,其中显示可用于进一步统计分析的计算值。此文件可以保存或复制到首选数据格式(例如.xlsx 或 .csv 文件)。

5. 统计分析

注:在以下各节中,我们描述了SPSS统计24中扩散图像的处理;但是,统计分析可以在其他统计工具箱中执行。

  1. 在 SPSS *.sav 文件中以宽格式加载数据。
  2. 要测试每个时间点(即基线或受伤后 1 天)两个组之间的统计差异,请单击"分析" |非参数测试 |旧对话框 |2 独立样品测试。加载需要测试的变量并指定组(即 TBI 和假组)。将曼惠特尼 U 指示为测试类型。
  3. 要测试每个组中的 2 个时间点之间的统计差异,需要拆分数据文件。转到"转到数据",拆分文件并指示比较组接下来,单击"分析"、"非参数测试"、"旧对话框"、"2 个相关样本测试",加载需要比较的变量,并将 Wilcoxon 指示为测试类型。
    注: 为了纠正多个比较,使用 Bonferroni 校正(即 p 值除以比较的参数数(DTI 4、DKI 3 和 WMTI 4))调整每个扩散模型的 p 值。更具体地说,p < 0.0125 被认为对 DTI 和 WMTI 型号很重要,p < 0.016 对于 DKI 模型很重要。

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Representative Results

在这项研究中,所有TBI大鼠(n= 10)在撞击中幸存下来,并在从麻醉23分离后15分钟内从撞击和麻醉中恢复过来。在CT图像上,没有证据表明颅骨骨折,T2图像没有显示任何异常,如出血,心室扩大,或水肿形成在挫伤部位1天后(图5)。因此,根据这些对解剖图像的目视检查,没有检测到大的焦点病变,证实了损伤的扩散性和轻度性。

通过将 T2 图像的叠加添加到彩色编码的 FA 映射(图 6),检查了 T2 图像和扩散数据集(步骤 4.4)之间的共注册(非刚性)步骤的质量。然后,计算了 FA、MD、AD 和 RD 参数化映射(1),并将其加载到 Amide 软件中。基于 FA 地图,绘制了包括海马结构在内的 ROI(图 4)。在感兴趣的区域内计算扩散指标的统计值平均值,并导出每个 DTI 指标的平均值以进行进一步分析。通过检查 DTI 指标中的异常值,可以执行扩散数据的另一个质量检查。例如,海马中的 FA 值应为 0.15 左右;因此,<0.10(表示各向异性扩散)或>0.30(数值在白质中可见)的值可被视为生物学上不可信的值。应拒绝进一步分析中的这些数据点。此外,还计算了扩散峰度模型的AK、RK和MK的平均值,以及WMTI模型的AWF、AxEAD、RadEAD和TORT的平均值(图2,图3)。

在我们的研究中,对 DTI 指标的分析显示,在 mTBI 组(图 7) 中影响后,FA 值显著增加(p = 0.007)和扩散值(MD 和 RD)(p = 0.007 和 p = 0.007)。RD 和 MD 的这些减少与假组显著不同(p = 0.005 和 p = 0.004)。扩散峰度指标显示,在影响后,RK (p = 0.005) 显著减少,但 AK 或 MK 没有变化(图 8)。使用 WMTI 模型,RadEAD (p = 0.007) 和 TORT(p = 0.007)在撞击后 1 天(图 9C,D) 中分别在 mTBI 组中显著减少和增加。沙姆组中的值未显示任何重大变化。

Figure 1
图1:分数各向异性(FA)、平均扩散率(MD)、轴向扩散率(AD)和径向扩散率(RD)的代表性参数图。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 2
图2:平均峰度(MK)、轴向峰度(AK)和径向峰度(RK)的代表性参数图。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 3
图3:轴状水分(AWF)、轴向和径向额外轴向扩散率(轴向、RadEAD)和扭曲率(TORT)的代表性参数图。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 4
图 4:在 MRtrix3 中创建掩码。在包含海马体体积的所有切片上,在海马周围绘制 ROI,该卷将保存为掩码文件。这可以单独为每个大鼠完成,也可以使用研究特定的模板掩码文件,每个参数化映射都可以共同注册到该文件。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 5
图5:碰撞后1天代表性的mTBI动物的CT和T2加权图像。CT 图像(顶行)不显示任何颅骨骨折。在T2加权图像(下排)上,没有出血、扩大心室或水肿形成。值得注意的是,水肿的形成是明显可见的,作为一个高度区域周围的伤口区域从手术干预。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 6
图6:在ExploreDTI中EPI、运动和涡流校正后,与解剖图像叠加的扩散数据集颜色编码FA映射。显示的是一个坏的更正和共同注册在左边和好的例子在右边。应确保颜色编码正确:红色方向为左-右(例如,语料库),前后方向为绿色,蓝色为劣等方向(例如,正音)。此外,颜色编码的 FA 图像应与解剖图像完美对齐。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 7
图7:假动物(n = 10)和mTBI动物(n = 10)的海马体扩散张数指标的变化。受其影响后,FA (A )显著增加,mTBI动物 (B、D) 的平均扩散率 (B) 和径向扩散率 (D ) 显著减少。在mTBI大鼠中,轴向扩散(C)没有观察到显著差异.假动物没有显示任何显著的 DTI 变化(\p < 0.0125)。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 8
图8:假动物(n = 10)和mTBI动物(n = 10)的海马体扩散峰度指标的变化。影响后,mTBI动物的RK(C)显著减少,但AK(B)或MK(A)没有变化。假动物没有显示任何变化(\p < 0.0166)。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 9
图 9:海马(n = 10)和 mTBI 动物(n = 10)的白质区完整性指标的变化。影响后,拉德(C)显著减少,mTBI动物TORT(D)显著增加,但AWF或AxEAD(A、B)没有变化。假动物没有显示任何变化(\p < 0.0125)。请点击此处查看此图的较大版本。

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Discussion

由于 mTBI 通常是扩散和细微损伤的结果,在 CT 和常规 MRI 扫描上没有异常,因此在轻度创伤后评估微结构损伤仍是一个挑战。因此,需要更先进的成像技术来可视化创伤的全部程度。扩散磁共振成像在TBI研究中的应用在过去十年中引起了更多的关注,其中扩散张量成像是最常用的5。DTI 模型的局限性是假设高斯扩散过程不是大脑微观结构的精确假设(由具有膜作为屏障的轴子和细胞组成的复杂网络组成),导致 DTI 指标不特定于基础生物微观结构24。扩散峰度成像是DTI模型的延伸,并试图描述非高斯扩散的程度17。这可能提供有关组织异质性或复杂性的其他信息。

虽然,DTI和DKI模型的缺点是它们只是扩散信号的表示,它代表了概率水位移剖面,但不特定于微观结构6。另一方面,基于峰度张量的白质片完整性模型是一种微结构映射技术,将先验生物信息(假设)纳入模型18。它将扩散信号属性到组织隔间,并可以更直接地评估生物属性。因此,这些生物物理模型可能为描述mTBI之后的异常提供新的信息,并克服这种非特异性问题6。利用这三种不同的模型,微结构改变和生物过程能够更详细地在mTBI之后可视化,特别是通过使用Marmarou降压模型。

马尔马鲁减肥模型易于使用,只需要小手术;然而,建议第二个实验者在第一次撞击后立即将大鼠从玻璃管中移开,以避免第二次撞击。此外,有时需要帮助大鼠在撞击后恢复呼吸反射。相当长的MRI协议,总采集时间约80分钟,是良好的耐受性,无论是假鼠和mTBI大鼠。虽然,在扫描过程中,重要的是要监测呼吸周期和调整麻醉,如果动物睡得太深或轻轻地。在采集期间和采集后保持动物温暖也很重要,直到大鼠完全清醒以避免体温过低。

在高级扩散MRI中,应尽可能避免运动伪影。减少扫描过程中运动的简单解决方案是使用牙杆,并使用一小块胶带或两个耳条固定头部(如果可用)。这确保了每次老鼠呼吸时头部不会上下移动。

使用高级扩散 MRI 协议,采集的图像必须经过几个(预)处理步骤,大多使用不同的软件工具,然后才能用于进一步分析。使用不同的软件工具来处理扩散加权图像的一个缺点是(通常)每个工具都使用自己的数据格式对梯度方向表进行编码。MRtrix3 将渐变信息与扩散加权图像一起存储在 .mif 文件中,而 ExploreDTI 则使用单独的文件 (B 矩阵) 来存储渐变方向。因此,请务必检查梯度方向是否从 MRtrix3 正确传输到探索DTI。这可以通过检查颜色编码在彩色编码的 FA 图像上是否正确(即,红色向左-向右方向(例如,语料库)、绿色前后方向和蓝色(例如,正数)的劣等方向来实现。彩色编码的FA图像也可用于检查扩散加权图像和结构T2加权图像之间的非刚性共配准过程的质量。

使用 ExploreDTI 提取参数化图,使用 DTI、DKI 和 WMTI 模型。DTI 模型为 MD、AD、RD 和 FA 提供参数化映射,而 DKI 模型为 MK、AK 和 RK 提供参数化映射。尽管计算了 WMTI 模型的四个指标(即 AWF、AxEAD、RadEAD、TORT),但无法在探索DTI中提取轴内扩散性 (IAD)。IAD可以使用WMTI模型25的开发人员提供的MATLAB工具获得。为此,扩散加权图像和梯度信息必须再次从探索DTI传输到Matlab。此步骤再次容易出现有关梯度信息编码的错误。此外,必须再次估计和计算峰度张数和 WMTI 参数。

采集图像的预处理、张量估计和参数图的计算需要很长的计算时间。在具有 8 个内核和 16 GB RAM 的服务器上,每个数据集需要 40 分钟 EPI、运动和涡流电流的校正。使用 ROI 分析,在碰撞之前和之后 1 天计算海马内部的平均值。然后,在 mTBI 组中量化了 DTI、DKI 和 WMTI 指标的更改。然而,在WMTI模型的DKI指标和AWF中,观察到了较大的主体间变异性,导致假组和mTBI组之间的基线值出现意外差异。这很可能是受调查区域内含有生物学上不可信的值(异常值)的体素的结果,在计算阿米德的平均值之前,可能会在今后的研究中过滤掉。

最后,该方案证明了在mTBI大鼠模型中,先进的扩散MRI在研究和量化海马微结构变化的可行性。使用三种不同的扩散模型,可以获得关于在mTBI之后导致条件的基础生物过程的补充信息。这标志着在mTBI生物标志物的开发上向前迈进了一步,这种标志物可能足够敏感,足以在轻微撞击后确定早期特定微结构变化。

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Disclosures

提交人没有利益冲突可披露。

Acknowledgments

作者要感谢研究基金会 - 佛兰德斯(FWO)支持这项工作(授权号:G027815N)。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Induction of trauma
0.9% NaCl physiologic solution B Braun 394496
brass weight 450g custom made custom made diamter 18mm and 210 mm height
catheter Terumo Versatus-W 26G
ethilon II Ethicon EH7824 FS-3, 4-0, 3/8, 16mm
Matrass Foam to Size Type E
Plexiglas tube ISPA Plastics 416564 M1 PMMA XT GOO tube 25x19 mm (inner diamter 19 mm, minimal length of 1.50 m)
Preclinical CT scanner Molecubes X-cube
Steel helmet custom made custom made diameter 10 mm and 3 mm thickness
Vetbond Tissue Adhesive 3M 1469SB
Vetergesic (buprenorphin) EcuPhar VETERG20 0.05 mk/kg
Xylocaine 2% gel AstraZeneca Xylocaine 2% gel
Xylocaine (lidocain 2%) Aspen/AstraZeneca Xylocaine 2% gel 100 μl injection
Diffusion MRI
Preclinical MRI acquisition software Bruker Biospin MRI GmbH Z400_PV51_CENTOS55 ParaVision 5.1 MRI software
Preclinical MRI scanner Bruker Biospin MRI GmbH PharmaScan 70/16 7T MRI scanner
Quadrature volume coil Bruker Biospin MRI GmbH RF RES 300 1H 075/040 QSN TR Model No: 1P T13161C3
Small animal physiological monitoring unit Rapid Biomedical EKGHR02-0571-043C01 Unit for respiratory monitoring
Water-based heating unit Thermo Fisher Scientific Haake S 5P Model No: 1523051
Anaesthesia
Anaesthesia movable unit Veterenary technics BDO - Medipass, Ijmuiden
isoflurane: Isoflo Zoetis B506
Oxygen generator Veterenary technics 7F-3 BDO - Medipass, Ijmuiden
Diffusion image processing
Amide http://amide.sourceforge.net Version 1.0.5. Medical Imaging Data Examiner Toolbox (Loening AM, Gambhir SS, " AMIDE: A Free Software Tool for Multimodality Medical Image Analysis", Molecular Imaging, 2(3):131-137, 2003)
ExploreDTI http://www.exploredti.com Version 4.8.6 Toolbox for (pre-)processing and analysis of diffusion weighted MR images (Leemans A, Jeurissen B, Sijbers J, and Jones DK. ExploreDTI: a graphical toolbox for processing, analyzing, and visualizing diffusion MR data. In: 17th Annual Meeting of Intl Soc Mag Reson Med, p. 3537, Hawaii, USA, 2009)
MRtrix3 http://www.mrtrix.org Version 3.0_RC3-86-g4b523b41 Toolbox for (pre-)processing and analysis of diffusion weighted MR images

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References

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  25. Matlab code DKI and WMTI model. Available from: https://github.com/NYU-DiffusionMRI/Diffusion-Kurtosis-Imaging (2019).

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