Avancerad diffusions avbildning i hippocampus hos råttor med mild traumatisk hjärnskada

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Det övergripande målet med detta förfarande är att få kvantitativ mikrostrukturell information av hippocampus i en råtta med mild traumatisk hjärnskada. Detta görs med hjälp av en avancerad diffusions-vägd magnetisk resonanstomografi protokoll och region-of-räntebaserad analys av parametriska diffusion kartor.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Braeckman, K., Descamps, B., Vanhove, C. Advanced Diffusion Imaging in The Hippocampus of Rats with Mild Traumatic Brain Injury. J. Vis. Exp. (150), e60012, doi:10.3791/60012 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Mild traumatisk hjärnskada (mTBI) är den vanligaste typen av förvärvad hjärnskada. Eftersom patienter med traumatisk hjärnskada uppvisar en oerhörd variation och heterogenitet (ålder, kön, typ av trauma, andra möjliga sjukdomar etc.), spelar djurmodeller en nyckelroll i att reda ut faktorer som är begränsningar i den kliniska forskningen. De ger en standardiserad och kontrollerad inställning för att undersöka de biologiska mekanismerna för skada och reparation efter TBI. Emellertid, inte alla djurmodeller efterlikna diffus och subtila karaktären av mTBI effektivt. Till exempel, den vanligen använda kontrollerad kortikal påverkan (CCI) och laterala Fluid slagverk skada (LFPI) modeller använder sig av en kraniotomi att exponera hjärnan och framkalla utbredd fokala trauma, som inte är vanligt förekommande i mTBI. Därför är dessa experimentella modeller inte giltiga för att efterlikna mTBI. Därför bör en lämplig modell användas för att undersöka mTBI. Den Marmarou vikt droppe modell för råttor inducerar liknande microstrukturella förändringar och kognitiva försämringar som ses hos patienter som upprätthåller milda trauma; därför valdes den här modellen för det här protokollet. Konventionell datortomografi och magnetisk resonanstomografi (MRI) skannar vanligtvis ingen skada efter en mild skada, eftersom mTBI inducerar ofta endast subtila och diffusa skador. Med diffusions viktad MRI är det möjligt att undersöka mikrostrukturella egenskaper hos hjärnvävnad, vilket kan ge mer insikt i de mikroskopiska förändringarna efter milt trauma. Därför är målet med denna studie att erhålla kvantitativ information av en utvald region-av-intresserar (dvs., Hippocampus) att följa upp sjukdomsprogression efter att ha fått en mild och diffus hjärnskada.

Introduction

Traumatisk hjärnskada (TBI) har fått mer uppmärksamhet under de senaste åren, eftersom det har blivit klart att dessa hjärnskador kan resultera i livslånga kognitiva, fysiska, känslomässiga och sociala konsekvenser1. Trots denna ökande medvetenhet, mild TBI (mTBI, eller hjärnskakning) är fortfarande ofta underrapporterat och odiagnostiserade. MTBI har refererats till som en tyst epidemi, och individer med en historia av mTBI visar högre grad av drogmissbruk eller psykiska problem2. Flera patienter med mTBI går odiagnostiserade varje år på grund av den diffusa och subtila karaktären av skadorna, som ofta inte syns på konventionell datortomografi (CT) eller magnetisk resonanstomografi (MRI) skannar. Denna brist på radiologiska bevis för hjärnskada har lett till utveckling av mer avancerade avbildningstekniker såsom diffusion MRI, som är känsligare för mikrostrukturella förändringar3.

Diffusion MRI möjliggör in vivo kartläggning av mikrostrukturen, och denna MRI-teknik har använts i stor utsträckning i TBI studier4,5,6. Från diffusions tensor, fraktionerad anisotropi (FA) och medel diffusivitet (MD) beräknas för att kvantifiera förändringen i den mikrostrukturella organisationen efter skada. Senaste recensionerna för mTBI patienter rapporterar ökningar av FA och minskningar av MD efter skada, vilket kan tyda på axonal svullnad7. Tvärtom, ökningar av MD och minskningar i FA finns också och har föreslagits för att ligga bakom störningar i parenkymal struktur efter ödembildning, axonal degeneration, eller fiber feljustering/störning8. Dessa blandade fynd kan delvis förklaras av den betydande kliniska heterogeniteten hos mTBI orsakad av olika slag och svårighetsgrad (t. ex. rotation-acceleration, trubbigt våld trauma, Blast skada eller kombination av den förstnämnda). Men för närvarande finns det ingen klar konsensus om den underliggande patologi och biologisk/cellulära grund som underbygger förändringar i den mikrostrukturella organisationen.

Djurmodeller ger en standardiserad och kontrollerad inställning för att undersöka biologiska mekanismer för skada och reparation efter TBI mer i detalj. Flera experimentella modeller för TBI har utvecklats och representerar olika aspekter av Human TBI (t. ex. fokal kontra diffust trauma eller trauma orsakad av rotations krafter)9,10. Vanligt förekommande djurmodeller inkluderar kontrollerad kortikal påverkan (CCI) och laterala Fluid slagverk skada (lfpi) modeller11,12. Även om de experimentella parametrarna kan vara väl kontrollerade, dessa modeller använder sig av en kraniotomi att exponera hjärnan. Kraniotomier eller skallfrakturer ses inte vanligt i mTBI; Därför är dessa experimentella modeller inte giltiga för att efterlikna mTBI. Den effekt accelerations modell som utvecklats av Marmarou et al.13 utnyttjar en vikt som tappas från en viss höjd på råttans huvud, som skyddas av en hjälm. Denna djurmodell inducerar liknande mikrostrukturella förändringar och kognitiva försämringar som ses hos patienter som upprätthåller milda trauma. Därför är denna marmarou vikt droppe modell lämpligt att undersöka Imaging biomarkörer för diffusa mtbi14,15.

Denna rapport visar tillämpningen av avancerad diffusion MRI i en mTBI råtta modell med Marmarou vikt droppe modell. Först visas är hur man inducerar en mild och diffus trauma, och analys med diffusion tensor imaging (DTI) modell tillhandahålls sedan. Specifik biologisk information erhålls med hjälp av mer avancerade diffusionsmodeller [dvs diffusion toppighet Imaging (DKI) och vit materia tarmkanalen integritet (wmti) modell]. Specifikt är mild trauma tillfogats och microstrukturella förändringar utvärderas sedan i hippocampus med konventionell T2-vägd MRI och en avancerad diffusion Imaging Protocol.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Protokollet har godkänts av djur etikkommittén vid universitetet i Gent (ECD 15/44Aanv), och alla experiment genomfördes i enlighet med Europeiska kommissionens riktlinjer (direktiv 2010/63/EU).

1. djur beredning och hjälm infästning

  1. Väg en kvinnlig Wistar H råtta (± 250 g eller 12 veckors ålder) och söva i en liten induktions kammare fylld med en blandning av isofluran (5%) och O2 i minst 1 min.
  2. Injicera råtta med 0,05 mg/kg buprenorfin subkutant i nacken, returnera den till hem buren, och tillåta förebyggande analgesi i minst 30 min för att ta en effekt.
    Obs: under 30 min vänta, operationsområdet kan förberedas.
  3. Placera en värmedyna hålls vid 37 ° c under Operations fältet. Placera de steriliserade kirurgiska instrumenten på det kirurgiska området som desinficerades med 70% etanol.
  4. Placera råttan tillbaka i induktions kammaren och söva råttan tills den är icke-lyhörd för en tass eller svans nypa.
  5. Placera råttan på Operations fältet och sätt in en kateter i den laterala svans venen. Nästa, raka råttans huvud, ta bort överflödig päls och desinficera hårbotten och resten av det kirurgiska området med klorohexidin.
  6. Injicera 100 μL av 2% lidokain lokalt i hårbotten.
  7. Gör en mittlinje snitt med en skalpell storlek 11 att exponera skallen, ta bort eventuella överskott membran med liten sax. Dra tillbaka huden med en ögats spekulum med en maximal spridning på 1 cm.  Dessutom, ta bort periostet genom att försiktigt gnugga en steril bomulls knopp över skallen tills periostet är inte längre närvarande.
  8. Lägg en droppe vävnads lim på skallen och en på den steriliserade metalliska skivan (diameter 10 mm och 3 mm tjocklek), som fungerar som hjälmen. Limma skivan ungefär en tredjedel före och två tredjedelar bakom bregma. Låt limmet torka i 1 min.

2. induktion av traumatisk hjärnskada (TBI)

  1. Placera råttan på skräddarsydd säng med en skummadrass av vissa vårkonstant (se tabell över material). Placera råttan direkt under ett transparent plaströr med en 450 g mässings vikt med hjälmen så horisontellt som möjligt. Ta bort råttan från anestesi.
  2. Dra vikten upp till 1 m och släpp när den är klar. Se till att en andra försöksledaren är närvarande för att flytta råttan bort från plaströr omedelbart efter påverkan för att förhindra en andra effekt.
    Anmärkning: de simulerade skadade råttor får samma experimentella förfarande (steg 1.1 – 2.7), med undantag för steg 2,2.
  3. Åter fästa råtta till anestesi och injicera 1 mL av fysiologisk lösning (0,9% NaCl) via katetern för att minska hemodynamiska chock.
    Obs: det är möjligt att råtta kort slutar andas på grund av påverkan. Komprimera försiktigt bröstkorgen om råttan inte spontant andas efter 2 s för att stimulera andningsreflexen.
  4. Ta bort hjälmen genom att försiktigt dra den från skallen. Ta bort eventuellt kvarvarande lim från skallen och huden och Stäng snittet med kirurgisk sutur. Applicera den lokala smärtlindring gel med en steril applikator spets.
  5. Placera råttan på sängen av CT-skannern. Bekräfta rätt position med hjälp av en Scout skanning. Justera synfält för att möjliggöra avbildning av hela huvudet inom en sängposition. Administrera en generell användning, låg dos datortomografi för att utesluta skallfrakturer.
    Anmärkning: skallfraktur är ett kriterium för eutanasi.
  6. Placera råttan i en ren bur på en värmedyna (37 ° c). Övervaka tiden för att återfå medvetandet. När råtta är duglig till sitta upprätt, den råtta kanna bli returnerat till hem bur.
  7. Administrera en andra dos på 0,05 mg/kg buprenorfin en dag efter TBI-induktion.

3. magnetisk resonanstomografi för diffusion (MRI)

Anmärkning: diffusion-vägd avbildning utförs före och 1 dag efter trauma induktion.

  1. Anesthetize råttan i en liten induktions kammare fylld med en blandning av isofluran (5%) och O2. När råttan är icke-lyhörd för en tass eller svans nypa minska anestesi till 2% med en flödeshastighet av 500 mL/min. överför djuret till skanner bädden i huvudets första liggande position.
  2. Placera råttan i huvudet hållaren med tänder bar och näsa konen, leverera anestesi, och skjut huvudet framåt tills mitten av hjärnan är i nivå med mitten av kvadratur volym MRI spole. Applicera smörj salva till ögonen i små mängder för att förhindra skador på hornhinnan. Fixera huvudet med en liten bit tejp för att undvika rörelse under skanning.
  3. Placera en tryckplatta under bröstkorgen av råtta för att övervaka andning och täcka råttan med en cirkulerande varmvatten värme filt och bubbelplast för att hålla råttan varm. Innan skanningen, kontrollera andnings monitorn för att säkerställa att signalen är klar utan buller och att andningscykeln är konsekvent. Flytta Tryck plattan om det behövs.
    Anmärkning: andningsfrekvensen bör hållas mellan 1 andetag per 1200 – 1700 MS genom att justera nivån av anestesi mellan 1% – 2%.
  4. Skjut kvadratur volym spole över huvudet. Justera inställning och matchande kondensatorer av spolen till rätt frekvens och impedans enligt de instruktioner som tillhandahålls av spolen säljaren. För in skanner bädden i skanner hålet för att börja skanna.
  5. Skaffa en standard Scout skanning med tre plan ("tripilot") för att säkerställa korrekt positionering.
    1. Ladda tripilot-sekvensen i skannings kontrollen genom att klicka på Ny skanning och välja tripilotsekvensen från protokoll listan. Klicka sedan på trafikljus knappen för att starta skanningen.
    2. När skanningen är klar, Ladda skanningen i bilden displayen och se till att 1) huvudet ligger rakt och 2) hjärnan är placerad i mitten av magnet och spole. Justera positionen för huvudet och/eller skanner bädden, om det behövs, och skaffa en ny tripilot-skanning.
  6. Justera det lokala magnetfältet med hjälp av en automatiserad andra ordningens mellanlägg-protokoll: Läs in det andra ordningens shim-protokoll i skannings kontrollen enligt beskrivningen i steg 3.5.1. Nästa, klicka på ACQ Tab | Aktuella justeringar | Metodspecifik justering för det lokala Fälthomogeniteten i fönstret för Spektrometerkontrollens verktygsfönster för att starta automatisk shimming.
  7. Ladda en ny T2 Rapid Imaging med Omfokuserad ekon (sällsynt) sekvens i skannings kontrollen som beskrivs i steg 3.5.1.
    1. Hämta T2-viktade bilder med standardinställningarna, med undantag för följande parametrar:
    2. Öppna fliken Redigera skanning och justera repetitions tiden (TR) och ECHO Time (te) till 5 500 ms respektive 37 MS. Ändra också synfält och matrisstorlek för att möjliggöra en högre in-plane-upplösning på 109 μm x 109 μm (standardupplösning = 156 μm x 156 μm). Kontrollera att segment tjockleken är 600 μm, att antalet segment är inställt på 45 och att RARE Factor är inställt på 8.
    3. Öppna geometri redigeraren och placera slice-paketet i rätt position, inklusive Bulbus av hjärnan och cerebellum.
  8. Ladda tre nya ECHO-planar diffusion-vägd spin-ECHO sekvens (DtiEpi) från mappen B_DIFFUSION i Scan Control Protocol som beskrivs i steg 3.5.1.
    Anmärkning: med hjälp av tre olika diffusion "skal", diffusion tensor imaging (DTI) modell4,16, diffusion toppighet Imaging (DKI) modell17, och vit materia tarmkanalen integritet (wmti) modell18 kan alla uppskattas. Det rekommenderas att använda minst tre olika b-värden, med det högsta b-värdet med högst 3000 s/mm2 med minst 15 jämnt fördelade riktningar per avbildnings skal17.
    1. Hämta diffusions viktade bilder (DWIs) med standardinställningarna, bortsett från följande inställningar:
    2. Öppna fliken Redigera skanning och justera de geometriska parametrarna under fliken geometri . Justera synfält och matrisstorlek till 105 x 105 för att säkerställa en upplösning på 333 μm x 333 μm.
    3. Ställ in segment orienteringen på axiellt och antalet segment till 25, vilket resulterar i en segment tjock lek på 500 μm och avståndet mellan segment på 600 μm. Ändra avläsning riktningen till vänster-höger.
    4. Klicka på fliken kontrast om du vill justera ECHO-tiden till 24 MS och repetitions tiden till 6 250 MS.
    5. Ställ in bandbredden till 250 000 Hz och vrid fett dämpning på. Justera antalet medelvärden till ett.
    6. Klicka på fliken forskning och ändra antalet MEDELVÄRDEN (EPI-segment) till 4.
    7. Klicka på fliken diffusion i fliken forskning. utför detta steg separat för vart och ett av de tre diffusions skalen.
      1. Justera antalet spridnings riktningar till 32 för det första skalet, 46 för det andra skalet och 64 för det tredje skalet.
      2. Justera övertoningsriktningen med anpassade övertoningsriktningar-filer.
      3. Ändra antalet B0-bilder till 5 för det första skalet, 5 för det andra skalet och 7 för det tredje skalet.
      4. Justera b-värdet per riktning till 800 s/mm2 för det första skalet, 1500 s/mm2 för det andra skalet och 2000 s/mm2 för det tredje skalet.
        Obs: justera gradienten riktningar med en anpassad gradient riktningar fil kan göras manuellt genom att Ange diffusion riktningar till Ja eller automatiskt med hjälp av makrot DTI_SET_DIRECTIONS.
    8. Öppna geometri redigeraren och placera synfält mellan Bulbus och lillhjärnan som innehåller endast storhjärnan att minska artefakt och skannings tid. Placera sex mättnad band på 5 mm utanför hjärnan för att minska artefakter genom att klicka på mättnad och glidande banden i önskad position med hjälp av rullningslisterna.
      Anmärkning: Bulbus och lillhjärnan kan identifieras baserat på anatomiska landmärken och de tre bilderna av tripilot Scan.
  9. Hämta de importerade sekvenserna genom att klicka på trafikljus symbolen. Med hjälp av inställningarna för parametrarna som beskrivs ovan, är förvärvs tiden för T2-RARE Scan 12 min, av det första DWI-skalet 15 min, av det andra DWI-skalet 21 min och det tredje skalet 30 min. Den sammanlagda förvärvs tiden är cirka 80 min (på ett enda mottagar kanalsystem).
  10. Vid slutförandet av skannings protokollet, ta bort djuret från skanner bädden och placera djuret i en ren bur med en värmedyna vid 37 ° c. Returnera djuret till hem buren när det återfår medvetandet.

4. bildbehandling

Anmärkning: i följande avsnitt, behandling av diffusions bilder beskrivs i MRtrix3, ExploreDTI19 och amide Software20 som är Open Access verktygslådor. Dock kan förbehandling steg utföras i andra verktygslådor (t. ex., FSL, MedInria, DTIStudio).

  1. Överför de förvärvade data från anskaffnings konsolen genom att exportera filen 2dseq.
  2. Konvertera 2dseq filer (RAW DWI-filer) i. MIF-format, vilket är standardformateringen av MRtrix3, för att möjliggöra ytterligare förbehandling steg i MRtrix3. Dessutom sammanfoga de tre diffusion skal med hjälp av följande kommandon i skalet:
    convert_bruker PDATA/1/2dseq ratID_T2. MIH (för T2-viktade bilder)
    convert_bruker PDATA/1/2dseq ratID_dwi1. MIH (för det första diffusions skalet)
    convert_bruker PDATA/1/2dseq ratID_dwi2. MIH (för det andra diffusions skalet)
    convert_bruker PDATA/1/2dseq ratID_dwi3. MIH (för det tredje diffusions skalet)
    mrcat ratID_dwi1. MIF ratID_dwi2. MIF ratID_dwi3. MIF ratID_dwi. MIF
  3. Utföra buller korrigering och Gibbs ringmärkning korrigering på DWIs i MRtrix321,22. Också, omvänd den korrigerat DWI profilen och T2 bild till NIFTI formaten användande den följande befallningen:
    dwidenoise ratID_dwi. MIF ratID_dwi_denoised. MIF
    mrdegibbs ratID_dwi_denoised. MIF ratID_dwi_denoised_gr. MIF
    mrconvert ratID_dwi_denoised_gr. MIF ratID. nii
    mrconvert ratID_T2. MIF ratID_T2. nii
  4. Utför korrigering för EPI, motion och Eddy Current snedvridningar i ExploreDTI:
    1. Konvertera NIFTI-avbildningarna till en. mat-fil genom att klicka på Beräkna DTI*. mat fil | Konvertera rådata till filen DTI*. mat. Ändra diffusion tensor uppskattning till vägd linjär och b-värdet till NaN. Justera Voxel-storleken till 0,333 0,333 0,6, antal icke-DWI-avbildningar till 17, antal DWI-avbildningar till 142 och matrisstorlek till 105 105 25.
      Anmärkningar: genom att ställa in b-värdet till nan, kommer exploredti betrakta datauppsättningen som en toppighet datauppsättning.
    2. Klicka på fliken Inställningar för att justera inställningarna för EPI-korrigering (detta är inaktiverat som standard). Välj SM/EC/EPI korrigering, även registrera dig till andra data? och klicka på Ja, att göra EPI korrigering (icke-styv). Ange suffixet för den anatomiska T2-bilden som motsvarar diffusions datauppsättning.
      Obs: ExploreDTI korrigerar för EPI snedvridningar med hjälp av bild registrering mellan den icke snedvridna anatomiska bilden och diffusion bilden.
    3. Klicka på fliken plugins och välj korrigering för ämne rörelse & EG/EPI snedvridningar och välj den förbehandlade diffusion datafilen från steg 2,3. Se till att T2-bilden finns i samma mapp och har samma bas som filnamnet för diffusions data (t. ex. rat1. nii för DWI och rat1_T2. nii för den anatomiska bilden). Detta steg kommer att generera en "Native" (* Native. mat) och "omvandlas" fil (* trafo. mat).
  5. Beräkna DTI mått för varje råtta genom att klicka på plugins och Exportera grejer till *. nii och välja PARAMETRISKA kartor av DTI-modellen: fraktionerad ANISOTROPI (FA), medel DIFFUSIVITET (MD), radiell DIFFUSIVITET (RD), och axiell DIFFUSIVITET (AD; betecknade som "största egen värdes L1").
  6. Dessutom exportera parametriska kartor för toppighet modellen (Mk, AK, och RK) och wmti Model (AWF, axead, radead och kränkning). Bearbetning av diffusions bilder kommer att resultera i 12 parametriska kartor (figur 1, figur 2, figur 3) som kan användas för ytterligare mikrostrukturell analys.
  7. Skapa en mask fil för Hippocampus varje råtta med hjälp av MRtrix3.
    1. Ladda FA bild av råtta i MRtrix Viewer genom att klicka på verktyg och ROI redaktör.
    2. Skapa en ny ROI genom att klicka på knappen "+" och tryck på Redigera för att rita ROI på varje sektor som innehåller Hippocampus (figur 4). För att radera oönskade områden från ROI dras, tryck på höger musknapp.
    3. När ritningen av ROI är klar, spara mask bilden genom att klicka på knappen Spara .
      Obs: denna mask fil kommer att vara en binär NIFTI bildfil med voxels av värde 1 som innehåller Hippocampus vävnad, och resterande voxels kommer att ha värden 0. För att standardisera regionen av hippocampus över råttor, parametriska kartor kan vara co-registrerade med en studie specifik mall med fördefinierade regioner av intresse avgränsas23 eller en råtta hjärna Atlas.
  8. För att extrahera diffusions måtten i hippocampus av råtta, Använd den skapade mask fil av steg 4,6 och öppna amide programvara.
    1. Öppna parametriska kartor och mask bild av råtta.
    2. Om du vill lägga till ROI för mask filen i Amid väljer du mask fils bilden, klickar på Redigera | Lägg till ROI | 3D Isocontour och klicka på ROI visas i mask bilden. Ge ROI ett beskrivande namn och bekräfta att den här volymen endast ska innehålla voxels som har värdet en.
    3. För att beräkna medelvärdena för diffusions måtten i hippocampus, klicka på verktyg | Beräkna ROI-statistik och ange de bilder och ROI som ska inkluderas. När du har klickat på Körkommer en annan skärm att dyka upp med beräknade värden som kan användas för ytterligare statistisk analys. Den här filen kan antingen sparas eller kopieras till ett önskat dataformat (t. ex. xlsx-eller CSV-fil).

5. statistisk analys

Anmärkning: i följande avsnitt beskrivs bearbetning av diffusion bilder i SPSS statistik 24; den statistiska analysen kan dock utföras i andra statistiska verktygslådor.

  1. Läs in data i det breda formatet i en SPSS *. sav-fil.
  2. Om du vill testa statistiska skillnader mellan de två grupperna för varje tidspunkt (dvs. baslinje eller 1-dag efter skada) klickar du på analysera | Icke-parametriska tester | Äldre dialoger | 2 oberoende prover tester. Läs in variablerna som behöver testas och ange grupperna (t. ex. TBI-och Sham-grupper). Ange Mann-Whitney U som test typ.
  3. För att testa statistiska skillnader mellan den 2 tidspunkten inom varje grupp måste datafilen delas upp. Gå till gå till data, dela fil och ange Jämför grupper. Nästa, klicka på analysera, nonparametric tester, Legacy dialoger, 2 relaterade prover tester, Ladda variabler som måste jämföras och indikerar Wilcoxon som testtyp.
    Anmärkning: för att korrigera för flera jämförelser, p-värden justeras för varje diffusion modell med Bonferroni korrigering [dvs p-värde dividerat med antalet parametrar jämfört (DTI 4, DKI 3, och WMTI 4)]. Mer specifikt, p < 0,0125 anses vara betydande för DTI och WMTI modeller, och p < 0,016 anses vara betydande för DKI-modellen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

I studien överlevde alla TBI råttor (n = 10) effekten och kunde återhämta sig från påverkan och anestesi inom 15 min efter avlossning från anestesi23. På CT-bilder, det fanns inga tecken på skallfrakturer och T2-bilderna visade inte några avvikelser såsom blödning, förstorade ventriklar, eller ödem bildas vid kontusion webbplats 1 dag efter trauma (figur 5). Således, baserat på dessa visuella inspektioner av de anatomiska bilderna, stora fokala lesioner upptäcktes inte, bekräftar diffus och mild karaktär av skadan.

Kvaliteten på coregistration (icke-styv) steg mellan T2 bild och diffusion datauppsättning (steg 4,4) undersöktes genom att lägga till en överlagring av T2-bilden till den färgkodade FA-kartan (figur 6). Därefter beräknades FA-, MD-, AD-och RD-parametriska kartor (figur 1) och laddas in i Amid-programvaran. Baserat på FA-kartan, en ROI inklusive Hippocampus struktur drogs (figur 4). Statistiska värden för diffusions måtten beräknades i genomsnitt över alla voxels inom intresseregionen och medelvärdena för varje DTI-mått exporterades för vidare analys. En annan kvalitetskontroll av diffusions data kan utföras genom att inspektera extremvärden i DTI-statistiken. Till exempel, FA värden i hippocampus bör vara runt 0,15; Därför kan värden på < 0,10 (som betecknar isotropisk diffusion) eller > 0,30 (värden ses i vit substans) betraktas som biologiskt osannolika värden. Dessa datapunkter bör avvisas från ytterligare analys. Dessutom beräknades medelvärdena för AK, RK och MK för diffusions modellen samt AWF, AxEAD, RadEAD och kränkning av WMTI-modellen (figur 2, figur 3).

I vår studie visade analys av DTI-måtten signifikanta ökade FA-värden (p = 0,007) och minskade diffusivitetsvärden (MD och RD) (p = 0,007 respektive p = 0,007) efter påverkan i mTBI-gruppen (figur 7). Dessa minskningar av RD och MD var signifikant annorlunda jämfört med den simulerade gruppen (p = 0,005 och p = 0,004, respektive). Diffusion toppighet mått visade en signifikant minskning i RK (p = 0,005) efter påverkan men inga förändringar i AK eller MK (figur 8). Med hjälp av WMTI-modellen uppvisade RadEAD (p = 0,007) och kränkning (p = 0,007) en signifikant minskning respektive ökning i mTBI-gruppen 1 dag efter påverkan (figur 9C, D). Värdena i Sham-gruppen visade inga signifikanta ändringar.

Figure 1
Figur 1: representativa parametriska kartor för fraktionerad anisotropi (FA), genomsnittlig diffusivitet (MD), axiell diffusivitet (AD) och radiell diffusivitet (RD). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: representativa parametriska kartor för genomsnittlig toppighet (Mk), axiell toppighet (AK) och radiell toppighet (RK). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: representativa parametriska kartor för axonal vatten fraktion (AWF), axiell och radiell extra axonal diffusivitet (AxEAD, RadEAD) och tortuosity (skadeståndsgrundande). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: skapa en mask i MRtrix3. En ROI dras runt Hippocampus på alla skivor som innehåller volymen av hippocampus, och volymen sparas som en mask fil. Detta kan antingen göras för varje råtta individuellt eller genom att använda en studie specifik mall mask fil som var och en av de parametriska kartorna kan medregistreras. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5: CT-och T2-viktade bilder av ett representativt mTBI-djur 1 dag efter påverkan. CT-bilder (översta raden) visar inte några skallfrakturer. På T2-viktade bilder (nedersta raden) ingen blödning, förstorade ventriklar, eller ödem bildas visades. Notera, ödem bildas är klart synlig som en hyperintensiva område runt såret området från kirurgiska ingrepp. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 6
Figur 6: FÄRGKODAD FA-karta över diffusion datauppsättning överlagt med anatomiska bilden efter korrigering för EPI, motion, och Eddy Current korrigering i ExploreDTI. Visas är en dålig korrigering och medregistrering till vänster och goda exempel till höger. Det bör säkerställas att färgkodningen är korrekt: vänster-höger riktning i rött (t. ex. corpus callosum), främre-posterior riktning i grönt, och sämre-överlägsen riktning i blått (t. ex., cingulum). Dessutom bör den färgkodade FA-bilden vara perfekt justerad med den anatomiska bilden. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 7
Figur 7: förändringar i diffusion tensor Metrics av hippocampus för Sham (n = 10) och mTBI djur (n = 10). Efter påverkan observerades en signifikant ökning av FA (a) och betydande minskningar av medelvärdet för diffusivitet (b) och Radialdiffusivitet (D) i mtbi-djuren (b, D). Inga signifikanta skillnader observerades för axiell diffusivitet (C) i mtbi råttor. De simulerade djuren visade inga signifikanta förändringar av DTI (* p < 0,0125). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 8
Figur 8: förändringar i diffusion toppighet-värden i hippocampus för Sham (n = 10) och mtbi-djur (n = 10). Efter påverkan, det fanns en signifikant minskning i RK (C) av mtbi djuren men inga förändringar i AK (B) eller MK (a). De simulerade djuren visade inga förändringar (* p < 0,0166). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 9
Figur 9: förändringar i vit materiens integritets statistik för Hippocampus för Sham (n = 10) och mTBI-djur (n = 10). Efter påverkan var det en betydande minskning i RadEAD (C) och betydande ökning av skadestånd (D) av mtbi djuren men ingen förändring i AWF eller AxEAD (a, B). De simulerade djuren visade inga förändringar (* p < 0,0125). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Eftersom mTBI ofta är resultatet av en diffus och subtil skada som inte visar några avvikelser på CT och konventionella MRI-skanningar, är utvärderingen av mikrostrukturella skador efter ett milt trauma fortfarande en utmaning. Därför krävs mer avancerade avbildningstekniker för att visualisera den fulla omfattningen av trauman. Tillämpningen av diffusion magnetisk resonanstomografi i TBI forskning har fått mer intresse under det senaste decenniet, där diffusion tensor imaging används mest5. En begränsning av DTI-modellen är antagandet av en Gaussisk diffusions process som inte är ett exakt antagande för hjärnans mikrostruktur (bestående av ett komplext nätverk av axoner och celler med membran som fungerar som barriärer), vilket resulterar i DTI-mätningar som inte är specifika för underliggande biologiska mikrostruktur24. Diffusion toppighet Imaging är en förlängning av DTI-modellen och försök att karakterisera graden av icke-Gaussisk diffusion17. Detta kan ge ytterligare information om vävnadernas heterogenitet eller komplexitet.

Though, en nackdel av DTI och DKI modellerar är att de är endast en framställning av diffusionen signalerar, som karakteriserar det probabilistiska bevattnar förskjutnings profilen men är inte specifik till mikrostruktur6. Å andra sidan är den vita materie tarmkanalen integritets modell baserad på toppighet tensor en mikrostrukturell kartläggning teknik som innehåller a priori biologisk information (antaganden) i modell18. Det attribut diffusions signalen till vävnad fack och kan bedöma biologiska attribut mer direkt. Dessa biofysiska modeller kan således erbjuda ny information för att beskriva avvikelser efter mTBI och övervinna denna icke-specificitet fråga6. Med hjälp av dessa tre olika modeller, mikrostrukturella förändringar och biologiska processer kunde visualiseras efter mTBI mer i detalj, särskilt genom att använda Marmarou vikt droppe modell.

Den Marmarou vikt droppe modellen är lätt att använda och kräver endast mindre kirurgi; emellertid, en andra försöksledaren rekommenderas att flytta råttan bort från glaset röret omedelbart efter den första effekten för att undvika en andra en. Dessutom, det är ibland krävs för att hjälpa råttan återfå sin andnings reflex efter påverkan. Den ganska långa MRI-protokollet, med en total förvärvs tid på cirka 80 min, tolereras väl av både bluff och mTBI råttor. Men under skanning, är det viktigt att övervaka andningscykeln och justera anestesi om djuret sover för djupt eller lätt. Det är också viktigt att hålla djuret varmt både under och efter förvärvet tills råttan är helt vaken för att undvika hypotermi.

I avancerad diffusion MRI, bör rörelse artefakter undvikas så mycket som möjligt. En enkel lösning för att minska rörelse under skanning är att använda en tänder bar och fixera huvudet med en liten bit tejp eller två öron stänger, om det finns. Detta säkerställer att huvudet inte kommer att flytta upp och ner varje gång råttan tar ett andetag.

Använda avancerad diffusion MRI-protokoll, de förvärvade bilderna måste passera genom flera (pre-) bearbetning steg, främst med hjälp av olika mjukvaruverktyg, innan de kan användas för ytterligare analys. En nackdel med att använda olika program verktyg för att bearbeta diffusions viktade bilder är att (ofta) varje verktyg använder sitt eget dataformat för att koda tabellen övertoningsriktningar. MRtrix3 lagrar övertoningsinformationen tillsammans med den diffusions viktade bilden i en. MIF-fil, medan ExploreDTI använder en separat fil (B-Matrix) för att lagra övertoningsriktningen. Därför är det viktigt att kontrollera att gradienten riktningar överförs korrekt från MRtrix3 till ExploreDTI. Detta kan göras genom att kontrollera att färgkodning är korrekt på färg kodade FA-bilder [dvs vänster-höger riktning i rött (t. ex. corpus callosum), främre-posterior riktning i grönt, och sämre-överlägsen riktning i blått (t. ex., cingulum)]. De färgkodade FA-bilderna kan också användas för att kontrollera kvaliteten på den icke-stela medregistreringprocessen mellan de diffusions viktade bilderna och de strukturella T2-viktade bilderna.

Använda ExploreDTI, parametriska kartor extraherades med hjälp av DTI, DKI, och WMTI modeller. DTI-modellen gav parametriska kartor för MD, AD, RD och FA, medan DKI-modellen ger parametriska kartor för MK, AK och RK. Även om fyra mätningar av WMTI-modellen beräknades (dvs. AWF, AxEAD, RadEAD, kränkning), var det inte möjligt att extrahera intra-axonal diffusivitet (IAD) inom ExploreDTI. IAD kan erhållas med hjälp av ett MATLAB-verktyg som tillhandahålls av utvecklarna av WMTI Model25. För att göra detta måste de diffusions viktade bilderna och övertoningsinformationen överföras igen från ExploreDTI till MATLAB. Det här steget är återigen benägna att fel som rör kodning av övertoningsinformation. Dessutom måste toppighet tensor och wmti-parametrarna uppskattas och beräknas på nytt.

Förbehandling av de förvärvade bilderna, uppskattning av Tensors, och beräkning av parametriska kartor kräver en lång tid av dator tid. Korrigeringar för EPI, motion och Eddy Current krävs ~ 40 min per datauppsättning på en server med åtta kärnor och 16 GB RAM. Med hjälp av en ROI-analys, medel värden inom Hippocampus beräknades före och 1 dag efter påverkan. Ändringar i DTI-, DKI-och WMTI-måtten kvantifierades sedan i mTBI-gruppen. Men i DKI Metrics och AWF av WMTI modellen observerades stora Inter-ämne variation, vilket resulterade i en oväntad skillnad i baseline värden mellan Sham och mTBI grupper. Detta är troligtvis resultatet av voxels som innehåller biologiskt osannolika värden (avvikare) inom den undersökta regionen och kan filtreras ut i framtida studier före beräkning av medelvärdena i Amid.

Sammanfattningsvis visar detta protokoll genomförbarheten av avancerad diffusion MRI för att undersöka och kvantifiera mikrostrukturella förändringar i hippocampus i en råtta modell av mTBI. Med hjälp av tre olika spridningsmodeller kan kompletterande information erhållas om de underliggande biologiska processerna som bidrar till förutsättningarna efter mTBI. Detta är ett steg framåt i utvecklingen av biomarkörer för mTBI som kan vara tillräckligt känsligt för att identifiera specifika mikrostrukturella förändringar i den tidiga fasen efter mild påverkan.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inga intressekonflikter att avslöja.

Acknowledgments

Författarna skulle vilja tacka Research Foundation-Flanders (FWO) för att stödja detta arbete (Grant Number: G027815N).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Induction of trauma
0.9% NaCl physiologic solution B Braun 394496
brass weight 450g custom made custom made diamter 18mm and 210 mm height
catheter Terumo Versatus-W 26G
ethilon II Ethicon EH7824 FS-3, 4-0, 3/8, 16mm
Matrass Foam to Size Type E
Plexiglas tube ISPA Plastics 416564 M1 PMMA XT GOO tube 25x19 mm (inner diamter 19 mm, minimal length of 1.50 m)
Preclinical CT scanner Molecubes X-cube
Steel helmet custom made custom made diameter 10 mm and 3 mm thickness
Vetbond Tissue Adhesive 3M 1469SB
Vetergesic (buprenorphin) EcuPhar VETERG20 0.05 mk/kg
Xylocaine 2% gel AstraZeneca Xylocaine 2% gel
Xylocaine (lidocain 2%) Aspen/AstraZeneca Xylocaine 2% gel 100 μl injection
Diffusion MRI
Preclinical MRI acquisition software Bruker Biospin MRI GmbH Z400_PV51_CENTOS55 ParaVision 5.1 MRI software
Preclinical MRI scanner Bruker Biospin MRI GmbH PharmaScan 70/16 7T MRI scanner
Quadrature volume coil Bruker Biospin MRI GmbH RF RES 300 1H 075/040 QSN TR Model No: 1P T13161C3
Small animal physiological monitoring unit Rapid Biomedical EKGHR02-0571-043C01 Unit for respiratory monitoring
Water-based heating unit Thermo Fisher Scientific Haake S 5P Model No: 1523051
Anaesthesia
Anaesthesia movable unit Veterenary technics BDO - Medipass, Ijmuiden
isoflurane: Isoflo Zoetis B506
Oxygen generator Veterenary technics 7F-3 BDO - Medipass, Ijmuiden
Diffusion image processing
Amide http://amide.sourceforge.net Version 1.0.5. Medical Imaging Data Examiner Toolbox (Loening AM, Gambhir SS, " AMIDE: A Free Software Tool for Multimodality Medical Image Analysis", Molecular Imaging, 2(3):131-137, 2003)
ExploreDTI http://www.exploredti.com Version 4.8.6 Toolbox for (pre-)processing and analysis of diffusion weighted MR images (Leemans A, Jeurissen B, Sijbers J, and Jones DK. ExploreDTI: a graphical toolbox for processing, analyzing, and visualizing diffusion MR data. In: 17th Annual Meeting of Intl Soc Mag Reson Med, p. 3537, Hawaii, USA, 2009)
MRtrix3 http://www.mrtrix.org Version 3.0_RC3-86-g4b523b41 Toolbox for (pre-)processing and analysis of diffusion weighted MR images

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Carroll, L. J., et al. Systematic Review of the Prognosis After Mild Traumatic Brain Injury in Adults. Cognitive, Psychiatric, and Mortality Outcomes: Results of the International Collaboration on Mild Traumatic Brain Injury Prognosis. Archives of Physical Medicine and Rehabilitation. 95, (3), S152-S173 (2014).
  2. Buck, P. W. Mild Traumatic Brain Injury: A Silent Epidemic in Our Practices. Health & Social Work. 36, (4), 299-302 (2011).
  3. Bodanapally, U. K., Sours, C., Zhuo, J., Shanmuganathan, K. Imaging of Traumatic Brain Injury. Radiologic Clinics of North America. 53, (4), 695-715 (2015).
  4. Basser, P. J., Mattiello, J., LeBihan, D. MR diffusion tensor spectroscopy and imaging. Biophysical Journal. 66, (1), 259-267 (1994).
  5. Hulkower, M. B., Poliak, D. B., Rosenbaum, S. B., Zimmerman, M. E., Lipton, M. L. A Decade of DTI in Traumatic Brain Injury: 10 Years and 100 Articles Later. American Journal of Neuroradiology. 34, (11), 2064-2074 (2013).
  6. Hutchinson, E. B., Schwerin, S. C., Avram, A. V., Juliano, S. L., Pierpaoli, C. Diffusion MRI and the detection of alterations following traumatic brain injury. Journal of Neuroscience Research. 96, (4), 612-625 (2018).
  7. Wallace, E. J., Mathias, J. L., Ward, L. Diffusion tensor imaging changes following mild, moderate and severe adult traumatic brain injury: a meta-analysis. Brain Imaging and Behavior. 1-15 (2018).
  8. Rutgers, D. R., et al. White Matter Abnormalities in Mild Traumatic Brain Injury: A Diffusion Tensor Imaging Study. American Journal of Neuroradiology. 29, (3), 514-519 (2008).
  9. Bondi, C. O., et al. Found in translation: Understanding the biology and behavior of experimental traumatic brain injury. Neuroscience & Biobehavioral Reviews. 58, 123-146 (2015).
  10. Shultz, S. R., et al. The potential for animal models to provide insight into mild traumatic brain injury: Translational challenges and strategies. Neuroscience & Biobehavioral Reviews. 76, 396-414 (2017).
  11. Osier, N. D., Dixon, C. E. The Controlled Cortical Impact Model: Applications, Considerations for Researchers, and Future Directions. Frontiers in Neurology. 7, (AUG), (2016).
  12. Lyeth, B. G. Historical Review of the Fluid-Percussion TBI Model. Frontiers in Neurology. 7, (DEC), 1-7 (2016).
  13. Marmarou, A., Foda, M. A. A. -E., van den Brink, W., Campbell, J., Kita, H., Demetriadou, K. A new model of diffuse brain injury in rats. Journal of Neurosurgery. 80, (2), 291-300 (1994).
  14. Heim, L. R., et al. The Invisibility of Mild Traumatic Brain Injury: Impaired Cognitive Performance as a Silent Symptom. Journal of Neurotrauma. 34, (17), 2518-2528 (2017).
  15. Zohar, O., Rubovitch, V., Milman, A., Schreiber, S., Pick, C. G. Behavioral consequences of minimal traumatic brain injury in mice. Acta Neurobiol Exp (Wars. 71, (1), 36-45 (2011).
  16. Pierpaoli, C., Basser, P. J. Toward a quantitative assessment of diffusion anisotropy. Magnetic resonance in medicine : official journal of the Society of Magnetic Resonance in Medicine / Society of Magnetic Resonance in Medicine. 36, (6), 893-906 (1996).
  17. Jensen, J. H., Helpern, J. A. MRI quantification of non-Gaussian water diffusion by kurtosis analysis. NMR in Biomedicine. 23, (7), 698-710 (2010).
  18. Fieremans, E., Jens, H., Jensen, J. A. H. White matter characterization with diffusional kurtosis imaging. NeuroImage. 58, 177-188 (2011).
  19. Leemans, A. Explore DTI. (2019).
  20. Loening, A. M., Gambhir, S. S. AMIDE: A Free Software Tool for Multimodality Medical Image Analysis. Molecular Imaging. 2, (3), 131-137 (2003).
  21. Veraart, J., et al. Denoising of diffusion MRI using random matrix theory. NeuroImage. 142, 394-406 (2016).
  22. Veraart, J., Fieremans, E., Novikov, D. S. Diffusion MRI noise mapping using random matrix theory. Magnetic Resonance in Medicine. 76, (5), 1582-1593 (2016).
  23. Braeckman, K., et al. Dynamic changes in hippocampal diffusion and kurtosis metrics following experimental mTBI correlate with glial reactivity. NeuroImage: Clinical. 21, (August 2018), 101669 (2019).
  24. Jones, D. K., Knösche, T. R., Turner, R. White matter integrity, fiber count, and other fallacies: The do's and don'ts of diffusion MRI. NeuroImage. 73, 239-254 (2013).
  25. Matlab code DKI and WMTI model. Available from: https://github.com/NYU-DiffusionMRI/Diffusion-Kurtosis-Imaging (2019).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics