Geavanceerde diffusie beeldvorming in de hippocampus van ratten met mild traumatisch hersenletsel

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Het algemene doel van deze procedure is het verkrijgen van kwantitatieve microstructurele informatie van de Hippocampus in een rat met milde traumatische hersenletsel. Dit wordt gedaan met behulp van een geavanceerde diffusie-gewogen magnetische resonantie imaging protocol en regio-of-interest gebaseerde analyse van parametrische diffusie kaarten.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Braeckman, K., Descamps, B., Vanhove, C. Advanced Diffusion Imaging in The Hippocampus of Rats with Mild Traumatic Brain Injury. J. Vis. Exp. (150), e60012, doi:10.3791/60012 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Mild traumatisch hersenletsel (mTBI) is de meest voorkomende vorm van verworven hersenletsel. Omdat patiënten met traumatisch hersenletsel een enorme variabiliteit en heterogeniteit (leeftijd, geslacht, soort trauma, andere mogelijke pathologieën, enz.) vertonen, spelen diermodellen een sleutelrol bij het ontraveling van factoren die beperkingen zijn in klinisch onderzoek. Ze bieden een gestandaardiseerde en gecontroleerde instelling om de biologische mechanismen van letsel en herstel na TBI te onderzoeken. Echter, niet alle diermodellen nabootsen de diffuse en subtiele aard van mTBI effectief. Bijvoorbeeld, de veelgebruikte gecontroleerde corticale impact (CCI) en laterale vloeistof percussie letsel (LFPI) modellen maken gebruik van een craniotomie om de hersenen bloot te leggen en induceren wijdverspreide focal trauma, die niet vaak worden gezien in mTBI. Daarom zijn deze experimentele modellen niet geldig om mTBI na te bootsen. Zo moet een geschikt model worden gebruikt om mTBI te onderzoeken. De Marmarou Weight drop model voor ratten induceert soortgelijke microstructurele veranderingen en cognitieve beperkingen zoals te zien bij patiënten die milde trauma ondersteunen; Daarom is dit model geselecteerd voor dit protocol. Conventionele computertomografie en magnetische resonantie imaging (MRI) scans vertonen vaak geen schade na een milde verwonding, omdat mTBI vaak alleen subtiele en diffuse verwondingen induceert. Met diffusie gewogen MRI is het mogelijk om microstructurele eigenschappen van hersenweefsel te onderzoeken, die meer inzicht kunnen geven in de microscopische veranderingen na een mild trauma. Daarom is het doel van deze studie om kwantitatieve informatie te verkrijgen van een geselecteerde regio-van-belang (dat wil zeggen, Hippocampus) om follow-up ziekteprogressie na het verkrijgen van een milde en diffuse hersenletsel.

Introduction

Traumatisch hersenletsel (TBI) heeft in de afgelopen jaren meer aandacht gekregen, omdat het duidelijk is geworden dat deze hersenletsel kan resulteren in levenslange cognitieve, fysieke, emotionele en sociale gevolgen1. Ondanks dit toenemende bewustzijn, is milde TBI (mTBI, of hersenschudding) nog vaak ondergemeld en niet gediagnosticeerd. MTBI is een stille epidemie genoemd, en individuen met een geschiedenis van mTBI vertonen hogere percentages van drugsmisbruik of psychiatrische problemen2. Verschillende patiënten met mTBI gaan elk jaar niet gediagnosticeerd vanwege de diffuse en subtiele aard van de verwondingen, die vaak niet zichtbaar zijn op conventionele computertomografie (CT) of Magnetic Resonance Imaging (MRI) scans. Dit gebrek aan radiologisch bewijs van hersenletsel heeft geleid tot de ontwikkeling van geavanceerdere beeldvormingstechnieken zoals diffusie-MRI, die gevoeliger zijn voor microstructurele veranderingen3.

Diffusie MRI maakt in vivo mapping van de microstructuur mogelijk, en deze MRI-techniek is uitgebreid gebruikt in TBI-onderzoeken4,5,6. Uit de diffusie-tensor worden gefractioneerde anisotropie (FA) en gemiddelde diffusiviteit (MD) berekend om de verandering in de microstructurele organisatie na letsel te kwantificeren. Recente beoordelingen in mTBI-patiënten rapporteren verhogingen in FA en dalingen in MD na letsel, wat indicatief kan zijn voor axonale zwelling7. Integendeel, stijgingen van de MD en dalingen in de FA worden ook gevonden en zijn gesuggereerd om verstoringen in de parenchymale structuur te ondervangen na oedeem vorming, axonale degeneratie, of Fiber misalignment/verstoring8. Deze gemengde bevindingen kunnen gedeeltelijk worden verklaard door de significante klinische heterogeniteit van mTBI veroorzaakt door verschillende soorten impact en Ernst (bijv. rotatie-versnelling, botte kracht trauma, blast letsel of combinatie van de eerste). Momenteel is er echter geen duidelijke consensus over de onderliggende pathologie en biologische/cellulaire basis die de veranderingen in de microstructurele organisatie onderbouw.

Diermodellen bieden een gestandaardiseerde en gecontroleerde instelling voor het onderzoeken van biologische mechanismen van letsel en reparatie na TBI in meer detail. Verschillende experimentele modellen voor TBI zijn ontwikkeld en vertegenwoordigen verschillende aspecten van menselijke TBI (bijv. focale vs. diffuus trauma of trauma veroorzaakt door rotatiekrachten)9,10. Veelgebruikte diermodellen zijn onder andere de gecontroleerde corticale impact (CCI) en laterale vloeistof percussie letsel (lfpi) modellen11,12. Hoewel de experimentele parameters goed gecontroleerd kunnen worden, maken deze modellen gebruik van een craniotomie om de hersenen bloot te leggen. Craniotomieën of schedel fracturen worden niet vaak gezien in mTBI; Daarom zijn deze experimentele modellen niet geldig om mTBI na te bootsen. Het effect acceleratie model ontwikkeld door Marmarou et al.13 maakt gebruik van een gewicht dat van een bepaalde hoogte op het hoofd van de rat wordt gedropt, dat wordt beschermd door een helm. Dit diermodel induceert soortgelijke microstructurele veranderingen en cognitieve stoornissen zoals te zien bij patiënten die milde trauma ondersteunen. Daarom is dit marmarou gewicht druppel model geschikt om Imaging biomarkers te onderzoeken voor diffuse mtbi14,15.

Dit rapport toont de toepassing van Advanced Diffusion MRI in een mTBI rat model met behulp van het Marmarou Weight drop model. Voor het eerst getoond is hoe een mild en diffuus trauma induceren, en analyse met behulp van diffusie tensor Imaging (DTI) model wordt dan verstrekt. Specifieke biologische informatie wordt verkregen met het gebruik van geavanceerdere diffusie modellen [d.w.z. diffusie kurtosis Imaging (DKI) en White Matter Tract Integrity (WMTI) model]. Specifiek, milde trauma wordt toegebracht en microstructurele veranderingen worden vervolgens geëvalueerd in de Hippocampus met behulp van conventionele T2-gewogen MRI en een geavanceerde diffusie Imaging protocol.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Het protocol is goedgekeurd door het dier ethisch comité aan de Universiteit Gent (ECD 15/44Aanv), en alle experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen van de Europese Commissie (richtlijn 2010/63/EU).

1. bevestiging van de dieren bereiding en helm

  1. Weeg een vrouwelijke Wistar H rat (± 250 g of 12 weken oud) en anesthetiseren in een kleine inductie kamer gevuld met een mengsel van Isofluraan (5%) en O2 gedurende ten minste 1 min.
  2. Injecteer de rat met 0,05 mg/kg buprenorfine subcutaan in de nek, breng het terug naar de huis kooi en laat de pre-emptive analgesie gedurende ten minste 30 min een effect innemen.
    Let op: tijdens de 30 minuten wachten kan de operatieplaats worden voorbereid.
  3. Plaats een verwarmingskussen op 37 °C onder het chirurgische veld. Plaats de gesteriliseerde chirurgische instrumenten op het chirurgische veld dat werd gedesinfecteerd met 70% ethanol.
  4. Plaats de rat terug in de inductie kamer en anesthetiseer de rat totdat het niet reageert op een poot of staart knijpen.
  5. Plaats de rat op het chirurgische veld en steek een katheter in de laterale staart ader. Scheer vervolgens het hoofd van de rat, Verwijder overtollig bont en Desinfecteer de hoofdhuid en de rest van het chirurgische gebied met chloorhexidine.
  6. Injecteer 100 μL 2% lidocaïne lokaal in de hoofdhuid.
  7. Maak een middenlijn incisie met behulp van een scalpel maat 11 om de schedel bloot, het verwijderen van overtollige membranen met kleine schaar. Trek de huid op met een oculair speculum met een maximale spreiding van 1 cm.  Verwijder bovendien het periosteum door zachtjes een steriele wattenstaafje over de schedel te wrijven totdat het periosteum niet meer aanwezig is.
  8. Zet een druppel weefsellijm op de schedel en één op de gesteriliseerde metalen schijf (diameter van 10 mm en 3 mm dikte), die als de helm fungeert. Lijm de schijf ongeveer een derde voor en twee derde achter de bregma. Laat de lijm 1 minuut drogen.

2. inductie van traumatisch hersenletsel (TBI)

  1. Plaats de rat op het op maat gemaakte bed met een schuimmatras van bepaalde veerconstante (Zie tabel met materialen). Positioneer de rat direct onder een doorzichtige plastic buis met een 450 g messing gewicht met de helm zo horizontaal mogelijk. Maak de rat los van anesthesie.
  2. Trek het gewicht tot 1 m en laat het los wanneer het klaar is. Zorg ervoor dat er een tweede experimenteerder aanwezig is om de rat onmiddellijk na de botsing van de plastic buis weg te bewegen om een tweede botsing te voorkomen.
    Opmerking: de schijn gewonde ratten krijgen dezelfde experimentele procedure (stappen 1.1 – 2.7), met uitzondering van stap 2,2.
  3. Bevestig de rat opnieuw aan de anesthesie en Injecteer 1 mL fysiologische oplossing (0,9% NaCl) via de katheter om de hemodynamische schok te verminderen.
    Opmerking: het is mogelijk dat de rat kort stopt met ademen vanwege de impact. Comprimeer de thorax voorzichtig als de rat na 2 s niet spontaan ademt om de Ademhalings reflex te stimuleren.
  4. Verwijder de helm door zachtjes uit de schedel te trekken. Verwijder alle overgebleven lijm van de schedel en de huid en sluit de incisie met chirurgische hechting. Breng lokale analgesie gel aan met een steriel applicator uiteinde.
  5. Plaats de rat op het bed van de CT-scanner. Bevestig de juiste positie met een Scout scan. Pas het gezichtsveld aan om beeldvorming van het hele hoofd in een bedpositie in te schakelen. Beheer een algemeen doel, lage dosis CT-scan om schedel fracturen uit te buiten.
    Opmerking: schedelfractuur is een criterium voor euthanasie.
  6. Plaats de rat in een schone kooi op een verwarmingskussen (37 °C). Bewaak de tijd om het bewustzijn te herwinnen. Zodra de rat in staat is om rechtop te zitten, kan de rat worden teruggebracht naar de huis kooi.
  7. Dien een tweede dosis van 0,05 mg/kg buprenorfine toe op één dag na de TBI-inductie.

3. diffusie magnetische resonantie beeldvorming (MRI)

Opmerking: diffusie-gewogen beeldvorming wordt uitgevoerd vóór en 1 dag na trauma inductie.

  1. Anesthetiseer de rat in een kleine inductie kamer gevuld met een mengsel van Isofluraan (5%) en O2. Wanneer de rat niet reageert op een poot of staart knijpen de anesthesie te verminderen tot 2% met een debiet van 500 mL/min. Breng het dier over naar het scanner bed in de hoofd-eerste liggende positie.
  2. Plaats de rat in de hoofd houder met de tanden balk en neuskegel, het leveren van de anesthesie, en schuif het hoofd naar voren totdat het centrum van de hersenen zich op het niveau van het midden van het Quadrature volume MRI-spoel bevindt. Smeer zalf aanbrengen op de ogen in kleine hoeveelheden om beschadiging van het hoornvlies te voorkomen. Fixeren de kop met een klein stukje tape om beweging tijdens het scannen te voorkomen.
  3. Plaats een drukpad onder de thorax van de rat om de ademhaling te bewaken en de rat te bedekken met een circulerende warm water-verwarmings deken en noppenfolie om de rat warm te houden. Controleer vóór het scannen de Ademhalings monitor om er zeker van te zijn dat het signaal zonder lawaai helder is en dat de Ademhalings cyclus consistent is. Verplaats het drukpad, indien nodig.
    Opmerking: de ademhalingsfrequentie moet tussen 1 adem per 1200 – 1700 MS worden gehouden door het niveau van anesthesie tussen 1% – 2% aan te passen.
  4. Schuif het Quadrature-volume spoel over het hoofd. Pas de tuning en bijpassende condensatoren van de spoel aan op de juiste frequentie en impedantie volgens de instructies van de fabrikant van de spoel. Het scanner-bed in de boring van de scanner om te beginnen met scannen.
  5. Verkrijg een standaard drie-Plane Scout-scan ("tripilot") om een correcte positionering te garanderen.
    1. Laad de trip pilot-reeks in het Scan besturingselement door op nieuwe scan te klikken en de trip pilot-reeks te selecteren in de lijst met protocollen. Klik vervolgens op de knop verkeerslicht om de scan te starten.
    2. Wanneer de scan is voltooid, laadt u de scan in het beeldscherm en zorgt u ervoor dat 1) het hoofd recht ligt en 2) de hersenen zijn gepositioneerd in het midden van de magneet en spoel. Pas de positie van het hoofd en/of het scanner bed zo nodig aan en verkrijg een nieuwe tripilot-scan.
  6. Pas het lokale magnetische veld aan met behulp van een geautomatiseerd tweede-orde shimming-Protocol: Laad het tweede-orde Shim-protocol in de scan besturing zoals beschreven in stap 3.5.1. Klik vervolgens op het tabblad Acq | Huidige aanpassingen | Methode specifieke aanpassing voor de lokale veld homogeniteit in de spectrometer controle tool venster om geautomatiseerde shimming te starten.
  7. Laad een nieuwe T2 rapid imaging met Refocused Echo's (RARE) sequentie in de scan besturing zoals beschreven in stap 3.5.1.
    1. Verkrijg de T2-gewogen afbeeldingen met de standaardinstellingen, met uitzondering van de volgende parameters:
    2. Open het tabblad Scan bewerken en pas de herhalings tijd (tr) en ECHO tijd (te) aan op respectievelijk 5.500 ms en 37 MS. Wijzig ook het gezichtsveld en de matrixgrootte om een hogere in-plane resolutie van 109 μm x 109 μm (standaardresolutie = 156 μm x 156 μm) mogelijk te maken. Zorg ervoor dat de segment dikte 600 μm, aantal segmenten is ingesteld op 45, en zeldzame factor is ingesteld op 8.
    3. Open de geometrie-editor en plaats het segment pakket in de juiste positie, inclusief de bulbus van de hersenen en het cerebellum.
  8. Laad drie nieuwe ECHO-planaire diffusie-gewogen spin-ECHO sequentie (DtiEpi) uit de map B_DIFFUSION in het Scan Control Protocol zoals beschreven in stap 3.5.1.
    Opmerking: met behulp van drie verschillende diffusie "shells", de diffusie tensor Imaging (DTI) model4,16, diffusie kurtosis Imaging (DKI) model17, en White Matter Tract integriteit (wmti) model18 kunnen worden geschat. Het wordt aanbevolen om ten minste drie verschillende b-waarden te gebruiken, met de hoogste b-waarde met een maximum van 3000 s/mm2 met ten minste 15 gelijkmatig verdeelde richtingen per Imaging shell17.
    1. Verkrijgen van diffusie gewogen afbeeldingen (DWIs) met behulp van de standaardinstellingen, afgezien van de volgende instellingen:
    2. Open het tabblad Scan bewerken en pas de geometrische parameters aan onder het tabblad geometrie . pas het gezichtsveld en de matrixgrootte aan op 105 x 105 om een resolutie van 333 μm x 333 μm te garanderen.
    3. Stel de segment oriëntatie in op axiaal en het aantal segmenten op 25, wat resulteert in een snijdikte van 500 μm en een interslice-afstand van 600 μm. Wijzig de uitleesrichting in links-rechts.
    4. Klik op het tabblad contrast om de echo tijd aan te passen tot 24 MS en de herhalings tijd tot 6.250 ms.
    5. Stel de bandbreedte in op 250.000 Hz en schakel de vetonderdrukking in. Pas het aantal gemiddelden aan een.
    6. Klik op het tabblad onderzoek en verander het aantal gemiddelden (epi-segmenten) naar 4.
    7. Klik op het tabblad diffusie op het tabblad onderzoek. Voer deze stap afzonderlijk uit voor elk van de drie diffusie ketels.
      1. Pas het aantal diffusie richtingen aan naar 32 voor de eerste shell, 46 voor de tweede shell en 64 voor de derde shell.
      2. Pas de verloop richtingen aan met aangepaste verloop richtingen bestanden.
      3. Wijzig het aantal B0-afbeeldingen in 5 voor de eerste shell, 5 voor de tweede shell en 7 voor de derde shell.
      4. Stel de b-waarde per richting in op 800 s/mm2 voor de eerste shell, 1500 s/mm2 voor de tweede shell en 2000 s/mm2 voor de derde shell.
        Opmerking: het aanpassen van de verloop richtingen met een aangepaste verloop Routebeschrijving kan handmatig worden gedaan door het invoeren van diffusie richtingen naar Ja of automatisch met behulp van de DTI_SET_DIRECTIONS macro.
    8. Open de geometrie-editor en plaats het veld van de weergave tussen de bulbus en cerebellum met alleen de hersenen om artefact en scantijd te verminderen. Plaats zes saturatie banden van 5 mm buiten de hersenen om artefacten te verminderen door op verzadiging te klikken en de banden in de voorkeurspositie te schuiven met behulp van de schuifbalken.
      Opmerking: de bulbus en het cerebellum kunnen worden geïdentificeerd op basis van anatomische monumenten en de drie beelden van de tripilot-scan.
  9. De geïmporteerde sequenties te verwerven door te klikken op het verkeerslicht symbool. Met behulp van de instellingen van de hierboven beschreven parameters is de acquisitie tijd van de T2-RARE scan 12 min, van de eerste DWI shell 15 min, van de tweede DWI shell 21 min en van de derde shell 30 min. De totale acquisitie tijd is ongeveer 80 min (op een enkel ontvangerkanaal systeem).
  10. Bij de voltooiing van het Scan protocol verwijdert u het dier uit het scanner bed en plaatst u het dier in een schone kooi met een verwarmingskussen van 37 °C. Keer het dier terug naar de huis kooi wanneer het bewustzijn herwint.

4. beeldverwerking

Opmerking: in de volgende secties wordt de verwerking van de diffusie beelden beschreven in MRtrix3, ExploreDTI19 en amide software20 die Open Access toolboxes zijn. De voor verwerkingsstappen kunnen echter worden uitgevoerd in andere gereedschapskisten (bijv. fsl, medinria, dtistudio).

  1. Breng de verkregen gegevens over van de acquisitie console door het bestand 2dseq te exporteren.
  2. Converteer de 2dseq-bestanden (RAW DWI-bestanden) naar de. mif-indeling, de standaardopmaak van MRtrix3, om verdere voorbewerkings stappen in MRtrix3 mogelijk te maken. Samenvoegen de drie diffusie schalen met behulp van de volgende commando's in de shell:
    convert_bruker pdata/1/2dseq ratID_T2. MIH (voor de T2-gewogen beelden)
    convert_bruker pdata/1/2dseq ratID_dwi1. MIH (voor de eerste diffusie schaal)
    convert_bruker pdata/1/2dseq ratID_dwi2. MIH (voor de tweede diffusie schaal)
    convert_bruker pdata/1/2dseq ratID_dwi3. MIH (voor de derde diffusie schaal)
    mrcat ratID_dwi1. mif ratID_dwi2. mif ratID_dwi3. mif ratID_dwi. mif
  3. Voer ruis correctie en Gibbs beltoon correctie op de DWIS in MRtrix321,22. Converteer ook de gecorrigeerde DWI-afbeeldingen en T2-afbeelding naar NIFTI-indeling met behulp van de volgende opdrachten:
    dvergroter Oise ratID_dwi. mif ratID_dwi_denoised. mif
    mrdegibbs ratID_dwi_denoised. mif ratID_dwi_denoised_gr. mif
    mrconvert ratID_dwi_denoised_gr. mif ratID. NII
    mrconvert ratID_T2. mif ratID_T2. NII
  4. Voer correctie uit voor EPI-, bewegings-en wervelstroom verstoringen in ExploreDTI:
    1. Converteer de NIFTI-afbeeldingen naar een. mat-bestand door te klikken op DTI*. mat-bestand berekenen | Zet RAW data om naar DTI*. mat bestand. Verander de diffusie tensor schatting naar gewogen lineair en de b-waarde naar NaN. Stel de Voxel-grootte in op 0,333 0,333 0,6, het aantal niet-DWI-images naar 17, het aantal DWI-images naar 142 en de matrixgrootte tot 105 105 25.
      Opmerking: door de b-waarde in te stellen op NaN, zal ExploreDTI de gegevensset beschouwen als een kurtosis DataSet.
    2. Klik op het tabblad instellingen om de instellingen voor epi-correctie aan te passen (dit is standaard uitgeschakeld). Selecteer SM/EC/epi-correctie, registreer ook voor andere gegevens? en klik op Ja, om de epi-correctie (niet-rigide) te doen. Specificeer het achtervoegsel van het anatomische T2-beeld dat overeenkomt met de diffusiegegevensset.
      Opmerking: ExploreDTI corrigeert EPI-vervormingen met behulp van beeldregistratie tussen het onvervormde anatomische beeld en de diffusie afbeelding.
    3. Klik op het tabblad Plug-ins en selecteer correctie voor onderwerp beweging & EC/epi-vervormingen en selecteer het voorverwerkte diffusie gegevensbestand uit stap 2,3. Zorg ervoor dat de T2-afbeelding zich in dezelfde map bevindt en dezelfde basis heeft als de bestandsnaam van de diffusie gegevens (bijv. rat1. NII voor de DWI en rat1_T2. NII voor het anatomische beeld). Deze stap genereert een "native" (* native. mat) en "getransformeerd" bestand (* Trafo. mat).
  5. Bereken de DTI-metrics voor elke rat door op plugins te klikken en spullen te exporteren naar *. NII en de parametrische kaarten van het DTI-model te selecteren: fractionele ANISOTROPIE (FA), gemiddelde diffusiviteit (MD), RADIALE diffusiviteit (RD) en axiale diffusiviteit (AD; aangeduid als "grootste eigenwaarde L1").
  6. Exporteer bovendien de parametrische kaarten voor het kurtosis-model (MK, AK en RK) en WMTI-model (AWF, AxEAD, RadEAD en onrechtmatige daad). Verwerking van de diffusie beelden zal resulteren in 12 parametrische kaarten (Figuur 1, figuur 2, Figuur 3) die kunnen worden gebruikt voor verdere microstructurele analyse.
  7. Maak een masker bestand voor de hippocampus van elke rat met behulp van MRtrix3.
    1. Laad de VA-afbeelding van de rat in de MRtrix-viewer door op te klikken gereedschap en ROI-editor.
    2. Maak een nieuwe ROI door op de knop "+" te klikken en druk op Edit om de ROI te tekenen op elk segment dat de Hippocampus bevat (Figuur 4). Druk op de rechtermuis knop om ongewenste gebieden uit de getekende ROI te verwijderen.
    3. Wanneer de tekening van de ROI is voltooid, slaat u de maskerafbeelding op door op de knop Opslaan te klikken.
      Let op: dit masker bestand zal een binair NIFTI beeldbestand zijn met voxels van waarde 1 met het hippocampal weefsel, en de resterende voxels zullen waarden van 0 hebben. Om de regio van de Hippocampus te standaardiseren over ratten, kunnen de parametrische kaarten samen worden geregistreerd met een specifiek studie-sjabloon met vooraf gedefinieerde gebieden van interesse, afgebakend23 of een rat-hersen Atlas.
  8. Om de diffusie statistieken van de hippocampus van de rat uit te pakken, gebruikt u het gemaakte masker bestand van stap 4,6 en opent u de amide software.
    1. Open de parametrische kaarten en het masker beeld van de rat.
    2. Als u de ROI van het masker bestand wilt toevoegen aan amide, selecteert u de afbeelding van het masker bestand, klikt u op bewerken | ROI toevoegen | 3D-Isocontour en klik op de ROI weergegeven in de afbeelding van het masker. Geef de ROI een betekenisvolle naam en bevestig dat dit volume alleen voxels met een waarde van één mag bevatten.
    3. Voor het berekenen van de gemiddelde waarden van de diffusie metrische gegevens in de hippocampus, klikt u op extra | Bereken de ROI-statistieken en geef de afbeeldingen en ROI aan die moeten worden opgenomen. Na het klikken op uitvoeren, zal een ander scherm verschijnen met berekende waarden die kunnen worden gebruikt voor verdere statistische analyse. Dit bestand kan worden opgeslagen of gekopieerd naar een voorkeurs gegevensindeling (bijv. XLSX-of. CSV-bestand).

5. statistische analyse

Opmerking: in de volgende secties beschrijven we de verwerking van de diffusie beelden in SPSS Statistics 24; de statistische analyse kan echter in andere statistische gereedschapskisten worden uitgevoerd.

  1. Laad de gegevens in het brede formaat in een SPSS *. sav-bestand.
  2. Als u wilt testen op statistische verschillen tussen de twee groepen voor elk tijdpunt (d.w.z. Baseline of 1-daagse post-blessure), klikt u op analyseren | Niet-parametrische tests | Oudere dialoogvensters | 2 onafhankelijke monsters testen. Laad de variabelen die moeten worden getest en specificeer de groepen (d.w.z. TBI-en Sham-groepen). Geef de Mann-Whitney U als testtype aan.
  3. Om te testen op statistische verschillen tussen het 2 tijdpunt binnen elke groep moet het gegevensbestand worden gesplitst. Ga naar gegevens, gesplitst bestand en geef vergelijkings groepen aan. Klik vervolgens op analyseren, niet-parametrische tests, legacy dialogen, 2 gerelateerde monsters tests, laad de variabelen die moeten worden vergeleken en geef Wilcoxon als testtype.
    Opmerking: om voor meervoudige vergelijkingen te corrigeren, worden p-waarden voor elk diffusie model aangepast met behulp van Bonferroni-correctie [d.w.z. p-waarde gedeeld door het aantal parameters vergeleken (DTI 4, DKI 3 en WMTI 4)]. Meer in het bijzonder wordt p < 0,0125 als significant beschouwd voor de DTI-en WMTI-modellen, en p < 0,016 wordt als significant beschouwd voor het DKI-model.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

In de studie, alle TBI ratten (n = 10) overleefde de impact en waren in staat om te herstellen van de impact en anesthesie binnen 15 minuten na loslating van de anesthesie23. Op de CT-beelden, er was geen bewijs van schedel fracturen en de T2 beelden vertonen geen afwijkingen zoals bloeden, vergrote ventrikels, of oedeem vorming op de contusie site 1 dag na trauma (Figuur 5). Op basis van deze visuele inspecties van de anatomische beelden werden dus geen grote focale laesies gedetecteerd, die de diffuse en milde aard van de verwonding bevestigden.

De kwaliteit van de coregistratie (niet-rigide) stap tussen de T2-beeld-en diffusiegegevensset (stap 4,4) werd onderzocht door een overlay van de T2-afbeelding toe te voegen aan de kleurgecodeerde FA-kaart (Figuur 6). Vervolgens werden de parameter kaarten FA, MD, AD en RD berekend (Figuur 1) en in de amide-software geladen. Op basis van de FA-kaart werd een ROI inclusief de hippocampal structuur getekend (Figuur 4). Statistische waarden van de diffusie metrieken werden gemiddeld berekend over alle voxels binnen het interessegebied en de gemiddelde waarden van elke DTI metriek werden geëxporteerd voor verdere analyse. Een andere kwaliteitscontrole van de diffusie gegevens kan worden uitgevoerd door de uitschieters in de DTI-Metrics te inspecteren. Bijvoorbeeld, VA-waarden in de Hippocampus moet rond 0,15; Daarom kunnen waarden van < 0,10 (die de isotrope diffusie aangeeft) of > 0,30 (waarden worden gezien in witte stof) als biologisch onplausibele waarden worden beschouwd. Deze data Points moeten worden verworpen voor verdere analyse. Ook werden de gemiddelde waarden voor AK, RK en MK van het diffusie kurtosis-model, evenals de AWF, AxEAD, RadEAD en onrechtmatige daad van het WMTI-model berekend (Figuur 2, Figuur 3).

In onze studie toonden de analyse van de DTI-Metrics significante toegenomen VA-waarden (p = 0,007), en verminderde diffusiviteit waarden (MD en RD) (p = 0,007 en p = 0,007, respectievelijk) na de impact in de mTBI-groep (Figuur 7). Deze dalingen in RD en MD waren significant verschillend van de Sham groep (p = 0,005 en p = 0,004, respectievelijk). Diffusie kurtosis metrische gegevens toonde een significante afname van RK (p = 0,005) na impact, maar geen veranderingen in AK of MK (Figuur 8). Met behulp van het model WMTI, RadEAD (p = 0,007) en onrechtmatige daad (p = 0,007) weergegeven een significante afname en toename, respectievelijk, in de mTBI groep 1 dag na de impact (figuur 9C, D). De waarden in de Sham-groep hebben geen belangrijke wijzigingen weergegeven.

Figure 1
Figuur 1: representatieve parametrische kaarten voor fractionele anisotropie (FA), gemiddelde diffusiviteit (MD), axiale diffusiviteit (AD) en radiaal diffusiviteit (RD). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: representatieve parametrische kaarten voor de gemiddelde kurtosis (MK), axiale kurtosis (AK) en radiale kurtosis (RK). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: representatieve parametrische kaarten voor axonale water fractie (AWF), axiale en radiale extra axonale diffusiviteit (AxEAD, RadEAD) en tortuositeit (onrechtmatige daad). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 4
Figuur 4: een masker maken in MRtrix3. Een ROI wordt getekend rond de Hippocampus op alle segmenten met het volume van de hippocampus, en het volume wordt opgeslagen als een masker bestand. Dit kan ofwel worden gedaan voor elke rat afzonderlijk of met behulp van een studie-specifieke sjabloon masker bestand waarop elk van de parametrische kaarten kunnen worden mede-geregistreerd. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 5
Figuur 5: CT-en T2-gewogen beelden van een representatieve mTBI-dier 1 dag na de botsing. De CT-afbeeldingen (bovenste rij) vertonen geen fracturen van de schedel. Op de T2-gewogen beelden (onderste rij) werden geen bloedingen, vergrote ventrikels of oedeem vorming aangetoond. Van noot, oedeem vorming is duidelijk zichtbaar als een hyperintens gebied rond het wondgebied van de chirurgische ingreep. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 6
Figuur 6: KLEURGECODEERDE FA-kaart van diffusiegegevensset die is overgelegd met het anatomische beeld na correctie voor epi-, bewegings-en Eddy-huidige correctie in ExploreDTI. Getoond is een slechte correctie en co-registratie aan de linkerkant en goede voorbeelden aan de rechterkant. Er moet voor worden gezorgd dat de kleurcodering correct is: links-rechts richting in rood (bijv. corpus callosum), anterieure-posterieure richting in het groen en inferieure-superieure richting in blauw (bijv. Cingulum). Bovendien moet de kleurgecodeerde FA-afbeelding perfect worden uitgelijnd met het anatomische beeld. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 7
Figuur 7: veranderingen in diffusie tensor metrische gegevens van Hippocampus voor Sham (n = 10) en mTBI dieren (n = 10). Na de impact was er een significante toename in FA (a) en significante dalingen in de gemiddelde Diffusiviteit (b) en radiale diffusiviteit (D) in de mtbi-dieren (b, D). Er werden geen significante verschillen waargenomen voor axiale diffusiviteit (C) in de mtbi ratten. De schijn dieren vertonen geen significante DTI-veranderingen (* p < 0,0125). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 8
Figuur 8: veranderingen in diffusie kurtosis metrische gegevens van Hippocampus voor Sham (n = 10) en mTBI dieren (n = 10). Na de impact was er een significante afname van RK (C) van de mtbi-dieren, maar geen veranderingen in AK (B) of mk (a). De schijn dieren vertonen geen wijzigingen (* p < 0,0166). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 9
Figuur 9: veranderingen in de integriteits statistieken van de witte materie van de Hippocampus voor Sham (n = 10) en mTBI-dieren (n = 10). Na de impact was er een significante afname in RadEAD (C) en een aanzienlijke toename van de onrechtmatige daad (D) van de mtbi-dieren, maar geen verandering in AWF of Axead (a, B). De schijn dieren vertonen geen wijzigingen (* p < 0,0125). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Omdat mTBI vaak het resultaat is van een diffuse en subtiele verwonding die geen afwijkingen vertoont op CT-en conventionele MRI-scans, blijft de evaluatie van micro structurele schade na een mild trauma een uitdaging. Daarom zijn er meer geavanceerde beeldvormingstechnieken nodig om de volledige omvang van het trauma te visualiseren. De toepassing van diffusie magnetische resonantie beeldvorming in TBI-onderzoek heeft in de afgelopen tien jaar meer belangstelling gekregen, waarbij diffusie tensor beeldvorming het vaakst wordt gebruikt5. Een beperking van het DTI-model is de aanname van een Gaussiaanse diffusie proces dat geen precieze aanname is voor de microstructuur van de hersenen (bestaande uit een complex netwerk van axonen en cellen met membranen die als barrières fungeren), wat resulteert in DTI-metrische gegevens die niet specifiek zijn voor de onderliggende biologische microstructuur24. Diffusie kurtosis Imaging is een uitbreiding van het DTI-model en probeert de mate van niet-Gaussiaanse diffusie17te karakteriseren. Dit kan aanvullende informatie bevatten over weefsel heterogeniteit of complexiteit.

Een nadeel van DTI-en DKI-modellen is echter dat ze slechts een representatie zijn van het diffusie signaal, dat het probabilistisch water verplaatsings profiel karakteriseert, maar niet specifiek is voor microstructuur6. Aan de andere kant is het integriteits model van de witte stof op basis van de kurtosis tensor een microstructurele toewijzings techniek die a priori biologische informatie (veronderstellingen) bevat in het model18. Het maakt het diffusie signaal aan weefsel compartimenten en kan de biologische attributen meer direct beoordelen. Deze biofysische modellen kunnen dus nieuwe informatie bieden voor het beschrijven van afwijkingen na mTBI en het overwinnen van dit niet-specificiteits probleem6. Met behulp van deze drie verschillende modellen, microstructurele veranderingen en biologische processen konden worden gevisualiseerd na mTBI in meer detail, met name met behulp van de Marmarou gewicht drop model.

De Marmarou Weight drop model is gemakkelijk te gebruiken en vereist slechts een kleine operatie; een tweede experimenteerder wordt echter aanbevolen om de rat onmiddellijk na de eerste botsing weg te bewegen van de glazen buis om een tweede te vermijden. Daarnaast is het soms nodig om de rat te helpen zijn Ademhalings reflex na de botsing te herwinnen. Het nogal lange MRI-protocol, met een totale acquisitie tijd van ongeveer 80 min, wordt goed verdragen door zowel de Sham-als mTBI-ratten. Hoewel, tijdens het scannen, het is belangrijk om te controleren ademhaling cyclus en de anesthesie aanpassen als het dier te diep of licht slaapt. Het is ook belangrijk om het dier warm te houden, zowel tijdens als na de overname totdat de rat volledig wakker is om hypothermie te voorkomen.

In Geavanceerde diffusie MRI moeten bewegings artefacten zoveel mogelijk worden vermeden. Een eenvoudige oplossing om de beweging tijdens het scannen te verminderen is door gebruik te maken van een tanden reep en het hoofd te fixeren met een klein stukje tape of twee gehoor stangen, indien beschikbaar. Dit zorgt ervoor dat het hoofd niet op en neer beweegt elke keer dat de rat een adem neemt.

Met behulp van geavanceerde diffusie-MRI-protocollen moeten de verkregen afbeeldingen verschillende (pre-) verwerkingsstappen doorlopen, meestal met behulp van verschillende software tools, voordat ze kunnen worden gebruikt voor verdere analyse. Een nadeel van het gebruik van verschillende software tools voor het verwerken van diffusie-gewogen afbeeldingen is dat (vaak) elk gereedschap zijn eigen gegevensindeling gebruikt om de tabel met verloop richtingen te coderen. MRtrix3 slaat de verloop informatie samen met de diffusiegewogen afbeelding op in een. mif-bestand, terwijl ExploreDTI gebruik maakt van een afzonderlijk bestand (B-matrix) om de verloop richtingen op te slaan. Daarom is het belangrijk om te controleren of de verloop richtingen correct worden overgebracht van MRtrix3 naar ExploreDTI. Dit kan worden gedaan door te controleren of de kleurcodering correct is op kleurgecodeerde FA-afbeeldingen [dat wil zeggen, links-rechts richting in het rood (bijv. corpus callosum), richting in het groen en inferieure-posterieure richting in het blauw (bijv. Cingulum)]. De kleurgecodeerde FA-afbeeldingen kunnen ook worden gebruikt om de kwaliteit van het niet-rigide co-registratieproces tussen de diffusie-gewogen beelden en structurele T2-gewogen beelden te controleren.

Met behulp van ExploreDTI werden parametrische kaarten geëxtraheerd met behulp van de DTI-, DKI-en WMTI-modellen. Het DTI-model voorzag in parametrische kaarten voor MD, AD, RD en FA, terwijl het DKI-model parametrische kaarten biedt voor MK, AK en RK. Hoewel vier metrische gegevens van het model WMTI werden berekend (dat wil zeggen, AWF, AxEAD, RadEAD, onrechtmatige daad), was het niet mogelijk om intra-axonale diffusiviteit (IAD) uit te pakken binnen ExploreDTI. IAD kan worden verkregen met behulp van een MATLAB-tool die wordt geleverd door de ontwikkel aren van het WMTI-model25. Om dit te doen, moeten de diffusiegewogen afbeeldingen en gradiënt informatie opnieuw van ExploreDTI naar MATLAB worden overgebracht. Deze stap is opnieuw gevoelig voor fouten met betrekking tot de codering van verloop informatie. Bovendien moeten de kurtosis tensor en de WMTI-parameters worden geschat en opnieuw berekend.

Voor verwerking van de verworven beelden, schatting van de Tensors, en berekening van de parametrische kaarten vereist een lange periode van computertijd. Correcties voor EPI, Motion en Eddy Current vereist ~ 40 min per gegevensset op een server met acht cores en 16 GB RAM. Met behulp van een ROI analyse, gemiddelde waarden binnen de Hippocampus werden berekend vóór en 1 dag na de botsing. Wijzigingen in de metrische gegevens van DTI, DKI en WMTI werden vervolgens gekwantificeerd in de mTBI-groep. In de DKI-metrische gegevens en AWF van het model WMTI werd echter een grote variabiliteit van de Inter-onderwerp waargenomen, wat resulteerde in een onverwacht verschil in basislijnwaarden tussen de Sham-en mTBI-groepen. Dit is hoogstwaarschijnlijk het resultaat van voxels die biologisch onplausibele waarden (uitschieters) in het onderzochte gebied bevatten en kan in toekomstige onderzoeken worden uitgefilterd voordat de gemiddelde waarden in amide worden berekend.

Concluderend, dit protocol demonstreert de haalbaarheid van Advanced Diffusion MRI voor het onderzoeken en kwantificeren van microstructurele veranderingen in de Hippocampus in een rat model van mTBI. Met behulp van drie verschillende diffusie modellen kan aanvullende informatie worden verkregen over de onderliggende biologische processen die bijdragen aan de voorwaarden na mTBI. Dit betekent een stap voorwaarts in de ontwikkeling van biomarkers voor mTBI die gevoelig genoeg kunnen zijn om specifieke microstructurele veranderingen in de vroege fase na milde impact te identificeren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.

Acknowledgments

De auteurs willen graag Research Foundation-Flanders (FWO) bedanken voor het ondersteunen van dit werk (subsidie nummer: G027815N).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Induction of trauma
0.9% NaCl physiologic solution B Braun 394496
brass weight 450g custom made custom made diamter 18mm and 210 mm height
catheter Terumo Versatus-W 26G
ethilon II Ethicon EH7824 FS-3, 4-0, 3/8, 16mm
Matrass Foam to Size Type E
Plexiglas tube ISPA Plastics 416564 M1 PMMA XT GOO tube 25x19 mm (inner diamter 19 mm, minimal length of 1.50 m)
Preclinical CT scanner Molecubes X-cube
Steel helmet custom made custom made diameter 10 mm and 3 mm thickness
Vetbond Tissue Adhesive 3M 1469SB
Vetergesic (buprenorphin) EcuPhar VETERG20 0.05 mk/kg
Xylocaine 2% gel AstraZeneca Xylocaine 2% gel
Xylocaine (lidocain 2%) Aspen/AstraZeneca Xylocaine 2% gel 100 μl injection
Diffusion MRI
Preclinical MRI acquisition software Bruker Biospin MRI GmbH Z400_PV51_CENTOS55 ParaVision 5.1 MRI software
Preclinical MRI scanner Bruker Biospin MRI GmbH PharmaScan 70/16 7T MRI scanner
Quadrature volume coil Bruker Biospin MRI GmbH RF RES 300 1H 075/040 QSN TR Model No: 1P T13161C3
Small animal physiological monitoring unit Rapid Biomedical EKGHR02-0571-043C01 Unit for respiratory monitoring
Water-based heating unit Thermo Fisher Scientific Haake S 5P Model No: 1523051
Anaesthesia
Anaesthesia movable unit Veterenary technics BDO - Medipass, Ijmuiden
isoflurane: Isoflo Zoetis B506
Oxygen generator Veterenary technics 7F-3 BDO - Medipass, Ijmuiden
Diffusion image processing
Amide http://amide.sourceforge.net Version 1.0.5. Medical Imaging Data Examiner Toolbox (Loening AM, Gambhir SS, " AMIDE: A Free Software Tool for Multimodality Medical Image Analysis", Molecular Imaging, 2(3):131-137, 2003)
ExploreDTI http://www.exploredti.com Version 4.8.6 Toolbox for (pre-)processing and analysis of diffusion weighted MR images (Leemans A, Jeurissen B, Sijbers J, and Jones DK. ExploreDTI: a graphical toolbox for processing, analyzing, and visualizing diffusion MR data. In: 17th Annual Meeting of Intl Soc Mag Reson Med, p. 3537, Hawaii, USA, 2009)
MRtrix3 http://www.mrtrix.org Version 3.0_RC3-86-g4b523b41 Toolbox for (pre-)processing and analysis of diffusion weighted MR images

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Carroll, L. J., et al. Systematic Review of the Prognosis After Mild Traumatic Brain Injury in Adults. Cognitive, Psychiatric, and Mortality Outcomes: Results of the International Collaboration on Mild Traumatic Brain Injury Prognosis. Archives of Physical Medicine and Rehabilitation. 95, (3), S152-S173 (2014).
  2. Buck, P. W. Mild Traumatic Brain Injury: A Silent Epidemic in Our Practices. Health & Social Work. 36, (4), 299-302 (2011).
  3. Bodanapally, U. K., Sours, C., Zhuo, J., Shanmuganathan, K. Imaging of Traumatic Brain Injury. Radiologic Clinics of North America. 53, (4), 695-715 (2015).
  4. Basser, P. J., Mattiello, J., LeBihan, D. MR diffusion tensor spectroscopy and imaging. Biophysical Journal. 66, (1), 259-267 (1994).
  5. Hulkower, M. B., Poliak, D. B., Rosenbaum, S. B., Zimmerman, M. E., Lipton, M. L. A Decade of DTI in Traumatic Brain Injury: 10 Years and 100 Articles Later. American Journal of Neuroradiology. 34, (11), 2064-2074 (2013).
  6. Hutchinson, E. B., Schwerin, S. C., Avram, A. V., Juliano, S. L., Pierpaoli, C. Diffusion MRI and the detection of alterations following traumatic brain injury. Journal of Neuroscience Research. 96, (4), 612-625 (2018).
  7. Wallace, E. J., Mathias, J. L., Ward, L. Diffusion tensor imaging changes following mild, moderate and severe adult traumatic brain injury: a meta-analysis. Brain Imaging and Behavior. 1-15 (2018).
  8. Rutgers, D. R., et al. White Matter Abnormalities in Mild Traumatic Brain Injury: A Diffusion Tensor Imaging Study. American Journal of Neuroradiology. 29, (3), 514-519 (2008).
  9. Bondi, C. O., et al. Found in translation: Understanding the biology and behavior of experimental traumatic brain injury. Neuroscience & Biobehavioral Reviews. 58, 123-146 (2015).
  10. Shultz, S. R., et al. The potential for animal models to provide insight into mild traumatic brain injury: Translational challenges and strategies. Neuroscience & Biobehavioral Reviews. 76, 396-414 (2017).
  11. Osier, N. D., Dixon, C. E. The Controlled Cortical Impact Model: Applications, Considerations for Researchers, and Future Directions. Frontiers in Neurology. 7, (AUG), (2016).
  12. Lyeth, B. G. Historical Review of the Fluid-Percussion TBI Model. Frontiers in Neurology. 7, (DEC), 1-7 (2016).
  13. Marmarou, A., Foda, M. A. A. -E., van den Brink, W., Campbell, J., Kita, H., Demetriadou, K. A new model of diffuse brain injury in rats. Journal of Neurosurgery. 80, (2), 291-300 (1994).
  14. Heim, L. R., et al. The Invisibility of Mild Traumatic Brain Injury: Impaired Cognitive Performance as a Silent Symptom. Journal of Neurotrauma. 34, (17), 2518-2528 (2017).
  15. Zohar, O., Rubovitch, V., Milman, A., Schreiber, S., Pick, C. G. Behavioral consequences of minimal traumatic brain injury in mice. Acta Neurobiol Exp (Wars. 71, (1), 36-45 (2011).
  16. Pierpaoli, C., Basser, P. J. Toward a quantitative assessment of diffusion anisotropy. Magnetic resonance in medicine : official journal of the Society of Magnetic Resonance in Medicine / Society of Magnetic Resonance in Medicine. 36, (6), 893-906 (1996).
  17. Jensen, J. H., Helpern, J. A. MRI quantification of non-Gaussian water diffusion by kurtosis analysis. NMR in Biomedicine. 23, (7), 698-710 (2010).
  18. Fieremans, E., Jens, H., Jensen, J. A. H. White matter characterization with diffusional kurtosis imaging. NeuroImage. 58, 177-188 (2011).
  19. Leemans, A. Explore DTI. (2019).
  20. Loening, A. M., Gambhir, S. S. AMIDE: A Free Software Tool for Multimodality Medical Image Analysis. Molecular Imaging. 2, (3), 131-137 (2003).
  21. Veraart, J., et al. Denoising of diffusion MRI using random matrix theory. NeuroImage. 142, 394-406 (2016).
  22. Veraart, J., Fieremans, E., Novikov, D. S. Diffusion MRI noise mapping using random matrix theory. Magnetic Resonance in Medicine. 76, (5), 1582-1593 (2016).
  23. Braeckman, K., et al. Dynamic changes in hippocampal diffusion and kurtosis metrics following experimental mTBI correlate with glial reactivity. NeuroImage: Clinical. 21, (August 2018), 101669 (2019).
  24. Jones, D. K., Knösche, T. R., Turner, R. White matter integrity, fiber count, and other fallacies: The do's and don'ts of diffusion MRI. NeuroImage. 73, 239-254 (2013).
  25. Matlab code DKI and WMTI model. Available from: https://github.com/NYU-DiffusionMRI/Diffusion-Kurtosis-Imaging (2019).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics