Imagem latente avançada da difusão no Hippocampus dos ratos com ferimento de cérebro traumático suave

Neuroscience

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Summary

O objetivo geral deste procedimento é obter informações microestruturais quantitativas do hipocampo em um rato com lesão cerebral traumática leve. Isto é feito usando um protocolo avançado difusão-tornado mais pesado da imagem latente de ressonância magnética e a análise baseada região--interesse de mapas paramétricos da difusão.

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Braeckman, K., Descamps, B., Vanhove, C. Advanced Diffusion Imaging in The Hippocampus of Rats with Mild Traumatic Brain Injury. J. Vis. Exp. (150), e60012, doi:10.3791/60012 (2019).

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Abstract

A lesão cerebral traumática leve (mTBI) é o tipo mais comum de lesão cerebral adquirida. Como os pacientes com lesão cerebral traumática apresentam uma tremenda variabilidade e heterogeneidade (idade, sexo, tipo de trauma, outras patologias possíveis, etc.), os modelos animais desempenham um papel fundamental nos fatores que são limitações na pesquisa clínica. Fornecem um ajuste padronizado e controlado para investigar os mecanismos biológicos do ferimento e do reparo depois de TBI. No entanto, nem todos os modelos animais imitam a natureza difusa e sutil do mTBI efetivamente. Por exemplo, o impacto cortical controlado comumente usado (CCI) e os modelos de lesão de percussão de fluido lateral (LFPI) fazem uso de uma craniotomia para expor o cérebro e induzir trauma focal generalizado, que não são comumente vistos no mTBI. Portanto, esses modelos experimentais não são válidos para imitar o mTBI. Assim, um modelo apropriado deve ser usado para investigar o mTBI. O modelo de queda de peso de Marmarou para ratos induz alterações microestruturais e deficiências cognitivas semelhantes, como observado em pacientes que sustentam trauma leve; Portanto, esse modelo foi selecionado para este protocolo. As varreduras convencionais do tomography computado e da imagem latente de ressonância magnética (MRI) mostram geralmente nenhum dano que segue uma lesão suave, porque o mTBI induz frequentemente somente as lesões subtis e difusas. Com o MRI tornado mais pesado da difusão, é possível investigar Propriedades microestrutural do tecido de cérebro, que pode fornecer mais introspecção nas alterações microscópicas que seguem o traumatismo suave. Portanto, o objetivo deste estudo é obter informações quantitativas de uma região de interesse selecionada (ou seja, hipocampo) para acompanhar a progressão da doença após a obtenção de uma lesão cerebral leve e difusa.

Introduction

A lesão cerebral traumática (TCE) tem ganhado mais atenção nos últimos anos, pois tornou-se evidente que essas lesões cerebrais podem resultar em consequências cognitivas, físicas, emocionais e sociais ao longo da vida1. Apesar desta consciência crescente, o TBI leve (mTBI, ou concussão) ainda é frequentemente subrelatado e não diagnosticado. O MTBI foi referido como uma epidemia silenciosa, e indivíduos com história de mTBI apresentam taxas mais elevadas de abuso de substâncias ou problemas psiquiátricos2. Diversos pacientes com mTBI vão undiagnosed cada ano devido à natureza difusa e subtil das lesões, que não são frequentemente visíveis em varreduras convencionais do tomography computado (CT) ou da imagem latente de ressonância magnética (MRI). Esta falta de evidência radiológica de ferimento de cérebro conduziu ao desenvolvimento de umas técnicas mais avançadas da imagem latente tais como a difusão MRI, que são mais sensíveis às mudanças microestrutural3.

A difusão MRI permite o mapeamento in vivo da microestrutura, e esta técnica de MRI tem sido usada extensivamente em estudos de TBI4,5,6. A partir do tensor de difusão, a anisotropia fracionária (FA) e a difusividade média (MD) são computadas para quantificar a alteração na organização microestrutural após lesão. Comentários recentes em pacientes com mTBI relatam aumentos na FA e diminuem em MD após lesão, o que pode ser indicativo de inchaço axonal7. Ao contrário, aumentos na MD e diminuições na FA também são encontrados e têm sido sugeridos para fundamentam rupturas na estrutura parenquimatosa após a formação de edema, degeneração axonal, ou desalinhamento de fibra/ruptura8. Esses achados mistos podem ser parcialmente explicados pela heterogeneidade clínica significativa do mTBI causada por diferentes tipos de impacto e severidade (por exemplo, rotação-aceleração, trauma de força bruta, lesão de jateamento ou combinação do primeiro). No entanto, atualmente não há um consenso claro sobre a patologia subjacente e base biológica/celular que sustentam alterações na organização microestrutural.

Os modelos animais fornecem um ajuste padronizado e controlado para investigar mecanismos biológicos de ferimento e reparar depois de TBI mais detalhadamente. Vários modelos experimentais para TBI foram desenvolvidos e representam diferentes aspectos da TBI humana (por exemplo, trauma focal vs. difuso ou trauma causado por forças rotacionais)9,10. Os modelos animais comumente usados incluem os modelos de impacto cortical controlado (CCI) e lesão de percussão de fluido lateral (lfpi)11,12. Embora os parâmetros experimentais possam ser bem controlados, estes modelos fazem uso de uma craniotomia para expor o cérebro. Craniotomias ou fraturas do crânio não são comumente observadas no mTBI; Portanto, esses modelos experimentais não são válidos para imitar o mTBI. O modelo de aceleração de impacto desenvolvido por Marmarou et al.13 faz uso de um peso que é retirado de uma certa altura para a cabeça do rato, que é protegida por um capacete. Este modelo animal induz alterações microestruturais e deficiências cognitivas semelhantes, como observado em pacientes que sustentam trauma leve. Portanto, este modelo de queda de peso de marmarou é apropriado para investigar biomarcadores de imagem para MTBI difuso14,15.

Este relatório demonstra a aplicação de MRI avançado da difusão em um modelo do rato do mTBI usando o modelo da gota do peso de Marmarou. Mostrado primeiramente é como induzir um traumatismo suave e difuso, e a análise usando o modelo da imagem latente do tensor da difusão (DTI) é fornecida então. A informação biológica específica é obtida com o uso de modelos de difusão mais avançados [isto é, imagem de curtose de difusão (DKI) e modelo de integridade do trato de matéria branca (WMTI)]. Especificamente, o traumatismo suave é infligido e as mudanças microestruturais são avaliadas então no hipocampo usando MRI convencional de T2-weighted e um protocolo avançado da imagem latente da difusão.

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Protocol

O protocolo foi aprovado pelo Comitê de ética animal da Universidade de Ghent (ECD 15/44Aanv), e todos os experimentos foram conduzidos de acordo com as diretrizes da Comissão Européia (diretiva 2010/63/UE).

1. preparação animal e acessório do capacete

  1. Pesar um rato fêmea Wistar H (± 250 g ou 12 semanas de idade) e anestesiar em uma pequena câmara de indução preenchida com uma mistura de isoflurano (5%) e O2 durante pelo menos 1 min.
  2. Injete o rato com 0, 5 mg/kg de buprenorfina por via subcutânea no pescoço, devolva-o para a gaiola de casa e permita a analgesia preventiva durante pelo menos 30 min para tomar um efeito.
    Nota: durante a espera de 30 minutos, o local cirúrgico pode ser preparado.
  3. Coloc uma almofada de aquecimento mantida em 37 ° c o campo cirúrgico. Coloque os instrumentos cirúrgicos esterilizados no campo cirúrgico que foi desinfectado com 70% de etanol.
  4. Coloque o rato de volta na câmara de indução e anestesiar o rato até que seja não-responsivo a uma pata ou cauda pitada.
  5. Coloque o rato no campo cirúrgico e insira um cateter na veia da cauda lateral. Em seguida, depilar a cabeça do rato, remover o excesso de pêlo e desinfectar o couro cabeludo e o resto da área cirúrgica com clorohexidina.
  6. Injetar 100 μL de lidocaína a 2% localmente no couro cabeludo.
  7. Faça uma incisão na linha média usando um bisturi tamanho 11 para expor o crânio, removendo qualquer excesso de membranas com pequenas tesouras. Retrair a pele usando um espéculo ocular com uma propagação máxima de 1 cm.  Além disso, retire o periósteo esfregando suavemente um cotonete estéril através do crânio até que o periósteo não esteja mais presente.
  8. Coloque uma gota de cola de tecido no crânio e uma sobre o disco metálico esterilizado (diâmetro de 10 mm e 3 mm de espessura), que atua como o capacete. Cole o disco aproximadamente um terço antes e dois terços atrás da Bregma. Deixe secar a cola durante 1 min.

2. indução de traumatismo cranioencefálico (TBI)

  1. Coloc o rato na cama feito-à-medida com um colchão da espuma da determinada mola constante (veja a tabela dos materiais). Posicione o rato diretamente um tubo plástico transparente com um peso de bronze de 450 g com o capacete tão horizontal como possível. Retire o rato da anestesia.
  2. Puxe o peso até 1 m e solte-o quando estiver pronto. Assegure-se de que um segundo experimentador esteja atual para mover o rato afastado do tubo plástico imediatamente depois do impacto para impedir um segundo impacto.
    Nota: os ratos lesionados recebem o mesmo procedimento experimental (passos 1.1 – 2.7), excepto no passo 2,2.
  3. Reconecte o rato à anestesia e Injete 1 mL de solução fisiológica (0,9% NaCl) através do cateter para reduzir o choque hemodinâmico.
    Nota: é possível que o rato pare brevemente a respiração devido ao impacto. Comprima suavemente o tórax se o rato não respirar espontaneamente após 2 s para incentivar o reflexo respiratório.
  4. Retire o capacete puxando-o suavemente do crânio. Retire qualquer cola remanescente do crânio e da pele e feche a incisão com sutura cirúrgica. Aplique o gel local da analgesia usando uma ponta estéril do aplicador.
  5. Coloque o rato na cama do scanner de TC. Confirme a posição correta usando uma varredura do Scout. Ajuste o campo de visão para permitir a imagem latente da cabeça inteira dentro de uma posição da cama. Administrar um propósito geral, baixa dose de tomografia computadorizada para descartar fraturas do crânio.
    Nota: a fratura do crânio é um critério para a eutanásia.
  6. Coloque o rato numa gaiola limpa numa almofada de aquecimento (37 ° c). Monitore o tempo para recuperar a consciência. Uma vez que o rato é capaz de sentar-se ereto, o rato pode ser devolvido para a gaiola de casa.
  7. Administrar uma segunda dose de 0, 5 mg/kg de buprenorfina um dia após a indução de TBI.

3. imagem latente de ressonância magnética da difusão (MRI)

Observação: a imagem ponderada por difusão é realizada antes e 1 dia após a indução do trauma.

  1. Anestesiam o rato em uma pequena câmara de indução preenchida com uma mistura de isoflurano (5%) e O2. Quando o rato é não-responsivo a uma pata ou a pitada da cauda reduzem a anestesia a 2% com uma taxa de fluxo de 500 mL/min. Transfira o animal à cama do varredor na posição prona cabeça-primeira.
  2. Posicione o rato no suporte principal com a barra dos dentes e o cone do nariz, entregando a anestesia, e deslize a cabeça para a frente até que o centro do cérebro esteja a nível do centro do volume da quadratura bobina de MRI. Aplique pomada lubrificante aos olhos em pequenas quantidades para evitar qualquer dano à córnea. Fixate a cabeça com um pequeno pedaço de fita para evitar o movimento durante a digitalização.
  3. Coloque uma almofada de pressão o tórax do rato para monitorar a respiração e cobrir o rato com um cobertor de aquecimento de água quente circulante e envoltório de bolha para manter o rato quente. Antes da digitalização, verifique o monitor respiratório para garantir que o sinal é claro, sem ruído e que o ciclo respiratório é consistente. Realocar a almofada de pressão, se necessário.
    Nota: a frequência respiratória deve ser mantida entre 1 respiração por 1200 – 1700 MS ajustando o nível de anestesia entre 1% – 2%.
  4. Deslize a bobina de volume de quadratura sobre a cabeça. Ajuste o ajuste e os capacitores de harmonização da bobina à freqüência e à impedância apropriadas de acordo com as instruções fornecidas pelo vendedor da bobina. Avance a cama do scanner no furo do scanner para iniciar a digitalização.
  5. Obtenha uma varredura de Scout de três planos padrão ("tripilot") para garantir o posicionamento correto.
    1. Carregue a sequência de tripilot no controle de digitalização clicando em nova verificação e selecionando a sequência de tripilot na lista de protocolos. Em seguida, clique no botão semáforo para iniciar a digitalização.
    2. Quando a digitalização for concluída, carregue a digitalização na exibição da imagem e assegure-se de que 1) a cabeça esteja deitada em linha reta e 2) o cérebro esteja posicionado no centro do ímã e da bobina. Ajuste a posição da cabeça e/ou do leito do scanner, se necessário, e adquira uma nova varredura tripilot.
  6. Ajuste o campo magnético local usando um protocolo de shimming de segunda ordem automatizado: carregue o protocolo de Shim de segunda ordem no controle de digitalização, conforme descrito na etapa 3.5.1. Em seguida, clique na guia ACQ | Ajustes atuais | Ajuste específico do método para a homogeneidade de campo local na janela da ferramenta de controle do espectrómetro para iniciar o shimming automatizado.
  7. Carregue uma nova imagem T2 Rapid com a sequência Refocused ecos (RARE) no controlo Scan, conforme descrito no passo 3.5.1.
    1. Adquira imagens ponderadas em T2 usando as configurações padrão, exceto para os seguintes parâmetros:
    2. Abra a guia Editar digitalização e ajuste o tempo de repetição (TR) e o tempo de eco (te) para 5.500 ms e 37 MS, respectivamente. Além disso, modifique o campo de visão e o tamanho da matriz para permitir uma resolução no plano mais alta de 109 μm x 109 μm (resolução padrão = 156 μm x 156 μm). Certifique-se de que a espessura da fatia é 600 μm, o número de fatias é ajustado a 45, e o fator raro está ajustado a 8.
    3. Abra o Editor de geometria e coloque o pacote de fatia na posição correta, incluindo o bulbus do cérebro e o cerebelo.
  8. Carregue três novos Echo-planar difusão-ponderada spin-Echo Sequence (DtiEpi) da pasta B_DIFFUSION no protocolo Scan Control conforme descrito na etapa 3.5.1.
    Nota: usando três diferentes de difusão "conchas", o tensor de difusão de imagem (DTI) modelo4,16, difusão curtose Imaging (DKI) modelo17, e matéria branca do trato de integridade (wmti) modelo18 pode todos ser estimado. Recomenda-se usar pelo menos três b-valores diferentes, com o b-valor o mais elevado que tem um máximo de 3000 s/milímetro2 com pelo menos 15 sentidos uniformemente espaçados por o escudo da imagem latente17.
    1. Adquira imagens ponderadas por difusão (DWIs) usando as configurações padrão, além das seguintes configurações:
    2. Abra a guia Editar digitalização e ajuste os parâmetros geométricos na guia geometria . Ajuste o campo de visão e o tamanho da matriz para 105 x 105 para garantir uma resolução de 333 μm x 333 μm.
    3. Defina a orientação da fatia como axial e o número de fatias para 25, resultando em uma espessura de fatia de 500 μm e distância a de 600 μm. Altere a direção de leitura para a esquerda-direita.
    4. Clique na guia contraste para ajustar o tempo de eco para 24 MS e tempo de repetição para 6.250 MS.
    5. Defina a largura de banda para 250.000 Hz e gire a supressão de gordura. Ajuste o número de médias para um.
    6. Clique na guia pesquisa e altere o número de médias (segmentos EPI) para 4.
    7. Clique na guia difusão dentro da guia de pesquisa. Realize esta etapa separadamente para cada uma das três conchas de difusão.
      1. Ajuste o número de direções de difusão para 32 para o primeiro Shell, 46 para o segundo Shell e 64 para o terceiro Shell.
      2. Ajuste as direções de gradiente com arquivos de direções de gradiente personalizados.
      3. Altere o número de imagens B0 para 5 para o primeiro Shell, 5 para o segundo Shell e 7 para o terceiro Shell.
      4. Ajuste o valor b por direção para 800 s/mm2 para a primeira casca, 1500 s/mm2 para o segundo Shell, e 2000 s/mm2 para o terceiro Shell.
        Observação: ajustar as direções de gradiente com um arquivo de direções de gradiente personalizado pode ser feito manualmente, definindo Inserir direções de difusão para Sim ou automaticamente usando a macro DTI_SET_DIRECTIONS.
    8. Abra o Editor de geometria e coloque o campo de visão entre o bulbus e o cerebelo contendo apenas o cérebro para reduzir o tempo de artefato e digitalização. Posicione seis bandas de saturação de 5 mm fora do cérebro para reduzir os artefatos clicando na saturação e deslizando as bandas na posição preferida usando as barras de rolagem.
      Nota: o bulbus e o cerebelo podem ser identificados com base em marcos anatômicos e as três imagens da varredura do tripilot.
  9. Adquira as sequências importadas clicando no símbolo de semáforo. Usando as configurações dos parâmetros descritos acima, o tempo de aquisição da digitalização T2-RARE é de 12 min, do primeiro Shell DWI 15 min, do segundo Shell DWI 21 min e do terceiro Shell 30 min. O tempo total de aquisição é de aproximadamente 80 min (em um único sistema de canal receptor).
  10. Na conclusão do protocolo de digitalização, retire o animal da cama do scanner e coloque o animal numa gaiola limpa com uma almofada de aquecimento a 37 ° c. Retorne o animal à gaiola Home quando recupera a consciência.

4. processamento de imagem

Observação: nas seções a seguir, o processamento das imagens de difusão é descrito em MRtrix3, ExploreDTI19 e Amida software20 que são caixas de ferramentas de acesso aberto. No entanto, as etapas de pré-processamento podem ser executadas em outras caixas de ferramentas (por exemplo, FSL, MedInria, DTIStudio).

  1. Transfira os dados adquiridos do console de aquisição exportando o arquivo 2dseq.
  2. Converta os arquivos 2dseq (arquivos DWI brutos) no formato. MIF, que é a formatação padrão de MRtrix3, para permitir mais etapas de pré-processamento em MRtrix3. Além disso, concatenar os três shells de difusão usando os seguintes comandos no Shell:
    convert_bruker pData/1/2dseq ratID_T2. mih (para as imagens ponderadas em T2)
    convert_bruker pData/1/2dseq ratID_dwi1. mih (para o primeiro escudo de difusão)
    convert_bruker pData/1/2dseq ratID_dwi2. mih (para o segundo escudo de difusão)
    convert_bruker pData/1/2dseq ratID_dwi3. mih (para o terceiro escudo de difusão)
    o ratID_dwi1. mif ratID_dwi2. mif ratID_dwi3. mif ratID_dwi. MIF
  3. Execute a correção de ruído e a correção de toque de Gibbs no DWIs em MRtrix3,21,22. Além disso, converta as imagens DWI corrigidas e a imagem T2 para o formato NIFTI usando os seguintes comandos:
    dwidenoise ratID_dwi. mif ratID_dwi_denoised. MIF
    mrdegibbs ratID_dwi_denoised. mif ratID_dwi_denoised_gr. MIF
    mrconvert ratID_dwi_denoised_gr. mif ratID. Nii
    mrconvert ratID_T2. mif ratID_T2. Nii
  4. Realize correção para as distorções de EPI, movimento e correntes parasitas no ExploreDTI:
    1. Converta as imagens NIFTI em um arquivo. Mat clicando em calcular arquivo DTI*. Mat | Converta dados brutos para o arquivo DTI*. Mat. Altere a estimativa de tensor de difusão para pesar linear e o valor b para NaN. Ajuste o tamanho do VOXEL a 0,333 0,333 0,6, o número de imagens não-DWI a 17, o número de imagens de DWI a 142, e o tamanho da matriz a 105 105 25.
      Observação: definindo o valor b para NaN, ExploreDTI considerará o DataSet como um conjunto de dados de curtose.
    2. Clique na guia configurações para ajustar as configurações para correção de EPI (isso é desativado por padrão). Selecione a correção SM/EC/EPI, registre-se também para outros dados? e clique em Sim, para fazer a correção EPI (não-rígida). Especifique o sufixo da imagem T2 anatômica correspondente ao conjunto de dados de difusão.
      Nota: ExploreDTI corrige para distorções de EPI usando o registro de imagem entre a imagem anatômica não distorcida e a imagem de difusão.
    3. Clique na guia plugins e selecione correção para o movimento do assunto & distorções EC/EPI e selecione o arquivo de dados de difusão pré-processado da etapa 2,3. Certifique-se de que a imagem T2 está na mesma pasta e tem a mesma base que o nome do arquivo de dados de difusão (por exemplo, rat1. Nii para o DWI e rat1_T2. Nii para a imagem anatômica). Esta etapa gerará um arquivo "nativo" (* Native. Mat) e "transformado" (* Trafo. Mat).
  5. Calcule as métricas de DTI para cada rato clicando em plugins e exporte coisas para *. Nii e selecionando os mapas paramétricos do modelo DTI: anisotropia fracionária (FA), DIFUSIVIDADE média (MD), DIFUSIVIDADE radial (RD) e DIFUSIVIDADE axial (AD; denotados como "maior valor autovalor L1").
  6. Além disso, exporte os mapas paramétricos para o modelo de curtose (MK, AK e RK) e o modelo WMTI (AWF, AxEAD, RadEAD e TORT). O processamento das imagens de difusão resultará em 12 mapas paramétricos (figura1, Figura 2, Figura 3) que podem ser utilizados para posterior análise microestrutural.
  7. Crie um arquivo de máscara para o hipocampo de cada rato usando MRtrix3.
    1. Carregue a imagem FA do rato no visualizador MRtrix clicando em ferramenta e editor de ROI.
    2. Crie um novo ROI clicando no botão "+" e pressione Edit para desenhar o ROI em cada fatia que inclua o hipocampo (Figura 4). Para apagar áreas indesejadas do ROI desenhado, pressione o botão direito do mouse.
    3. Quando o desenho do ROI for concluído, salve a imagem da máscara clicando no botão salvar .
      Nota: este arquivo de máscara será um arquivo de imagem NIFTI binário com voxels de valor 1 contendo o tecido hipocampal, e voxels restantes terão valores de 0. Para padronizar a região do hipocampo em ratos, os mapas paramétricos podem ser coregistados com um modelo específico de estudo com regiões de interesse predefinidas delineadas23 ou um Atlas cerebral de rato.
  8. Para extrair as métricas de difusão do hipocampo do rato, use o arquivo de máscara criado da etapa 4,6 e abra o software Amide.
    1. Abra os mapas paramétricos e a imagem da máscara do rato.
    2. Para adicionar o ROI do arquivo de máscara em amida, selecione a imagem do arquivo de máscara, clique em Editar | Adicionar ROI | 3D Isocontour e clique no ROI exibido na imagem da máscara. Dê ao ROI um nome significativo e confirme que este volume só deve conter voxels com um valor de um.
    3. Para calcular os valores médios das métricas de difusão no hipocampo, clique em ferramentas | Calcule estatísticas de ROI e indique as imagens e o ROI que devem ser incluídos. Depois de clicar em executar, outra tela aparecerá com valores computados que podem ser usados para posterior análise estatística. Esse arquivo pode ser salvo ou copiado em um formato de dados preferencial (por exemplo, arquivo. xlsx ou. csv).

5. análise estatística

Nota: nas seções a seguir, descrevemos o processamento das imagens de difusão no SPSS Statistics 24; no entanto, a análise estatística pode ser realizada em outras caixas de ferramentas estatísticas.

  1. Carregue os dados no formato largo em um arquivo SPSS *. SAV.
  2. Para testar as diferenças estatísticas entre os dois grupos para cada ponto temporal (i.e., linha de base ou 1 dia pós-lesão), clique em analisar | Testes não paramétricos | Diálogos legados | 2 testes de amostras independentes. Carregue as variáveis que precisam ser testadas e especifique os grupos (i.e., TBI e grupos Sham). Indique o U de Mann-Whitney como o tipo de teste.
  3. Para testar as diferenças estatísticas entre o 2 ponto de tempo dentro de cada grupo, o arquivo de dados precisa ser dividido. Vá para ir para dados, dividir arquivo e indicar comparar grupos. Em seguida, clique em analisar, testes não paramétricos, caixas de diálogo herdadas, 2 testes de amostras relacionados, carregar as variáveis que precisam ser comparadas e indicar Wilcoxon como tipo de teste.
    Nota: para corrigir várias comparações, os valores de p são ajustados para cada modelo de difusão usando a correção de Bonferroni [i.e., valor de p dividido pelo número de parâmetros comparados (DTI 4, DKI 3 e WMTI 4)]. Mais especificamente, p < 0, 125 é considerado significativo para os modelos DTI e WMTI, e p < 0, 16 é considerado significativo para o modelo DKI.

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Representative Results

No estudo, todos os ratos TBI (n = 10) sobreviveram ao impacto e conseguiram recuperar do impacto e da anestesia dentro de 15 min após o descolamento da anestesia23. Nas imagens tomográficas, não houve evidência de fraturas cranianas e as imagens T2 não mostraram anormalidades como sangramento, ventrículos aumentados ou formação de edema no local da contusão 1 dia após o trauma (Figura 5). Assim, com base nessas inspeções visuais das imagens anatômicas, grandes lesões focais não foram detectadas, confirmando a natureza difusa e leve da lesão.

A qualidade da etapa de coregistração (não rígida) entre a imagem T2 e o conjunto de dados de difusão (etapa 4,4) foi examinada adicionando uma sobreposição da imagem T2 ao mapa de FA codificado por cores (Figura 6). Em seguida, foram calculados os mapas paramétricos FA, MD, AD e RD (Figura 1) e carregados no software Amida. Com base no mapa de FA, foi desenhado um ROI, incluindo a estrutura hipocampal (Figura 4). Os valores estatísticos das métricas de difusão foram calculados em média em todos os voxels dentro da região de interesse e os valores médios de cada métrica DTI foram exportados para posterior análise. Uma outra verificação da qualidade dos dados da difusão pode ser executada inspecionando os outliers nas métricas DTI. Por exemplo, os valores de FA no hipocampo devem ser em torno de 0,15; Conseqüentemente, os valores de < 0.10 (que denotam a difusão isotrópico) ou > 0.30 (os valores são considerados na matéria branca) podem ser considerados como valores biologicamente implausíveis. Estes pontos dados devem ser rejeitados de uma análise mais aprofundada. Foram calculados também os valores médios de AK, RK e MK do modelo de curtose de difusão, assim como o AWF, AxEAD, RadEAD e TORT do modelo WMTI (Figura 2, Figura 3).

Em nosso estudo, a análise das métricas de DTI revelou aumento significativo dos valores de FA (p = 0, 7) e diminuição dos valores de difusividade (MD e RD) (p = 0, 7 e p = 0, 7, respectivamente) após o impacto no grupo mTBI (Figura 7). Essas reduções na RD e MD foram significativamente diferentes do grupo Sham (p = 0, 5 e p = 0, 4, respectivamente). As métricas de curtose de difusão mostraram uma diminuição significativa da RK (p = 0, 5) após o impacto, mas não houve alterações na AK ou MK (Figura 8). Usando o modelo de WMTI, RadEAD (p = 0, 7) e TORT (p = 0, 7) exibiu uma diminuição significativa e aumento, respectivamente, no grupo mTBI 1 dia após o impacto (Figura 9C, D). Os valores no grupo Sham não mostraram alterações significativas.

Figure 1
Figura 1: mapas paramétricos representativos para anisotropia fracionária (FA), difusividade média (MD), difusividade axial (AD) e difusividade radial (RD). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: mapas paramétricos representativos para curtose média (MK), curtose axial (AK) e curtose radial (RK). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: mapas paramétricos representativos para fração de água axonal (AWF), difusividade axial e radial extra axonal (AxEAD, RadEAD) e tortuosidade (TORT). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: criando uma máscara em MRtrix3. Um ROI é desenhado em torno do hipocampo em todas as fatias contendo o volume do hipocampo, e o volume é salvo como um arquivo de máscara. Isso pode ser feito para cada rato individualmente ou usando um arquivo de máscara de modelo específico de estudo para o qual cada um dos mapas paramétricos pode ser coregistrado. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5: imagens ponderadas de TC e T2 de um animal representativo do mTBI 1 dia após o impacto. As imagens do CT (fileira superior) não mostram nenhumas fraturas do crânio. Nas imagens de T2-weighted (fileira inferior) nenhum sangramento, ventrículos aumentados, ou formação do edema foram demonstrados. Da nota, a formação do edema é claramente visível como uma área do hyperintense em torno da área da ferida da intervenção cirúrgica. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 6
Figura 6: mapa de FA codificado por cores do conjunto de dados de difusão sobreposto com a imagem anatômica após correção para EPI, movimento e correção de correntes parasitas no ExploreDTI. Mostrado é uma má correção e coregistro à esquerda e bons exemplos à direita. Deve-se garantir que a codificação de cores esteja correta: direção esquerda-direita em vermelho (por exemplo, corpo caloso), direção ântero-posterior em verde e direção inferior-superior em azul (por exemplo, cingulum). Adicionalmente, a cor codificou a imagem do FA deve perfeitamente ser alinhada com a imagem anatômica. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 7
Figura 7: alterações nas métricas de tensor de difusão do hipocampo para os animais Sham (n = 10) e mTBI (n = 10). Após o impacto, houve aumento significativo da FA (a) e diminuição significativa da difusividade média (b) e da difusividade radial (d) nos animais do MTBI (b, d). Não foram observadas diferenças significativas para a difusividade axial (C) nos ratos MTBI. Os animais simulados não mostraram alterações significativas na DTI (* p < 0, 125). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 8
Figura 8: alterações na métrica de curtose de difusão do hipocampo para os animais Sham (n = 10) e mTBI (n = 10). Após o impacto, houve uma diminuição significativa da RK (C) dos animais do MTBI, mas não houve alterações na AK (B) ou MK (a). Os animais simulados não mostraram alterações (* p < 0, 166). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 9
Figura 9: alterações nas métricas de integridade do trato de matéria branca do hipocampo para os animais Sham (n = 10) e mTBI (n = 10). Após o impacto, houve uma diminuição significativa na RadEAD (C) e aumento significativo no Tort (D) dos animais MTBI, mas nenhuma alteração na AWF ou axead (a, B). Os animais simulados não mostraram alterações (* p < 0, 125). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Desde que o MTBI é frequentemente o resultado de um ferimento difuso e subtil que não mostre nenhuma anomalia no CT e em varreduras convencionais de MRI, a avaliação de dano microestrutural após um traumatismo suave permanece um desafio. Conseqüentemente, umas técnicas mais avançadas da imagem latente são necessárias para visualizar a extensão cheia do traumatismo. A aplicação da imagem latente de ressonância magnética da difusão na pesquisa de TBI ganhou mais interesse durante a última década, onde a imagem latente do tensor da difusão é usada o mais freqüentemente5. Uma limitação do modelo DTI é a suposição de um processo de difusão gaussiana que não é uma suposição precisa para a microestrutura cerebral (consistindo em uma complexa rede de axônios e células com membranas atuando como barreiras), resultando em métricas de DTI não específicas para a microestrutura biológica subjacente24. A imagem latente da curtose da difusão é uma extensão do modelo de DTI e tenta caracterizar o grau de difusão não-Gaussian17. Isso pode fornecer informações adicionais sobre a heterogeneidade ou complexidade tecidual.

Embora, uma desvantagem dos modelos DTI e DKI é que eles são apenas uma representação do sinal de difusão, que caracteriza o perfil de deslocamento probabilístico de água, mas não é específico para a microestrutura6. Por outro lado, o modelo de integridade do trato de matéria branca baseado no tensor da curtose é uma técnica de mapeamento microestrutural que incorpora uma informação biológica a priori (pressupostos) no modelo18. Atribui o sinal de difusão aos compartimentos do tecido e pode avaliar atributos biológicos mais diretamente. Esses modelos biofísicos podem, assim, oferecer novas informações para descrever anormalidades após o mTBI e superar essa questão não-especificidade6. Usando estes três modelos diferentes, as alterações microestruturais e os processos biológicos puderam ser visualizados seguindo mTBI mais detalhadamente, especificamente usando o modelo de queda de peso de Marmarou.

O modelo da gota do peso de Marmarou é fácil de usar-se e exige somente a cirurgia menor; no entanto, um segundo experimentador é recomendado para mover o rato para longe do tubo de vidro imediatamente após o primeiro impacto para evitar um segundo. Além disso, às vezes é necessário para ajudar o rato recuperar seu reflexo respiratório após o impacto. O protocolo de RM bastante longo, com um tempo de aquisição total de cerca de 80 min, é bem tolerado pelos ratos Sham e mTBI. Embora, durante a digitalização, é importante monitorar o ciclo respiratório e ajustar a anestesia se o animal está dormindo muito profundamente ou levemente. Também é importante manter o animal quente durante e após a aquisição até que o rato está totalmente acordado para evitar a hipotermia.

Em MRI avançado da difusão, os artefatos do movimento devem ser evitados tanto quanto possível. Uma solução simples para reduzir o movimento durante a digitalização é fazer uso de uma barra de dentes e fixar a cabeça com um pequeno pedaço de fita ou duas barras de ouvido, se disponível. Isto assegura-se de que a cabeça não mova para cima e para baixo cada vez que o rato toma uma respiração.

Usando protocolos avançados da difusão MRI, as imagens adquiridas devem passar através de diversos (pre-) etapas processando, na maior parte usando ferramentas de software diferentes, antes que possam ser usadas para uma análise mais adicional. Uma desvantagem de usar diferentes ferramentas de software para processar as imagens ponderadas por difusão é que (muitas vezes) cada ferramenta usa seu próprio formato de dados para codificar a tabela de direções de gradiente. MRtrix3 armazena as informações de gradiente juntamente com a difusão ponderada imagem em um arquivo. MIF, enquanto ExploreDTI faz uso de um arquivo separado (matriz B) para armazenar as direções de gradiente. Portanto, é importante verificar se as direções de gradiente são transferidas corretamente de MRtrix3 para ExploreDTI. Isso pode ser feito verificando-se que a codificação de cores está correta em imagens de FA codificadas por cores [i.e., direção esquerda-direita em vermelho (por exemplo, corpo caloso), direção ântero-posterior em verde e direção inferior superior em azul (por exemplo, cingulum)]. As imagens de FA codificadas por cores também podem ser usadas para verificar a qualidade do processo de coregistro não-rígido entre as imagens de difusão ponderada e as imagens estruturais ponderadas em T2.

Utilizando o ExploreDTI, foram extraídos mapas paramétricos utilizando os modelos DTI, DKI e WMTI. O modelo DTI forneceu mapas paramétricos para MD, AD, RD e FA, enquanto o modelo DKI fornece mapas paramétricos para MK, AK e RK. Embora quatro métricas do modelo WMTI tenham sido calculadas (ou seja, AWF, AxEAD, RadEAD, TORT), não foi possível extrair a difusividade intra-axonal (IAD) dentro do ExploreDTI. O IAD pode ser obtido usando uma ferramenta MATLAB fornecida pelos desenvolvedores do modelo WMTI25. Para isso, as imagens ponderadas por difusão e as informações de gradiente devem ser transferidas novamente do ExploreDTI para o MATLAB. Este passo é novamente propenso a erros relacionados com a codificação de informações de gradiente. Adicionalmente, o tensor da curtose e os parâmetros de WMTI devem ser estimados e calculados outra vez.

O pré-processamento das imagens adquiridas, a estimativa dos tensores e o cálculo dos mapas paramétricos requer um longo período de tempo de computação. Correções para EPI, movimento e corrente de Foucault exigido ~ 40 min por conjunto de dados em um servidor com oito núcleos e 16 GB de RAM. Usando uma análise de ROI, os valores médios dentro do hipocampo foram calculados antes e 1 dia após o impacto. As alterações nas métricas DTI, DKI e WMTI foram então quantificadas no grupo mTBI. No entanto, nas métricas de DKI e no AWF do modelo WMTI, observou-se grande variabilidade intertemática, o que resultou em uma diferença inesperada nos valores basais entre os grupos Sham e mTBI. Este é provavelmente o resultado de voxels contendo valores biologicamente implausíveis (outliers) dentro da região investigada e pode ser filtrado em estudos futuros antes do cálculo dos valores médios em Amida.

Em conclusão, este protocolo demonstra a viabilidade da RM de difusão avançada para investigar e quantificar alterações microestruturais no hipocampo em um modelo de rato de mTBI. Usando três modelos de difusão diferentes, informações complementares podem ser obtidas sobre os processos biológicos subjacentes que contribuem para as condições após o mTBI. Isso representa um passo em frente no desenvolvimento de biomarcadores para mTBI que podem ser sensíveis o suficiente para identificar alterações microestruturais específicas na fase inicial após um leve impacto.

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Disclosures

Os autores não têm conflitos de interesse para divulgar.

Acknowledgments

Os autores gostariam de agradecer à Fundação de pesquisa-Flandres (FWO) por apoiar este trabalho (número de subvenção: G027815N).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Induction of trauma
0.9% NaCl physiologic solution B Braun 394496
brass weight 450g custom made custom made diamter 18mm and 210 mm height
catheter Terumo Versatus-W 26G
ethilon II Ethicon EH7824 FS-3, 4-0, 3/8, 16mm
Matrass Foam to Size Type E
Plexiglas tube ISPA Plastics 416564 M1 PMMA XT GOO tube 25x19 mm (inner diamter 19 mm, minimal length of 1.50 m)
Preclinical CT scanner Molecubes X-cube
Steel helmet custom made custom made diameter 10 mm and 3 mm thickness
Vetbond Tissue Adhesive 3M 1469SB
Vetergesic (buprenorphin) EcuPhar VETERG20 0.05 mk/kg
Xylocaine 2% gel AstraZeneca Xylocaine 2% gel
Xylocaine (lidocain 2%) Aspen/AstraZeneca Xylocaine 2% gel 100 μl injection
Diffusion MRI
Preclinical MRI acquisition software Bruker Biospin MRI GmbH Z400_PV51_CENTOS55 ParaVision 5.1 MRI software
Preclinical MRI scanner Bruker Biospin MRI GmbH PharmaScan 70/16 7T MRI scanner
Quadrature volume coil Bruker Biospin MRI GmbH RF RES 300 1H 075/040 QSN TR Model No: 1P T13161C3
Small animal physiological monitoring unit Rapid Biomedical EKGHR02-0571-043C01 Unit for respiratory monitoring
Water-based heating unit Thermo Fisher Scientific Haake S 5P Model No: 1523051
Anaesthesia
Anaesthesia movable unit Veterenary technics BDO - Medipass, Ijmuiden
isoflurane: Isoflo Zoetis B506
Oxygen generator Veterenary technics 7F-3 BDO - Medipass, Ijmuiden
Diffusion image processing
Amide http://amide.sourceforge.net Version 1.0.5. Medical Imaging Data Examiner Toolbox (Loening AM, Gambhir SS, " AMIDE: A Free Software Tool for Multimodality Medical Image Analysis", Molecular Imaging, 2(3):131-137, 2003)
ExploreDTI http://www.exploredti.com Version 4.8.6 Toolbox for (pre-)processing and analysis of diffusion weighted MR images (Leemans A, Jeurissen B, Sijbers J, and Jones DK. ExploreDTI: a graphical toolbox for processing, analyzing, and visualizing diffusion MR data. In: 17th Annual Meeting of Intl Soc Mag Reson Med, p. 3537, Hawaii, USA, 2009)
MRtrix3 http://www.mrtrix.org Version 3.0_RC3-86-g4b523b41 Toolbox for (pre-)processing and analysis of diffusion weighted MR images

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References

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