Immunofluorescens mærkning af humane og murin neutrofile ekstracellulære fælder i paraffin-indlejret væv

Medicine
 

Summary

Neutrofile ekstrellulære fælder (NETs) er tredimensionale strukturer genereret af stimulerede neutrofile granulocytter. Det er i de seneste år blevet klart, at NETs er involveret i en lang række sygdomme. Påvisning af garn i væv kan have diagnostisk relevans, så der kræves standardiserede protokoller til mærkning af netto komponenter.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Abu Abed, U., Brinkmann, V. Immunofluorescence Labelling of Human and Murine Neutrophil Extracellular Traps in Paraffin-Embedded Tissue. J. Vis. Exp. (151), e60115, doi:10.3791/60115 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Neutrofile granulocytter, også kaldet polymorphonukleare leukocytter (PMN) på grund af deres lobuleret kerne, er den mest udbredte type leukocytter. De modnes i knoglemarven og frigives i det perifere blod, hvor de cirkulerer i ca. 6 − 8 timer; men i væv, de kan overleve i dagevis. Ved diapedese gennem endothelium, de forlader blodet, indtaste væv, og migrere mod stedet for en infektion efter kemoterapi gradienter. Neutrofiler kan bekæmpe invaderende mikroorganismer ved fagocytose, degranulering og generering af neutrofile ekstracellulære fælder (NETs). Denne protokol vil bidrage til at afsløre garn i paraffin-indlejret væv. NETs er resultatet af en proces kaldet NETosis, som fører til frigivelse af nukleare, granulære og cytoplasmatiske komponenter enten fra levende (Vital Netose) eller døende (Suicidal NETosis) neutrofiler. In vitro, NETs danner Sky-lignende strukturer, som optager et rum flere gange større end de celler, hvorfra de nedstammer. Rygraden af garn er kromatin, som et udvalg af proteiner og peptider stammer fra granulat og cytoplasma er bundet. Derved opretholdes en høj lokal koncentration af giftige forbindelser, således at NETs kan indfange og inaktivere en række patogener, herunder bakterier, svampe, vira og parasitter, mens udbredelsen af de meget aktive NETKOMPONENTER, der fører til skader i tilstødende væv er begrænset. Ikke desto mindre er det i de seneste år blevet tydeligt, at net, hvis de produceres i overflod eller ryddet utilstrækkeligt, har patologisk potentiale, der spænder fra autoimmune sygdomme til kræft. Påvisning af garn i vævsprøver kan således have diagnostisk betydning, og påvisning af net i et sygt væv kan påvirke behandlingen af patienter. Da paraffin-indlejrede vævsprøver er det Standardpræparat, der anvendes til patologisk analyse, blev det forsøgt at etablere en protokol for fluorescerende farvning af netto komponenter i paraffin-indlejret væv ved hjælp af kommercielt tilgængelige antistoffer.

Introduction

Neutrofile ekstrellulære fælder (NETs) har en kompleks tredimensionel struktur. Høj opløsning scanning-elektron mikroskopisk analyse afslørede, at de består af glatte fibre med en diameter på 15 − 20 Nm (kromatin) besat med glokulære domæner af > 25 Nm, som formentlig består af et sortiment af omkring 30 granulære og cytoplasmatiske proteiner og peptider1,2. Når net genereres in vitro fra isolerede neutrofiler, kan det identificeres ved farvning af to eller flere af deres bestanddele ved immunofluorescens (f. eks. histoner og neutrofile elastase [NE]). I ustimulerede polymorphonukleare leukocytter (PMN) er histoner udelukkende placeret i kernen, mens NE er indeholdt i granulat. Under netosis, ne kommer ind i kernen, hvor det behandler histoner3,4. NETs er karakteriseret ved samlokalisering af komponenter, som er klart adskilt i ustimulerede neutrofiler. Da der i øjeblikket ikke findes antistoffer, der udelukkende detekterer specifikke netto epitoper (dvs. ikke reagerer med naive neutrofiler), er påvisning af samlokalisering af neutrofilproteiner i net den eneste måde at identificere garn på.

I væv kan garn næppe påvises ved konventionelle histologiske pletter (f. eks. ved farvning med hematoxylin/eosin [H & E], som skildrer net som en diffus bleg blålig skær). Kun når der er meget rigelige, kan garn tydeligt skelnes med H & E farvning, såsom i trombi5. Da garn er diffus i sig som sådan, skal vævs strukturen bevares optimalt, så Cryo-præparater, der er tilbøjelige til at fremkalde fryse artefakter, er suboptimale til analyse af garn i væv. I stedet, formaldehyd fiksering og paraffin indlejring har vist sig at bevare netto struktur i væv godt2. (Immuno-) histologisk inspektion af sektioner af paraffin-indlejret væv er standardmetode til patologisk analyse. Da væv i paraffinblokke bevares, selv ved stuetemperatur (RT), kan vævsprøver fra det daglige diagnostiske arbejde sammenlignes med prøver, der er blevet udarbejdet år siden, med spørgsmål og teknikker, der for nylig er opstået. Garn i væv er ikke blevet påvist indtil for nylig, og detaljeret analyse af netto dannelse og fjernelse i løbet af sygdomme kan føre til ny indsigt i patogenesen. Brugen af paraffin-indlejret væv har den uvurderlige fordel at tillade analyse af arkiverings materiale og til at foretage retrospektive undersøgelser6. Unægtelig, disse fordele kommer til en pris. Før det integreres i paraffin, skal vævet være formaldehyd-fast, dehydreret og opvarmet over 50 °C. Disse procedurer inducerer vævs autofluorescens samt epitop maskering.

For at begrænse fikserings artefakter bør fikserings tiden holdes på et minimum, så størrelsen af vævsprøverne må ikke overskride et område på 20 mm x 30 mm med ~ 3 mm tykkelse. Prøver af denne størrelse er helt fikseret efter natten inkubation ved RT i formaldehyd, ideelt efterfulgt af direkte dehydrering og paraffin indlejring. Alternativt kan faste prøver opbevares i 1 eller 2 dage i buffer. For immunofluorescens undersøgelser skal fikseret være frisk fremstillet af PARAFORMALDEHYD opløst i en passende buffer (f. eks. fosfat-bufferet saltvand [PBS] eller Tris-bufferet saltvand [TBS]). Under fixativ tilberedning skal temperaturen holdes under 60 °C for at forhindre dannelse af myresyre. Formalin, som er en standard fixativ for patologi, bør ikke anvendes, da det indeholder methanol, andre aldehyder, ketoner og myresyre. Disse urenheder fører til øget epitop maskering og signifikant vævs autofluorescens.

For vellykket immunolabelling, epitop maskering skal være vendt i en proces kaldet antigen hentning. Vævs sektioner opvarmes i en passende buffer, som menes at bryde methylenbroer, så epitoper bliver tilgængelige for antistofferne7. Til påvisning af garn foretrækkes varme induceret epitop-hentning (HIER) til andre metoder, såsom anvendelse af Proteolytiske enzymer. Rutinemæssigt udføres immunolmærkning af paraffin sektioner med et enkelt antistof efterfulgt af et peroxidase-mærket sekundært antistof, som detekteres med et bund dannende substrat. Sammenlignet med immunofluorescens, enzym-baserede detekteringsmetoder har en lavere rumlig opløsning på grund af diffusion af substratet bundfald, og generelt, samtidig påvisning af mere end ét antigen er begrænset6.

Som i øjeblikket ingen antistoffer eksisterer, der udelukkende binder sig til NETs, denne protokol bruges til at mærke to proteiner, Histon 2b, som er nuklear, og neutrofile elastase, som er lokaliseret i granulat. I ustimulerede neutrofiler adskilles disse proteiner, men de er lokaliseret i neutrofiler, der gennemgår Netose og i net. Samtidig påvisning af to antigener kan opnås med to primære antistoffer, der er rejst i forskellige værter og to artsspecifikke sekundære antistoffer mærket med forskellige fluorochromer. Denne rapport er en standardisering af vores tidligere offentliggjorte protokol8 og bruger en kombination af to kommercielt tilgængelige antistoffer, der PÅLIDELIGT pletter netto komponenter i paraffin-indlejret væv, både frisk og arkiverings, af human og murine oprindelse.

Protocol

Vævs protokollerne blev godkendt af Landesamt für Gesundheit und Soziales, Berlin, Tyskland (G0121/16). Der blev gennemført eksperimenter i overensstemmelse med EU-direktiv 2010/63/EU om omsorg, velfærd og behandling af dyr.

1. fiksation, dehydrering, paraffin indlejring, skæring, montage af sektioner

  1. Forbered 2% formaldehyd opløsning ved at opløse PARAFORMALDEHYD i TBS (pH 7,4). Undgå opvarmning over 60 °C. Kold til RT. formaldehyd opløsning kan opbevares ved-20 °C.
  2. Placer fersk væv (her: mus lunge) i en glaspetri skål med TBS. Med en skalpel, dissekere i stykker på højst 20 mm x 30 mm x 3 mm i størrelse. Nedsænk prøven i 2% formaldehyd opløsning i TBS.
    Bemærk: volumenet af fixativ bør være mindst 20x af vævet.
  3. Fix hos RT for 8 − 20 h. Overfør prøver til TBS. Placer i kassetter.
  4. Dehydrat ved hjælp af en række ethanol (70%, 80%, 90%, 96%, 100%, 100%), med hvert trin varede 1 h.
  5. Klare prøver 2x i 100% xylen (dimethylbenzen), hvert trin 1 h.
  6. Sug i paraffin 2x ved 60 °C (smeltetemperatur 54 − 56 °C), hvert trin 1 h.
  7. Monter enheder ved hjælp af indlejrings forme, brug kassette bunden som et dæksel.
  8. Lad paraffin størkne og fjerne indlejring forme.
  9. Forbered 3 μm vævs sektioner, og lad dem flyde på 37 °C vandbad.
  10. Float sektioner på vandoverfladen på klæbende glas slides (tabel over materialer).
  11. Inkuber sektioner på glas glider natten over ved 40 °C for at bindevævet til glasset.

2. rehydrering, varme induceret epitop hentning, farvning, montering, mikroskopisk analyse

  1. Placer sektioner på glas glider i racks og nedsænkning dem i de medier, der anvendes til dehydrering og clearing, i omvendt rækkefølge, med hvert trin i 5 min: 2x 100% xylen, ethanol-serien (2x 100%, 96%, 90%, 80%, 70%).
  2. Opvarm et vandbad med en temperaturkontrolleret kogeplade til 70 °C. Placer en krukke fyldt med varme induceret epitop hentning (HIER)-buffer (pH 9; Indeholdende 10% glycerol som temperatur buffer i et vandbad. Når HIER buffer har nået 70 °C, skal du placere stativet med slides i buffer krukke.
  3. Inkubatglas sene i 120 min ved 70 °C.
  4. Fjern glasset fra vandbad og lad det køle til RT. Skyl sektioner 3x med deioniseret vand og en gang med TBS (pH 7,4).
  5. Fjern forsigtigt væske fra slides mellem sektioner med rullet filterpapir eller vatpind, forlader sektioner hydreret.
  6. Opret barriere omkring sektioner med en hydrofobe barriere pen.
  7. Incubate sektioner i blokerende buffer (1% bovin serumalbumin [BSA], 2% normalt æsel serum, 5% kold vand fisk gelatine og rengøringsmidler [tabel over materialer] i TBS) ved rt i 30 min for at forhindre uspecifik binding.
  8. Primære antistoffer fortyndes i en koncentration på 1 μg/mL i blokerende buffer.
    Bemærk: for menneske-og muse garn kan der anvendes en kombination af kanin antistof mod neutrofilelastase og kyllinge antistof mod Histon 2B (tabel over materialer).
  9. Placer slides i et fugtigt kammer. Fjern blokerende buffer og tilsæt de fortyndede primære antistoffer uden at vaske til sektionerne ved hjælp af tilstrækkelig volumen til at forhindre tørring. Forsegl fugtigt kammer med paraffin film og Inkuber natten over ved RT.
  10. Vask sektioner 3x med TBS for 5 min hver.
  11. Forbered arbejdsopløsning af sekundære antistoffer i blokerende buffer. Til påvisning af primære antistoffer, brug sekundære antistoffer rejst i æsel og præ-absorberet mod serumproteiner fra flere arter (tabel over materialer). Dække vævs sektioner med arbejdsopløsning af sekundære antistoffer. Overfør slides til fugtigt kammer, tætning med paraffin film. Inkuber i 1 time ved RT.
    Bemærk: Donkey anti kanin konjugeret til Cy2 og æsel anti kylling konjugeret til Cy3 kan kombineres med en DNA-kontra plet.
  12. Vask sektioner 3x for 5 min hver med TBS, derefter en gang i 5 minutter med deioniseret vand.
  13. Cover sektioner med monterings medium (tabel over materialer) og anvende Cover glas undgå bobledannelse.
  14. Lad montering medium størkne, derefter analysere immunofluorescenstest ved hjælp af en bred felt mikroskop med passende band pass filtre eller en confokale mikroskop.

Representative Results

Ved hjælp af denne protokol, netto komponenter kan med held påvises i paraffin-indlejret væv både af human og murine oprindelse. I ustimulerede neutrofiler er H2B udelukkende placeret i kernen og neutrofilelastase i granulat; deres fluorescens signaler overlapper derfor ikke hinanden. I modsætning, under Netose og efter netto dannelse, NE, H2B, og DNA delvist colocalize. Hvis der er tale om grønne, røde og blå signaler, afbildes områder med samlokalisering som hvidlig overlay (figur 1G, figur 2Dog figur 3D). Denne overlejring kan også kvantificeres ved hjælp af billedanalyse software. Pixels fra overlappende signaler, som er positive for grøn, rød og blå, er blevet brugt til at skabe en lilla overlay, der skildrer netto områder i figur 1g', figur 2D'og figur 3D'. Nogle af cellerne i figur 1 og figur 2 har lobulated kerner, men er negative for ne. Det menes, at disse celler er eosinofile granulocytter.

Hvis vævs sektionerne har en tykkelse på 2 – 3 μm, kan de analyseres ved bred felts mikroskopi ved hjælp af 10x eller 20x mål. Et eksempel er præsenteret i figur 1, som skildrer en del af menneskelige blindtarmsbetændelse væv bejdset for ne (grøn), H2B (rød) og Hoechst 33342 (blå). Panelerne A, C, E og G er fra et område i afsnittet indeholdende net, mens paneler B, D, F og H er fra et andet område af samme sektion, som indeholder talrige neutrofiler (figur 1b, ne), men ingen garn. Områder med massiv netto dannelse kan nemt findes selv ved lave forstørrelser, da alle tre netto komponenter colocalize, ofte i trævlet ekstracellulære strukturer, som i overlay af de tre kanaler vises som hvidlig ekstracellulære fibre (figur 1g ), lilla overlejring i figur 1g'.

De to vævs områders farvnings mønstre er tydeligt forskellige, idet NE er indeholdt i granulat (figur 1b) og DNA i kerner (figur 1f). Det er interessant, at farvningen for H2B er temmelig svag i neutrofilrige områder (figur 1d) sammenlignet med net-holdige væv (figur 1c). Dette kan skyldes størrelsen af antistoffet (IgY har 180 kD sammenlignet med 150 kD for IgG), som kan forhindre binding til kompakt kromatin i intakt kerner, mens adgang til H2B lettes, hvis kromatin dekomprimeres, som det er tilfældet i NETs (figur 1c).

For højere opløsning skal konfokale mikroskoper eller widefield mikroskoper med devolution bruges til at minimere uskarpt sløret. Figur 2 skildrer et net-rigt område fra det samme menneskelige blindtarmsbetændelse prøveeksemplar. Det er en maksimal projektion af en confokal stak. NE (grøn, figur 2a) findes i granulat, men er også rigelig ekstrellulært, hvor det colocalizes med H2B (rød, figur 2b) og DNA (blå, figur 2c). Den ekstracellulære samlokalisering resulterer i en hvidlig farvekombination (figur 2D). Disse pixels positive for grøn, rød og blå er blevet brugt til at skabe en lilla overlay præsenterer NETs i figur 2D'.

Figur 3 er en detalje af en central del af en mus lunge inficeret med Mycobacterium tuberkulose (M. TB). Antigen genfinding og farvnings betingelser er de samme som for figur 1 og figur 2. Igen, samlokalisering af alle tre NET komponenter er klart synlig som hvidlig områder mellem neutrofiler, som er blevet brugt til at skabe et lilla lag, der indikerer garn i figur 3D'.

Den særlige karakter af farvning er påvist i supplerende figur 1, som skildrer ubetydelig farvning med kontrol antistoffer, og supplerende figur 1a, B skildrer kanin ikke-immunserum (grøn) og kylling anti-gfp igy (rød). Figur 1 C, D viser farvning med sekundære antistoffer alene, kombinationen var den samme som blev brugt i figur 1, figur 2, og figur 3. Supplerende figur 1a, C viser en del af human blindtarmsbetændelse svarende til figur 1 og figur 2. Supplerende figur 1b, D er mus lungevævet ligner figur 3. DNA er plettet med Hoechst 33342. Skalalinjen repræsenterer 25 μm.

Figure 1
Figur 1: bred-felt Fluorescens mikroskopi af en paraffin del af en menneskelig blindtarmsbetændelse prøve.
Paneler A, C, E og G afbilder et vævs område med net, mens paneler B, D, F og H viser et andet område af samme sektion, som er rigt på neutrofiler, men uden netto dannelse. Farvning er mod NE (A, B; grøn), H2B (C, D; rød) og DNA (E, F; blå). Figur 1G, H repræsenterer overlejringen af alle tre kanaler. Pixels med en intensitet mellem 80 og 256 i alle farver repræsenterer områder med overlappende farvning for NE, H2B og DNA og anses for at være afledt af net eller neutrofiler, der gennemgår Netose. Disse pixels har været pseudo-farvet som lilla i panel G ', hvor de udgør et stort område; og i panel H ', hvor kun små pletter er fundet. Billeder blev taget med et bredt felt mikroskop ved hjælp af en 20x mål, og skala bar repræsenterer 25 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Konfokal Fluorescens mikroskopi af netto komponenter i en menneskelig blindtarms prøve.
Den samme vævs sektion, der blev anvendt i figur 1 , blev anvendt. A) farvning af ne,B) skildring af H2B ogC) Hoechst 33342 farvning af DNA. D) overlejringen af alle tre kanaler. Samlokalisering af alle tre signaler er pseudo-farvet lilla i panel D '. Til dette, pixels med en intensitet > 80 i alle tre farver blev detekteret ved hjælp af Volocity 6,3. Det lilla område skildrer net eller neutrofiler, som gennemgår Netose. Billederne blev taget med en Konfokal mikroskopi som Z-stakke og præsenteret som maksimal projektion. Skalalinjen repræsenterer 25 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Konfokal Fluorescens mikroskopi af netto komponenter i en mus lunge inficeret med M. TB.
Det er en detalje fra den centrale del af en del af en komplet lunge med massiv neutrofilinfiltration. (A) ne farvning, (B) H2B farvning, og (C) DNA-farvning. D) overlejringen af alle tre kanaler. Den lilla overlejring i panel D ' indikerer pixel med intensitetsværdier på > 80 i alle tre farver, der indikerer neutrofiler, der gennemgår Netose samt net. Billederne blev taget som en Z-stakke med et confokal mikroskop og præsenteret som maksimal projektion. Skalalinjen repræsenterer 25 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Supplerende figur 1: farvnings kontrol med ikke-forretningsmæssigt forbundne primære antistoffer. Humane (a, C) og murine væv (B, D) som blev anvendt til figur 1 og figur 2, og figur 3var henholdsvis plettet med ikke-forretningsmæssigt forbundne primære antistoffer (A, B) eller uden primære antistoffer (C, D). Som kontrol primære antistoffer i paneler A og B, serum fra en ikke-immuniseret kanin og en kylling IgY mod GFP blev anvendt. Sekundære antistoffer var de samme som vist i alle andre farvninger og anvendes også i paneler C og D. Som forventet blev der under alle forhold påvist ubetydelig baggrunds farvning, hvilket illustrerer specificiteten af de antistoffer, som er anvendt til figur 1, figur 2, og figur 3. Billederne blev taget med et confokal mikroskop, DNA farvet med Hoechst 33342, og Scale bar repræsenterer 25 μm. Klik her for at downloade dette tal.

Discussion

Med stigende bevidsthed om rollen af NETs under patogenesen9, deres påvisning i væv fra patienter eller forsøgsdyr vinder stigende betydning. Paraffin-indlejrede vævsprøver har en række fordele sammenlignet med andre vævs præparater (f. eks. dele af kryopræserverede prøver). Vævs konservering i paraffin-indlejrede prøver er klart overlegne, og når indlejret, prøverne bevares i årtier, muliggør tilbage undersøgelser. Til påvisning af garn, som er filigran strukturer, god prøve bevaring er en forudsætning udelukker brugen af kryopræserverede materiale, som er tilbøjelige til vævsskade på grund af is krystaldannelse, der kan give anledning til artefakter morfologisk ligner Net.

For at opnå optimal konservering bør væv fra forsøgsdyr fastsættes kort efter døden, ideelt set ved perfusion, for at undgå autolyse. Som fixative, frisk tilberedte eller frisk optøede opløsninger af PARAFORMALDEHYD i en passende buffer som TBS eller PBS malm optimalt. Dette er kemisk defineret i modsætning til formalin præparater, der anvendes til standard histologi, og inducerer mindre vævs autofluorescens. I modsætning hertil er humant væv ofte ikke fastgjort direkte efter excision, og som fikseringsmiddel anvendes normalt en 10% fortynding af formalin, som indeholder 10% til 15% methanol som stabilisator for at forhindre polymerisering, samt myresyre, andre aldehyder og ketoner . Ofte, vævet er lagret i denne fiksativ for længere mængder af tid, før indlejring. Resultatet kan være autolyse (afhængigt af tiden mellem excision og fiksering), og overdreven dannelse af methylen broer på grund af over fiksering. Formaldehyd fiksering inducerer ændringer i den tertiære struktur af proteiner ved dannelse af intra-og Inter-molekylære methylen broer10. Ikke-proteinholdige celle komponenter som nukleinsyrer, kulhydrater og lipider er ikke fastgjort direkte, men immobiliseret i det tredimensionale proteinnetværk. For at opnå en vellykket mærkning, skal methylen obligationer brydes for at afsløre epitoper i processen med antigen hentning. Dette opnås ved opvarmning af vævs sektioner monteret på mikroskop glider i en passende varme-induceret antigen hentning buffer (HIER buffer)11. Vores tidligere undersøgelse analyserede indflydelsen af pH og temperatur af HIER buffere på påvisning af netto komponenter i paraffinized væv, og det blev konstateret, at vellykket væv forbehandling for en komponent ofte er suboptimal for en anden komponent8.

I mellemtiden har det været konstateret, at opvarmning af vævet til 70 °C i HIER buffer ved en pH-værdi på 9 er et godt kompromis for mange netto komponenter og vil bevare god vævs bevaring, som ofte kompromitteres ved højere temperaturer. Det foreslås at bruge den tid, der er angivet som udgangspunkt, men især med arkiverings enheder af ukendte fikserings parametre, kan farvnings intensiteten være utilfredsstillende. I dette tilfælde kan forlængelse af eller højere temperatur under hentningproceduren forbedre farvnings effektiviteten. Dette kan også påvirke Histon 2b-farvning af det igy-antistof, der anvendes i vores protokol. Som vist i figur 1, dekomprimeret kromatin kan findes i neutrofiler undergår netose samt i net pletter meget stærkere med dette antistof sammenlignet med kromatin i hvilende neutrofiler. Dette er sandsynligvis på grund af begrænset adgang til 180 kDa igy molekyle til kompakte kerner og kan afvige efter øget epitop opsving. Dette kan forstærke bindende effektivitet selv i områder med kondenseret kromatin, hvilket vil resultere i stærkere fluorescens i normale kerner af neutrofiler og andre celler. Forskellen i farvnings effektivitet mellem neutrofiler, der gennemgår Netose og ikke-stimulerede neutrofiler, kan være mindre udtalt end afbildet i figur 1. Områder med netto dannelse vil stadig blive identificeret ved samlokalisering af NE, H2B og DNA.

Fikserings proceduren kan også fremkalde en betydelig autofluorescens af vævet, hovedsageligt i den blålige/greeniske del af spektret. Det er vigtigt at undgå det meste af denne autofluorescens ved hjælp af passende smalle båndpas fluorescens filtersæt (Wide-felt) eller detektor indstillinger (confocal), der svarer til emissions maksimum af vha, der anvendes med blå excitation, f. eks Cy2, alexafluor 488. i ekstreme tilfælde af autofluorescens bør den blåagtige/greeniske del af spektret undgås. I stedet kan fluorescens signaler påvises lettere i den fjerneste røde del af spektret (f. eks. sekundære antistoffer koblet til CY 5 eller alexafluor 635), men dette kræver og sort/hvide kameraer eller konfokale mikroskoper. Da det menneskelige øje er temmelig ufølsom ud over 600 nm, kan langt røde fluorescens signaler næppe detekteres ved hjælp af okularer. Under alle omstændigheder er det vigtigt at anvende negative kontroller (f. eks. ikke-immunsera/isotype kontrol i stedet for primære antistoffer eller udelade primære antistoffer) for at bestemme passende eksponeringstider eller detektor indstillinger.

Vævs sektioner på 1 − 2 μm kan analyseres med brede felt mikroskoper med 10x eller 20x mål. Disse linser giver en stor fokal dybde, så (næsten) hele vævs sektionen vil være i fokus. Dette kan bruges til hurtigt at scanne vævs sektioner for områder med netto dannelse, hvis de er tilstrækkeligt store (som i figur 1). Samlokaliseringen af de grønne (NE), røde (H2B) og blå (DNA) kanaler resulterer i en hvid farvning, der indikerer områder med netto dannelse (figur 1G). For højere forstørrelser er det nødvendigt med konfokale eller bred felt mikroskoper med dekoncentrering. Figur 2 viser detaljer om det humane blindtarms præparat, der også anvendes til figur 1. I figur 2alokaliserer ne til små prikker (granulat), men en stor del er ekstracellulære, ofte danner striber, der overlapper med H2B (figur 2b) og DNA (figur 2c). Denne samlokalisering resulterer i et hvidlig overlay, der indikerer net (figur 2D). Et meget lignende mønster kan findes i lunge delen af en mus inficeret med M. tuberkulose (figur 3).

Modellerne præsenteres her er karakteriseret ved områder med en høj grad af netto dannelse, som kan identificeres selv ved lav forstørrelse. Afhængigt af vævs tætheden og den respektive stimulus kan netto dannelsen være langt mindre udtalt, ned til netto dannelsen af små grupper af neutrofiler (for eksempel i myocarditis, se en tidligere publikation12). Det menes, at denne protokol vil bidrage til at fremme forskningen i net i væv og forhåbentlig hjælpe med at fjerne ikke-anerkendte nettenes rolle i dannelsen eller forebyggelsen af sygdomme.

Disclosures

Finansieringskilden til dette arbejde er Max Planck Society. Vi takker Arturo Zychlinsky for kritisk at læse manuskriptet og Philippe Saikali for mus væv.

Acknowledgments

Forfatterne har intet at afsløre.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
bovine serum albumine Sigma A7906
chicken anti Histone 2B antibody Abcam ab 134211
cold water fish gelatine Sigma-Aldrich G7765
donkey anti chicken antibody, Cy3 conjugated, for multiple labelling Jackson Immuno Research 703-165-155
donkey anti rabbit antibody, Cy2 conjugated, for multiple labelling Jackson Immuno Research 711-225-152 alternatively Cy5 conjugate, 711-175-152
embedding cassettes Roth K116.1
embedding molds Sakura 4162
embedding station Microm AP280
ethanol Roth 9065.4
filter paper, rolled OCB
forceps Dumont 7a
glass cylinder with 20 cm diameter VWR 216-0075
glycerol Roth 3783.1
HIER buffer pH 9 Scytek TES999
Hoechst 33342 Sigma 14533
incubator (dry, up to 40 °C) Memmert MMIPP30
moist chamber (plastic box with tight lid) Emsa 508542
Mowiol 40-88 Aldrich 32.459-0
normal donkey serum Merck S30
PAP-pen ImmEdge Vector Lab H-4000
paraffin microtome Microm 355S water bath included
paraformaldehyde Aldrich 16005
petri dishes Schubert /Weiss 7020051
rabbit anti ELANE antibody Atlas HPA068836
racks, jars for microscope slides Roth H554.1 H552.1
scalpel Braun Fig.22
Superfrost Plus glass slides Thermo Scientific J1800AMNZ
temperature-controlled hot plate NeoLab D6010
tissue processor for paraffin embedding Leica TP1020
Tris buffered saline TBS VWR 788
Triton X100 Roth 3051.4
Tween 20 Fluka 93773
water bath 37 °C GFL 1052
widefield or confocal microscope Leica DMR, SP8
xylene (dimethylbenzene) Roth 9713.3

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303, (5663), 1532-1535 (2004).
  2. Urban, C. F., et al. Neutrophil extracellular traps contain calprotectin, a cytosolic protein complex involved in host defense against Candida albicans. PLOS Pathogens. 5, (10), e1000639 (2009).
  3. Fuchs, T. A., et al. Novel cell death program leads to neutrophil extracellular traps. Journal of Cell Biology. 176, (2), 231-241 (2007).
  4. Papayannopoulos, V., Metzler, K. D., Hakkim, A., Zychlinsky, A. Neutrophil elastase and myeloperoxidase regulate the formation of neutrophil extracellular traps. Journal of Cell Biology. 191, (3), 677-691 (2010).
  5. de Boer, O. J., Li, X., Goebel, H., van der Wal, A. C. Nuclear smears observed in H&E-stained thrombus sections are neutrophil extracellular traps. Journal of Clinical Pathology. 69, (2), 181-182 (2016).
  6. Robertson, D., Savage, K., Reis-Filho, J. S., Isacke, C. M. Multiple immunofluorescence labelling of formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissue. BioMed Central Cell Biology. 9, 13 (2008).
  7. Rait, V. K., Xu, L., O'Leary, T. J., Mason, J. T. Modeling formalin fixation and antigen retrieval with bovine pancreatic RNase A II. Interrelationship of cross-linking, immunoreactivity, and heat treatment. Laboratory Investigation. 84, (3), 300-306 (2004).
  8. Brinkmann, V., Abu Abed, U., Goosmann, C., Zychlinsky, A. Immunodetection of NETs in Paraffin-Embedded Tissue. Frontiers in Immunology. 7, 513 (2016).
  9. Papayannopoulos, V. Neutrophil extracellular traps in immunity and disease. Nature Reviews Immunology. 18, (2), 134-147 (2018).
  10. Cattoretti, G., et al. Antigen unmasking on formalin-fixed, paraffin-embedded tissue sections. Journal of Pathology. 171, (2), 83-98 (1993).
  11. Yamashita, S., Okada, Y. Mechanisms of heat-induced antigen retrieval: analyses in vitro employing SDS-PAGE and immunohistochemistry. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 53, (1), 13-21 (2005).
  12. Weckbach, L. T., et al. Midkine drives cardiac inflammation by promoting neutrophil trafficking and NETosis in myocarditis. Journal of Experimental Medicine. 216, (2), 350-368 (2019).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics