HIV 표적의 항체 의존적 세포 식세포 분석에서 사용하기 위해 인간 모유에서 백혈구의 분리

Immunology and Infection

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Summary

모유는 인간 면역 결핍 바이러스 (HIV)를 전송하지만 HIV에 감염된 어머니가 모유로 기르는 유아의 15 %만이 감염됩니다. 모유로 기르는 유아는 ~ 105-10 8 이 세포가 understudyed 하더라도 매일8 개의 모계 백혈구를 섭취합니다. 여기에서 우리는 모유 백혈구의 격리및 그들의 식세포 용량의 분석을 기술합니다.

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Powell, R. L., Fox, A. Isolation of Leukocytes from Human Breast Milk for Use in an Antibody-dependent Cellular Phagocytosis Assay of HIV Targets. J. Vis. Exp. (151), e60149, doi:10.3791/60149 (2019).

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Abstract

항 레트로 바이러스 약물이없는 경우에도 HIV에 감염된 어머니가 모유를 수유한 유아의 ~ 15 %만이 감염되어 모유 (BM)의 강력한 보호 효과를 시사합니다. 깨끗한 물과 적절한 유아용 분유에 대한 접근이 신뢰할 수 없다면, WHO는 HIV에 감염된 산모에게 모유 수유를 중단할 것을 권장하지 않습니다. BM 전송을 줄이기 위해 여러 가지 요인이 함께 작동할 가능성이 높습니다. 모유로 기르는 유아는 매일 ~ 105-108 모계 백혈구를 섭취하지만, 크게 불분명남아있는 것은 BM의 항 바이러스 특성에 대한 이러한 세포의 기여입니다. 항체 의존성 세포 식세포증 (ADCP), HIV 표적에 대하여 BM 식세포에 의해 가장 필수적이고 보편적인 선천적인 선천적인 면역 반응의 한개. 세포는 수유의 다양한 단계에서 수득된 5개의 인간 BM 샘플로부터 분리되었다. 격리는 부드러운 원심분리를 통해 수행되었고, 그 다음에 우유 지방을 주의 깊게 제거하고 세포 펠릿을 반복적으로 세척시켰다. HIV 봉투(Env) 에피토프로 코팅된 형광 비드는 ADCP의 분석을 위한 표적으로 사용하였다. 세포는 백혈구를 확인하기 위해 CD45 표면 마커로 염색하였다. ADCP 활성이 HIV 특이적 항체 830A를 사용하여 대조군 실험 및 재현 가능한 측정가능한 위 유의한 것으로 나타났다.

Introduction

인간 모유 (BM)는 >90% 실행 가능한1모계 세포로 구성됩니다. 세포 조성은 수유의 단계, 어머니와 유아의 건강 상태 및 개인 변화에 의해 강하게영향을 받는데, 이는1,2,3,4. BM이 ~ 103-105 백혈구 / mL을 함유하고 있음을 감안할 때, 모유 수유 된 유아가매일~ 105-108 모계 백혈구를 섭취한다고 추정 할 수 있습니다. 생체 내 다양한 연구는 모계 백혈구가 유아에게 중요한 면역력을 제공하고 초기섭취5, 6,7,8의 이러한 부위를 훨씬 넘어서 는 기능성을 입증했습니다. ,9,10,11. 유아에 의해 섭취된 모든 모계 유래 세포는 유아의 백혈구12와함께 면역 기능을 수행하거나 보상할 가능성이 있다.

인간 면역 결핍 바이러스 (HIV)의 어머니 -투 - 아이 전송 (MTCT)는 자원 제한 국가에서 위기 남아있다. 설사와 호흡기 질환이 자원 제한 국가에서 유아 중 사망률의 상당한 비율에 대한 책임이 있기 때문에, 이러한 질병은 독점적 인 모유 수유에 의해 크게 감소, HIV에 감염된 어머니에게 혜택 모유 수유는 위험13,14,15보다훨씬 큽니다. 깨끗한 물과 적절한 유아용 분유에 대한 접근이 신뢰할 수 없다면, WHO는 HIV에 감염된산모16에대한 모유 수유를 중단할 것을 권장하지 않습니다. BM을 통해 대략 100,000 선교사 훈련원은 매년 발생합니다; 아직, HIV에 감염된 산모에 의해 모유수유를 한 유아의 ~15%만이 감염되어 BM17,18,19,20,21의강력한 보호 효과를 시사한다. 수많은 요인이 전송을 방지하기 위해 함께 작동 할 가능성이 높습니다. 중요한 것은, BM에 있는 HIV 특정 항체 (Abs)는 HIV 감염22,23에서감소된 MTCT 및/또는 감소된 유아 죽음과 상관되었습니다. 크게 불분명 남아 있는 것은 그것의 항 바이러스 자질에 BM의 세포 분획의 기여.

많은 Abs는 면역 글로불린 분자의 '일정한' 영역에 의해 매개되는 다양한 항 바이러스 활동을 촉진하며, 결정화 가능한 단편(Fc)은 사실상 모든 선천성 면역 세포에서 발견되는 Fc 수용체(FcRs)와의 상호작용을 통해 사실상 모든 항바이러스 작용을 촉진합니다. 인간 BM24에서발견된다. 항체 의존성 세포 식세포증(ADCP)은 바이러스 감염의 허가를 위해 필요에 따라입증되었으며 HIV25,26,27의MTCT 예방의 경우 과소 연구되어왔다. 28세 , 29. HIV의 MTCT 예방에 BM 식세포에 의한 ADCP 활동의 잠재적 기여에 대한 지식의 빈약함을 감안할 때, 우리는 세포에 의해 매개 된 ADCP의 연구를 수행하기 위해 인간 BM에서 세포를 분리하는 엄격한 방법을 개발하는 것을 목표로했습니다. BM은 수유의 다양한 단계에서 얻은.

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Protocol

이 연구의 각 참가자는 IRB 승인을 사용하여 시나이 산의 인간 피험자 보호 프로그램 (PPHS)의 지침 및 승인과 함께 윤리적 및 제도적 검토 위원회 (IRB) 승인에 따라 모집및 인터뷰되었습니다. 모유 샘플을 얻기위한 프로토콜.

1. 표적 마이크로스피어 준비

  1. 관련 표적 항원을 선택합니다.
    참고: 이 예에서는, 재조합 단백질 V1V2-2F5K가 사용되었고, 이는 네이티브 HIV 봉투30의삼각정 정점을 모방하도록 설계되었다.
  2. 제조업체의 프로토콜에 따라 상용키트(재료 표)를사용하여 생체 이식을 수행합니다.
    1. 제큐를 사용하여 5배 어금니 과잉에 대한 반응에 첨가하는 비오틴 시약의 mmol을 계산한다: mmol 비오틴 = mL 단백질 x (mg 단백질/mL 단백질) x (mmol 비오틴/mg 단백질) x (5 mmol 비오틴/mmol 단백질)30,31. 이어서 제식을 사용하여 첨가할 비오틴 시약의 μL을 계산한다: μL 비오틴 = mmol 비오틴 x (1,000,000 μL/L) x (L/10 mmol).
    2. 개봉 전에 비오틴을 실온에 평형화하십시오. 위의 계산에 따라 인산완충식염수(PBS)의 0.5-2.0 mL에 단백질을 용해시.
    3. 디메틸설폭사이드(DMSO)에서 10 mM의 비오틴 시약용액을 준비하고 단백질 용액에 10 mM의 적절한 부피를 첨가하고, 얼음상에서 2시간 또는 실온에서 30분 동안 배양반응을 한다.
  3. 단백질 농축기 (polyethersulfone [PES] 멤브레인, 3 kDa 분자량 컷 오프 [MWCO], 0.5 mL를 사용하여 과잉 비오틴을 제거; 재료 표) 제조업체의 지침에 따라.
    1. 샘플을 스핀 컬럼의 상부 챔버에 증착하고 최대 400 μL. Cap까지 PBS를 추가한 다음 이 샘플 챔버를 수집 튜브에 삽입합니다. 실온에서 12,000 x g에서 30 분 동안 원심 분리기.
    2. 흐름을 통해 버리고 PBS를 400 μL에 추가합니다. 흐름을 버리고 PBS를 100 μL에 추가합니다. 분광광도계별로 단백질 농도를 측정합니다.
      참고: 단백질은 사용할 때까지 -80°C에서 알리인용및 냉동될 수 있습니다.

2. 항체 의존세포 식세포증 (ADCP) 분석판 제제

  1. 1 μm 마이크로스피어에 생체 구성 단백질을 공액화 ('구슬'; 재료 표) 제조업체의 지침에 따라.
    1. 접합된 비드 의 플레이트 당, 200 μL의 소 혈청 알부민 (BSA)-PBS에서 200 μL의 스톡 비드 12 μl로 단백질 6 μg을 배양하고, 20 분마다 부드럽게 소용돌이치게 한다.
    2. 원심분리기는 5분 동안 13,000 x g에서 경상, 소용돌이를 부드럽게 버리고 0.1% BSA-PBS의 1200 μL에서 다시 중단합니다. 스핀을 반복하고 2 x를 씻으세요. 0.1% BSA-PBS의 1200 μL에서 다시 중단하십시오.
  2. 둥근 바닥 96 웰 플레이트에서 웰 당 비드 용액의 10 μL. 일반적으로 항체의 50 μg/mL 또는 1/100 혈청 희석에서 시작하여 2% HSA HBSS의 12 μL에서 관심 있는 항체 또는 면역 혈청의 희석을 준비합니다.
    참고: 샘플 데이터에서, 단일클론 항체(mAb) 830A를 사용하였다.
  3. 비드 플레이트에 적정 항체/세라 10 μL을 넣고 37°C에서 2시간 동안 배양합니다. 각 우물에 2% HSA HBSS의 200 μL을 추가하고 10 분 동안 2,000 x g에서 원심 분리기 플레이트를 추가하십시오.
  4. 눈에 보이지 않는 비드 펠릿을 방해하지 않도록 플레이트 우물에서 액체를 빠르게 전복하고 싱크대에 디캔팅하여 상판을 조심스럽게 제거하십시오.

3. 모유 세포 격리

  1. 이중 전자 또는 수동 펌프를 사용하여 표현 된 건강한 수유 여성에게서 인간의 모유를 얻으실 수 있습니다. 발현의 ~ 4 시간 내에서 세포를 분리, 실온에서 우유를 유지.
  2. 50 mL 튜브를 사용하여, 원심 분리기 50 mL 우유 800 x g에서 15 분. 조심스럽게 세포 펠릿을 방해하지 않고 두고있는 동안 탈지 우유와 지방을 부어. 튜브 벽에서 모든 지방을 제거하기 위해 보풀이없는 닦아 튜브의 내부를 닦으십시오.
  3. 행크의 균형 잡힌 소금 용액에 2% 인간 혈청 알부민 10 mL을 추가하십시오 (2% HSA HBSS [Ca2+ 또는 Mg++]가 없습니다). 세포 활성화 및 세포 자멸을 피하기 위해 부드러운 파이펫팅으로 펠릿을 다시 일시 중단하십시오. 15 mL 튜브와 원심분리기로 10 분 동안 450 x g으로 옮긴다.
  4. 상급을 붓고 1.3 단계를 반복하십시오. 이어서, 예상 된 세포 수에 따라 2 % HSA HBSS의 1-2 mL에서 세포를 부드럽게 재중단하고, 혈세포 계측기 또는 자동화 된 세포 카운터에 의해 세포를 카운트하고, 또한 세포 생존가능성을 주목한다.

4. ADCP 분석

참고 : 여기에 설명 된 방법은 아커만 외32에서적응 .

  1. 각 ADCP 분석 판에 50,000개의 갓 단리된 BM 세포를 2% HSA-HBSS의 200 μL에서 잘 추가합니다. 37 °C에서 2 시간 동안 배양하십시오.
    1. 대조군 실험의 경우, 37°C에서 세포를 10 μg/mL 액틴 억제제(cytochalasin-D), 50 μg/mL FcR 차단제(FcBlock) 또는 플레이트에 첨가하기 전에 둘 다의 조합을 배양한다.
  2. 원심분리기 플레이트는 930 x g에서 10분 동안. 2% HSA HBSS의 200 μL을 추가하고 원심분리를 반복합니다. 2.7 단계에서와 같이 상급제를 조심스럽게 제거하고 세탁을 반복하십시오.
  3. 0.5 μg/mL(최종 농도)을 사용하여 생존을 위해 상수 및 얼룩 세포를 조심스럽게 제거하여 2% HSA HBSS의 50 μL에서 잘 당 450의 고칠 수 있는 생존 가능한 얼룩을 제거합니다. 어둠 속에서 실온에서 20 분 배양하십시오. 원심 분리기 플레이트는 930 x g에서 10 분 동안 2.7 단계에서와 같이 상판을 제거합니다. 2% HSA HBSS 및 원심 분리판의 200 μL을 다시 넣고 2.7단계에서와 같이 상판을 제거합니다.
  4. 생존성 염색 후, 관심 있는 백혈구 마커에 대한 얼룩 세포는, 예상 데이터에서 최적화된 농도에서 PE-마우스 항인간 CD45(클론 HI30)와 같은 CD45 특이적 얼룩을 최소한으로 포함한다(50 μL에서 1 μl/μL).
    참고: 관심 있는 모든 계보별 마커를 포함할 수 있습니다.
  5. 어둠 속에서 실온에서 20 분 배양하십시오. 원심 분리기 플레이트는 930 x g에서 10 분 동안 2.7 단계에서와 같이 상판을 제거합니다. 1% BSA HBSS의 200 μL을 추가하고 원심분리를 반복합니다. 상급을 제거합니다. 실온에서 30분 또는 4°C에서 하룻밤 동안 암흑에서 0.5% 포름알데히드의 200 μL에서 세포를 고정시다. 분석이 있을 때까지 어둠 속에서 냉장 보관하십시오.

5. 유세포분석에 의한 분석

  1. 초기 게이팅을 수행하여 전방 산란(FSC) 대 측면 산란(SSC) 플롯 및 파편(FSC = 5000보다 작은 재료)에서 이중을 제거합니다(그림 1참조). SSC 대 생존 력 얼룩(이 경우 V450) 플롯을 사용하여 죽은 세포(생존 성 얼룩에 대해 양수인 셀)를 제거합니다.
  2. SSC 대 CD45 플롯을 사용하여 광범위하게 설명된33,34와같이 주요 백혈구 클래스(과립구, 단핵구, 림프구)를 구별합니다.
    참고: 이 분류는 암시적이며 세포 유형을 확인하기 위해 계보별 마커가 필요합니다.
  3. 모든 CD45+ 세포에 대해, 또는 관심있는 각 백혈구 하위 집합에 대해, 형광 비드가 검출되는 플루오레세인 이소티옥시아네이트(FITC) 채널의 히스토그램에서 비드 양성 세포에 마커를 사용하여 ADCP 활성을 측정합니다.
    참고: 비드가 추가되지 않은 음의 제어 웰은 비드 양성 세포가 히스토그램에서 명백한 위치와 따라서 게이팅 마커를 배치할 위치를 나타냅니다.
  4. ADCP 점수를 (비드 양성 세포의 중간 형광 강도 [MFI])로 계산합니다( 양수 집단에서 총 CD45 + 세포의 %). 그래픽 소프트웨어를 사용하여 각 Ab/혈청 농도에서 점수를 플롯하고 AUC(언더 커브) 분석을 수행합니다.
    참고: AUC가 비특이적 음성 대조군 mAb의 ADCP 점수 AUC의 3배 표준 편차보다 큰 경우 ADCP는 양수로 간주됩니다(이 경우, 3865).

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Representative Results

우유는 실온이나 쿨러에서 보관 할 수 있습니다 (냉동되지는 않지만); 그러나 우유가 매우 차갑게 유지되었을 때 생존 가능성이 감소(데이터가 표시되지 않음)를 관찰하고 주변 온도에서 간단하게 수집, 보관 및 운반이 더 간단하다는 점을 감안할 때, 시료를 줄이기 위해 냉장보관하지 않는 것이 좋습니다. 샘플 간 가변성. 산후 7-183일 동안 얻은 우유에서, 자동화된 세포 카운터에 의해 결정된 세포 농도는 16,083-222,857 세포/mL에서 구역 수색했습니다. 그림 1은 이중, 파편 및 죽은 세포를 제거하는 게이팅 전략을 보여 줍니다. 생존율 ~90-99%였다. 총 라이브 셀의 약 1.6-12.3%는CD45+ 백혈구(표1)였다. 대부분의 의도적인된 단핵구는 암시적인 SSC 대 CD45 게이팅34에기초하여, 앞서 설명한 바와 같이 전구체/미성숙 세포인 것으로 나타났다. 의도적인된 단핵구는 SSC저중간/CD45낮음으로정의되었지만, 의도된 림프구 집단(SSC 낮음/CD45낮음)과 구별되는 더높은 CD45 염색 수준을 나타내지는 거의 없었습니다. 혈액 단핵구와 관련된(그림 1),이전 연구와 유사33,34. 의도된 과립구는 SSC 고/CD45 중간33,34(표 1)로정의되었다. 이 분류는 암시적일 뿐이며 세포 유형을 확인하기 위해 계보별 마커가 필요합니다.

갓 단리된 BM 세포의 ADCP 활성은 HIV 봉투의 V2 영역에 특이적이며 여기에서 시험된 V1V2-2F5K 항원에 결합하는 HIV 특이적 인간 mAb 830A를 사용하여 측정하였다. ADCP 활성은 산후 1개월에서 얻은 우유를 사용하여 본 실시예에 대해 측정하였다(도2A). 실시예 데이터는CD45+ 셀에서 게이팅할 때 보이는 예상 FITC(비드+) 히스토그램을 나타낸다(1 μg/mL mAb를 사용하여 생성된 데이터가 도시됨). 검정 색 마커는 ADCP 점수를 계산하는 데 사용되는 인구를 나타냅니다. 샘플 830A 데이터(도 2A의첫 번째 패널)에서 CD45+ 세포의 백분율과 해당 집단의 평균 형광이 도시되며, 이는 3.4단계의 방정식을 사용하여 ADCP 점수를 계산하는 데 사용되었다. 액틴 억제제 시토샬라신-D(cytod) 및/또는 FcR 차단 복근(FcBlock)으로 미리 배양된 세포는 Ab-바운드/항원 결합 비드와 함께 배양하기 전에 대조군 mAb 3865 이하의 수준에서 ADCP 활성을 나타내었으며, ADCP는 FcR임을 나타낸다. 및 액틴종속(그림 2). 총 CD45+ 세포에 대해 결정된 ADCP 점수는 음성 대조항 탄트락스 mAb 3865를 사용하여 정의된 배경 수준보다 ~25-35배 높았습니다. 각 주요 하위 집합도 별도로 분석되었습니다. 의도적인 된 과립구는 ADCP 활성 ~ 12-29 배 배경보다 높게 나타냈다. 의도적인 단핵구 ADCP는 배경 위의 ~2−3배였습니다(그림2). 예상대로 의도된 림프구는 측정 가능한 ADCP 활성을 나타내지 않았다(비특이적 음성 대조군 mAb 3865의 ADCP 점수 AUC의 3배 미만 표준 편차; 데이터는 도시되지 않음).

Figure 1
그림 1: 모유로부터 분리된 세포의 샘플 흐름 세포 분석 데이터. 세포는 프로토콜에 기재된 바와 같이 처리및 염색하였다. (A)단일 셀은 그림과 같이 FSC-H 대 FSC-A 플롯에서 더블릿을 제거하기 위해 게이트화되었으며, FSC-A에서 5,000개의 작은 파편을 게이팅했습니다. (B)이 집단은 SSC 대 V450 (생존 성 얼룩) 플롯에서 살아있는 세포 (생존 성 염료로 얼룩이없는)에 게이트하는 데 사용되었습니다. (C)이러한 라이브 셀은 FSC 대 SSC 플롯에 사용되었다. 비 백혈구의 예상 위치, 주로 유방 상피 세포가 될 가능성이, 강조 ("E"). (D)동일한 FSC 대 SSC 플롯은 CD45+ 셀로만 표시됩니다. 지적된 주요 백혈구 하위 집합은 잘 확립되고 예상되는 SSC 매개 변수(G = 과립구)에 기초한 ID만 을 사칭합니다. M = 단핵구; L = 림프구). (e)주요 백혈구 서브세트를 사용한 SSC 대 CD45 플롯에 생존 세포를 사용하였다. 이 플롯에서 백 게이팅은 패널 D에 표시된 데이터를 산출했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 2
그림 2: 모유에서 분리된 세포를 사용하여 ADCP 데이터를 샘플링합니다. 수행된 ADCP 분석은 Ackerman 외30에서적응된 분석에 기초한다. 상기 분석은 상기 프로토콜에 설명된 바와 같이 수행되었다. (A)ADCP 점수를 결정하는 데 사용되는 비드/FITC+ 모집단을 나타내는 마커와 함께 1 μg/mL mAb에서 FITC 히스토그램을 샘플링합니다. 스코어는 (비드 양성 세포의 MFI) x(비드/FITC+ 양성 집단에서총 CD45+ 세포의 %)로 계산하였다. mAb 830A를 단독으로 사용하는 첫 번째 패널은 또한 총 CD45+ 셀의 백분율과 해당 예에서 ADCP 점수를 계산하는 데 사용되는 평균 형광 강도 값을 나타냅니다. (B)각 mAb 희석 분석에서 ADCP 점수는 그래픽 소프트웨어에서 영역 아래 곡선 (AUC) 값을 계산하는 데 사용되었다. 대조군 실험을 위해, 액틴 억제제 시토칼라신-D(cytoD), FcR 차단제(FcBlock) 또는 둘 다의 조합은 면역 복합체에 첨가하기 전에 세포와 미리 배양하였다(전설 참조). 이 세포 분류는 암시적일 뿐이며 세포 유형을 확인하기 위해 계보별 마커가 필요합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

샘플 셀/mL % CD45+ % 과립구*  % 단핵구*
1 222,857 12.3 ± 1.9 13.6 ± 3.8 65.9 ± 5.6
2 27,361 1.6 ± 0.01 25.2 ± 4.0 9.1 ± 5.6
3 161,486 3.6 ± 1.1 47.8 ± 6.8 24.3 ± 4.3
4 16,083 2.7 ± 0.1 17.9 ± 3.5 34.4 ± 1.0
5 25,155 4.0 ± 0.7 29.7 ± 2.6 20.5 ± 1.4
*CD45+셀의

표 1: 전형적인 모유 세포 수 및 특성의 예.

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Discussion

본원에 기재된 ADCP 활성을 측정하기 위한 유세포 분석 기반 기술은 2011년30년에 처음 기술되었으며, 이후 80개 이상의 연구에서 견고하게 입증되고 인용되었다. 여기에 설명된 프로토콜은 이 기술을 1차 BM 세포와 처음으로 사용하기 위해 적응합니다. BM 세포에 의한 Fc 매개 기능의 이전 연구는 초유로부터 분리된 세포를 사용하여 산화 파열 또는 장기학 기반 식세포 분석법의 측정에 크게 제한되었습니다(출생 후 0-4일). 사실상 아무 연구도 초유 단계를 지나 인간 BM에 있는 세포를 검토하지 않았습니다. 초유 세포를 이용한 연구는 일반적으로 초유의 과립구가 혈액에서 분리된 것보다 덜 활동적이라는 결론을 내렸으며, 이는 '삼출자 세포'로서 의외의공간(35)으로옮겨진 것으로, 충돌하는 연구가 있지만 보고 유사한 식세포 및 살균 능력36.

수십 년 동안, 전통적인 현미경 검사법은 BM 백혈구를 확인하기 위하여 이용되고, 시각적인 식별의 이 모형은 세포오인1로이끌어 냈습니다. 몇몇 연구 결과는 수유의 첫번째 달 을 넘어 BM 백혈구 조성물을 비교하고, 대부분은 초유에 집중했습니다. 세포를 확인하기 위하여 유동 세포측정의 사용은 정확하게 세포를 확인하기 위하여 확률이 높습니다, BM 연구 결과의 단지 소수만이 아주 작은 견본 수로, 수시로 이 방법을 사용하여 행해졌더라도. 현재 연구에 따르면 수유의 모든 단계에서 BM의 백혈구 함량은 ~104-7 x 105 백혈구/mL에 이르기까지 매우 다양하며, 성숙한 우유에서 103-5x10 4 백혈구/mL로 감소, 모든 연구는 세포 농도와 조성이 수유1,2,3,4,5의단계에 의해 강하게 영향을 받는다는 것을 확인하지만. 우유가 성숙한 조성으로 전환함에 따라 호중구 농도가 증가하는 것으로 보이지만, 이러한 연구는 일반적으로 산후1개월(34)을넘어서는 확장되지 는 않았다.

본원에 기재된 프로토콜은 형광 비드를 식세포 표적로서 사용하지만, 다양한 Ab 아이소타입에 의해 유발되는 면역 복합체 및 감염된 세포와 같은 보다 생물학적으로 관련된 다양한 표적의 BM ADCP를 연구하기 위해 적용될 수 있음 서브 클래스. 더 큰 세포 염색 패널은 백혈구를 더 분화하기 위하여 이용될 수 있습니다. 큰 연구 결과는 이 관련 1 차적인 세포에 의하여 ADCP의 포괄적인 이해를 개발하기 위하여 필수적일 것입니다. 이 프로토콜은 HIV의 MTCT의 감소를위한 잠재적 인 메커니즘으로 BM 백혈구에 의해 ADCP의 설립을 허용, 뿐만 아니라 다른 병원체.

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Disclosures

저자는 공개 할 것이 없다.

Acknowledgments

우리는 원고 검토를 위해 마운트 시나이의 아이칸 의과 대학의 의학 및 미생물학과에서 수잔 졸라 - 파즈너 박사에게 감사드립니다. NIH/NICHD는 보조금 번호 R21 HD095772-01A1에 따라 이 프로젝트에 대한 자금을 제공했습니다. 또한, R. 파월은 시나이 산의 이칸 의과 대학, 감염증 학과의 기금으로 지원되었습니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 µm FluoSpheres NeutrAvidin-Labeled Microspheres  Thermo Fisher F8776
BD Pharmingen PE Mouse Anti-Human CD45 BD 560975
Bovine serum Albumin MP Biomedicals 8810025
Corning V-bottom polystyrene 96-well plate  Corning  3894
Cytochalasin D Sigma 22144-77-0
EZ-Link NHS-LC-LC-Biotin kit  Thermo Fisher 21338
Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes Corning  352196
Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes Corning  352070
Fixable Viability Stain 450  BD 562247
Formaldehyde solution Sigma 252549 
HBSS without Calcium, Magnesium or Phenol Red Life Technologies 14175-095
Human BD Fc Block BD 564219
Human Serum Albumin MP Biomedicals 2191349
Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipers Kimberly-Clark Professional  34120
PBS 1x pH 7.4 Thermo Fisher 10010023
Polystyrene 10 mL Serological Pipettes  Corning  4488
Protein Concentrators PES, 3K MWCO, 0.5 mL Pierce 88512

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References

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