En svin hornhinnen endothelial organ kultur modell ved hjelp av Split hornhinne knapper

Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Her presenteres en steg-for-trinn-protokoll for utarbeidelse og dyrking av svin delt hornhinne knapper. Ettersom denne organo-typisk dyrket orgel kultur modellen viser cellen dødstallene innen 15 dager, kan sammenlignes med menneskelig donor hornhinner, representerer den første modellen gir langsiktig dyrking av ikke-menneskelige hornhinner uten å legge giftig dextran.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Wenzel, D. A., Kunzmann, B. C., Steinhorst, N. A., Spitzer, M. S., Schultheiss, M. A Porcine Corneal Endothelial Organ Culture Model Using Split Corneal Buttons. J. Vis. Exp. (152), e60171, doi:10.3791/60171 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Eksperimentell forskning på hornhinnen endothelial celler er forbundet med flere vanskeligheter. Human donor hornhinner er knappe og sjelden tilgjengelig for eksperimentelle undersøkelser som de er normalt nødvendig for transplantasjon. Endothelial cellekulturer ofte ikke oversette godt til in vivo situasjoner. På grunn av biostructural karakteristikker av ikke-menneskelige hornhinner, stromal hevelse under dyrking induserer betydelig hornhinne endothelial celle tap, noe som gjør det vanskelig å utføre dyrking i en lengre periode. Deswelling midler som dextran brukes til å motvirke dette svaret. Men de også forårsake betydelig endothelial celle tap. Derfor ble en ex vivo organ kultur modell som ikke krevde deswelling agenter etablert. Pig øyne fra en lokal slakteri ble brukt til å forberede delt hornhinnen knapper. Etter delvis hornhinne inngrep, de ytre lag av hornhinnen (epitel, Bowman lag, deler av stroma) ble fjernet. Dette reduserer hornhinnen endothelial celle tap indusert av massiv stromal hevelse og Descemefs ' s membran folding gjennom lengre dyrking perioder og forbedrer generell bevaring av endothelial celle laget. Påfølgende komplett hornhinne inngrep ble etterfulgt av fjerning av splitt hornhinnen knappen fra de resterende øye pære og dyrking. Endothelial celle tetthet ble vurdert ved oppfølgings tider på opptil 15 dager etter tilberedning (dvs. dager 1, 8, 15) ved hjelp av lys mikroskopi. Preparatet teknikken brukes gir en bedre bevaring av endothelial celle laget aktiveres av mindre stromal vev hevelse, som resulterer i langsom og lineær nedgang priser i delt hornhinnen knapper sammenlignes med menneskelig donor hornhinner. Som denne standardiserte organo-vanligvis dyrket forsknings modell for første gang gir en stabil dyrking i minst to uker, er det et verdifullt alternativ til menneskelig donor hornhinner for fremtidige undersøkelser av ulike eksterne faktorer med hensyn til deres effekter på hornhinnen endotelet.

Introduction

Hornhinnen transplantasjon prosedyrer er blant de hyppigst utførte Sygehus over hele verden1. Ettersom det er en alvorlig mangel på menneskelig donor hornhinner, eksperimentell forskning adressering hornhinnen endothelial celler i menneskelig hornhinner er vanskelig å utføre1. Men innføringen av vannings løsninger og andre stoffer som brukes i øyet, viskoelastiske enheter, samt Kirurgiske instrumenter og teknikker (f. eks, phacoemulsification instrumenter og teknikker, ultralyd energi) krever gyldige og omfattende undersøkelser om deres virkninger på hornhinnen endotelet før klinisk bruk.

Få alternativer til menneskelige donor hornhinner eksisterer for forskning. Animal forskning modeller er svært verdifull, men på samme tid svært ressurskrevende og stadig spørsmålstegn etisk. En stor ulempe for in vitro cellekulturer er deres begrenset oversettelse til det menneskelige øyet. Resultater innhentet fra cellekulturer kan være urimelig å i vivo forhold, fordi cellene kan gjennomgå endothelial mesenchymal overgang (EMT), noe som resulterer i Fibroblast-lignende morfologi forårsaket av tap av celle polaritet og endringer i celle form og gen uttrykket2.

Mens tidligere ex vivo-modeller rapporterte dyrking perioder på opp til bare 120 h, en roman forberedelse teknikk for å etablere en svin hornhinnen endothelial orgel kultur modell av dyrking fersk gris hornhinner i minst 15 dager ble nylig innført3 ,4,5,6. Hvis hornhinnen epitel og deler av stroma er fjernet (ca 300 μm totalt) fra hornhinnen før dyrking, hevelse i stroma er redusert i delt hornhinnen knapper resulterer i mindre endothelial celle tap og en godt vedlikeholdt endothelial celle lag etter opp til 15 dager, mens ikke-delt hornhinnen knapper viser signifikant endothelial celle tap på grunn av ujevn stromal hevelse og dannelse av Descemefs ' s folder. Øye bankene bruker vanligvis osmotisk deswelling midler som dextran for å redusere hevelse av hornhinner før transplantasjon. Imidlertid ble disse agentene vist å indusere økt endothelial celle tap7,8,9.

Denne artikkelen tar sikte på å visualisere denne standardiserte ex vivo forskning modell i en detaljert trinn-for-trinn-protokollen for å muliggjøre fremtidige etterforskere til å utføre forskning på hornhinnen endotelet ved hjelp av delt hornhinnen knapper. Denne modellen representerer en grei metode for å teste stoffer og teknikker som brukes i øyet, for eksempel viskoelastiske enheter, vannings løsninger og ultralydsenergi, eller andre prosedyrer der hornhinnen endotelet er av interesse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Denne protokollen følger de etiske retningslinjene for institusjonen vår. I samsvar med vedtektene for vår institusjon etiske vurdering komiteen ingen etisk godkjenning måtte innhentes før eksperimentene, som alle svin hornhinner ble innhentet fra den lokale slakteri.

1. orgel kultur

  1. Forbered gris øyne.
    1. Fra den lokale slakteri, få gris øyne som ble fjernet kort tid postmortem men før termisk behandling. Transporter øynene til laboratoriet og behandle dem i løpet av få timer. Under transport, hold øynene ved romtemperatur (ca. 21 ° c) før behandling.
    2. Fjern alle orbital adnexes (øye muskler, conjunctiva, fettvev) før desinfeksjon ved hjelp av øye sakser og Colibri tang. Skill og forkaste alle øyne med åpenbare traumer, ytre skader (f. eks, kniv cut), eller synlig hornhinnen uklarheter.
    3. Forbered en 5% jod-PBS-løsning (1:20) i en steril kopp ved å legge til 3 mL 7,5% povidon jod til 57 mL av en fosfat bufret saltvann (PBS) løsning. Tilbered også en separat steril kopp som inneholder 60 mL ren PBS.
      Merk: den totale mengden brukt jod-PBS-løsning og størrelsen på koppen avhenger av antall hornhinner som skal dissekert. Fem til seks øyne krever ca 60 mL av 5%-jod-PBS-løsningen skal desinfiseres riktig.
    4. Sett fem til seks øyne inn i 5%-jod-PBS løsning for totalt 5 min til riktig desinfisere øynene ' overflate. Rør forsiktig hvert minutt for å sikre at øynene ' overflaten er helt neddykket og desinfiseres helt i jod løsning.
    5. Etter 5 min, overføre desinfiseres øynene til forberedt koppen fylt med ren PBS. Igjen, forsiktig røre for å sikre at jod-PBS-løsningen er vasket bort fra øynene ' overflate.
      Merk: Utfør dette steget på en ren benk for å hindre kontaminering av desinfiseres øynene.
  2. Klargjør cellekultur plater.
    Merk: Utfør følgende trinn på en ren benk med konstant laminær luftstrøm.
    1. Tin 2 mL av fosterets kalv serum (FCS). Fyll en sprøyte (5 mL) med FCS ved hjelp av en stump kanyle. Tøm sprøyten gjennom et sprøyte filter (0,22 μm) for å hindre mulig bakteriell contaminationof på FCS i 80 mL dextran-fri kultur medium I (minimum essensielle medium [MEM] med Earle ' s salter, penicillin/Streptomycin, L-glutamin [200 mM], amfotericin B [250 μg/mL], Hepes buffer [1 M] [50x], NaHCO3og destillert vann). Agitere blandingen for å sikre jevn fordeling av underlaget.
    2. Fyll hver brønn av en 12 brønn cellekultur plate med 3 mL av underlaget blanding.
  3. Utfør disseksjon og inkubasjons.
    Merk: Utfør dette trinnet på en ren benk. Ikke berør hornhinnen endotelet med noen instrumenter.
    1. Overfør en øye pære fra koppen med PBS inn i øye pære holde ren med hornhinnen vendt opp og plasser den under en øyen kirurgisk mikroskop. Bruk en sprøyte fylt med 0,9% NaCl for å påføre litt sug på øyet over øye pære holde ren for å fixate øyet i posisjon for disseksjon.
    2. Bruk en trephine (ø 7,5 mm) som inneholder et standardisert innlegg, som sikrer at trephined dybden ikke vil overstige 300 μm, for å skjære overfladisk inn i den sentrale hornhinnen (figur 1a).
    3. Bruk Colibri tang og en en gangs skalpell med et trekantet blad for å klippe og fjerne den delvis trephined delen av hornhinnen horisontalt gjennom stroma. Kast den separerte hornhinnen delen består av hornhinnen epitel, Bowman lag, og en del av stroma.
      Merk: Hold den horisontale skjære retningen strengt for å oppnå en jevn tykkelse på de resterende stroma.
    4. Overfladisk plassere en 10-0 Sutur (10-0 polyamid 6) i stroma for å kunne skille endothelial fra stromal side under eksperimenter (figur 1B). Forhindre inntrengning av hornhinnen endotelet. Kast øye pæren hvis endotelet er gjennomsyret.
      Merk: penetrasjon av hornhinnen endotelet med suturing nålen vil være synlig, som væske fra fremre øye kammer vil lekke gjennom Sutur kanal.
    5. Bruk trephine uten innlegg for å fremme trephined kuttet til full dybde til det fremre øye kammeret er nådd (figur 1C). En distinkt fall i motstand og væske lekker fra fremre øye kammer kan oppfattes etter fullstendig inntrengning av hornhinnen.
      Merk: Bruk en hockey kniv hvis splitt hornhinnen knappen forblir festet på den ene siden av splitt hornhinnen knappen etter inngrep.
    6. Overfør den oppnådde splitt hornhinnen knappen, som nå består av en del av stroma (figur 2), descemefs ' s membran, og hornhinnen endotelet, inn i kulturen medium (kultur medium I + FCS, se avsnitt 1,2) i 12 brønn cellekultur plate med merket side vendt ned, slik at hornhinnen endotelet vender opp.
      Merk: Hvis endothelial IDen vender ned, kan endotelet bli skadet.
    7. Tilordne et individuelt nummer til hver delt hornhinne knapp for identifisering under følge ups og merke brønnene på cellen kultur platen tilsvarende.
    8. Ruge den fylte cellekultur platene i en inkubator under standard forhold ved en temperatur på 37 ° c, 5% CO2 og en relativ luftfuktighet på 95%. Endre kultur mediet (kultur medium I + FCS) på dag 8 hvis en inkubasjonsperiode på 7 dager overskrides.
      Merk: inkubasjons prosedyren ved hjelp av delte hornhinne knapper har blitt validert i opptil 15 dager.

Figure 1
Figur 1: Disseksjon av svin hornhinnen for å få delt hornhinnen knapper. (A) etter inngrep av hornhinnen ved hjelp av en trephine med et innlegg å skjære i en dybde på 300 μm og fjerning av epitel og deler av stromal vev, (B) en Sutur er plassert overfladisk inn i stroma uten penetrasjon av hornhinnen endotelet for senere identifisering av stromal IDen. (C) full inngrep av de resterende hornhinnen etterfølges av (D) fjerning av den oppnådde splittet hornhinne knappen fra øye pæren. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

2. mikroskopi og undersøkelse av endotelet

  1. Utfør unstained undersøkelse.
    Merk: unstained undersøkelse kan utføres flere ganger (f.eks. ved ukentlig følge ups på dag 1, 8 og 15). Men unstained telling tillater bare vurdering av endothelial celle tetthet, ikke morfologiske parametre.
    1. Fyll 3 mL hypotonisk balansert saltoppløsning (hBSS, se sammensetning i materialfortegnelsen) i hver brønn av en 12 brønn cellekultur plate. Forsiktig plassere en enkelt delt hornhinnen knappen i hBSS å indusere hevelse av hornhinnen endothelial celler og forbedre synligheten av cellene for celle telling.
      Merk: Pass på at endothelial IDen vender mot retningen til mikroskopet. Hvis det brukes et omvendt fase kontrast mikroskop, må endothelial IDen vendt nedover. Mens på plass, kulturen plate bør ikke flyttes for å hindre endothelial celle skade.
    2. La cellene hovne opp i 1-2 min før du tar et bilde av endotelet med kameraet festet til mikroskopet. Ta minst tre bilder av minst tre forskjellige områder for å få et representativt inntrykk av den faktiske tilstanden til hornhinnen endotelet. Legg til en skala bar med den sanne til skala lengde på 100 μm for senere analyse av hornhinnen endothelial celle tetthet og morfologiske parametre.
    3. Å forhindre osmotisk skade, fjerne det up hornhinnen knapp fra det hBSS etter et maksimum av 5 min og forflytning den rygg inn i kulturen medium3.
  2. Utfør beiset undersøkelse.
    Merk: farging avslutter eksperimenter, som flekker stoffene som brukes er cytotoksisk. Derfor kan flekker bare utføres på slutten av observasjonsperioden for vurdering av morfologiske parametre (reformasjonen tall, rosett formasjoner, alizarin røde flekker celler).
    1. Forbered en 0,25% trypan blå oppløsning og 0,2% alizarin rød S-løsning for farge prosedyren.
      1. For 0,25% trypan blå oppløsning, fortynne 0,4% trypan blå oppløsning med en 0,9% NaCl løsning.
        Merk: for eksempel, for å få 20 mL av en 0,25% trypan blå oppløsning, fortynne 12,5 mL av 0,4% trypan blå oppløsning med 7,5 mL av 0,9% NaCl løsning. Den trypan blå oppløsningen kan oppbevares ved romtemperatur i flere uker eller måneder.
      2. For å få en 0,2% alizarin rød S-løsning oppløse 100 mg av alizarin røde S pulver i 50 mL av en 0,9% NaCl løsning under konstant omrøring og oppvarming til 50 ° c på en magnet røring plate med varmefunksjon. Hvis du vil fjerne mulige precipitates, filtrerer du den oppnådde løsningen. Juster pH i alizarin rød S-løsning til pH 4,2 ved å tilsette natriumhydroksid eller saltsyre tilsvarende.
        Merk: før hver påføring av alizarin rød S-løsning må du kontrollere at pH-verdien korrigeres til 4,2, og at det ikke er noen precipitates i løsningen. Oppløsningen kan oppbevares ved romtemperatur. Ikke Oppbevar løsningen i mer enn 4 uker.
    2. Plasser splitt hornhinnen knappene i Petri retter med endothelial siden vendt oppover for å flekken de endothelial cellene. Bruk en pipette for langsomt å dryppe på 0,25% trypan blå løsning dråpe for dråpe på hornhinnen endotelet for 90 s.
      Merk: Trypan blå tillater identifisering av skadede hornhinne celler med en gjennomtrengelig membran fordi den flekker deres kjerner.
    3. Skyll forsiktig den delte hornhinne knappen 3x i 0,9% NaCl i et lite glass beger. Igjen, bruk en pipette å langsomt dryppe på 0,2% alizarin rød S løsning dråpe for dråpe på hornhinnen endotelet for 90 S.
      Merk: Alizarin rød S flekker på Descemefs ' s membran, som bidrar til å markere celle grenser i uskadet hornhinnen endothelial celler og å markere ødelagte celler når den underliggende Descemefs membran blir synlig. Det muliggjør også enkel identifisering av større ødelagte områder.
    4. For undersøkelse av farget hornhinnen endotelet følge trinnene forklart for unstained telling i § 2,1.

3. analyse av hornhinnen endothelial celle tetthet og morfologiske parametre

  1. Prosjekt tellings ruter på bildene ved hjelp av en grafikkredigeringsprogram vare (tabell med materialer).
    1. Åpne programvaren og åpne et bilde av hornhinnen endotelet ved å velge fil | Åpne | Velg.
    2. Projisere et kvadrat med en sann skala side lengde på 100 μm på bildet.
      Merk: følgende trinn i avsnitt 3.1.2 kan ignoreres hvis visningsprogram varen tillater projisering av telle firkanter på bildet. Sidelengden på plassen avhenger av oppløsningen på bildene tatt med mikroskopet kamera og kan beregnes med skalaen bar.
      1. Beskjær Skalerings linjen fra fotografiet som er tatt med mikroskopet: Velg det rektangulære markeringsverktøyet på verktøylinjen eller trykk på M, deretter kantlinjen på skalaen, og velg deretter Rediger | Beskjær eller trykk CTRL + X.
      2. Klikk på fil | Ny (eller trykk CTRL + N). I det kommende vinduet velger du utklippstavle i rullegardinlisten dokument type . Antall piksler som vises, er sidelengden til telle firkanten. Legg merke til de tilsvarende bildepunktene for de andre bildene, og klikk OK.
      3. Velg fil | Ny (eller CTRL + N). Sett inn bredde og lengde (i piksler) på telle firkanten i det kommende vinduet i henhold til lengden på Skalerings linjen. Velg bakgrunnsfarge hvit, og trykk deretter på OK.
      4. Klikk Velg | Velg alle (eller CTRL + A). Velg Rediger | Kopier (eller CTRL + C).
      5. Velg bildet av hornhinnen endotelet åpnet i trinn 3.1.1. Velg Rediger | Lim inn (eller CTRL + V) for å sette inn firkanten på bildet av hornhinnen endotelet.
      6. Velg laget på firkanten, og Juster gjennomsiktigheten. Velg lag | Lag stil | Blending valg | Sett opacity til 30% | Det er greit.
      7. Lagre bildet med den projiserte firkanten med en sann skala side lengde på 100 μm. Gjenta med de andre bildene som trengs for analyse.
  2. Vurdere endothelial celle tetthet og morfologiske parametre.
    1. Åpne bildene med de projiserte rutene i ImageJ (versjon 1.50 i) og bruke CellCounter PlugIn for å telle cellene i kvadratet. Åpne ImageJ, velg fil | Åpne (eller CTRL + O) | Velg bilde.
      Merk: ImageJ og CellCounter PlugIn er freeware tilgjengelig for nedlasting på nettet.
    2. Velg plugins | Cell_Counter | Cell Counter | Initialiser. Tell de endothelial cellene, og Registrer resultatet. På to sider av plassen, telle celler som er kuttet av kvadratet kanten. Ikke telle kutte celler på de to andre sidene.
    3. Analyser minst seks ruter per hornhinne fra forskjellige områder (for eksempel tre bilder, to firkanter per bilde) og Bestem den gjennomsnittlige hornhinne endothelial celle tetthet per kvadrat (100 μm2). Ekstrapolere den endothelial celle tettheten per 100 μm2 til 1 mm2 ved å multiplisere med 100.
  3. For vurdering av morfologiske endringer, telle reformasjonen tall (felles møte ≥ 4 celler/celle grenser i stedet for tre), rosett formasjoner (karakteristisk rosett-formet utseende, fem eller flere radielt arrangert celler rundt en ødelagt celle ), eller alizarin røde områder (ødelagte celler) i de projiserte rutene.
    Merk: Alternativt kan det være nyttig å bruke større firkanter (f.eks. 200 x 200 μm2) for morfologiske analyser i godt bevarte prøver for å få mer representative resultater.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Den presenterte disseksjon teknikken innebærer delvis fjerning av stromal vev, noe som resulterer i en tynnere hornhinne prøve og dermed mindre stromal hevelse (figur 1 og figur 2). Mindre stromal hevelse induserer mindre skjær og klype krefter som har en negativ innvirkning på hornhinnen endotelet, og dermed forårsaker lavere endothelial celle tap priser6. Split hornhinnen knapper viser en betydelig bedre bevarte endothelial celle lag etter 15 dager med dyrking i forhold til ikke-delt hornhinnen knapper og hele corneoscleral prøver, som reflekterer mindre endothelial celle tap og et lavere antall reformasjonen tall (≥ 4 celler/cellekantlinjer siamesiske i stedet for tre), rosett formasjoner (fem eller flere radielt arrangert celler møte på ett sted), og alizarin røde (ødelagt) celler etter 15 dager6.

Over en periode på 15 dager, splitt hornhinnen knapper viser en jevn nedgang i endothelial celle tetthet med en gjennomsnittlig ukentlig Prosentual endothelial celle tap på 4,90% (n = 40, Figur 3). Starter på dag 1 med en endothelial celle tetthet på 4 033 ± 146/163 celler/mm2 (median ± 25%/75% kvartiler), celle tetthet redusert til 3 850 ± 167/233 celler/mm2 på dag 8, og 3 650 ± 200/233 celler/mm2 på dag 15. Bestemt celle tap var lik for første og andre uke. På dag 1 − 8, 4,00 ± 2.17/1.93% (median ± 25%/75% kvartiler); dager 8 − 15, 4,88 ± 5.52/4.42%; dager 1 − 15, 8,64 ± 4.32/2.71%). Dermed er den gitte nedgangen rate lik satsen rapportert i Human donor hornhinner under dyrking i tidligere studier10,11,12.

Morfologiske parametre ble vurdert etter farging av endothelial celle laget på dag 15 (n = 28, Figur 4). Reformasjonen tallene består 7,18 ± 2.36/2.90% (median ± 25%/75% kvartiler) av sammenslåing cellekantlinjer. En median på 1,11 ± 1.11/15.56 rosett formasjoner/mm2 (median ± 25%/75% kvartiler) var til stede i de undersøkte prøvene, mens 13,33 ± 4.44/11.67 alizarin røde fargede celler/mm2 (median ± 25%/75% kvartiler) merket punktlig celle tap.

Figur 5 gir representative bilder av hornhinnen endotelet under mikroskopisk evaluering i HBSS (figur 5A) og etter farging med trypan blå og alizarin rød S (figur 5B). Vurderingen av endothelial celle tetthet i hBSS kan utføres flere ganger (for eksempel på dag 1, 8 og 15), mens fargede prøver kan brukes til vurdering av morfologiske parametre (reformasjonen tall, rosett formasjoner, alizarin rød beiset celler) eller bestemmelse av endothelial celle tetthet på slutten av eksperimentene på grunn av de cytotoksisk egenskapene til de fleste flekker stoffer.

Hvis splitt hornhinnen knappene er plassert og dyrket med endothelial siden vendt ned ved et uhell, omfattende endothelial celle skade er å forvente (figur 6A). Ikke-Split hornhinnen knapper lide betydelig økt endothelial celle tap på grunn av stromal hevelse, forårsaker Descemefs ' s membran folding over 15 dager med dyrking (figur 6B), mens Split hornhinnen knapper viser en stor grad bevart hornhinnen endotelet etter 15 dager med dyrking, indikert av spredte punktlig alizarin rød beiset områder som indikerer enkelt ødelagte celler (figur 6C).

Figure 2
Figur 2: skjematisk illustrasjon av ikke-delt hornhinne knapper og splitt hornhinne knapper. Etter fjerning av 300 μm av svin hornhinnen, inkludert epitel og store deler av stromal vev, tykkelsen på delt hornhinne knappene er redusert til fordel for bedre bevaring av hornhinnen endotelet på grunn av redusert stromal hevelse gjennom dyrking av opp til 15 dager. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: endothelial celle tetthet (ECD) av delt hornhinne knapper over 15 dager. Splitt hornhinne knapper (n = 40) viste en jevn nedgang. ECD på dag 1, 4 033 ± 146/163 celler/mm2 (median ± 25%/75% kvartiler); dag 8, 3 850 ± 167/233 celler/mm2; dag 15, 3 650 ± 200/233 celler/mm2. Data er avbildet som median ± 25%/75% kvartiler, kinnskjegg representerer enten minimum og maksimum eller 1,5 av interquartile rekkevidde (IQR). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: morfologiske parametre for ytterligere evaluering av celle skade og omorganisering prosesser. Mikroskopiske fotografier av hornhinnen endotelet i 400x forstørrelse etter 15 dager med dyrking og farging med trypan blå og alizarin rød S viser (A) reformasjonen tall (piler, felles møte i fire eller flere celler/celle grenser i stedet for tre), (B) rosett formasjoner (prikket sirkel, sentrale avtagende celle med karakteristisk rosett formasjoner av fem eller flere tilstøtende celler) og (C) alizarin røde fargede celler (stiplede sirkler, ødelagte celler). Data (n = 28) er avbildet som median ± 25%/75% kvartiler. Kinnskjegg representerer enten minimum og maksimum eller 1,5 av det interquartile området (IQR). Sirkler representerer outliers som ikke er innenfor IQR. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5: unstained og beiset hornhinnen endotelet. Den endothelial celle laget sett under mikroskopisk evaluering (400x forstørrelse) i (A) hypotonisk balansert saltløsning (hBSS) forårsaker endothelial celle hevelse og dermed bedre celle synlighet og (B) etter farging med trypan blå og alizarin rød S. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 6
Figur 6: oversikt fotografier av hornhinnen endotelet av (a) en splitt hornhinnen knapp dyrket opp ned, (B) en ikke-delt hornhinnen knappen, og (C) en delt hornhinnen knappen etter farging. Fotografier viser hornhinnen endotelet etter farging med trypan blå og alizarin rød S. (A) omfattende hornhinnen endothelial celle skade (rødt område) er observert etter splitt hornhinnen knappene er dyrket med endothelial siden vendt ned etter en uke med dyrking. (B) signifikant økt endothelial celle skade i ikke-delt hornhinnen knapper på grunn av descemefs ' s membran folding og stromal hevelse etter 15 dager med dyrking (røde striper). (C) Split hornhinnen knapper viser en godt bevart endothelial celle lag etter 15 dager med dyrking bare viser punktlig ødelagte celler sett i alizarin rød beiset områder. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denne protokollen gir en metode for utarbeidelse av svin delt hornhinnen knapper, som representerer en standardisert og rimelig ex vivo hornhinnen endothelial organ kultur modell for forskningsformål6. Svin Split hornhinne knappene viste en reduksjon av endothelial celle tetthet sammenlignes med endothelial celle tap observert i Human donor hornhinner dyrket i øye bankene over en to-ukers periode6,10,11, det er 12.

Den overlegenhet over ikke-delt hornhinnen knapper samt hele svin corneoscleral prøvene ble vist tidligere6. I denne studien ble tre grupper sammenlignet på dag 1, 8 og 15. Hornhinnen endotelet av alle grupper (corneoscleral knapper, ikke-delt hornhinnen knapper, delt hornhinnen knapper) var i god stand på dag 1, representert ved en godt bevart endothelial celle lag6. Imidlertid, på grunn av stromal hevelse, folding av Descemefs ' s membran ødela store deler av endotelet av hele corneoscleral prøver, slik at en representativ vurdering av hornhinnen endothelial celle tetthet på dager 8 og 15 kunne ikke utføres. Til tross for endotelet av det ingen-up hornhinnen tastene var frisk bevart til dag 15, noe Descemefs ' membran folde var likeledes gave. Selv sammenlignet med corneoscleral prøvene den endothelial celle laget av ikke-delt hornhinnen knapper var i bedre stand, den endothelial celle laget av delt hornhinnen knappene var i langt bedre stand. Dette kan sees i kvantitative og kvalitative parametre, som endothelial celle tap innen 15 dager etter dyrking var signifikant høyere (p = 0,041) i ikke-delt hornhinnen knapper (-575 ± 25/250 celler/mm2) sammenlignet med delt hornhinnen knapper (-417 ± 138/179 celler/mm2), som er sammenfallende til de bestemte morfologiske egenskaper tydelig i en mer vanlig Hexagon celle mønster, færre reformasjonen tall og rosett formasjoner, samt færre ødelagte celler (alizarin røde områder) i Split hornhinnen knapper6. Prosentual endothelial celle tap bekrefte disse funnene, som Prosentual celle tap innen 15 dager i ikke-delt og delt hornhinnen knappene er 14,89% og 10,2% (p = 0,032) henholdsvis6. Siden denne metoden ble validert for en periode på opptil 15 dager, tillater den lengre observasjons perioder enn publiserte studier hittil (72 til 120 h)3,4,5.

Forbedringene i bevaring av endothelial celle lag, bruke vanlige dyrke protokoller også brukt i øye banker, kan utelukkende tilskrives den reduserte hevelse i hornhinnen stroma, siden en stor del (300 μm) av stroma er fjernet før dyrking6,13. Normalt stroma tendens til å hovne opp enormt under dyrking på grunn av sin hydrofile egenskaper og molekyler innebygd i stromal tissue14,15. Hevelse, som induserer skjær og klype krefter og descemefs ' s membran folding, som også fører til mekanisk belastning på hornhinnen endotelet og endothelial celle tap, er redusert etter delvis fjerning av stroma6,10. I motsetning til øye banker, som ofte bruker osmotisk agenter som dextran til deswell menneskelige donor hornhinner før transplantasjon, splitte hornhinnen knappene ikke krever osmotisk deswelling16,17. Som kultur medium supplert med dextran er kjent for å bli absorbert av hornhinnen endothelial celler og å indusere økt celle tap7,8,9,18,19 ,20, dyrking av splitt hornhinnen knapper uten dextran (eller andre osmotisk midler) eliminerer så mange negative giftige faktorer som mulig6. Som kultur medium ikke er supplert med noen tilsetningsstoffer i den presenterte metoden, ingen giftige påvirkninger forårsaket av noen tilsatt substans er forventet, noe som gjør denne modellen verdifull for undersøkelser av biokompatibilitet tester av nye stoffer.

Selv om hornhinnen endotelet er en svært delikat celle lag og utarbeidelse av Split hornhinnen knapper krever moderate kirurgiske ferdigheter og skånsom håndtering, denne teknikken kan være en standardisert metode for å arbeide med og å få pålitelige resultater om effekter av ulike faktorer på hornhinnen endotelet innenfor en svært rimelig tidsramme. Likevel er det noen få trinn i denne protokollen der hornhinnen endotelet er i fare. Tydeligvis skadet eller ugjennomsiktig øyne må være nøye identifisert og forkastet i begynnelsen for å hindre mulige fordommer. Også, hornhinnen endotelet må alltid stå urørt under inngrep, disseksjon, ekstraksjon, og håndtering (f. eks, overføring fra øye til kultur plate, fra kultur plate til kultur plate, etc.) av Split hornhinnen knapper for å hindre noen mekaniske skader. Når du plasserer Sutur overfladisk i stroma, kan endotelet potensielt være gjennomsyret hvis nålen er tilfeldigvis satt inn for langt i dybden. I så fall vil merkbar væske fra det fremre øye kammeret passere gjennom Sutur kanalen og det tilsvarende øyet må kastes. For å unngå dette bør nålen holdes overfladisk innenfor stroma. Videre, forsiktighet må tas for å strengt splitte hornhinnen knappen horisontalt ved hjelp av skalpell. Ujevn skjæring vil resultere i ujevn hevelse under dyrking, muligens forårsaker økt endothelial celle tap.

Undersøkelsen av unstained hornhinnen endothelial celler i hBSS er vanligvis utføres i menneskelige donor hornhinner. Det er ingen bevis for betydelige celle skader forårsaket av osmotisk hevelse i endothelial celler for den valgte eksamens tiden av delt hornhinne knapper i hBSS3. Selv om farging forbedrer synligheten av cellekantlinjer, resulterer ikke unstained telling i signifikant forskjellige resultater av endothelial celle tetthet sammenlignet med telling av fargede celler21. Den klare fordelen med unstained telling er at det tillater flere oppfølgings undersøkelser gjennom hele løpet av eksperimentene, mens farging av stoffer vanligvis cytotoksisk og avslutter observasjonsperioden. Farget telling er imidlertid fortsatt viktig for å vurdere de morfologiske egenskapene til endotelet. Trypan blå fremhever kjerner av skadede celler som ofte synes uskadet i unstained telling. Alizarin røde S forbedrer tydelig synligheten av cellen grenser og skadede celler ved farging av Descemefs ' s membran, som forenkler vurderingen av endothelial celle tetthet og tillater analyse av morfologiske funksjoner av hornhinnen endotelet , slik som reformasjonen tall, rosett formasjoner, og alizarin røde flekker (Figur 4).

En stor begrensning av splitt hornhinnen knapper som en ex vivo-modellen er at, akkurat som in vitro-modeller, de er bare egnet for å undersøke ytre påvirkninger på hornhinnen endothelial celler. Derfor, in vivo-modeller er uerstattelig for forskning på systemiske sykdommer og tilstander med innvirkning på øyet og hornhinnen endotelet. Uansett, denne preparatet teknikken kan generere gyldige data for å teste virkningene av ulike eksterne faktorer på hornhinnen endotelet (f. eks, i biokompatibilitet testing av nye stoffer)22. Etter 3R-prinsippet (utskifting, reduksjon, avgrensning) for å redusere antall levende dyre eksperimenter, gir denne metoden en tilstrekkelig forsknings modell for å ytterligere lukke gapet mellom in vitro cellekulturer, der resultatene er ofte urimelig å i vivo-situasjon hos mennesker, og dyr forskning, som krever betydelig innsats og i økende grad reiser etiske bekymringer23.

På grunn av deres egenskaper og tilgjengelighet, gris øyne synes å være den eneste tilstrekkelig erstatning for menneskelige øyne for forskningsformål. Hornhinner fra ikke-menneskelige primater er ikke et godt alternativ på grunn av etiske årsaker og tilgjengelighet, selv om disse dyrene er den nærmeste arten til mennesker. På den annen side, øynene til mindre dyr er rett og slett for små til å tillate effektiv hornhinnen fjerning. Gris øyne er sammenlignbare med menneskelige øyne i størrelse og vise lignende egenskaper av hornhinnen endothelial celler, som også gjenspeiles i forskningen håndtere mulige fremtidige xenotransplantation av genmodifiserte svin hornhinner24, 25,26. Også å være et biprodukt av slakterier, de er enkle å få tak.

I konklusjonen, den presenterte metoden ved hjelp svin hornhinner tilbyr en svært reproduserbar organo-typisk dyrket forskning modellen muliggjør kostnadseffektiv forskning på hornhinnen endothelial celler. Fremtidige etterforskere kan bruke Split hornhinnen knapper for å analysere virkningene av ulike faktorer som nye stoffer, kirurgiske teknikker, utstyr og andre mulige ytre påvirkninger der hornhinnen endotelet er av stor interesse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Etableringen av den presenterte forskningen modellen ble støttet av KMU-innovativ (FKZ: 13GW0037F) av Federal Ministry of Education and Research Tyskland.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Subject
Pig eyes local abbatoir
Substances
Alizarin red S Sigma-Aldrich, USA
Culture Medium 1, #F9016 Biochrom GmbH, Germany
Dulbecco's PBS (1x) Gibco, USA
Fetal calf serum Biochrom GmbH, Germany
Hydrochloric acid (HCl) solution own production
Hypotonic balanced salt solution own production per 1 L of H2O: NaCl 4.9 g; KCl 0.75 g; CaCl x H2O 0.49 g; MgCl2 x H2O 0.3 g; Sodium Acetate x 3 H2O 3.9 g; Sodium Citrate x 2 H2O 1.7 g
Povidon iodine 7.5%, Braunol B. Braun Melsungen AG, Germany
Sodium chloride (NaCl) 0.9% B. Braun Melsungen AG, Germany
Sodium hydroxide (NaOH) solution own production
Trypan blue 0.4% Sigma-Aldrich, USA
Materials & Instruments
Accu-jet pro Brand GmbH, Germany
Beaker Glass 50 mL Schott AG, Germany
Blunt cannula incl. Filter (5 µm) 18G Becton Dickinson, USA
Cell culture plate (12 well) Corning Inc., USA
Colibri forceps Geuder AG, Germany
Corneal scissors Geuder AG, Germany
Eppendorf pipette Eppendorf AG, Germany
Eye Bulb Holder L. Klein, Germany
Eye scissors Geuder AG, Germany
Folded Filter ø 185 mm Whatman, USA
Hockey knife Geuder AG, Germany
Laboratory Glass Bottle with cap 100 mL Schott AG, Germany
Magnetic stir bar Carl Roth GmbH & Co. KG, Germany
MillexGV Filter (5 µm) Merck Millopore Ltd., USA
Needler holder Geuder AG, Germany
Petri dishes VWR International, USA
Pipette tips Sarstedt AG & Co., Germany
Scalpel (single use), triangular blade Aesculap AG & Co. KG, Germany
Serological pipette 10 mL Sarstedt AG & Co., Germany
Serological pipette 5 mL Sarstedt AG & Co., Germany
Sterile cups Greiner Bio-One, Österreich
Sterile gloves Paul Hartmann AG, Germany
Sterile surgical drape Paul Hartmann AG, Germany
Stitch scissors Geuder AG, Germany
Suture Ethilon 10-0 Polyamid 6 Ethicon Inc., USA
Syringe (5 mL) Becton Dickinson, USA
trephine ø 7.5 mm own production
Tying forceps Geuder AG, Germany
Weighing paper neoLab Migge GmbH, Germany
Equipment & Software
Binocular surgical microscope Carl Zeiss AG, Germany
Camera mounted on microscope Olympus, Japan
CellSens Entry (software) Olympus, Japan
Cold-light source Schott AG, Germany
Incubator Heraeus GmbH, Germany
Inverted phase contrast microscope Olympus GmbH, Germany
Magnetic stirrer with heating function IKA-Werke GmbH & Co. KG, Germany
pH-meter pHenomenal VWR International, USA
Photoshop CS2 Adobe Systems, USA
Precision scale Ohaus Europe GmbH, Switzerland

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gain, P., et al. Global Survey of Corneal Transplantation and Eye Banking. JAMA Ophthalmology. 134, (2), 167-173 (2016).
  2. Roy, O., et al. Understanding the process of corneal endothelial morphological change in vitro. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56, (2), 1228-1237 (2015).
  3. Meltendorf, C., Ohrloff, C., Rieck, P., Schroeter, J. Endothelial cell density in porcine corneas after exposure to hypotonic solutions. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 245, (1), 143-147 (2007).
  4. Schroeter, J., Meltendorf, C., Ohrloff, C., Rieck, P. Influence of temporary hypothermia on corneal endothelial cell density during organ culture preservation. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 246, (3), 369-372 (2008).
  5. Schroeter, J., Ruggeri, A., Thieme, H. Impact of temporary hyperthermia on corneal endothelial cell survival during organ culture preservation. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 253, (5), 753-758 (2015).
  6. Kunzmann, B. C., et al. Establishment Of A Porcine Corneal Endothelial Organ Culture Model For Research Purposes. Cell and Tissue Banking. 19, (3), 269-276 (2018).
  7. Redbrake, C., et al. A histochemical study of the distribution of dextran 500 in human corneas during organ culture. Current Eye Research. 16, (5), 405-411 (1997).
  8. Zhao, M., et al. Poloxamines for Deswelling of Organ-Cultured Corneas. Ophthalmic Research. 48, (2), 124-133 (2012).
  9. Filev, F., et al. Semi-quantitative assessments of dextran toxicity on corneal endothelium: conceptual design of a predictive algorithm. Cell and Tissue Banking. 18, (1), 91-98 (2017).
  10. Pels, E., Schuchard, Y. Organ-culture preservation of human corneas. Documenta Ophthalmologica. 56, (1-2), 147-153 (1983).
  11. Borderie, V. M., Kantelip, B. M., Delbosc, B. Y., Oppermann, M. T., Laroche, L. Morphology, Histology and Ultrastructure of Human C31 Organ-Cultured Corneas. Cornea. 14, (3), 300-310 (1995).
  12. Linke, S. J., et al. Thirty years of cornea cultivation: long-term experience in a single eye bank. Acta Opthalmologica. 91, (6), 571-578 (2013).
  13. Schroeter, J., et al. Arbeitsrichtlinien - Gute Fachliche Praxis für Hornhautbanken [Procedural guidelines. Good tissue practice for cornea banks]. Ophthalmologe. 106, (3), 265-276 (2009).
  14. Dohlman, C. H., Hedbys, B. O., Mishima, S. The swelling pressure of the corneal stroma. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 1, 158-162 (1962).
  15. Xuan, M., et al. Proteins of the corneal stroma: importance in visual function. Cell and Tissue Research. 364, (1), 9-16 (2016).
  16. Sperling, S. Human Corneal Endothelium in Organ Culture - The Influence of Temperature and Medium of Incubation. Acta Opthalmologica. 57, (2), 269-276 (1979).
  17. Schroeter, J. Endothelial Evaluation in the Cornea Bank. Developments in Ophthalmology. 43, 47-62 (2009).
  18. Pels, E., Schuchard, Y. The Effects of High Molecular Weight dextran on the Presevation of Human Corneas. Cornea. 3, (3), 219-227 (1985).
  19. van der Want, H. J. L., Pels, E., Schuchard, Y., Olesen, B., Sperling, S. Electron Microscopy of Cultured Human Corneas Osmotic Hydration and the Use of dextran Fraction (dextran T 500) in Organ Culture. Archives of Ophthalmology. 101, (12), 1920-1926 (1983).
  20. Thuret, G., Manissolle, C., Campos-Guyotat, L., Guyotat, D., Gain, P. Animal compound-free medium and poloxamer for human corneal organ culture and Deswelling. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 46, (3), 816-822 (2005).
  21. Wenzel, D. A., Kunzmann, B. C., Spitzer, M. S., Schultheiss, M. Staining of endothelial cells does not change the result of cell density. Cell and Tissue Banking. 20, (2), 327-328 (2019).
  22. Wenzel, D. A., Kunzmann, B. C., Hellwinkel, O., Druchkiv, V., Spitzer, M. S., Schultheiss, M. Effects of perfluorobutylpentane (F4H5) on corneal endothelial cells. Current Eye Research. (2019).
  23. Olsson, I. A. S., Franco, N. H., Weary, D. M., Sandøe, P. The 3Rs principle - mind the ethical gap! ALTEX Proceedings, 1/12, Proceedings of WC8. 333-336 (2012).
  24. Sanchez, I., Martin, R., Ussa, F., Fernandez-Bueno, I. The parameters of the porcine eyeball. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 249, (4), 475-482 (2011).
  25. Kim, M. K., Hara, H. Current status of corneal xenotransplantation. International Journal of Surgery. 23, (Pt B), 255-260 (2015).
  26. Fujita, M., et al. Comparison of Proliferative Capacity of Genetically-Engineered Pig and Human. Ophthalmic Research. 49, (3), 127-138 (2013).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics