Un modello di cultura dell'organo endoteliale porcina utilizzando i pulsanti corneali divisi

Medicine

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Summary

Qui, viene presentato un protocollo passo-passo per la preparazione e la coltivazione di bottoni corneali divisi su porcini. Poiché questo modello di coltura organo-tipicamente coltivata mostra i tassi di mortalità cellulare entro 15 giorni, paragonabili alle cornee dei donatori umani, rappresenta il primo modello che consente la coltivazione a lungo termine di cornee non umane senza aggiungere dextran tossico.

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Wenzel, D. A., Kunzmann, B. C., Steinhorst, N. A., Spitzer, M. S., Schultheiss, M. A Porcine Corneal Endothelial Organ Culture Model Using Split Corneal Buttons. J. Vis. Exp. (152), e60171, doi:10.3791/60171 (2019).

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Abstract

La ricerca sperimentale sulle cellule endoteliali corneali è associata a diverse difficoltà. Le cornee dei donatori umani sono scarse e raramente disponibili per le indagini sperimentali, in quanto sono normalmente necessarie per il trapianto. Le colture di cellule endoteliali spesso non si traducono bene in situazioni in vivo. A causa delle caratteristiche biostrutturali delle cornee non umane, il gonfiore stromale durante la coltivazione induce una sostanziale perdita di cellule endoteliali corneali, che rende difficile eseguire la coltivazione per un lungo periodo di tempo. Gli agenti di deswelling come dextran vengono utilizzati per contrastare questa risposta. Tuttavia, causano anche una significativa perdita di cellule endoteliali. Pertanto, è stato istituito un modello di coltura di organi ex vivo che non richiede agenti di deswelling. Occhi di maiale da un macello locale sono stati utilizzati per preparare i pulsanti corneali divisi. Dopo una parziale trefinazione corneale, gli strati esterni della cornea (epitelio, strato di arco, parti dello stroma) sono stati rimossi. Questo riduce significativamente la perdita di cellule endoteliali indotte da un massiccio gonfiore stromale e dal ripiegamento della membrana di Descemet durante i periodi di coltivazione più lunghi e migliora la conservazione generale dello strato di cellule endoteliali. La successiva trefinazione corneale completa fu seguita dalla rimozione del pulsante corneale diviso dal bulbo oculare rimanente e dalla coltivazione. La densità delle cellule endoteliali è stata valutata nei periodi di follow-up fino a 15 giorni dopo la preparazione (cioè i giorni 1, 8, 15) utilizzando la microscopia leggera. La tecnica di preparazione utilizzata consente una migliore conservazione dello strato di cellule endoteliali, resa possibile da un rallentamento del tessuto stromale, che si traduce in tassi di declino lenti e lineari nei bottoni corneali divisi paragonabili alle cornee dei donatori umani. Poiché questo modello di ricerca standardizzato coltivato organo-tipicamente consente per la prima volta una coltivazione stabile per almeno due settimane, è una valida alternativa alle cornee dei donatori umani per future indagini su vari fattori esterni effetti sull'endotelio corneale.

Introduction

Le procedure di trapianto di cornea sono tra le trapianti più comunemente eseguite in tutto il mondo1. Poiché vi è una grave carenza di cornee dei donatori umani, la ricerca sperimentale che si occupa delle cellule endoteliali corneali nelle cornee umane è difficile da eseguire1. Tuttavia, l'introduzione di soluzioni di irrigazione e altre sostanze utilizzate all'interno dell'occhio, dispositivi viscolicici oftalmici, così come strumenti e tecniche chirurgiche (ad esempio, strumenti e tecniche di facoemulsificazione, energia ecografica) richiede valide ed estese indagini riguardanti i loro effetti sull'endotelio corneo prima dell'uso clinico.

Esistono poche alternative alle cornee dei donatori umani per la ricerca. I modelli di ricerca sugli animali sono molto preziosi, ma allo stesso tempo molto dispendiosi in termini di risorse e sempre più in discussione eticamente. Uno dei principali inconvenienti delle colture di cellule in vitro è la loro limitata traduzione all'occhio umano. I risultati ottenuti dalle colture cellulari possono essere incongrui in condizioni in vivo, perché le cellule possono subire una transizione mesenchymica endoteliale (EMT), con conseguente morfologia fibroblasta-come causata dalla perdita di polarità cellulare e cambiamenti nella forma cellulare e gene l'espressione2.

Mentre i precedenti modelli ex vivo riportavano periodi di coltivazione fino a 120 h, è stata recentementeintrodotta una nuova tecnica di preparazione per stabilire un modello di coltura endoteliale endoteliale del porcellino, coltiva cornee di maiale fresco per almeno 15 giorni ,4,5,6. Se l'epitelio corneale e parti dello stroma vengono rimossi (circa 300 m in totale) dalla cornea prima della coltivazione, il gonfiore dello stroma viene ridotto in pulsanti corneali divisi con conseguente perdita di cellule meno endoteliali e un endoteliale ben mantenuto strato mastrose dopo fino a 15 giorni, mentre i pulsanti corneali non divisi mostrano una significativa perdita di cellule endoteliali a causa di gonfiore stromale irregolare irregolare e formazione delle pieghe di Descemet. I banchi oculari di solito usano agenti di deswelling osmotici come dextran per ridurre il gonfiore delle cornee prima del trapianto. Tuttavia, questi agenti hanno dimostrato di indurre una maggiore perdita di cellule endoteliali7,8,9.

Questo articolo ha lo scopo di visualizzare questo modello di ricerca ex vivo standardizzato in un protocollo dettagliato passo-passo al fine di consentire ai futuri ricercatori di eseguire ricerche sull'endotelio cornealeutilizzando utilizzando pulsanti corneali divisi. Questo modello rappresenta un metodo semplice per testare le sostanze e le tecniche utilizzate all'interno dell'occhio, come i dispositivi viscolicici oftalmici, le soluzioni di irrigazione e l'energia ad ultrasuoni o altre procedure in cui l'endotelio corneale è di interesse.

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Protocol

Questo protocollo segue gli orientamenti etici della nostra istituzione. Conformemente agli statuti del comitato di revisione etica del nostro istituto non è stato necessario ottenere alcuna approvazione etica prima degli esperimenti, poiché tutte le cornee di suine sono state ottenute dal macello locale.

1. Cultura dell'organo

  1. Preparare gli occhi di maiale.
    1. Dal macello locale, ottenere gli occhi di maiale che sono stati rimossi poco dopo la morte ma prima del trattamento termico. Trasportare gli occhi al laboratorio ed elaborarli in poche ore. Durante il trasporto, tenere gli occhi a temperatura ambiente (circa 21 gradi centigradi) prima dell'elaborazione.
    2. Rimuovere tutti gli adnexe orbitali (muscoli oculari, congiuntiva, tessuto adiposo) prima della disinfezione utilizzando forbici oculari e pinze di conforto. Separare e scartare tutti gli occhi con traumi evidenti, danni esterni (ad esempio, taglio di coltello) o opacità corneale visibili.
    3. Preparare una soluzione 5% iodio-PBS (1:20) in una tazza sterile aggiungendo 3 mL di 7,5% di iodio povidone a 57 mL di una soluzione di salina con buffer fosfato (PBS). Preparare anche una tazza sterile separata contenente 60 mL di PBS puro.
      NOTA: la quantità totale di iodio-PBS usati e la dimensione della tazza dipende dal numero di cornee da sezionare. Da cinque a sei occhi richiedono circa 60 mL della soluzione 5-iodio-PBS per essere disinfettati correttamente.
    4. Mettete da cinque a sei occhi nella soluzione 5%-iodio-PBS per un totale di 5 minuti per disinfettare correttamente la superficie degli occhi. Mescolare con attenzione ogni minuto per garantire che la superficie degli occhi sia completamente sommersa e disinfettata completamente nella soluzione di iodio.
    5. Dopo 5 min, trasferire gli occhi disinfettati alla tazza preparata riempita con PBS puro. Ancora una volta, mescolare con attenzione per garantire che la soluzione di iodio-PBS venga lavata via dalla superficie degli occhi.
      NOTA: Eseguire questo passaggio su un banco pulito per evitare la contaminazione degli occhi disinfettati.
  2. Preparare piastre di coltura cellulare.
    NOTA: Eseguire i seguenti passaggi su una panca pulita con flusso d'aria laminare costante.
    1. Scongelare 2 mL di siero di vitello fetale (FCS). Riempire una siringa (5 mL) con l'FCS utilizzando una cannula smussata. Svuotare la siringa attraverso un filtro di siringa (0,22 m) per evitare la possibile contaminazione batterica dell'FCS in 80 mL di media io di coltura senza dextran (mezzo minimo essenziale [MEM] con sali di Earle, penicillina/streptomicina, L-glutamina [200 mM], amphotericin a B [250 g/mL], buffer di epes [1 M] [50x], NaHCO3e acqua distillata). Agitare la miscela per garantire anche la distribuzione del substrato.
    2. Riempire ogni pozzetto di una piastra di coltura a 12 cellule di pozzo con 3 mL della miscela di substrato.
  3. Eseguire la dissezione e l'incubazione.
    NOTA: Eseguire questo passaggio su un banco pulito. Non toccare l'endotelio corneale con strumenti.
    1. Trasferire una lampadina oculare dalla tazza con PBS nel supporto del bulbo oculare con la cornea rivolta verso l'alto e posizionarla sotto un microscopio chirurgico oftalmico. Utilizzare una siringa riempita con 0,9% NaCl per applicare leggermente un po 'di aspirazione all'occhio sopra il supporto del bulbo oculare per fissare l'occhio in posizione per la dissezione.
    2. Utilizzare una trefra (7,5 mm) contenente un intarsio standardizzato, che garantisce che la profondità trefalata non superi i 300 m, per tagliare superficialmente nella cornea centrale (Figura 1A).
    3. Utilizzare pinze colibri e un bisturi monouso con una lama triangolare per tagliare e rimuovere la parte parzialmente treficata della cornea orizzontalmente attraverso lo stroma. Scartare la parte corneale separata costituita dall'epitelio corneale, dallo strato di bowman e da una parte dello stroma.
      NOTA: Mantenere rigorosamente la direzione di taglio orizzontale per ottenere uno spessore uniforme dello stroma rimanente.
    4. Posizionare superficialmente una sutura 10-0 (10-0 poliamide 6) nello stroma per essere in grado di differenziare l'endoteliale dal lato strostro durante gli esperimenti (Figura 1B). Impedire la penetrazione dell'endotelio corneale. Scartare la lampadina oculare se l'endotelio è penetrato.
      NOTA: sarà visibile la penetrazione dell'endotelio corneo con l'ago di sutura, poiché il fluido proveniente dalla camera anteriore dell'occhio fuoriuscite attraverso il canale di sutura.
    5. Utilizzare il trephine senza intarsio per far avanzare il taglio trephined a piena profondità fino a raggiungere la camera anteriore dell'occhio (Figura 1C). Una goccia distinta di resistenza e perdita di liquido dalla camera degli occhi anteriore può essere percepita dopo la completa penetrazione della cornea.
      NOTA: Utilizzare un coltello da hockey se il pulsante corneale diviso rimane attaccato su un lato del pulsante corneale diviso dopo la trefrina.
    6. Trasferire il pulsante corneale diviso ottenuto, ora costituito da una parte dello stroma (Figura 2), la membrana del Descemet e l'endotelio corneale, nel mezzo di coltura (mezzo di coltura I - FCS, vedere la sezione 1.2) nella piastra di coltura a 12 cellule lato marcato rivolto verso il basso, in modo che l'endotelio corneo sia rivolto verso l'alto.
      NOTA: Se il lato endoteliale è rivolto verso il basso, l'endotelio potrebbe danneggiarsi.
    7. Assegnare un numero individuale a ogni pulsante corneale diviso per l'identificazione durante i follow-up ed etichettare i pozze sulla piastra di coltura cellulare di conseguenza.
    8. Incubare le placche riempite di coltura cellulare in un'incubatrice in condizioni standard a una temperatura di 37 gradi centigradi, il 5% di CO2 e un'umidità d'aria relativa del 95%. Cambiare il mezzo di coltura (media di coltura I e FCS) il giorno 8 se viene superato un periodo di incubazione di 7 giorni.
      NOTA: la procedura di incubazione con pulsanti corneali divisi è stata convalidata per un massimo di 15 giorni.

Figure 1
Figura 1: Dissezione della cornea porcina per ottenere pulsanti corneali divisi. (A) Dopo la trefrina della cornea con una trefrina con un intarsio per tagliare in una profondità di 300 m e la rimozione dell'epitelio e di parti del tessuto stromale, (B) una sutura viene posta superficialmente nello stroma senza penetrazione della cornea endotelio per l'identificazione successiva del lato strostro. (C) La trefinazione completa della cornea rimanente è seguita da (D) la rimozione del pulsante corneale diviso ottenuto dalla lampadina oculare. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

2. Microscopia ed esame dell'endotelio

  1. Eseguire un esame incontaminato.
    NOTA: L'esame non colorato può essere eseguito più volte (ad esempio, al follow-up settimanale del giorno 1, 8 e 15). Tuttavia, il conteggio non colorato consente solo la valutazione della densità delle cellule endoteliali, non dei parametri morfologici.
    1. Riempire 3 mL di soluzione di sale ipotonico bilanciato (hBSS, vedi composizione nella tabella dei materiali) in ogni pozzo di una piastra di coltura di 12 cellule. Posizionare con attenzione un singolo pulsante corneale diviso in hBSS per indurre il gonfiore delle cellule endoteliali corneali e migliorare la visibilità delle cellule per il conteggio cellulare.
      NOTA: Assicurarsi che il lato endoteliale sia rivolto verso la direzione del microscopio. Se si utilizza un microscopio a contrasto di fase invertito, il lato endoteliale deve essere rivolto verso il basso. Mentre è sul posto, la piastra di coltura non deve essere spostata per prevenire danni alle cellule endoteliali.
    2. Lasciare che le cellule si gonfino per 1-2 min prima di scattare una foto dell'endotelio con la fotocamera collegata al microscopio. Scattare almeno tre fotografie di almeno tre aree diverse per ottenere un'impressione rappresentativa delle condizioni effettive dell'endotelio corneale. Aggiungere una barra della scala con la lunghezza a misura reale di 100 m per un'analisi successiva della densità delle cellule endoteliali e dei parametri morfologici.
    3. Per evitare danni osmotici, rimuovere il pulsante corneale diviso dall'hBSS dopo un massimo di 5 min e trasferirlo di nuovo nel mezzo di coltura3.
  2. Eseguire l'esame macchiato.
    NOTA: la colorazione termina gli esperimenti, poiché le sostanze coloranti utilizzate sono citossiche. Pertanto, la colorazione può essere eseguita solo alla fine del periodo di osservazione per la valutazione dei parametri morfologici (figure di riforma, formazioni di rosetta, cellule colorate rosse di alizarin).
    1. Preparare una soluzione blu trypan dello 0,25% e 0,2% alizarin rosso S soluzione per la procedura di colorazione.
      1. Per la soluzione trypan blue dello 0,25%, diluire la soluzione blu trypan 0.4% con una soluzione NaCl 0.9%.
        NOTA: Ad esempio, per ottenere 20 mL di una soluzione blu trypan dello 0,25%, diluire 12,5 mL della soluzione blu trypan 0,4% con 7,5 mL della soluzione NaCl 0,9%. La soluzione blu trypan può essere conservata a temperatura ambiente per diverse settimane o mesi.
      2. Per ottenere uno 0,2% alizarin soluzione rosso S dissolvere 100 mg della polvere di alizarin rosso S in 50 mL di una soluzione 0.9% NaCl in costante agitazione e riscaldamento a 50 gradi centigradi su una piastra di mescolando magnete con funzione di riscaldamento. Per rimuovere eventuali precipitati, filtrare la soluzione ottenuta. Regolare il pH della soluzione S rossa di alizarin a pH 4.2 aggiungendo di conseguenza l'idrossido di sodio o l'acido cloridrico.
        NOTA: Prima di ogni applicazione della soluzione alizarin red S assicurarsi che il pH sia corretto a 4.2 e che non vi siano precipitamenti nella soluzione. La soluzione può essere conservata a temperatura ambiente. Non conservare la soluzione per più di 4 settimane.
    2. Posizionare i pulsanti corneali divisi nei piatti Petri con il lato endoteliale rivolto verso l'alto per macchiare le cellule endoteliali. Utilizzare una pipetta per gocciolare lentamente la soluzione blu trypan 0.25% goccia a goccia sull'endotelio corneale per 90 s.
      NOTA: Trypan blu consente l'identificazione di cellule corneali danneggiate con una membrana permeabile perché macchia i loro nuclei.
    3. Sciacquare con attenzione il pulsante corneale diviso 3x in 0.9% NaCl in un piccolo bicchiere di vetro. Ancora una volta, utilizzare una pipetta per gocciolare lentamente la soluzione 0.2% alizarin rosso S goccia per goccia sull'endotelio corneale per 90 s.
      NOTA: Alizarin rosso S macchia la membrana del Descemet, che aiuta a evidenziare i bordi delle cellule in cellule endoteliali corneali intatte e a evidenziare le cellule distrutte quando la membrana del Descemet sottostante diventa visibile. Inoltre, consente una facile identificazione di aree distrutte più grandi.
    4. Per l'esame dell'endotelio corneo colorato seguire i passaggi spiegati per il conteggio incontaminato nella sezione 2.1.

3. Analisi della densità delle cellule endoteliali e dei parametri morfologici

  1. Conteggio dei progetti dei quadrati sulle immagini utilizzando un software di editing grafico (Tabella dei materiali).
    1. Aprire il software e aprire un'immagine dell'endotelio corneale selezionando File Proprietà Open . Selezionare.
    2. Proiettare un quadrato con una lunghezza laterale in scala fedele di 100 m sull'immagine.
      NOTA: I seguenti passaggi della sezione 3.1.2 possono essere ignorati se il software di visualizzazione consente la proiezione del conteggio dei quadrati sull'immagine. La lunghezza laterale del quadrato dipende dalla risoluzione delle immagini scattate con la fotocamera del microscopio e può essere calcolata con la barra della scala.
      1. Ritagliare la barra della scala dalla fotografia scattata con il microscopio: selezionare lo strumento Selezione rettangolare sulla barra degli strumenti o premere M, quindi delimitare la barra della scala, quindi selezionare Modifica Ritagliare o premere Ctrl e X.
      2. Fare clic su File . Nuovo (oppure premere Ctrl e N). Nella finestra imminente selezionare Appunti nell'elenco a discesa Tipo di documento. Il numero di pixel visualizzati è la lunghezza laterale del quadrato di conteggio. Notare i pixel corrispondenti per le altre immagini e fare clic su OK.
      3. Selezionare il file Nuovo (oppure CTRL e N). Inserire la larghezza e la lunghezza (in pixel) del quadrato di conteggio nella finestra successiva in base alla lunghezza della barra della scala. Selezionare il colore di sfondo Bianco, quindi premere OK.
      4. Fare clic su Seleziona . Seleziona tutto (oppure Ctrl e A). Selezionare Modifica . Copia (oppure CTRL e C).
      5. Selezionare l'immagine dell'endotelio corneale aperto al punto 3.1.1. Selezionare Modifica . Incolla (oppure Ctrl e V) per inserire il quadrato sulla foto dell'endotelio corneale.
      6. Selezionare il livello del quadrato e regolare la trasparenza. Selezione del layer Stile di livello : Opzioni di fusione - Impostare Opacità su 30% OK.
      7. Salvare l'immagine con il quadrato proiettato con una lunghezza laterale in scala uniforme di 100 m. Ripetere con le altre immagini necessarie per l'analisi.
  2. Valutare la densità delle cellule endoteliali e i parametri morfologici.
    1. Aprire le immagini con i quadrati proiettati in ImageJ (versione 1.50i) e utilizzare CellCounter PlugIn per contare le celle all'interno del quadrato. Apri ImageJ, seleziona File Apertura (oppure CTRL e O) Selezionare Immagine.
      NOTA: ImageJ e CellCounter PlugIn sono freeware disponibili per il download online.
    2. Selezionare Plugins Proprietà Cell_Counter . Contatore di celle Inizializzare. Contare le cellule endoteliali e registrare il risultato. Su due lati del quadrato, contare le celle tagliate dal bordo del quadrato. Non contare le celle tagliate sugli altri due lati.
    3. Analizzare almeno sei quadrati per cornea da aree diverse (ad esempio, tre immagini, due quadrati per immagine) e determinare la densità media delle cellule endoteliali corneali per quadrato (100 m2). Estrapolare la densità delle cellule endoteliali per 100 mda 2 a 1 mm2 moltiplicando per 100.
  3. Per la valutazione dei cambiamenti morfologici, contare le cifre di riforma (riunione congiunta di cellule n. 4/confini cellulari invece di tre), formazioni di rosetta (aspetto caratteristico a forma di rosetta, cinque o più cellule disposte radialmente che circondano una cellula distrutta ), o aree rosse di alizarin (cellule distrutte) nei quadrati proiettati.
    NOTA: In alternativa, può essere utile utilizzare quadrati più grandi (ad esempio, 200 x 200 m2)per l'analisi morfologica in campioni ben conservati per ottenere risultati più rappresentativi.

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Representative Results

La tecnica di dissezione presentata implica la rimozione parziale del tessuto stromale, con conseguente un campione di cornea più sottile e quindi un gonfiore meno stromale (Figura 1 e Figura 2). Il gonfiore meno stromale induce meno forze di taglio e pizzico che hanno un impatto negativo sull'endotelio corneale, causando così una minore perdita di cellule endoteliali6. I pulsanti corneali divisi mostrano uno strato di cellule endoteliali significativamente meglio conservato dopo 15 giorni di coltivazione rispetto ai pulsanti corneali non divisi e ai campioni corneoscleri interi, che riflette una perdita di cellule meno endoteliali e un numero inferiore di reformazione figure (z 4 cellule/bordi cellulari congiunti invece di tre), formazioni di rosetta (cinque o più cellule disposte radialmente che si incontrano in un unico punto) e cellule rosse (distrutte) di alizarin dopo 15 giornie 6.

Per un periodo di 15 giorni, i pulsanti corneali divisi mostrano un costante declino della densità delle cellule endoteliali con una perdita media settimanale di cellule endoteliali del 4,90% (n - 40, Figura 3). A partire dal primo giorno con una densità di cellule endoteliali di 4.033 x 146/163 cellule/mm2 (mediana - 25%/75% quartili), la densità delle cellule è diminuita a 3.850 x 167/233 cellule/mm2 il giorno 8 e 3,650 x 200 cellule/mm2 il giorno 15. Le perdite cellulari determinate sono state simili per la prima e la seconda settimana. Nei giorni 1-8, 4,00 x 2,17/1,93% (mediana - 25%/75% quartili); giorni 8-15, 4,88 : 5,52/4,42%; giorni 1/15, 8,64 : 4,32/2,71%). Pertanto, il tasso di declino dato è simile al tasso riportato nelle cornee dei donatori umani durante la coltivazione in studi precedenti10,11,12.

I parametri morfologici sono stati valutati dopo la colorazione dello strato endoteliale il giorno 15 (n : 28, Figura 4). I dati della riforma si compivano di 7,18 x 2,36/2,90% (mediana - 25%/75% quartili) dei bordi cellulari che si fondono. Nei campioni esaminati erano presenti una mediana di 1,11 x 1,11/15,56 formazioni di rosette/mm2 (quartili mediana - 25%/75%) marcata per le cellule puntuali.

Figura 5 fornisce immagini rappresentative dell'endotelio corneale durante la valutazione microscopica in hBSS (Figura 5A) e dopo la colorazione con trypan blu e alizarin rosso S (Figura 5B). La valutazione della densità delle cellule endoteliali in hBSS può essere eseguita più volte (ad esempio, nei giorni 1, 8 e 15), mentre i campioni macchiati possono essere utilizzati per la valutazione dei parametri morfologici (figure di riforma, rosette, macchie rosse di alizarina cellule) o determinazione della densità delle cellule endoteliali alla fine degli esperimenti a causa delle proprietà citotossiche della maggior parte delle sostanze coloranti.

Se i pulsanti corneali divisi sono posizionati e coltivati con il lato endoteliale rivolto verso il basso per caso, è prevedibile un ingenti danno alle cellule endoteliali (Figura 6A). I pulsanti corneali non divisi subiscono una perdita di cellule endoteliali notevolmente aumentata a causa del gonfiore stromale, causando la piegatura della membrana di Descemet in 15 giorni di coltivazione (Figura 6B), mentre i pulsanti corneali divisi mostrano un endotelio corneo dopo 15 giorni di coltivazione, indicato da aree sparse puntuali alizarin macchiate rosso che indica singole cellule distrutte (Figura 6C).

Figure 2
Figura 2: Illustrazione schematica dei pulsanti corneali non divisi e dei pulsanti corneali divisi. Dopo la rimozione di 300 m della cornea porcina, tra cui l'epitelio e le parti principali del tessuto stromale, lo spessore dei pulsanti corneali divisi è ridotto a favore di una migliore conservazione dell'endotelio corneale dovuto alla diminuzione del gonfiore stromale in tutto coltivazione fino a 15 giorni. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Densità delle cellule endoteliali (ECD) di pulsanti corneali divisi in 15 giorni. I pulsanti corneali divisi (n - 40) hanno mostrato un declino costante. ECD il giorno 1, 4.033 - 146/163 cellule/mm2 (mediana - 25%/75% quartili); giorno 8, 3,850 x 167/233 celle/mm2; giorno 15, 3.650 x 200/233 cellule/mm2. I dati sono rappresentati come quartili mediani - 25%/75%, i baffi rappresentano almeno e massimo o 1,5 dell'intervallo interquartile (IQR). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: Parametri morfologici per ulteriori valutazioni dei danni alle cellule e processi di riarrangiamento. Fotografie microscopiche dell'endotelio corneale nell'ingrandimento 400x dopo 15 giorni di coltivazione e colorazione con trypan blu e alizarin rosso S mostrando (A) figure di riforma (frecce, riunione congiunta di quattro o più bordi cellulari / cellule invece di (B) formazioni di rosetta (cerchio punteggiato, cellula centrale in diminuzione con formazioni di rosetta caratteristiche di cinque o più celle adiacenti) e (C) cellule macchiate rosse di alizarin (cerchi tratteggiati, cellule distrutte). I dati (n - 28) sono raffigurati come mediani - 25%/75% quartili. I baffi rappresentano il minimo e il massimo o 1,5 dell'intervallo interquartile (IQR). I cerchi rappresentano outlier non all'interno dell'IQR. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
Figura 5: Endotelio corneo non macchiato e macchiato. Lo strato di cellule endoteliali visto durante la valutazione microscopica (400x ingrandimento) in (A) soluzione ipotonica di sale equilibrato (hBSS) causando gonfiore delle cellule endoteliali e quindi una migliore visibilità cellulare e (B) dopo la colorazione con trypan blu e alizarin rosso S. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figure 6
Figura 6: Panoramica delle fotografie dell'endotelio corneale di (A) di un pulsante corneale diviso coltivato a testa in giù, (B) un pulsante corneale non diviso e (C) un pulsante corneale diviso dopo la colorazione. Le fotografie mostrano l'endotelio corneale dopo la colorazione con il blu trypan e alizarin rosso S. (A) Esteso danno endoteliale (area rossa) è osservato dopo split corneal buttons isivated con il lato endoteliale rivolto verso il basso dopo uno settimana di coltivazione. (B) Aumento significativo dei danni alle cellule endoteliali nei bottoni corneali non divisi a causa del ripiegamento della membrana di Descemet e del gonfiore stromale dopo 15 giorni di coltivazione (striature rosse). (C) I pulsanti corneali divisi mostrano uno strato di cellule endoteliali ben conservato dopo 15 giorni di coltivazione che mostra solo cellule puntuali distrutte osservate nelle aree macchiate rosse di alizarin. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Questo protocollo fornisce un metodo per la preparazione di pulsanti corneali divisi su vitello, che rappresenta un modello standardizzato e a basso costo di coltura endoteliale endoteliale per scopi di ricerca6. I bottoni corneali porcini divisi hanno mostrato una diminuzione della densità delle cellule endoteliali paragonabile alle perdite di cellule endoteliali osservate nelle cornee dei donatori umani coltivate nelle banche oculari per un periodo di due settimane6,10,11, 12.

La superiorità sui pulsanti corneali non divisi e su campioni integrali di corneoscleral sui porcini è stata mostrata in precedenza6. In tale studio, tre gruppi sono stati confrontati nei giorni 1, 8 e 15. L'endotelio corneale di tutti i gruppi (pulsanti corneoscleali, bottoni corneali non divisi, pulsanti corneali divisi) era in buone condizioni il giorno 1, rappresentato da uno strato di cellule endoteliali ben conservato6. Tuttavia, a causa del gonfiore stromale, il ripiegamento della membrana del Descemet distrusse ampie aree dell'endotelio di campioni integrali di corneoscleral, in modo che non fosse possibile eseguire una valutazione rappresentativa della densità delle cellule endoteliali corneali nei giorni 8 e 15. Anche se l'endotelio dei bottoni corneali non divisi era ben conservato fino al giorno 15, erano presenti anche alcune pieghe di membrana di Descemet. Anche se rispetto ai campioni corneoscleali lo strato di cellule endoteliali di bottoni corneali non divisi era in condizioni migliori, lo strato di cellule endoteliali dei pulsanti corneali divisi era in condizioni di gran lunga migliori. Questo può essere visto nei parametri quantitativi e qualitativi, come la perdita di cellule endoteliali entro 15 giorni dalla coltivazione è stata significativamente superiore (p - 0,041) in pulsanti corneali non divisi (-575 25/250 celle / mm2) rispetto ai pulsanti corneali divisi (-417 138/179 cellule/mm2), che è congruente alle caratteristiche morfologiche determinate evidenti in un modello di cellule esagonali più regolari, meno figure di riforma e formazioni di rosetta, nonché meno cellule distrutte (aree rosse di alizarin) in split pulsanti corneali6. Le perdite percentali delle cellule endoteliali confermano questi risultati, poiché la perdita di cellule percentuali entro 15 giorni nei pulsanti corneali non divisi e divisi è rispettivamente del 14,89% e del 10,2% (p - 0,032)rispettivamente 6. Poiché questo metodo è stato convalidato per un periodo fino a 15 giorni, consente periodi di osservazione più lunghi rispetto agli studi pubblicati finora (72 a 120 h)3,4,5.

I miglioramenti nella conservazione dello strato di cellule endoteliali, applicando protocolli di coltivazione comuni utilizzati anche nelle banche degli occhi, possono essere attribuiti esclusivamente al ridotto gonfiore dello stroma corneale, dal momento che una parte maggiore (300 m) dello stroma viene rimossa prima coltivazione6,13. Normalmente lo stroma tende a gonfiarsi enormemente durante la coltivazione a causa delle sue proprietà idrofile e molecole incorporate all'interno del tessuto stromale14,15. Il gonfiore, che induce le forze di taglio e pizzicamento e il ripiegamento della membrana di Descemet, che provoca anche tensione meccanica sull'endotelio corneale e la perdita di cellule endoteliali, vengono ridotti dopo la rimozione parziale dello stroma6,10. Al contrario delle banche oculari, che spesso utilizzano agenti osmotici come dextran per deswell cornee e donatrici umane prima del trapianto, i pulsanti corneali divisi non richiedono dwelling osmotico16,17. Come mezzo di coltura integrato con dextran è noto per essere assorbito dalle cellule endoteliali corneali e per indurre una maggiore perdita di cellule7,8,9,18,19 ,20, la coltivazione di pulsanti corneali divisi senza dextran (o altri agenti osmotici) elimina il maggior numero possibile di fattori tossici negativi6. Poiché il mezzo di coltura non è integrato con alcun additivo nel metodo presentato, non sono previste influenze tossiche causate da sostanze aggiunte, il che rende questo modello prezioso per le indagini sui test di biocompatibilità di nuove sostanze.

Anche se l'endotelio corneo è uno strato cellulare molto delicato e la preparazione di pulsanti corneali divisi richiede abilità chirurgiche moderate e una manipolazione delicata, questa tecnica può essere un metodo standardizzato per lavorare e ottenere risultati affidabili per quanto riguarda il effetti di vari fattori sull'endotelio corneale entro un lasso di tempo molto ragionevole. Ciò nonostante, ci sono pochi passi in questo protocollo in cui l'endotelio corneale è a rischio. Ovviamente gli occhi danneggiati o opachi devono essere accuratamente identificati e scartati all'inizio per evitare possibili distorsioni. Inoltre, l'endotelio corneo deve sempre essere lasciato intatto durante la trefinazione, la dissezione, l'estrazione e la manipolazione (ad esempio, il trasferimento da un occhio all'altro, dalla piastra di coltura alla piastra di coltura, ecc.) di pulsanti corneali divisi al fine di evitare qualsiasi danni meccanici. Quando si posiziona la sutura superficialmente nello stroma, l'endotelio può potenzialmente essere penetrato se l'ago viene accidentalmente inserito troppo in profondità. In tal caso, il liquido evidente dalla camera oculare anteriore passerà attraverso il canale di sutura e l'occhio corrispondente deve essere scartato. Per evitare questo, l'ago deve essere tenuto superficialmente all'interno dello stroma. Inoltre, occorre fare attenzione a dividere rigorosamente il pulsante corneale orizzontalmente utilizzando il bisturi. Il taglio irregolare si tradurrà in gonfiore irregolare durante la coltivazione, causando probabilmente una maggiore perdita di cellule endoteliali.

L'esame delle cellule endoteliali corneali non macchiate in hBSS è comunemente eseguito in cornee donatori umani. Non ci sono prove di danni cellulari significativi causati dal gonfiore osmotico delle cellule endoteliali per il tempo di esame scelto dei pulsanti corneali divisi in hBSS3. Sebbene la colorazione migliori la visibilità dei bordi delle cellule, il conteggio non macchiato non produce risultati significativamente diversi della densità delle cellule endoteliali rispetto al conteggio colorato21. Il chiaro vantaggio del conteggio incontaminato è che consente più esami di follow-up nel corso degli esperimenti, mentre le sostanze coloranti sono di solito citotossiche e terminano il periodo di osservazione. Il conteggio delle macchie, tuttavia, rimane importante per valutare le caratteristiche morfologiche dell'endotelio. Il blu Trypan evidenzia i nuclei delle cellule danneggiate che spesso sembrano intatte nel conteggio incontaminato. Alizarin rosso S migliora chiaramente la visibilità dei bordi delle cellule e delle cellule danneggiate macchiando la membrana del Descemet, che facilita la valutazione della densità delle cellule endoteliali e consente l'analisi delle caratteristiche morfologiche dell'endotelio corneale , come le figure di riforma, le formazioni di rosetta e le cellule colorate rosse di alizarin (Figura 4).

Una delle principali limitazioni dei pulsanti corneali divisi come modello ex vivo è che, proprio come i modelli in vitro, sono adatti solo per studiare le influenze esterne sulle cellule endoteliali corneali. Pertanto, i modelli in vivo sono insostituibili per la ricerca sulle malattie sistemiche e le condizioni con un impatto sull'occhio e sull'endotelio corneale. Indipendentemente da ciò, questa tecnica di preparazione può generare dati validi per testare gli effetti di vari fattori esterni sull'endotelio corneale (ad esempio, nei test di biocompatibilità di nuove sostanze)22. Seguendo il principio 3R (sostituzione, riduzione, perfezionamento) per ridurre il numero di esperimenti su animali vivi, questo metodo fornisce un modello di ricerca adeguato per colmare ulteriormente il divario tra le colture in vitro cellule, dove i risultati sono spesso incongrui nei confronti situazione vivo nell'uomo, e la ricerca animale, che richiede sforzi sostanziali e solleva sempre più preoccupazioni etiche23.

A causa delle loro proprietà e disponibilità, gli occhi di maiale sembrano essere l'unico sostituto adeguato per gli occhi umani per scopi di ricerca. Le cornee provenienti da primati non umani non sono una buona alternativa a causa di ragioni etiche e disponibilità, anche se questi animali sono le specie più vicine agli esseri umani. D'altra parte, gli occhi degli animali più piccoli sono semplicemente troppo piccoli per consentire una rimozione efficiente della cornea. Gli occhi di maiale sono paragonabili agli occhi umani in termini di dimensioni e mostrano proprietà simili delle cellule endoteliali corneali, che si riflettono anche nella ricerca che si occupa di possibile futuro xenotrapianto di cornee di porcina geneticamente modificate24, 25,26. Inoltre, essendo un sottoprodotto dei mattatoi, sono facili da ottenere.

In conclusione, il metodo presentato utilizzando cornea porcine offre un modello di ricerca organo-tipicamente riproducibile altamente riproducibile che consente una ricerca efficiente in termini di costi sulle cellule endoteliali corneali. I futuri ricercatori possono utilizzare pulsanti corneali divisi per analizzare gli effetti di vari fattori come nuove sostanze, tecniche chirurgiche, attrezzature e altre possibili influenze esterne in cui l'endotelio corneale è di grande interesse.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgments

L'istituzione del modello di ricerca presentato è stata sostenuta da KMU-innovativ (13GW0037F) del Ministero federale dell'istruzione e della ricerca Germania.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Subject
Pig eyes local abbatoir
Substances
Alizarin red S Sigma-Aldrich, USA
Culture Medium 1, #F9016 Biochrom GmbH, Germany
Dulbecco's PBS (1x) Gibco, USA
Fetal calf serum Biochrom GmbH, Germany
Hydrochloric acid (HCl) solution own production
Hypotonic balanced salt solution own production per 1 L of H2O: NaCl 4.9 g; KCl 0.75 g; CaCl x H2O 0.49 g; MgCl2 x H2O 0.3 g; Sodium Acetate x 3 H2O 3.9 g; Sodium Citrate x 2 H2O 1.7 g
Povidon iodine 7.5%, Braunol B. Braun Melsungen AG, Germany
Sodium chloride (NaCl) 0.9% B. Braun Melsungen AG, Germany
Sodium hydroxide (NaOH) solution own production
Trypan blue 0.4% Sigma-Aldrich, USA
Materials & Instruments
Accu-jet pro Brand GmbH, Germany
Beaker Glass 50 mL Schott AG, Germany
Blunt cannula incl. Filter (5 µm) 18G Becton Dickinson, USA
Cell culture plate (12 well) Corning Inc., USA
Colibri forceps Geuder AG, Germany
Corneal scissors Geuder AG, Germany
Eppendorf pipette Eppendorf AG, Germany
Eye Bulb Holder L. Klein, Germany
Eye scissors Geuder AG, Germany
Folded Filter ø 185 mm Whatman, USA
Hockey knife Geuder AG, Germany
Laboratory Glass Bottle with cap 100 mL Schott AG, Germany
Magnetic stir bar Carl Roth GmbH & Co. KG, Germany
MillexGV Filter (5 µm) Merck Millopore Ltd., USA
Needler holder Geuder AG, Germany
Petri dishes VWR International, USA
Pipette tips Sarstedt AG & Co., Germany
Scalpel (single use), triangular blade Aesculap AG & Co. KG, Germany
Serological pipette 10 mL Sarstedt AG & Co., Germany
Serological pipette 5 mL Sarstedt AG & Co., Germany
Sterile cups Greiner Bio-One, Österreich
Sterile gloves Paul Hartmann AG, Germany
Sterile surgical drape Paul Hartmann AG, Germany
Stitch scissors Geuder AG, Germany
Suture Ethilon 10-0 Polyamid 6 Ethicon Inc., USA
Syringe (5 mL) Becton Dickinson, USA
trephine ø 7.5 mm own production
Tying forceps Geuder AG, Germany
Weighing paper neoLab Migge GmbH, Germany
Equipment & Software
Binocular surgical microscope Carl Zeiss AG, Germany
Camera mounted on microscope Olympus, Japan
CellSens Entry (software) Olympus, Japan
Cold-light source Schott AG, Germany
Incubator Heraeus GmbH, Germany
Inverted phase contrast microscope Olympus GmbH, Germany
Magnetic stirrer with heating function IKA-Werke GmbH & Co. KG, Germany
pH-meter pHenomenal VWR International, USA
Photoshop CS2 Adobe Systems, USA
Precision scale Ohaus Europe GmbH, Switzerland

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References

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