Um método de montagem em camadas para a microscopia confocal de lapso de tempo prolongado de embriões zebrafish inteiros

Developmental Biology

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Summary

Este artigo descreve um método para montar embriões frágeis do zebrafish para a microscopia confocal prolongada do tempo-lapso. Este método de baixo custo é fácil de executar usando pratos regulares de microscopia com fundo de vidro para imagens em qualquer microscópio invertido. A montagem é realizada em camadas de agarose em diferentes concentrações.

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Upadhyay, S., Vergara, L., Shah, P., Gustafsson, J. Å., Kakadiaris, I., Bondesson, M. A Layered Mounting Method for Extended Time-Lapse Confocal Microscopy of Whole Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (155), e60321, doi:10.3791/60321 (2020).

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Abstract

A dinâmica do desenvolvimento pode ser seguida pela microscopia confocal do time-lapse de embriões transgênicos vivos do zebrafish que expressam a fluorescência em tecidos ou em pilhas específicos. Uma dificuldade com o desenvolvimento de embriões inteiros da imagem latente é que os embriões do zebrafish crescem substancialmente no comprimento. Quando montada como feito regularmente em 0,3-1% de baixa agarose de raço, a agarose impõe restrição de crescimento, levando a distorções no corpo de embriões moles. No entanto, para realizar microscopia confocal time-lapse, o embrião deve ser imobilizado. Este artigo descreve um método de montagem em camadas para embriões de zebrafish que restringem a motilidade dos embriões, permitindo o crescimento irrestrito. A montagem é realizada em camadas de agarose em diferentes concentrações. Para demonstrar a usabilidade deste método, o desenvolvimento vascular, neuronal e do músculo inteiro do embrião foi imaged em peixes transgémicos por 55 horas consecutivas. Este método de montagem pode ser usado para imagens fáceis e de baixo custo de embriões inteiros de zebrafish usando microscópios invertidos sem requisitos de moldes ou equipamentos especiais.

Introduction

O zebrafish tem sido um organismo modelo para a biologia do desenvolvimento, e a microscopia é o método principal para visualizar o desenvolvimento embrionário. As vantagens do uso de embriões de zebrafish para estudos de desenvolvimento incluem pequeno tamanho, clareza óptica, desenvolvimento rápido e alta fecundidade dos peixes adultos. A geração de linhas transgênicas de zebrafish expressando fluorescência em certos tecidos ou células permitiu uma visualização direta do desenvolvimento de tecidos de maneiras não possíveis com animais vertebrados maiores. Em combinação com a microscopia de lapso de tempo, detalhes e dinâmicas do desenvolvimento do tecido podem ser prontamente estudados.

Uma dificuldade com o desenvolvimento do zebrafish da imagem latente é que os embriões crescem substancialmente no comprimento; o embrião estende seu comprimento quatro vezes nos primeiros 3 dias de vida1. Além disso, o corpo do embrião precoce é macio e facilmente se torna distorcido se o crescimento for restrito. No entanto, para realizar microscopia confocal, o embrião deve ser imobilizado. Para manter os embriões em posição fixa para imagens confocais de lapso de tempo, eles são regularmente anestesiados e montados em 0,3-1% de baixa fusão agarose. Isto tem a vantagem de permitir algum crescimento durante a imagem latente por um determinado período de tempo, ao restringir movimentos do embrião. Partes do embrião podem ser imagemdas de forma eficiente assim. No entanto, ao utilizar este método de imagem de todo o embrião por longos períodos de tempo, as distorções são observadas devido ao crescimento restrito causado pela agarose. Assim, outros métodos de montagem são necessários. Kaufmann e seus colegas descreveram uma montagem alternativa de embriões de zebrafish para microscopia de folha de luz, como microscopia seletiva de iluminação plana (SPIM), montando os embriões em tubos de etileno fluorado (FEP) contendo baixas concentrações de agarose ou metilcelulose2. Esta técnica produz uma visualização soberba de embriogênese ao longo do tempo. Schmid et al. descrevem a montagem de até seis embriões em agarose em tubos feb para microscopia de folha de luz3 fornecendo visualização de vários embriões em uma sessão de imagem. Os moldes foram usados para criar disposições do embrião para a montagem eficiente de um número maior de embriões4. Masselkink et al. construíram moldes plásticos impressos em 3D que podem ser usados para fazer moldes de silício em que embriões de zebrafish em diferentes estágios podem ser colocados, permitindo a montagem em uma posição constante para imagens, incluindo imagens confocais5. Impressão 3D também tem sido usada para fazer moldes para o posicionamento consistente de embriões zebrafish em 96 bem formato6. Alguns moldes são personalizados para determinadas fases e não podem permitir o crescimento irrestrito por longos períodos de tempo, enquanto outros moldes são mais flexíveis. Recentemente, Weijts et al. publicou o projeto e fabricação de um prato de quatro poços para imagens ao vivo de embriões zebrafish7. Neste prato, a cauda e o tronco de embriões de peixeanestesiados são colocados manualmente um telhado de silicone claro ligado logo acima de um copo de cobertura para formar um bolso. O embrião é então fixado nesta posição pela adição de 0,4% agarose. Esta montagem permite a imagem latente da parte posterior de aproximadamente 2 milímetros de comprimento (tronco e cauda) do embrião, e como até 12 embriões podem ser montados por poço, o método permite a imagem latente de amostras múltiplas. Da mesma forma, Hirsinger e Steventon apresentaram recentemente um método onde a cabeça do peixe é montada em agarose, enquanto a cauda pode crescer livremente, e este método também facilita eficientemente a imagem do tronco e da região da cauda do embrião8.

Este artigo descreve um método de montagem em camadas para embriões de zebrafish que restringem os movimentos dos embriões, permitindo um crescimento irrestrito. As vantagens deste método de montagem são que é um método de baixo custo, rápido e fácil de montar embriões de várias fases para imagens usando qualquer microscópio invertido. A montagem permite a imagem latente a longo prazo do corpo inteiro (cabeça, tronco e cauda) durante o desenvolvimento do embrião. Para mostrar a usabilidade deste método, o desenvolvimento vascular, neuronal e do músculo inteiro do embrião foi imaged em peixes transgénicas. Dois embriões por sessão, em dois comprimentos de onda em 3D foram imageados pela microscopia do time-lapse por 55 horas consecutivas para render filmes do desenvolvimento do tecido.

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Protocol

O trabalho animal apresentado aqui foi aprovado pelos Comitês Institucionais de Cuidados e Uso de Animais (IACUCs) da Universidade de Houston e da Universidade de Indiana.

1. Criação de peixes

NOTA: O trabalho com modelos de vertebrados requer um protocolo aprovado pela IACUC. Deve ser conduzida de acordo com as diretrizes nacionais e internacionais relevantes.

  1. Manter zebrafish adulto, como descrito na literatura publicada anteriormente9.
  2. À tarde, coloque zebrafish adulto em tanques de reprodução. Raça machos para fêmeas em uma proporção de 1:2.

2. Preparação de soluções

  1. Faça uma solução de estoque de 1% de baixa agarose de derretimento em mídia embrionária (E3: 5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl2, 0,33 mM MgSO4, ajustado ao pH 7.0). Aliquot a solução de ações em tubos de 1,5 mL e armazená-los em 4 °C.
  2. Faça uma solução de estoque de 4% (w/v) Tricaine (MS-222) em água destilada. Guarde a 4 °C em uma garrafa escura.
    CUIDADO: Tricaine é tóxico e deve ser pesado e dissolvido em um capô de fumaça.
  3. Faça uma solução de estoque de 20 mM N-fenilthiourea (PTU) em água destilada. Armazenar a -20 °C.

3. Preparação de embriões

  1. Após o acasalamento, colher embriões em E3 em uma placa de Petri e incubar-los em 26,5 ° C por cerca de 28 h antes da montagem.
    NOTA: Isso retarda o desenvolvimento dos embriões para que os embriões estejam aproximadamente em 30 estágios semolo no início da imagem.
  2. Embriões de anestesia em 0,016-0,020% Tricaine na E3. Para inibir a pigmentação, adicione ptu a uma concentração de 200 μM.
  3. Dechorionate os embriões usando fórceps um microscópio de dissecação. Usando dois fórceps, aderência e puxe suavemente o chorão para além para liberar o embrião.

4. Montagem em agarose

NOTA: O método de montagem desenvolvido requer duas concentrações diferentes de agarose de baixo derretimento na E3 com 0,02% Tricaine e PTU, conforme necessário. A primeira solução agarose contém uma concentração ideal de agarose em que a distorção e motilidade estão no mínimo. A otimização é descrita na etapa 5 abaixo.

  1. Aqueça as soluções agarose para as duas camadas (concentração definida na etapa 5 abaixo e 1%) a 65 °C. Deixe a agarose esfriar a aproximadamente 30 °C pouco antes de montar para que o embrião não seja prejudicado pelo calor. Para a montagem, use pratos de fundo de vidro de 35 mm com um fundo de vidro de cobertura Nº 0. O vidro de tampa unido à parte inferior do prato cria um poço raso de 10 milímetros (aproximadamente 1.2 milímetros), em que o embrião deve ser coloc.
    NOTA: Neste caso, a concentração com menor motilidade e distorções ficou entre 0,025 a 0,040% agarose.
  2. Coloque suavemente um embrião dechorionado com um de seus lados laterais em direção ao fundo do prato usando uma pipeta de vidro ou micropipette. Se estiver usando uma micropipette, corte a parte externa da ponta para aumentar o tamanho da abertura para caber o embrião (Figura 1A). Retire cuidadosamente qualquer E3 restante com uma micropipette.
  3. Adicione a primeira solução agarose para o pequeno poço criado pelo vidro de tampa ligado ao fundo do prato para cobrir o embrião (Camada 1) (Figura 1B). Certifique-se de que a agarose cobre o pequeno poço, mas não vai sobressá-lo.
  4. Cubra o pequeno poço com um vidro de cobertura (22 mm x 22 mm) (Figura 1C)para criar um espaço estreito agarose cheio com o embrião entre os dois óculos de cobertura.
  5. Coloque uma camada de 1% solução agarose em cima do vidro de tampa em todo o fundo do prato (Camada 2) (Figura 1D). Como esta camada solidifica, ele mantém o vidro da tampa no lugar.
  6. Preencha a parte restante do prato com E3 contendo 0,02% Tricaine para manter o sistema hidratado (Camada 3) (Figura 1E).
    NOTA: Nesta configuração, o vidro de tampa e 1% agarose proteger a camada inferior de ficar diluído.

5. Otimização da solução agarose para a camada 1

  1. Para identificar a concentração ideal de agarose para a Camada 1, use uma abordagem de pesquisa de rede multiescala. Os embriões da montagem em concentrações crescentes do agarose que variam de 0.01% a 1% seguidos pela imagem latente do time-lapse da limitação e da motilidade do crescimento do embrião no campo de vista. Identifique as concentrações onde a distorção e a motilidade estão no mínimo.
  2. Para otimizar ainda mais a concentração de agarose, monte os embriões com uma gama mais fina de concentrações de agarose (por exemplo, entre 0,025 e 0,040% agarose), dependendo da concentração encontrada para ser melhor na etapa 5.1 (por exemplo, 0,025%, 0,028%, 0,031%, etc.).
    NOTA: Em nosso laboratório, a concentração agarose ideal foi de cerca de 0,03%.

6. Imagens de lapso de tempo

NOTA: Este método de montagem funciona para qualquer microscópio invertido com funcionalidade de lapso de tempo para fluorescência e imagens de campo brilhantes.

  1. Realize imagens de lapso de tempo para todo o embrião ou partes dele por até 55 h. Para imagens de vários embriões, use um adaptador de palco que contém vários pratos com um embrião montado por prato. Gire os pratos um por um para que os embriões sejam posicionados aproximadamente horizontalmente como determinados pelo olho. Para o crescimento e desenvolvimento ideal do embrião, use um estágio do microscópio com uma incubadora ajustada em 28.5 °C.
  2. Selecione um objetivo de baixa ampliação no software do microscópio. a parte do olho, localizar e alinhar finamente os embriões horizontalmente, girando os pratos usando iluminação de campo brilhante e gravar suas localizações no software. Crie um nome de arquivo para a avaliação automática dos dados.
    NOTA: Neste experimento, um plano apo λ 4x 0.2 NA objetivo e a guia XY dentro da janela de aquisição ND foram usados para registrar os locais dos embriões. Os dados foram salvos em formato .nd2. O objetivo foi selecionado clicando em seus ícones na aba Ti Pad.
  3. Defina o tamanho do pinhole, a velocidade da varredura, o tamanho da imagem e o zoom. Em seguida, selecione um objetivo de ampliação maior para capturar as imagens.
    NOTA: Neste experimento, um objetivo de plano-apo 10x 0,45 NA foi usado para imagens de embriões inteiros, e um objetivo superfluor 20x 0,75 NA foi usado para a maior imagem de ampliação de partes do embrião. O pinhole foi ajustado a 1.2 UA (19.2 μm para a lente 10x), a velocidade da varredura foi ajustada para um tempo do habitamento do pixel de 2.4 μs e o tamanho da imagem foi ajustado a 1024 x 1024 pixels com um zoom da varredura de um, dando um tamanho do pixel de 1.24 μm para a lente 10x e 0,62 μm para a lente 20x.
  4. Selecione os canais para que a fluorescência seja imagemda. Ajuste as configurações de captura de imagem em um canal de cada vez. Para cada canal de fluorescência ajustar o poder do laser e o detector de alta tensão, certificando-se de recolher a melhor faixa dinâmica possível, evitando a saturação e limitando o clareamento.
    NOTA: Neste experimento, gfp foi imagemdo com o canal verde 488, (488 nm laser e emissão entre 500 e 550 nm), e RFP com o canal vermelho 561 (561 nm laser e emissão entre570 e 600 nm), ea imagem de transmissão foi coletada usando o laser 561 nm e o detector de luz transmitida ( canalTD ).
  5. Para a imagem de todo o embrião com o objetivo 10x, imagem vários campos de visão com sobreposição e costura-los usando o software microscópio.
    NOTA: Como os embriões crescerão substancialmente em tamanho durante a imagem, certifique-se de que há espaço no campo de visão anterior e posterior ao embrião. Use a aba Scan Large Image da janela de aquisição nd e selecione um padrão de 4 x 1 com 10% de sobreposição para capturar quatro campos de visão adjacentes.
  6. Configure as configurações para capturar as pilhas Z usando o software de microscópio.
    NOTA: Porque o embrião é montado perto da parte inferior do prato de vidro, seu centro mover-se-á longe da parte inferior enquanto cresce. Use a guia Z da janela de aquisição nd e selecione a faixa relativa assimétrica. Com este método, o plano de foco atual é usado como o plano de referência e o resto dos aviões são distribuídos assimétricamente acima e abaixo para incluir todo o embrião dentro do volume da pilha Z, com espaço suficiente para explicar o crescimento do espécime. Em todos os experimentos, o intervalo foi fixado em 11 μm e o alcance total de cerca de 45 aviões.
  7. A fim de manter o foco de embriões múltiplos durante a imagem de longo prazo de lapso de tempo, use um foco automatizado. Se a imagem de vários embriões, ajuste os níveis de compensação individuais para cada embrião para se concentrar no plano de referência.
    NOTA: Neste experimento, um sistema de estabilização de foco baseado em laser foi usado.
  8. Configure parâmetros de lapso de tempo no software e imagem do microscópio para uma duração de 55 h em intervalos de cerca de 1 h. Em cada ciclo, capture dois conjuntos de dados de embriões sequencialmente e economize dados automaticamente após cada ciclo.
  9. Processe imagens usando uma versão on-line ou off-line do software de microscópio. Se mais de um embrião foi imageado, crie arquivos independentes para cada embrião dividindo o conjunto de dados com base na localização da imagem. Use projeções de intensidade máxima ou uma ferramenta semelhante para converter conjuntos de dados de tempo 3D em conjuntos de dados de tempo 2D. Crie arquivos de filmes usando a opção Save as menu, selecionando .avi como formato de arquivo. Selecione a opção sem compressão com intervalos de 200 ms para uma velocidade de reprodução de 5 quadros /s.
    NOTA: O conjunto de dados original de dois embriões neste experimento foi dividido usando a função de locais Split no software ( Arquivo| Importação/Exportação | Dividir multipontos). Os conjuntos de dados de tempo 3D foram convertidos em conjuntos de dados de tempo 2D usando a função de projeção de intensidade máxima (Imagem | ND Processamento| Criar imagem de projeção de intensidade máxima em Z).

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Representative Results

Desenvolvimento do método de montagem
O principal objetivo deste trabalho foi desenvolver uma técnica de montagem de baixo custo para imagens de lapso de tempo do desenvolvimento de zebrafish por longos períodos de tempo. O método de montagem em camadas foi desenvolvido para permitir o crescimento total do frágil corpo embrionário de zebrafish, restringindo seus movimentos. Se a concentração agarose da camada 1 for muito alta, os embriões ficarão distorcidos e curvos(Figura 2). Embriões cultivados em 0,1% e 0,5% agarose encurtaram caudas, barbatanas distorcidas e cabeças curvas. Pelo contrário, se a concentração de agarose é muito baixa, os embriões vão sair do campo de visão durante a microscopia time-lapse, mesmo que eles são anestesiados, como a cauda crescente oscila para fora do corpo embrionário e faz com que ele se mova. Em nossas mãos, a concentração agarose ideal variou entre 0,028% e 0,034% agarose entre diferentes lotes de agarose. A montagem abaixo de 0,025% agarose não proporcionou resistência suficiente para que o embrião permanecesse no campo de visão.

Imagens prolongadas de lapso de tempo do desenvolvimento vascular, neuronal e muscular
Depois de otimizar o método de montagem descrito acima, imagens de microscopia confocal de lapso de tempo foram capturadas em um espaço de 55 h. Nós imaged zebrafish transgênico vivo expressando GFP ou RFP em diferentes tecidos. Uma vantagem do uso de peixes transgênicos com fluorescência endógena para imagens de lapso de tempo é que as moléculas de fluorescência, como GFP e RFP, são produzidas continuamente no embrião vivo e, assim, não facilmente foto alvejante. Primeiro, embriões de uma cruz de Tg (kdr1: EGFP)mitfab692/b69210 e Ubi-zebrabow11 foram imagemdas. Nestes embriões, a RFP é expressa em todas as células do embrião, o que permite a visualização da estrutura embrionária geral. Gfp é expresso nas células endotélias da vasculatura. Embriões transgênicos duplos foram imageados por 55 horas a partir de aproximadamente 30 estágios sonitais para visualizar o desenvolvimento vascular na cabeça e no corpo(Figura 3 e Filme Suplementar S1)usando um objetivo de 10x com 0,45 NA. Dois embriões/sessão foram imaged com z-pilhas e time-lapse em um laço de modo que após a imagem latente o primeiro embrião em dois comprimentos de onda diferentes, segundo foi imaged subseqüentemente e então primeiro outra vez. A figura 3 mostra o vaso intersegmental (ISV) brotando, o desenvolvimento de vasos subintestinais e vasculatura de cabeça e condensação de plexo da veia caudal juntamente com a extensão do tronco. A imagem latente do embrião inteiro com a vasculatura mostra que o ISV que sprouting começa entre somites e cresce dorsal até o ponto do tubo neural, onde os ISVs toma um trajeto diferente e sprouts em um sentido sobre ao limite anterior seguinte do somite.

Em seguida, embriões de uma cruz de Tg (mnx:GFP)mitfab692/b629 e Ubi-zebrabow foram imageados por 55 horas aproximadamente do estágio somite 30 para visualizar o desenvolvimento do neurônio motor (Figura 4 e Filme Suplementar S2). Tg (mnx:GFP) tinha sido cruzado pela primeira vez para mitfab692/b692 (ambos do Zebrafish International Resource Center da Universidade de Oregon, OR) para produzir Tg(mnx:GFP)mitfab692/b629. Os axônios do motorneuron sprout do tubo neural ventral sobre os somites para o lado ventral do embrião. Ao contrário dos vasos intersegmentais que brotam entre os sonátons, os axônios brotam sobre o meio sobre os sonás formados pela chevron. O brotamento começa em direção à extremidade anterior do tubo neural, em um ângulo reto do tubo neural, e se espalha posterior. Pela interface somite/yolk, brotação muda de direção para brotos anteriores e posteriores. Observe a inanição interior do coração em desenvolvimento pelos neuritos anteriores.

Além disso, embriões de uma cruz de Tg (kdr:enl.memRFP)mitfab692/b692 (cruz de Tg (kdr:enl.memRFP e mitfab692/b692) e Tg (mnx:GFP)mitfab692/b692 foram imagem. Nos embriões anteriores, a fluorescência vascular vermelha não era visível até 36 horas após a fertilização (hpf), e conseqüentemente nós começamos a imagem latente em um ponto de tempo mais atrasado em 2 dpf. Nós imaged uma parte do tronco, dorsalà extensão do saco do yolk, usando uma ampliação mais elevada (objetivo 20x). Este filme mostra que os embriões ainda estavam o suficiente para uma boa qualidade de imagem em maior ampliação. O co-desenvolvimento do brotamento dorsal de axônios motorneuron em relação à posição dos vasos intersegmentais foi seguido(Figura 5 e Filme Suplementar S3). Nestes filmes, os detalhes mais finos do axônio ventral brotando são visíveis, bem como axônio dorsal brotando do tubo neural para um ponto onde os axônios neuronais e vasos intersegmentais co-migrar. A condensação do plexo da veia caudal também é claramente mostrada. Note-se que, como um broto neurito está faltando para a extremidade posterior da cauda (na posição do neurite 12 do lado direito), o neurônio posterior mais próximo se estende em direção à parte anterior do embrião para cobrir a área entre neurites 11 e 13.

Finalmente, uma cruz de HGn39b12,13 e Ubi-zebrabow foi imagemda. HGn39b é uma linha zTRAP com a inserção GFP no ativador de proteína de choque térmico ATPase homolog 1 (AHA1) gene(http://kawakami.lab.nig.ac.jp/)e expressa GFP nos músculos dos sonos (Figura 6 e Filme Suplementar S4). À medida que os números de somite aumentam, os sem-som também se estendem em comprimento e largura. Este filme também mostra muito bem o desenvolvimento do coração na fluorescência vermelha da linha de peixeubi-zebrabow.

Figure 1
Figura 1: Descrição do método de montagem. (A)Adicione o embrião zebrafish para o pequeno poço criado pelo fundo de vidro no prato de 35 mm. (B)Adicione a camada agarose 1 para o pequeno poço para cobrir o embrião. (C)Coloque cuidadosamente um copo de cobertura sobre o pequeno poço. (D)Adicione a camada de agarose 2 em todo o fundo do prato de 35 mm. (E)Adicione E3 para o prato. (F)Desenho esquemático de uma seção transversal da montagem criada. (G) Imagem do microscópio (objetivo 5x) do embrião do zebrafish no montage final. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.

Figure 2
Figura 2: Restrição de crescimento embrionário e atraso no desenvolvimento em diferentes concentrações de agarose. Os embriões foram montados em diferentes concentrações de agarose e seu tamanho e desenvolvimento foram imageados a 48 hpf. Imagens capturadas por um microscópio equipado com uma câmera colorida do microscópio digital (objetivo 2.5x) e o software de acompanhamento do microscópio. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.

Figure 3
Figura 3: Visualização do desenvolvimento da vasculatura. Cruz de Tg (kdr1: EGFP)mitfab692/b692 e Ubi-zebrabow imaged de cerca de 30 palco sonitado para 55 h em um microscópio confocal. Vasculatura em verde e todas as outras células em vermelho. Barra de escala 500 μm. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior deste número.

Figure 4
Figura 4: Visualização do desenvolvimento de neurônios e neuritos brotando. Cruz de Tg (mnx:GFP)mitfab692/b629 e Ubi-zebrabow imaged de cerca de 30 palco sonite para 55 h em um microscópio confocal. Motorneurons em verde, todas as outras células em vermelho. Barra de escala 500 μm. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior deste número.

Figure 5
Figura 5: Visualização do co-desenvolvimento de neurônios e vasculatura. Cruz de Tg (kdr:enl.memRFP)mitfab692/b692 e Tg (mnx:GFP)mitfab692/b692 imaged for 55 hours from about 2 dpf on a confocal microscope. Vasculatura em vermelho, motorneurons em verde. Barra de escala 500 μm. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior deste número.

Figure 6
Figura 6: Visualização da expressão do GFP muscular em somites. Cruz de HGn39b e Ubi-zebrabow foram imaged em um microscópio confocal para 55 h de cerca de 30 palco semite. Músculo no verde, todas as outras células em vermelho. Barra de escala 500 μm Clique aqui para ver uma versão maior deste número.

Supplementary Movie S1
Filme Suplementar S1: Filme de um embrião de uma cruz de Tg (kdr1:EGFP)mitfab692/b692 e Ubi-zebrabow imaged from about 30 somite stage for 55 h on a confocal microscope using a 10x objective. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Supplementary Movie S2
Filme Suplementar S2: Filme de um embrião de uma cruz de Tg (mnx:GFP)mitfab692/b629 e Ubi-zebrabow imaged from about 30 somite stage for 55 h on a confocal microscope using a 10x objective. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Supplementary Movie S3
Filme Suplementar S3: Filme de um embrião de uma cruz de Tg (kdr:enl.memRFP)mitfab692/b692 e Tg (mnx:GFP)mitfab692/b692 imaged from about 2 dpf for 55 h on a confocal microscope using a 20x objective. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Supplementary Movie S4
Filme Suplementar S4: Filme de um embrião de uma cruz de HGn39b e Ubi-zebrabow imaged de cerca de 30 palco sonitado para 55 h em um microscópio confocal usando um objetivo 10x. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

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Discussion

Um método de montagem para a microscopia confocal de lapso de tempo prolongado de embriões inteiros de zebrafish é descrito aqui. O passo mais crítico para o método de montagem é identificar a concentração ideal de agarose que permitirá o crescimento irrestrito do embrião de zebrafish e, ao mesmo tempo, manter os embriões em uma posição completamente fixa para imagens confocais. Como a concentração ideal de agarose é muito estreita, esse valor é muito sensível aos erros na medição do peso da agarose e ao volume de E3 durante a preparação da solução. A concentração ideal também pode depender da temperatura e estágio do embrião. Assim, a concentração ideal precisará ser redefinida para cada novo lote de solução agarose por meio da repetição de testes de diferentes concentrações.

Outro passo crítico está no método de montagem é a adição da segunda camada de agarose. A segunda camada prende o vidro de tampa no lugar. Deve ser adicionado com cuidado ao prato um pouco de cada vez de modo que não faça com que o vidro de tampa mova-se. A segunda camada também serve como uma barreira permeável para a E3. Sem E3, os embriões secarão durante a imagem. Sem a segunda camada de agarose, o vidro de tampa e o embrião começarão flutuar.

Uma limitação do método de montagem proposto é que, embora funcione bem para microscópios invertidos, ele não funciona para microscópios eretos. Várias tentativas foram feitas para realizar imagens de lapso de tempo usando um microscópio ereto, enchendo o prato de fundo de vidro com E3, selando-o com parafilme, e virando-o de cabeça para baixo. No entanto, muitas vezes isso resultou em que a montagem desabou no meio da imagem. Isso pode ter sido causado pelo aumento do calor na amostra após a longa exposição à luz laser, o que faz com que a camada de agarose solidificada derreta.

Ao final da microscopia de lapso de tempo, os embriões começaram a mostrar edema pericárdio. Variando entre diferentes experimentos, o edema foi observado entre 35 e 50 horas de imagem. Se isso foi causado pela imobilização embrionária, ou um efeito de anestésicos, atualmente não é conhecido. Tricaine é conhecido por suprimir a contração dos músculos esqueléticos e cardíacos. Consequentemente, tricaina afeta a freqüência cardíaca em peixes adultos14 e embriões15. Outros estudos também relataram que o tratamento tricaino causa edema pericárdio em embriões zebrafish2,16. Neste artigo, uma concentração de Tricaine (0,016-0,020%) foi usado que é comumente usado na pesquisa zebrafish; ainda, o edema pericárdio ocorreu ao final do nosso período de imagem. O edema pericárdio constituiu uma principal restrição para viabilizar a imagem dos embriões por períodos de tempo ainda mais longos. As formas potenciais de diminuir esta toxicidade cardíaca estão combinando dois anestésicos diferentes, como tricaino com eugenol, ou usando injeção de mRNA α-bungarotoxin para anestesia16; efeitos benéficos de compostos de anestesia combinatória ou alternativa precisam ser investigados para imagens prolongadas de lapso de tempo do desenvolvimento de zebrafish.

Em conclusão, o método de montagem descrito é rápido, fácil, rentável e funciona em qualquer microscópio invertido. Os pratos inferiores de vidro regulares e a aagarose de baixo derretimento podem ser usados, e nenhum molde especial, equipamento ou instrumentação são exigidos. O método de montagem em camadas permite o crescimento embrionário e, ao mesmo tempo, manter os embriões em uma posição fixa. Usando a imagem latente prolongada do time-lapse do conhecimento novo do organismo inteiro do desenvolvimento do tecido pode ser obtido.

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Disclosures

Os autores não têm nada a divulgar.

Acknowledgments

Agradecemos a Albert Pan e Arndt Sieakmann por presentes de peixe transgênico. Agradecemos Koichi Kawakami no Instituto Nacional de Genética, o Projeto Nacional de BioResource do Ministério da Educação, Cultura, Esportes, Ciência e Tecnologia do Japão para o dom do zebrafish transgênico HGn39b. Agradecemos também a Fátima Merchant e Kathleen Gajewski pela assistência na microscopia confocal e a Tracey Theriault por fotografias.

Este trabalho foi apoiado por subvenções do Instituto Nacional de Ciências da Saúde Ambiental dos Institutos Nacionais de Saúde (número de subvenção P30ES023512 e número de contrato HHSN273201500010C). A SU foi apoiada por uma bolsa do programa Keck Computational Cancer Biology (Gulf Coast Consortia CPRIT grant RP140113) e por Hugh Roy e Lillie Endowment Fund. J-Å G foi apoiado pela Fundação Robert A. Welch (E-0004).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Low melting agarose Sigma-Aldrich, MO A9414 Store dissolved solution at 4 °C
35 mm glass bottom dishes with No. 0 coverslip and 10 mm diameter of glass bottom MatTek Corporation, MA P35GCOL-0-10-C
Tricaine (MS-222) Sigma-Aldrich, MO E10521 Store dissolved solution at 4 °C
N-phenylthiourea (PTU) Sigma-Aldrich, MO P7629 Store dissolved solution at -20 °C
Micro cover glass 22x22 mm VWR 48366 067
Leica DMi8 fluorescence microscope Leica NA
LAS X software Leica NA Microscope software
DMC4500 digital microscope camera Leica NA
Nikon A1S confocal microscope Nikon Instruments Inc. NA
Nikon NIS AR Version 4.40 Nikon Instruments Inc. NA Microscope software

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References

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