Plataforma lab-on-a-CD para geração de esferóides tridimensionais multicelulares

Bioengineering

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Summary

Apresentamos um dispositivo microfluídico centrífuga movido a motor que pode cultivar esferóides celulares. Usando este dispositivo, esferóides de tipos de células únicas ou múltiplas podem ser facilmente coculturados condições de alta gravidade.

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Kim, D., Lee, G. H., Park, J., Lee, J. C., Park, J. Y. Lab-on-a-CD Platform for Generating Multicellular Three-dimensional Spheroids. J. Vis. Exp. (153), e60399, doi:10.3791/60399 (2019).

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Abstract

Uma cultura tridimensional de células esferóides pode obter resultados mais úteis em experimentos celulares porque pode simular melhor microambientes celulares do corpo vivo do que a cultura celular bidimensional. Neste estudo, fabricamos uma plataforma elétrica de laboratório em um CD (disco compacto), chamada de sistema de cultura esferóide de base microfluídica (CMS), para criar esferóides de células tridimensionais (3D) implementando força centrífuga alta. Este dispositivo pode variar velocidades de rotação para gerar condições de gravidade de 1 x g a 521 x g. O sistema CMS tem 6 cm de diâmetro, tem cem 400 microwells μm, e é feito moldando com polidimetilsiloxano em um molde de policarbonato pré-feito por uma máquina de controle numérica de computador. Uma parede de barreira na entrada do canal do sistema CMS usa força centrífuga para espalhar as células uniformemente dentro do chip. No final do canal, há uma região de deslizamento que permite que as células entrem nos micropoços. Como demonstração, os esferóides foram gerados pela monocultura e pela cocultura de células-tronco derivadas do adiposo humano e dos fibroblastos pulmonares humanos em condições de alta gravidade usando o sistema. O sistema CMS usou um esquema de operação simples para produzir esferóides de cocultura de várias estruturas de concêntricos, Janus e sanduíche. O sistema CMS será útil em biologia celular e estudos de engenharia de tecidos que exigem esferóides e cultura organóide de tipos de células únicas ou múltiplas.

Introduction

É mais fácil simular microambientes in vivo biológicos com cultura celular esferóide tridimensional (3D) do que com cultura celular bidimensional (2D) (por exemplo, cultura celular convencional da placa de Petri) produzir experimental fisiologicamente mais realista resultados1. Os métodos de formação esferóide atualmente disponíveis incluem a técnica de queda suspensa2,a técnica de sobreposição líquida3,a técnica de celulose carboxtil4,a técnica microfluídica baseada em força magnética5,e o uso de biorreatores6. Embora cada método tenha seus próprios benefícios, é necessária uma melhora adicional na reprodutibilidade, produtividade e geração de esferóides da cocultura. Por exemplo, enquanto a técnica microfluídica baseada em força magnética5 é relativamente barata, os efeitos de fortes campos magnéticos em células vivas devem ser cuidadosamente considerados. Os benefícios da cultura esferóide, particularmente no estudo da diferenciação e proliferação de células-tronco mesenchymal, têm sido relatados em vários estudos7,8,9.

O sistema microfluídico centrífuga, também conhecido como laboratório-em-um-CD (disco compacto), é útil para controlar facilmente o fluido dentro e explorar a rotação do substrato e, portanto, tem sido utilizado em aplicações biomédicas, como imunoensaios10, Ensaios colorimétricos para detectar marcadores bioquímicos11, ensaios de amplificação de ácido nucleico (PCR), sistemas automatizados de análise de sangue12e dispositivos microfluídicos centrífugas de todos emum 13. A força motriz que controla o fluido é a força centrípeta criada pela rotação. Além disso, várias funções de mistura, valving e divisão de amostras podem ser feitas simplesmente nesta única plataforma de CD. No entanto, em comparação com os métodos de análise bioquímica acima mencionados, houve menos ensaios aplicando plataformas de CD para células culturais, especialmente esferóides14.

Neste estudo, mostramos o desempenho do sistema de esferóides microfluídicos (CMS) de base microfluífuga por monocultura ou cocultura de células-tronco derivadas do adiposo humano (hASC) e fibroblastos pulmonares humanos (MRC-5). Este artigo descreve em detalhes a metodologia de pesquisa15do nosso grupo. Assim, a plataforma de cultura esferóide lab-on-a-CD pode ser facilmente reproduzida. Um sistema gerador cms compreendendo um chip de cultura CMS, um suporte de chip, um motor DC, uma montagem de motor, e uma plataforma rotativa, é apresentado. A montagem do motor é impressa em 3D com estireno butadiene acrilonitrile (ABS). O suporte de chip e a plataforma rotativa são CNC (controle numérico de computador) usinado com o PC (policarbonato). A velocidade de rotação do motor é controlada de 200 a 4.500 rpm codificando um algoritmo de PID (proporcional-integral-derivado) baseado na modulação da pulso-largura. Suas dimensões são de 100 mm x 100 mm x 150 mm e pesa 860 g, tornando mais fácil de manusear. Usando o sistema CMS, os esferóides podem ser gerados várias condições de gravidade de 1 x g a 521 x g,de modo que o estudo da promoção de diferenciação celular alta gravidade pode ser estendido de células 2D16,17 a 3D Spheroid. A cocultura de vários tipos de células também é uma tecnologia fundamental para efetivamente imitar o ambiente in vivo18. O sistema CMS pode facilmente gerar esferóides de monocultura, bem como esferóides de cocultura de vários tipos de estrutura (por exemplo, concêntricos, Janus e sanduíche). O sistema CMS pode ser utilizado não só em estudos esferóides simples, mas também em estudos organóides 3D, para considerar estruturas de órgãos humanos.

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Protocol

1. Fabricação de chips de cultura microfluídica (CMS) de base microfluídica (CMS)

  1. Faça moldes de PC para as camadas superior e inferior do chip de cultura CMS por usinagem CNC. Dimensões detalhadas do chip são dadas na Figura 1.
  2. Misture a base pdms e pdms agente de cura em uma proporção de 10:1 (w/ w) para 5 min e coloque em um desidratador para 1 h para remover bolhas de ar.
  3. Depois de derramar a mistura PDMS nos moldes do chip de cultura CMS, retire as bolhas de ar para mais de 1 h e cure em uma câmara de calor a 80 °C por 2 h.
  4. Coloque-os no aspirador de plasma aspirado com as superfícies a serem ligados de frente e expô-los ao plasma assistido pelo ar a uma potência de 18 W para 30 s.
  5. Ligue as duas camadas do chip de cultura CMS e coloque-o na câmara de calor a 80 °C por 30 min para aumentar a força de adesão.
  6. Esterilizar o chip de cultura CMS em um esterilizador de autoclave em 121 °C e 15 psi.

2. Preparação celular

  1. Descongele o 1 mL do frasco contendo 5 × 105-1 × 106 hASCs ou células MRC-5s em um banho de água a 36,5 °C por 2 min.
  2. Adicione 1 mL do Modied Eagle Medium (DMEM) de Dulbecco a um frasco e misture suavemente com uma pipeta de 1.000 μL.
  3. Coloque 15 mL do DMEM pré-aquecido a 36,5 °C em uma placa de Petri de 150 mm de diâmetro usando uma pipeta e adicione as células do frasco.
  4. Após 1 dia, aspirar o DMEM e substituir por 15 mL de DMEM fresco. Posteriormente, alterar a mídia a cada 2 ou 3 dias.
  5. Para separar as células da placa de Petri, adicione 4 mL de trippsina para as placas de Petri e colocá-los em uma incubadora em 36,5 ° C e 5% CO2 para 4 min.

3. Formação esferóide da monocultura

  1. Coloque 2,5 mL de 4% (w/v) solução plurônica F-127 no buraco de entrada do chip de cultura CMS (Figura 2A),enquanto gira o chip em 500-1.000 rpm e, em seguida, girar o chip em 4.000 rpm por 3 min usando o sistema CMS (Figura 2B).
    NOTA: O revestimento plurônico impede o acessório da pilha à porta da entrada quando a microplaqueta girar. Certifique-se de que o ar não está preso nos micropoços.
  2. Incubar o chip de cultura CMS preenchido com solução plurônica durante a noite a 36,5 °C em 5% CO2.
  3. Retire a solução plurônica, lave a solução plurônica restante com DMEM e seque o chip por 12 h em um banco limpo.
  4. Adicione 2,5 mL de DMEM ao chip de cultura CMS e gire o chip em ~ 4.000 rpm por 3 min para prewetting o interior do chip.
  5. Pare a rotação e retire 100 μL de DMEM para abrir espaço para injetar a suspensão celular.
  6. Adicione 100 μL de suspensões celulares que contêm 5 × 105 hASCs ou 8× 105 MRC-5s por pipetting Uniformemente distribuir as células por pipetting 3-5x para resuspensão.
  7. Gire o chip a 3.000 rpm para 3 min para prender as células em cada microwell por força centrífuga.
    NOTA: Velocidade rotacional excessiva pode causar fuga celular através de buracos de ejeção de solução.
  8. Cultura as células por 3 dias na incubadora em 36,5 °C, >95% umidade, e 5% CO2, girando em 1.000-2.000 rpm. Mude a cultura a cada dia.

4. Formação esferóide da cocultura

  1. Formação de esferóides concêntricos
    1. Adicione as primeiras células, 2,5 × 105 hASCs, e girar o chip em 3.000 rpm. Após 3 min, adicione as segundas células, 4 × 105 MRC-5s, e gire o chip em 3.000 rpm para 3 min. Injetar um total de 100 μL de suspensões celulares por pipetting. Quando as células são injetadas, mudar a velocidade de rotação para 500-1.000 rpm.
    2. Cultura as células da incubadora a 36,5 °C, >95% umidade, e 5% CO2 girando em 1.000-2.000 rpm. Os esferóides concêntricos são criados dentro de 24 h. Para a cultura a longo prazo, mude o meio da cultura diário.
  2. Formação esferóide de Janus
    1. Adicione 100 μL de suspensões celulares contendo as primeiras células, 2,5 × 105 hASCs, por pipetting enquanto o chip gira em 500-1.000 rpm. Em seguida, gire o chip em 3.000 rpm por 3 min.
    2. Incubar o chip a 36,5 °C, >95% umidade, e 5% CO2 girando em 1.000-2.000 rpm para 3 h.
    3. Adicione 100 μL das suspensões celulares contendo o segundo conjunto de células, 4 × 105 MRC-5s, por pipetting enquanto o chip gira em 500-1.000 rpm. Em seguida, gire o chip em 3.000 rpm por 3 min.
    4. Cultura as células da incubadora a 36,5 °C, >95% umidade, e 5% CO2 girando em 1.000-2.000 rpm. Os esferóides Janus são criados dentro de 24 h. Para a cultura a longo prazo, mude o meio da cultura diário.
  3. Formação do sferoide do sanduíche
    1. Adicione 100 μL de suspensões celulares contendo as primeiras células, 1,5 × 105 hASCs, por pipetting enquanto o chip gira em 500-1.000 rpm. Em seguida, gire o chip em 3.000 rpm por 3 min.
    2. Incubar o chip a 36,5 °C, >95% umidade, e 5% CO2 girando em 1.000-2.000 rpm para 3 h.
    3. Adicione 100 μL de suspensões celulares contendo as segundas células, 3 × 105 MRC-5s, por pipetting enquanto o chip gira em 500-1.000 rpm. Em seguida, gire o chip em 3.000 rpm por 3 min.
    4. Incubar o chip a 36,5 °C, >95% umidade, e 5% CO2 girando em 1.000-2.000 rpm para 3 h.
    5. Adicione 100 μL de suspensões celulares contendo as terceiras células, 1,5 × 105 hASCs, por pipetting enquanto o chip gira em 500-1.000 rpm. Em seguida, gire o chip em 3.000 rpm por 3 min.
    6. Cultura as células da incubadora a 36,5 °C, >95% umidade, e 5% CO2 girando em 1.000-2.000 rpm. Os esferóides sanduíche são criados dentro de 12 h. Para a cultura a longo prazo, mude o meio da cultura diário.

5. Coloração celular

  1. Aqueça a corantes de fluorescência celular à temperatura ambiente (20 °C).
  2. Adicione 20 μL de anidro dimitilsulfoxida (DMSO) por frasco para fazer uma solução de 1 mM.
  3. Diluir a fluorescência a uma concentração de trabalho final de 1 μM usando DMEM.
  4. Adicione a fluorescência à suspensão celular e retire suavemente usando uma pipeta.
  5. Incubar 20 min a 36,5 °C, umidade de >95%, e 5% CO2.

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Representative Results

O chip de cultura CMS de 6 cm de diâmetro (Figura 2)foi feito com sucesso seguindo o protocolo acima. Primeiro, o chip foi feito separadamente de uma camada superior e uma camada inferior e, em seguida, ligado si por ligação plasmática. Esferóides resultantes podem ser facilmente reunidos, desanexando o chip. O canal do chip de cultura CMS compreende uma porta de inseto e regiões centrais, slide, e microwell (Figura 3). As soluções celular, média e plurônica são injetadas através de um buraco de inseto com um diâmetro de 5 mm. As células injetadas são distribuídas uniformemente pela resuspensão 3-5x na região portuária de enseadas. As células são submetidas à força centrífuga na região central e se espalham para fora. Como a região central é maior do que o microwell, ela pode conter mais mídia, permitindo que os esferóides sobrevivam por mais tempo. A altura do micropoço é de 0,4 mm e a altura da região central é de 1,5 mm. Os buracos de sucção estão presentes no centro da região central para remover facilmente as soluções internas. A região de deslizamento é uma área inclinada que liga a região central e a região do micropoço. As células se movem ao longo de uma inclinação de 45° e se instalam na região do micropoço, onde as células se instalam, crescem e se emaranham para formar esferóides. Microwells localizados a 14 mm do centro do chip são semicylindrical com uma altura de 400 μm e um diâmetro de 400 μm. Um total de 100 esferóides podem ser gerados simultaneamente em 100 microwells.

Usando o chip CMS preparado, os esferóides podem ser gerados na ordem mostrada no protocolo(Figura 4). Esferóides de monocultura e cocultura foram gerados com células hASC e MRC-5. Para gerar um esferóide monocultura de cada tipo de célula, foram injetados 5 × 105 hASCs ou 8 ×105 MRC-5s. O número de células injetadas era independente do tamanho da célula. Imagens de lapso de tempo de ambos os tipos de células foram tiradas a 2.000 rpm até o dia 3 da cultura celular (Figura 5). Esferóides de cocultura de hASCs e MRC-5s também foram gerados com estruturas concêntricas, janus e sanduíches. Para fazer esferóides concêntricos, as primeiras células (2,5 × 105 hASCs) foram injetadas e as segundas células (4 × 105 MRC-5s) foram injetadas 3 min mais tarde(Figura 6A). Quando as primeiras células foram injetadas, elas se tornaram em forma de U devido à alta gravidade, e quando as segundas células foram injetadas, elas se mudaram para o meio da forma de U. Ao longo do tempo, as primeiras células em forma de U cercaram as segundas células e completaram os esféidos concêntricos. Para fazer esféios Janus, as primeiras células (2,5 × 105 hASCs) foram injetadas, e as segundas células (4 × 105 MRC-5s) foram injetadas 3 h depois (Figura 6B). Quando o intervalo de injeção entre as duas células era longo, a forma das primeiras células mudou de forma U para uma forma elíptica por agregação celular. Uma vez que as segundas células foram adicionadas à forma elíptica das primeiras células, os esferóides Janus foram gerados. No caso dos esferóides sanduíche, as primeiras células (1,5 × 105 hASCs) foram injetados, as segundas células (3 × 105 MRC-5s) foram injetadas 3 h mais tarde, e as terceiras células (1,5 × 105 hASCs) foram injetadas após outro 3 h ( Figura 6C) foram injetadas 3 HC ( Figura 6C) e as terceiras células (1,5 × 10 5 hASCs) foram injetadas após outro 3 h (Figura 6C ) ). Semelhante ao esferóide Janus, cada célula agregada em forma elíptica, e as três camadas empilhadas para gerar esferóides sanduíche. Por fim, para demonstrar a capacidade cultural de longo prazo do CMS, os hASCs foram cultivados, expostos à alta gravidade por 7 dias seguidos por um ensaio vivo/morto realizado para mostrar que a maioria das células sobreviveu (Figura 7). Além disso, fotos de todos os micropoços do CMS foram tiradas após 3 dias de cultivo mrc-5s para mostrar excelente uniformidade e esfericidade de esferóides (Figura 8).

Figure 1
Figura 1: Dimensões das camadas superior e inferior de um chip de cultura CMS. O molde do PC foi feito usando uma máquina de CNC e replicado com PDMS para fazer uma microplaqueta da cultura de CMS baseada no desenho criado por um CAD 3D (projeto computador-ajudado). Os quatro círculos nas bordas das camadas superior e inferior são para alinhar as duas camadas. As dimensões estão em milímetros. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.

Figure 2
Figura 2: Fotografias do sistema CMS. (A)Fotografias do chip de cultura CMS concluído. O diâmetro do chip é de 6 cm e o diâmetro do micropoço é de 400 μm. Os números acima dos microwells representam os números individuais dos microwells de 1 a 100. Estes números foram gravados no molde. Barra de escala = 400 μm. (B)Fotografia de todo o sistema CMS. O sistema CMS compreende o chip de cultura CMS, suporte de chips, motor DC e plataforma rotativa. Os dispositivos CMS podem gerar condições de gravidade até 521 x g através da força rotacional. O suporte de chip impede a separação do chip de cultura CMS devido à alta gravidade. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.

Figure 3
Figura 3: Componentes do canal do CMS. (A)Imagens esquemáticas e (B)fotografias de uma seção transversal do chip de cultura CMS. O chip de cultura CMS consiste em uma porta de inseto e regiões centrais, de slides e micropoços. Como as células injetadas não passam pela barreira a uma velocidade rotativa de menos de 1.000 rpm, a barreira ajuda na resuspensão da célula e até mesmo na distribuição para o micropoço. Barra de escala = 2 mm. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: Processo de carregar células no chip de cultura CMS. (A)Para evitar que as células grudem na parte inferior do chip, cubra com 2,5 mL da solução plurônica F-127 a 4.000 rpm. Espere um dia para que o revestimento seja aplicado. (B)Retire a solução plurônica e pré-preencha o canal com 2,5 mL do meio DMEM. (C)Remover 100 μL do DMEM e adicionar 100 μL de suspensão celular. Neste momento, resuspender 3-5x para que as células são distribuídos uniformemente. (D)Mova as células para o micropoço girando o chip, e depois cultura as células por 3 dias em 1.000 a 2.000 rpm. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.

Figure 5
Figura 5: Fotografia time-lapse de esferóides monocultura de células hASC e MRC-5. As células foram cultivadas por 24 h a 2.000 rpm. O esferóide foi gerado dentro de 24 h. Barra de escala = 400 μm. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.

Figure 6
Figura 6: Imagens de fluorescência de esferóides da cocultura. (A) Formas esferóides concêntricas em que as células hASC (verde) cercam as células MRC-5 (vermelho). (B) Janus forma esferóide em que duas células são simétricos. (C)Forma esferóide sanduíche em que camadas hASC são empilhados entre duas camadas MRC-5. Barra de escala = 400 μm. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.

Figure 7
Figura 7: Ensaio ao vivo/morto do hASC no dia 7. A cor fluorescente verde representa células vivas e a cor fluorescente vermelha representa células mortas. Barra de escala = 400 μm. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.

Figure 8
Figura 8: Spheroids mrc-5 no dia 3. Um número relativamente constante de células entra em cada micropoço e forma esferóides com esfericidade relativamente constante no sistema CMS. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.

Figure 9
Figura 9: Colheita de esferóides. Esferóides cultivados podem ser colhidos dividindo as duas camadas do chip de cultura CMS. As duas camadas de plasma ligados podem ser facilmente separadas à mão. Em seguida, os esferóides são coletados a partir dos microwells na camada inferior simplesmente por pipetting. Barra de escala = 400 μm. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.

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Discussion

O CMS é um sistema fechado em que todas as células injetadas entram no micropoço sem resíduos, tornando-o mais eficiente e econômico do que os métodos convencionais de geração esferóide à base de microwell. No sistema CMS, a mídia é substituída a cada 12-24 h através de um buraco de sucção projetado para remover a mídia no chip (Figura 3A). Durante o processo de sucção da mídia, quase nenhuma mídia escapa de dentro do micropoço devido à tensão superficial entre a mídia e a parede do microwell. Um usuário pode facilmente remover a mídia presa pressionando perto da região de micropoço do chip com um dedo, porque o chip feito de PDMS é elástico e flexível. As células do micropoço permanecem estáveis sem escapar, mesmo com múltiplas mudanças na mídia. Para alcançar a mesma qualidade de esferóide em todos os 100 microwells, a rotação do dispositivo não deve ser excêntrica, e o chip deve ser axisiétrico. Caso contrário, um número variável de células pode entrar em cada poço e o tamanho e a forma do esferóide podem diferir. No sistema de micropoço convencional, porque o ar é muitas vezes preso no microwell, é necessário remover as bolhas de ar. No entanto, o sistema CMS não requer o processo de remoção da bolha porque a alta força centrífuga gerada pela rotação faz com que a mídia empurre as bolhas e espremê-las das microesferas.

O sistema CMS também tem suas limitações em comparação com os métodos convencionais. O sistema CMS requer um espaço de cultura maior (por exemplo, grande espaço de incubadora), pois compreende um motor, plataforma rotativa e um controlador, e seu tamanho total é de aproximadamente 100 mm x 100 mm x 150 mm (Figura 2B). Além disso, causa uma vibração leve, mas persistente. Esperamos que a miniaturização do sistema (espero que semelhante ao tamanho de 6 placas de poço) vai resolver esses problemas.

Note-se que os esferóides cultivados podem ser coletados separando as duas camadas de plasma do sistema CMS (Figura 9). A ligação das duas camadas é forte o suficiente para evitar que a mídia vaze durante a operação do sistema. No entanto, devido à pequena área de ligação, é separável à mão. Os esferóides podem ser simplesmente coletados da camada inferior por pipetting.

O sistema CMS tem melhor reprodutibilidade e produtividade do que os métodos convencionais de geração esferóide. Os métodos convencionais, tais como o microwell normal ou métodos de gotículas suspensas, são trabalhosos. No entanto, no sistema CMS, é muito mais fácil aumentar o número de esferóides, simplesmente aumentando o tamanho do chip. Com este dispositivo, também é possível gerar organóides que exigem cultura de tipos multicelulares, o que não é fácil de fazer nos métodos de cultura convencionais. Além das células deste estudo (hASC e MRC-5), cms poderia ser usado para a produção de esferóides usando vários outros tipos de células que podem formar esferóides.

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Disclosures

Os autores não têm nada a divulgar.

Acknowledgments

Esta pesquisa foi apoiada pelo Basic Science Research Program (2016R1D1A1B03934418) e pelo Programa de Desenvolvimento de Biotecnologia e Tecnologia Médica (2018M3A9H1023141) da NRF e financiado pelo governo coreano, MSIT.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3D printer Cubicon 3DP-210F
Adipose-derived mesenchymal stem cells (hASC) ATCC PCS-500-011
Antibiotic-Antimycotic Gibco 15240-062 Contained 1% of completed medium and buffer
CellTracker Green CMFDA Thermo Fisher Scientific C2925 10 mM
CellTracker Red CMTPX Thermo Fisher Scientific C34552 10 mM
Computer numerical control (CNC) rotary engraver Roland DGA EGX-350
DC motor Nurielectricity Inc. MB-4385E
Dimethylsulfoxide (DMSO) Sigma Aldrich D2650
Dulbecco's modified eaggle's medium (DMEM) ATCC 30-2002
Dulbecco's phosphate buffered saline (D-PBS) ATCC 30-2200
Fetal bovine serum ATCC 30-2020 Contained 10% of completed medium
human lung fibroblasts (MRC-5) ATCC CCL-171
Inventor 2019 Autodesk 3D computer-aided design program
Petri dish Φ 150 mm JetBiofill CAD010150 Surface Treated
Plasma cleaner Harrick Plasma PDC-32G
Pluronic F-127 Sigma Aldrich 11/6/9003 Dilute with phosphate buffered saline to 4% (w/v) solution
Polycarbonate (PC) Acrylmall AC15PC 200 x 200 x 15 mm
Polydimethylsiloxane (PDMS) Dowcorning Sylgard 184
Trypsin Gibco 12604021

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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