सर्वव्यापकता और सर्वव्यापी की तरह निर्भर पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधनों और महत्वपूर्ण परिवर्तनों की पहचान की रूपरेखा

Biochemistry

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Summary

इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य सर्वव्यापकता (यूबी) और सर्वव्यापी-पसंद (यूबीएलएस) विशिष्ट प्रोटेम स्थापित करना है ताकि इस प्रकार के पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधनों (पीटीएमएस) के परिवर्तनों की पहचान की जा सके, जो उपचार या फेनोटाइप जैसी विशिष्ट स्थिति से जुड़े हैं।

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Swayden, M., Dobric, A., Berthois, Y., Villalba, H., Audebert, S., Camoin, L., Iovanna, J., Soubeyran, P. Profiling Ubiquitin and Ubiquitin-like Dependent Post-translational Modifications and Identification of Significant Alterations. J. Vis. Exp. (153), e60402, doi:10.3791/60402 (2019).

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Abstract

सर्वव्यापकता (यूबी) और सर्वव्यापी की तरह (यूबीएल) प्रोटीन के बाद अनुवादात्मक संशोधन प्रोटीन स्थिरता, गतिविधि, बातचीत, और इंट्रासेलुलर स्थानीयकरण को नियंत्रित करके कोशिका के भीतर मौलिक जैविक नियामक भूमिकाएं निभाते हैं। वे सेल को संकेतों का जवाब देने और अपने वातावरण में बदलाव के अनुकूल बनाने में सक्षम बनाते हैं। इन तंत्रों के भीतर परिवर्तन न्यूरोडीजेनेरेटिव बीमारियों और कैंसर जैसे गंभीर रोग स्थितियों का कारण बन सकते हैं। यहां वर्णित तकनीक का उद्देश्य सुसंस्कृत सेल लाइनों से यूबी/यूबीएलएस निर्भर पीटीएमएस प्रोफाइल को तेजी से और सही ढंग से स्थापित करना है । विभिन्न शर्तों से प्राप्त विभिन्न प्रोफाइल की तुलना विशिष्ट परिवर्तनों की पहचान की अनुमति देती है, जैसे कि उदाहरण के लिए उपचार द्वारा प्रेरित। लेंटिवायरल मध्यस्थता सेल ट्रांसड्यूक्शन को दो टैग (6His और फ्लैग) संस्करण को व्यक्त करने के लिए स्थिर सेल लाइनें बनाने के लिए किया जाता है जो संशोधक (सर्वव्यापी या यूबीबीएल जैसे एसयूबीओ1 या नेड8) का संस्करण है। ये टैग सर्वव्यापकता के शुद्धिकरण की अनुमति देते हैं और इसलिए कोशिकाओं से सर्वव्यापी प्रोटीन की अनुमति देते हैं। यह दो चरण शुद्धिकरण प्रक्रिया के माध्यम से किया जाता है: पहला 6His टैग का उपयोग करके शर्तों को डेन्टुरिंग में किया जाता है, और दूसरा फ्लैग टैग का उपयोग करके मूल परिस्थितियों में होता है। इससे संशोधित प्रोटीन का अत्यधिक विशिष्ट और शुद्ध अलगाव होता है जिसे बाद में तरल क्रोमेटोग्राफी द्वारा पहचाना जाता है और अर्ध-मात्रा निर्धारित की जाती है और उसके बाद मिलकर मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एलसी-एमएस/एमएस) प्रौद्योगिकी होती है । एक्सेल सॉफ्टवेयर का उपयोग करके एमएस डेटा का आसान सूचना विश्लेषण पृष्ठभूमि संकेतों को खत्म करके पीटीएम प्रोफाइल की स्थापना को सक्षम बनाता है। इन प्रोफाइल की तुलना प्रत्येक स्थिति के बीच की जाती है ताकि विशिष्ट परिवर्तनों की पहचान की जा सके, जिसका मानक जैव रसायन तकनीकों द्वारा उनके सत्यापन से शुरू होकर अधिक विशेष रूप से अध्ययन किया जाएगा।

Introduction

यहां प्रस्तावित विधि एक विशिष्ट स्थिति (उपचार, भेदभाव, आदि) से जुड़े संभावित परिवर्तनों की पहचान करने के लिए सुसंस्कृत स्तनधारी कोशिकाओं से सर्वव्यापक परिवार के सदस्यों द्वारा मध्यस्थता पीटीएमएस का अध्ययन करने के लिए समर्पित है। पीटीएमएस प्रोटीन के कार्यों के नियमन के अंतिम चरण का प्रतिनिधित्व करते हैं1। दरअसल, एक बार ट्रांसलेशनल मशीनरी द्वारा उत्पादित, सबसे अधिक नहीं तो सभी प्रोटीन विभिन्न प्रकार के पीटीएमएस से गुजरते हैं जो उनकी गतिविधि, आणविक बातचीत और इंट्रासेल्युलर स्थान1को मिलाते हैं। पीटीएमएस की अधिकता में प्रोटीन के सर्वव्यापी परिवार द्वारा मध्यस्थता करने वाले हैं, सर्वव्यापी स्वयं और सभी सर्वव्यापी-पसंद, सभी इंट्रासेलर या आंशिक रूप से साइटोप्लाज्मिक प्रोटीन2को विनियमित करने की क्षमता रखते हैं। क्योंकि वे खुद प्रोटीन हैं, वे एक दूसरे के लिए संयुग्मित किया जा सकता है, विविध topologies की सजातीय और विषम श्रृंखला बनाने, प्रत्येक विशिष्ट नियामक कार्यों के साथ जुड़े2। इस जटिल मशीनरी को समझने और समझने की कोशिश करने के लिए उपकरण की जरूरत है। दुनिया भर में कई दृष्टिकोण विकसित किए गए थे, जिनके अपने फायदे और नुकसान थे, और यहां हम सुसंस्कृत कोशिकाओं के लिए उपयुक्त उच्च प्रदर्शन के साथ एक का प्रस्ताव करते हैं।

इस विधि का मुख्य लाभ इसकी सटीकता है। दरअसल, अलग संशोधित प्रोटीन की शुद्धता दो टैग (6His और ध्वज) और दो कदम प्रक्रिया के संयोजन उपयोग से अत्यधिक सुधार हुआ है और इसलिए यह एक टैग फ्यूजन यूबी/यूबीएल3,4की तुलना में बहुत अधिक चयनात्मक है । 6His टैग की उपस्थिति पूरी तरह से इनकार करने वाली स्थिति में शुद्धि का पहला चरण सक्षम बनाती है जिससे सर्वव्यापी बाध्यकारी डोमेन या सर्वव्यापी लोगों के लिए बाध्यकारी अन्य प्रोटीन वाले प्रोटीन के किसी भी सह-शुद्धिकरण से बचा जा सकता है। यह एक तकनीकी समस्या है जो सर्वव्यापी प्रोटेम की आत्मीयता शुद्धि के आधार पर विशिष्ट एंटीबॉडी5 या टैंडेम सर्वव्यापी बाध्यकारी तत्वों (TUBEs)6का उपयोग करके कई अन्य दृष्टिकोणों द्वारा सामना करना पड़ा है। महत्वपूर्ण बात, यह तकनीक एक निश्चित प्रकार के सर्वव्यापकता के शुद्धिकरण के पक्ष में पक्षपाती नहीं है, क्योंकि यह कुछ अन्य दृष्टिकोणों के लिए मामला हो सकता है, क्योंकि मोनो और विभिन्न प्रकार के पॉलीयूबिओटिओशन दोनों की पहचान7की गई थी। नतीजतन, एक बार पाया, सर्वव्यापकता के परिवर्तन के लिए मानक जैव रासायनिक दृष्टिकोण द्वारा अधिक जानकारी में अध्ययन किया जाना होगा ताकि सर्वव्यापीकी सटीक तरह की पहचान करने के लिए शामिल है ।

अंत में, इस प्रोटोकॉल का एक और तकनीकी लाभ लेंटिवायरस का उपयोग है, जो सामान्य सेलुलर व्यवहार में हस्तक्षेप किए बिना टैग किए गए संशोधक की अभिव्यक्ति के उचित स्तर के साथ आसानी से और तेजी से स्थिर व्यक्त करने वाली सेल लाइनें बनाता है।

जबकि सर्वव्यापकता की एक महत्वपूर्ण भूमिका प्रोटेसोमल क्षरण के लिए प्रोटीन को लक्षित करना है, अब यह ज्ञात है कि इसमें संभावित रूप से सबसे अधिक इंट्रासेलर या आंशिक रूप से इंट्रासेल्युलर प्रोटीन1के लिए कई अन्य नियामक गुण हैं। इन कार्यों की संख्या प्रोटीन जैसे कई सर्वव्यापी के अस्तित्व से और अधिक बढ़ादी जाती है, जो लगभग हर कोशिका तंत्र1को विनियमित करने वाले प्रोटीन का परिवार बनाती है। इनके परिवर्तनों का कोशिका जीव विज्ञान पर भारी प्रभाव पड़ सकता है और वे कैंसर9जैसी पैथोलॉजिकलस्थितियोंमें ले जा सकते हैं या भाग ले सकते हैं . इसलिए, इस विशाल परिदृश्य का पता लगाने और एक रोग की स्थिति से जुड़े परिवर्तनों की पहचान करने के लिए उपकरणों की आवश्यकता होती है जो उपन्यास चिकित्सीय लक्ष्यों के रूप में काम कर सकती है।

यह प्रोटोकॉल संस्कृति में कोशिकाओं को समर्पित है क्योंकि उन्हें एक्सोजेनस टैग यूबी/यूबीएल को व्यक्त करने के लिए ट्रांसड्यू किए जाने की आवश्यकता है । एक बार बनाए जाने के बाद, इन स्थिर सेल लाइनों का उपयोग 2डी या 3 डी या ज़ेनोग्राफ्ट में संस्कृति से यूबीएल प्रोफाइल उत्पन्न करने के लिए किया जा सकता है, जिससे विभिन्न प्रयोगात्मक मॉडलों के क्षितिज का विस्तार हो ता है जिन्हें पीटीएमएस प्रोफाइल का अध्ययन करने के लिए लागू किया जा सकता है।

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Protocol

1. स्थिर सेल लाइनों की पीढ़ी 6His-झंडा-Ubl व्यक्त

नोट: पीसीसीएल-6एचएफ-यूबीएल, पीवीएसवीजी और डेल्टा-हेल्पर के साथ एचईसी-293T कोशिकाओं का सह-ट्रांसफेक्शन।

  1. दिन 0: एक 6 अच्छी तरह से थाली में बीज 293T कोशिकाओं को 50-70% संगम प्राप्त करने के बाद दिन ।
  2. दिन 1: पीसीसीएल-6एचएफ-यूबीएल या पीसीएसीएल-जीएफपी के 1 μg के मिश्रण के साथ 50-70% कन्फ्लोरेंट कोशिकाओं को सह-ट्रांसफेक्ट, एक ट्रांसफेक्शन पुनरुत्थान और लेंटिवायरस उत्पादन के लिए प्रोटोकॉल का उपयोग करके। 6 एच के ट्रांसफेक्शन के बाद, माध्यम को कोशिकाओं के अनुरूप एक ताजा में बदल दें। बीज कोशिकाओं को 6 अच्छी तरह से प्लेट में स्थानांतरित किया जाएगा ताकि दिन में 10-20% संगम प्राप्त करने के लिए (ट्रांसड्यूक्शन शुरू करने का दिन)।
  3. दूसरा दिन: ट्रांसफेक्शन के बाद 24 घंटे, लेंटिवायरल कणों वाले माध्यम को ठीक करें और 0.45 माइक्रोन फिल्टर का उपयोग करके फ़िल्टर करें। यदि आवश्यक हो, तो लेंटिवायरस के दूसरे बैच का उत्पादन करने के लिए इस बिंदु पर ताजा माध्यम जोड़ें। कोशिकाओं के माध्यम को बदलें (10-20% संगम) लेंटिवायरस युक्त एक द्वारा ट्रांसड्यू किया जाए।
    नोट: लेंटिवायरल माध्यम को ट्रांसड्यूक्शन से पहले कई दिनों तक +4 डिग्री सेल्सियस पर रखा जा सकता है या महीनों तक -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
  4. एक मानक इनक्यूबेटर (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2)में 24 घंटे से 72 घंटे के बीच लेंटिवायरस वाली कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें और फिर नए मानक के लिए माध्यम को बदलें। यदि संभव हो, तो ट्रांसड्यूक्शन की दक्षता का मूल्यांकन करने के लिए एक उल्टे फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप का उपयोग करके जीएफपी अभिव्यक्ति की जांच करें: कोशिकाओं को व्यक्त करने का प्रतिशत और प्रति सेल अभिव्यक्ति का सापेक्ष स्तर। यदि कोई फ्लोरेसेंस का पता नहीं चला है, तो अतिरिक्त 2-3 दिनों तक प्रतीक्षा करें क्योंकि अभिव्यक्ति को स्थानांतरित करने के लिए कोशिकाओं प्रकार के आधार पर अधिक समय लग सकता है।
  5. यदि जीएफपी नियंत्रण सकारात्मक है, तो एंटी-फ्लैग एंटीबॉडी का उपयोग करके प्रतिरक्षण और पश्चिमी दाग द्वारा 6एचएफ-यूबीएल का अभिव्यक्ति नियंत्रण करने के लिए पर्याप्त होने तक सभी कोशिकाओं को विकसित करें।

2. संशोधित प्रोटीन का दोहरा शुद्धिकरण

नोट: बफर 1: 6 एम ग्वानिडिनियम-एचसीएल, ०.१ एम एनए2एचपीओ4/NaH2पीओ4,पीएच ८.०, ०.५% ट्राइटन एक्स-१०० ।
बफर 2: 50 एमएम एनएएच2पीओ4,150 एमएम एनएसीएल, 1% ट्वीन20, 5% ग्लाइसेरोल, पीएच 8.0।
बफर 3: 100 एमएम एनएच4एचसीओ3,पीएच 8.0।

  1. सेल लिसिस: एक बार तैयार होने के बाद, कमरे के तापमान (आरटी) पर फॉस्फेट-बफर्ड लवण (पीबीएस) के साथ कम से कम एक बार संस्कृति व्यंजन धोएं और सेल लिसिस या वैकल्पिक रूप से, तरल एन2 में फ्लैश फ्रीज और -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। लिसिस के लिए आरटी में 15 सेमी डिश के हिसाब से बफर 1 का 2 एमएल डालें। 50 एमएल शंकुअप सेंट्रलाइज ट्यूब (अंतिम वॉल्यूम करीब 20 बजे) में सभी लिस्ट्स को ठीक करने के लिए सेल स्क्रैपर का इस्तेमाल करें।
  2. 1 मिन के ठहराव से अलग 30 एस के लिए तीन बार लायसेट्स का केट करें।
  3. 15 मिन के लिए 15,000 x ग्राम पर सोनिकेट लाइसेट्स को सेंट्रलाइज करें।
  4. एक सेल छलनी (40 μm) का उपयोग कर एक नई ट्यूब के लिए supernatant हस्तांतरण।
  5. नमूनों की एकाग्रता निर्धारित करें और यदि आवश्यक हो, तो प्रोटीन और एक ही मात्रा की एक ही मात्रा प्राप्त करने के लिए समायोजित करें। 50 और 100 मिलीग्राम (MiaPaCa-2 कोशिकाओं के लिए 15 सेमी व्यास वाले 10 व्यंजन) के बीच कुल मात्रा में प्रोटीन का उपयोग करें।
  6. 1 मिलीग्राम प्रोटीन के प्रति मोतियों के 2 μL का उपयोग करके नी2 +-एनटीए मोतियों को जोड़ें।
  7. आरटी में 2.5 घंटे के दौरान 30 आरपीएम पर घुमाएं।
  8. 5 00 x ग्राम पर 5 00 x ग्राम पर मोतियों को 5 मिन के लिए गोली।
  9. बफर 1 के 1 mL के साथ मोतियों को धोएं, नमूनों को 1.5 मीटर माइक्रोसेंटरिफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें, फिर बर्फ पर ट्यूबों को स्थानांतरित करें। बर्फ पर या 4 डिग्री सेल्सियस पर अगले सभी कदम प्रदर्शन करते हैं।
  10. बर्फ के 1 मिलीएल के साथ दो बार धोएं-कोल्ड बफर 2 जिसमें 10 mM इमिडाजोल होता है।
  11. बाउंड प्रोटीन को एल्यूट करने के लिए बफर 2 का 600 माइक्रोन जोड़ें जिसमें 250 एमएम इमिडाजोल होऔर 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए घुमाएं।
  12. 1 मिन के लिए 500 x ग्राम पर केंद्रीकरण द्वारा मोतियों को गोली मार ें। सुपरनेटेंट को नए, पूर्व-कूल्ड, 1.5 मिलीग्राम ट्यूबों में स्थानांतरित करें और एंटी-फ्लैग एम 2 एंटीबॉडी संयुग्मित मोतियों के 50 माइक्रोन जोड़ें।
  13. 4 डिग्री सेल्सियस पर 2.5 घंटे के लिए 30 आरपीएम पर घुमाएं, फिर बफर 2 के 500 माइक्रोन के साथ 2 बार धोएं, फिर बफर 3 के 500 माइक्रोन के साथ 2 बार।
  14. अंतिम एलुशन के लिए, बफर 3 के 100 माइक्रोन जोड़ें जिसमें 0.1 μg/μL पर फ्लैग पेप्टाइड होता है और 1.5 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर घुमाया जाता है।
  15. 1 मिन के लिए 500 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र और नए पूर्व कूल्ड ट्यूबों के लिए supernatants हस्तांतरण।
  16. एसडीएस-पेज पर लोड करने के लिए 10% (10 माइक्रोन) लें और शुद्धिकरण की गुणवत्ता को नियंत्रित करने के लिए जेल का चांदी धुंधला प्रदर्शन करें। यदि शुद्धि अच्छी लग रही है, ९०% एलसी द्वारा छोड़ दिया एमएस/एमएस का विश्लेषण करें ।

3. यूबी/यूबीएलएस पीटीएमएस की प्रोफाइल उत्पन्न करने और उनके बीच महत्वपूर्ण मतभेदों की पहचान करने के लिए बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री डेटा का प्रसंस्करण

नोट: एमएस विश्लेषण से परिणाम पेप्टाइड्स की कुल संख्या के साथ ही पीक क्षेत्र मूल्यों (शीर्ष 3 पेप्टाइड क्षेत्र10का मतलब) प्रत्येक नमूनों में पहचाने गए प्रत्येक प्रोटीन के लिए कई जानकारी शामिल हैं । इन डेटा को या तो पेप्टाइड काउंट नंबर या पीक एरिया वैल्यूज, या दोनों का उपयोग करके संसाधित किया जा सकता है। चोटी क्षेत्रों के साथ गणना के लिए, क्योंकि ये मूल्य आमतौर पर 106की सीमा में होते हैं, नीचे के समान सूत्रों को लागू करने से पहले उन्हें इस क्रम से विभाजित करना आवश्यक है। गिनती के दोनों तरीकों के साथ प्राप्त परिणाम एक मजबूत संबंध दिखाना चाहिए के रूप में यह आमतौर पर करता है । प्रत्येक पहचाने गए प्रोटीन के लिए, निम्नलिखित सूत्रों का उपयोग करें जहां:
गैर-इलाज सर्वव्यापी नमूने में v1 पेप्टाइड्स मूल्य (उदाहरण के लिए, यूबी - दवा)
Gemcitabine में v2 पेप्टाइड्स मूल्यों का इलाज सर्वव्यापकता नमूना (जैसे, यूबी + दवा)
गैर-इलाज नियंत्रण जीएफपी नमूने में k1 पेप्टाइड्स मूल्य (उदाहरण के लिए, जीएफपी - दवा)
Gemcitabine में k2 पेप्टाइड्स मूल्यों का इलाज नियंत्रण GFP नमूना (जैसे, GFP + दवा) ।

  1. सामान्यीकरण: निम्नलिखित सूत्रों का उपयोग करके सर्वव्यापी और जीएफपी के लिए दवा उपचारित कोशिकाओं और अनुपचारित कोशिकाओं के बीच मूल्यों को सामान्य करें। सामान्यीकृत वी = वी और सामान्यीकृत कश्मीर = कश्मीर।
    V1=v1। (v1+ ' v2)/(2. V2=v2। (v1+ ' v2)/(2.
    K1= k1. (k1+ k2) / (2. k1) ; K2= k2। (k1+ k2)/(2. k2)
  2. पृष्ठभूमि को हटाना: निम्नलिखित सूत्रों का उपयोग करना, दोनों स्थितियों में प्रत्येक चिन्हित प्रोटीन के लिए विशिष्ट मूल्यों (V'1 और V'2) प्राप्त करने के लिए सर्वव्यापक नमूना में मूल्यों से नियंत्रण नमूना (जीएफपी) में मूल्यों को घटाना।
    V'1= V1-K1 यदि V1-K1 0; V'1=0 यदि V1-K1<0
    V'2= V2-K2 अगर V2-K2 0; V'2 =0 यदि V2-K2<0
  3. सर्वव्यापकता का भिन्नता (वीएआर) । एक दवा द्वारा प्रेरित पीटीएमएस की सकारात्मक और नकारात्मक विविधताओं के लिए (-100 और +100 के बीच) स्कोर प्राप्त करने के लिए, निम्नलिखित सूत्र का उपयोग करें जिसमें उपचारित और अनुपचारित नमूनों के विशिष्ट मूल्यों के बीच का अंतर सभी मूल्यों के योग से विभाजित किया जाता है, जिनमें शामिल हैं। नियंत्रण (प्रोटीन को दंडित करने के लिए भी नियंत्रण GFP में पहचान की), और १०० से गुणा ।
    Var = (V'2-V'1) /(V1+K1+V2+K2) * 100; -100नीचे की विविधताएं -50 (पीटीएम का दमन) या 50 से ऊपर (पीटीएम का शामिल करना) आमतौर पर महत्वपूर्ण माना जाता है।
  4. आत्मविश्वास (कंफ) । 0 और 100% के बीच विश्वास मूल्य प्राप्त करने के लिए निम्नलिखित सूत्र का उपयोग करें,:
    Conf = ((V1+V2)2/(1+V1+V2+K1+K2) 2)*100- 100/(1+V'1+V'2) ; =0 यदि और एलटी;0
    50 से ऊपर के मूल्यों को आमतौर पर आत्मविश्वासी माना जाता है।
  5. प्रेरण/दमन मूल्यों का एक अच्छे वितरण प्राप्त करने के लिए और दोनों भिन्नता और विश्वास मापदंडों पर विचार करने के लिए, निम्नलिखित फार्मूला का उपयोग कर वी वी वर और सी Conf
    = एसआई (V2>0;(V2 * C2) ^2) /(10 ^6); (V2 * C2) ^2) /(10 ^6))
    नोट: चूंकि पीक एरिया वैल्यूआमतौर पर पेप्टाइड गिनती की तुलना में अधिक सटीक होती हैं, इसलिए विशिष्ट सॉफ़्टवेयर का उपयोग करना संभव है जो इस तरह के डेटा जैसे पर्सियस (https://www.biochem.mpg.de/5111810/perseus) की व्याख्या के लिए समर्पित हैं, निम्नलिखित उपयोग की सिफारिशें।

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Representative Results

जीएफपी और 6एचएफ-यूबी व्यक्त कोशिकाओं को बनाने के लिए संस्कृति स्तनधारी कोशिकाओं का ट्रांसड्यूक्शन
लेंटिवायरस का उत्पादन करने के लिए जो बाद में MiaPaCa-2 कोशिकाओं को पार करने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा, ७०% समप्रवाह HEK-293T कोशिकाओं को सह तीन वैक्टर, पीसीसीएल-6HF-Ubiquitin या GFP/डेल्टा-सहायक/pvSvG की एक समान राशि से संक्रमित हैं । उत्पादन के 24 घंटे के बाद, मसूर के कणों वाले माध्यम को बरामद किया जाता है और फ़िल्टर किया जाता है। इस बिंदु पर एक उल्टे माइक्रोस्कोप पर 293T कोशिकाओं को व्यक्त GFP के हरे रंग की फ्लोरेसेंस की जांच करके ट्रांसफेक्शन की दक्षता को नियंत्रित करना संभव है। यह कोशिकाओं के 100% के पास होना चाहिए। MiaPaCa-2 कोशिकाओं को 1 से 3 दिनों के लिए लेंटिवायरल सुपरनेटेंट के साथ इनक्यूबेटेड किया जाता है। लेंटिवायरल ट्रांसड्यूक्शन की प्रभावकारिता को पहले जीएफपी ट्रांसड्यूड कोशिकाओं(चित्रा 1एक ऊपरी पैनल) के जीएफपी फ्लोरेसेंस को देखकर नियंत्रित किया जाता है। जीएफपी अभिव्यक्ति स्तर एक कोशिका से दूसरे कोशिका में भिन्न हो सकता है लेकिन उनमें से 100% फ्लोरोसेंट होना चाहिए। एक बार यह नियंत्रण हो जाने के बाद ध्वज-सर्वव्यापकता की अभिव्यक्ति को भी नियंत्रित करना होगा। यह प्रतिरक्षण द्वारा एक विरोधी ध्वज एंटीबॉडी (आमतौर पर M2 मोनोक्लोनल)(चित्रा 1एक कम पैनल) का उपयोग करके किया जाता है। यह ट्रांसड्यूड कोशिकाओं का प्रतिशत दिखाएगा, जो सेल संस्कृति के भविष्य के मार्ग पर स्थिर अभिव्यक्ति की गारंटी देने के लिए 100% होना चाहिए। एक्सोजेनस फ्लैग-सर्वव्यापकता के अभिव्यक्ति स्तर को नियंत्रित करने के लिए, ट्रांसड्यूड कोशिकाओं से lysates का विश्लेषण एसडीएस-पेज द्वारा किया जाता है जिसके बाद एंटी-फ्लैग एंटीबॉडी(चित्रा 1बी)के साथ पश्चिमी दाग होता है। दोनों सेल लाइनों को फ्रीज किया जा सकता है।

एसडीएस पेज और चांदी धुंधला द्वारा दो कदम शुद्धिकरण और नियंत्रण
एक बार स्थिर व्यक्त करने वाली सेल लाइनों को मान्य कर दिया गया है, दोनों GFP और 6HF-ubiquitin कोशिकाओं को परिलक्षित किया जाता है जब तक कि दो चरण शुद्धिकरण के साथ आगे बढ़ने के लिए पर्याप्त सामग्री प्राप्त नहीं की जाती है। जरूरत पड़ने पर उन्हें गल ने में सक्षम होने के लिए इन सेल लाइनों का बैकअप तरल नाइट्रोजन में जमे हुए स्टॉक के रूप में रखने की सिफारिश की जाती है। प्रसंस्करण से पहले 36 एच, कोशिकाओं के आधे (आधा GFP और आधा 6HF-Ubiquitin) Gemcitabine के 10 μM के साथ इलाज कर रहे हैं। जब तैयार हो जाएं, सर्वव्यापी प्रोटीन को 6एचएफ-सर्वव्यापकता से और जीएफपी नियंत्रण कोशिकाओं से शुद्ध किया जाता है, दो चरण शुद्धिकरण प्रोटोकॉल(चित्रा 2ए)का उपयोग करके। अंतिम एल्यूशन का 10% एसडीएस-पेज और जेल के चांदी धुंधला द्वारा शुद्ध सामग्री की मात्रा और अखंडता को नियंत्रित करने के लिए प्रयोग किया जाता है(चित्रा 2बी)। आणविक वजन मार्कर बैंड शुद्ध सर्वव्यापी प्रोटीन की मात्रा का अनुमान लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। वैकल्पिक रूप से, शुद्ध प्रोटीन की मात्रा बढ़ाने में मदद करने के लिए जैल की एक पंक्ति में बीएसए या किसी अन्य प्रोटीन की ज्ञात मात्रा लोड की जा सकती है। एक बार यह सत्यापन हो जाने के बाद, शेष 90% नमूनों का विश्लेषण तरल क्रोमेटोग्राफी द्वारा किया जाता है, जिसके साथ-साथ शुद्ध प्रोटीन की पहचान और अर्ध-मात्रा की अनुमति देने के लिए सामूहिक स्पेक्ट्रोमेट्री को जोड़ा जाता है।

पृष्ठभूमि (जीएफपी नमूने) घटाव द्वारा सर्वव्यापी प्रोटीन की पहचान
नमूनों के एलसी-एमएस/एमएस विश्लेषण से डेटा जीएफपी में प्रत्येक चिन्हित प्रोटीन के नाम और मात्रा (पीक क्षेत्रों और मनाया पेप्टाइड्स की संख्या) और 6HF-Ub नमूनों देते हैं । GFP नमूने की तुलना में सर्वव्यापक नमूना में उच्चतम मात्रा वाले प्रोटीन सबसे अधिक होने की संभावना है जो वास्तव में सर्वव्यापी हैं और ऊपर दिए गए तरीकों में वर्णित सूत्रों को लागू करते हैं, 0 से 100% तक कॉन्फिडेंस स्कोर देकर उनके वर्गीकरण की अनुमति देता है . 50% से ऊपर के स्कोर के साथ पहचाने जाने वाले प्रोटीन को सर्वव्यापी माना जाता है(चित्रा 3ए)।

यह कदम जो मूल रूप से सर्वव्यापक ताक से पृष्ठभूमि प्रोटीन (जीएफपी) को हटा देता है, उसने 364 प्रोटीनों की पहचान की, जो काफी सर्वव्यापी(चित्रा 3बी)7। यहां ध्यान दें कि उच्चतम स्कोर के साथ पहचाने गए प्रोटीन को ज्यादातर पहले से ही सर्वव्यापकता के मुख्य लक्ष्यों के रूप में जाना जाता है जो इस शुद्धि विधि की प्रभावकारिता को साबित करता है।

फिर इन सर्वव्यापी प्रोटीनों का जीन सेट संवर्धन विश्लेषण (जीएसईए) करना संभव है ताकि उन जैविक प्रक्रियाओं को उजागर किया जा सके जिनमें वे शामिल हैं(चित्रा 3सी),उनके आणविक कार्य, उनके सेलुलर डिब्बे, या किसी अन्य जीन ऑन्टोलॉजी वर्गीकरण। जब संभव हो तो सेल के पूर्ण प्रोटेम के साथ इस सर्वव्यापी प्रोटेम की तुलना करना दिलचस्प है। दरअसल, यह विश्लेषण विशिष्ट प्रक्रियाओं जैसे अनुवाद या प्रोटेओलिसिस में इन सर्वव्यापी प्रोटीन के वास्तविक योगदान को प्रकट करता है(चित्रा 3सी)।

इस प्रकार के प्रयोग का मुख्य उद्देश्य उदाहरण के लिए उपचार द्वारा प्रेरित सर्वव्यापी प्रोटेम के भीतर परिवर्तनों की पहचान करना है, यहां gemcitabine। विशिष्ट सूत्र का उपयोग करके इलाज और अनुपचारित कोशिकाओं में सर्वव्यापी (सर्वव्यापी विशिष्ट प्रोटेम) की तुलना करके -100 (सर्वव्यापकता का दमन) से +100 (सर्वव्यापकता का शामिल होना) तक मूल्य की पैदावार करता है। केवल नीचे के मूल्यों को ध्यान में रखते हुए -50 या उससे ऊपर +50 महत्वपूर्ण के रूप में, कुल 73 प्रेरित सर्वव्यापकता और 29 दमित सर्वव्यापकता की पहचान की गई है(चित्र4ए)। सर्वव्यापकता के इन परिवर्तनों के जीएसईए विश्लेषण से डीएनए मरम्मत प्रक्रियाओं या सेल चक्र में विशिष्ट संवर्धन और अनुवाद और आरएनए मेटाबोलिक प्रक्रियाओं(चित्र4बी)में महत्वपूर्ण भिन्नताओं का पता चला। यह परिणाम अत्यधिक तार्किक है क्योंकि जेसिटासिन एक आधार एनालॉग है जो डीएनए संश्लेषण को अवरुद्ध करता है और डीएनए हर्जाना भड़काता है।

आगे बढ़ने के लिए, सर्वव्यापकता(चित्रा 5)के रत्नसिटाइन प्रेरित परिवर्तनों द्वारा गठित संभावित बातचीत नेटवर्क का पता लगाने और मान्य करने के लिए प्रोटीन को बातचीत करने के डेटाबेस का उपयोग करना भी दिलचस्प है। इसके कारण कार्यात्मक इंटरैटिंग नेटवर्क की पहचान दृढ़ता से शामिल प्रोटीन की वृद्धि या घटकर सर्वव्यापकता से प्रभावित हुई।

अंत में, बदल सर्वव्यापकता के बीच, कुछ साहित्य के अनुसार अपने ज्ञात या संभावित कार्यों के कारण, उच्चतम ब्याज के प्रोटीन शामिल हो सकते हैं । इसलिए, एक महत्वपूर्ण कदम यह मान्य करना है कि बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा जो मनाया जाता है वह वास्तविक और भरोसेमंद है। पीसीएनए मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण(चित्र4ए)द्वारा पता लगाए गए जेसिटाबिन उपचार पर सबसे अधिक सर्वव्यापी प्रोटीन में से एक था। यह सत्यापित करने के लिए कि gemcitabine वास्तव में PCNA के सर्वव्यापीता लाती है, MiaPaCa-2 कोशिकाओं को व्यक्त 6HF-Ub और GFP बड़े हो रहे हैं, इलाज या नहीं, और या तो नी-NTA शुद्धि के अधीन निंदा शर्तों में या विरोधी झंडा इम्यूनोप्रिसिपेटेशन के लिए झंडा द्वारा पीछा देशी परिस्थितियों में पेप्टाइड एल्यूशन, एसडीएस पेज पर हल किया गया और उसके बाद इसी एंटीबॉडी के साथ पश्चिमी दाग। चित्रा 6 में दिखाए गए परिणाम ने पुष्टि की कि वास्तव में पीसीएनए को MiaPaCa-2 कोशिकाओं में gemcitabine उपचार के जवाब में दृढ़ता से सर्वव्यापी है।

Figure 1
चित्रा 1: स्थिर सेल लाइनों की स्थापना 6His-झंडा-Ubl व्यक्त । (क) जीएफपी में जीएफपी अभिव्यक्ति का नियंत्रण कोशिकाओं (ऊपरी पैनल) और 6उसके-फ्लैग-यूबीक्विटिन को प्रतिरक्षण द्वारा एंटी-फ्लैग (एम2) एंटीबॉडी का उपयोग करके प्राथमिक और एलेक्सा-567 एंटी-माउस सेकेंडरी एंटीबॉडी के रूप में प्रतिकार किया गया है। DAPI का उपयोग नाभिक को दाग देने के लिए किया गया था। स्केल बार: 50 μm. (B) 6His-Flag-Ubiquitin अभिव्यक्ति का नियंत्रण पश्चिमी दाग द्वारा सेल lysates में विरोधी झंडा एंटीबॉडी का उपयोग कर (वैकल्पिक रूप से, एक विरोधी 6अपने एंटीबॉडी का इस्तेमाल किया जा सकता है) बाईं ओर, और विरोधी सर्वव्यापक एंटीबॉडी, दाईं ओर, अभिव्यक्ति की तुलना करने के लिए 6His-Flag-Ubiquitin (6HF-Ubiq) के साथ एंडोजेनस यूबीक्विटिन (एंडो) । यूबीक्यू) । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: सर्वव्यापी प्रोटीन की दो कदम शुद्धि। (क) प्रक्रिया का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व । (ख) अंतिम एल्यूशन का 10% एसडीएस पेज के अधीन था जिसके बाद अलग प्रोटीन की मात्रा और शुद्धता (जीएफपी की तुलना में) का अनुमान लगाने के लिए जेल की चांदी का धुंधला होना था । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: सर्वव्यापी प्रोटीन की पहचान (बोनासी एट अल से अनुकूलित। 7) (क) प्रत्येक चिन्हित प्रोटीन के लिए विशिष्ट (सर्वव्यापी नमूना) और गैर-विशिष्ट (जीएफपी नमूना) पेप्टाइड्स की सापेक्ष मात्रा उनके आत्मविश्वास स्कोर के कार्य में रची गई थी । जैसा कि दिखाया गया है, सर्वव्यापी प्रोटीन पर गैर-विशिष्ट का अनुपात ५० के स्कोर से बहुत नीचे बहुत महत्वपूर्ण हो जाता है । इसलिए, केवल 50 से बेहतर स्कोर के साथ पहचाने जाने वाले प्रोटीन को महत्वपूर्ण माना जाता है। (ख) तालिका में 364-कुल पहचान किए गए 20 सर्वश्रेष्ठ सर्वव्यापी प्रोटीन ों को दर्शाया गया है। (ग) जैविक प्रक्रियाओं के भीतर सर्वव्यापी प्रोटीन और MiaPaCa-2 कोशिकाओं के कुल प्रोटीन का पुनर्विभाजन (मूल्य ों और 15% पर ही विचार किया गया था)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: Gemcitabine पीटीएम प्रोफाइल के परिवर्तन प्रेरित (Bonacci एट अल से अनुकूलित । 7) (क) जेसिटाबिन उपचार पर उच्चतम वृद्धि (कुल 73) या कमी (कुल 29) सर्वव्यापीीकरण वाले 20 प्रोटीनों की सूची(कंफ: आत्मविश्वास; इंड: इंडक्शन; प्रतिनिधि: दमन) । (ख) जेसिटाबिन के पुनर्विभाजन ने जैविक प्रक्रियाओं के भीतर परिवर्तन सर्वव्यापीता और गैर-उपचारित के साथ तुलना को प्रेरित किया । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5: रत्नसिटाइन के कार्यात्मक इंटरैक्टॉमी ने परिवर्तन किए गए सर्वव्यापकता को प्रेरित किया। सर्वव्यापकता के रत्न प्रेरित परिवर्तन के साथ सभी प्रोटीन के बीच संभावित बातचीत एक प्रोटीन प्रोटीन इंटरैक्शन डेटाबेस (स्ट्रिंग: string-db.org) का उपयोग करके पहचानकी जाती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 6
चित्रा 6: दिलचस्प रत्नके जैव रासायनिक सत्यापन ने सर्वव्यापकता के परिवर्तन ों को प्रेरित किया। रत्नसिटाइन उपचार के बाद पीसीएनए की बढ़ी हुई सर्वव्यापकता को मान्य करने के लिए, 6एचएफ-यूबिक्विटिन व्यक्त करने वाली कोशिकाओं के लाइसेट्स, जेसिटाबिन के साथ इलाज किया गया या नहीं, निकेल पुल-डाउन (नी-एनटीए) के अधीन थे जिसके बाद एंटी-पीसीएनए वेस्टर्न ब्लॉट थे। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

हमने मुख्य सर्वव्यापक परिवार के सदस्यों द्वारा संशोधित प्रोटीन की प्रोफाइल उत्पन्न करने के लिए एक मजबूत और विश्वसनीय पद्धति विकसित की है। दरअसल, हमने सर्वव्यापकता द्वारा पीटीएमएस की प्रोफाइल उत्पन्न करने के लिए और सुमो और नेड8 द्वारा भी इस प्रोटोकॉल को लागू किया है, और एक निश्चित जीन की अभिव्यक्ति या नॉकडाउन के जवाब में उपचार7से जुड़े परिवर्तनों का पता लगाने के लिए (डेटा नहीं दिखाया गया है) और कोशिकाओं में है कि विविध कीमोथेरेपी दवाओं के लिए एक प्रतिरोधी फेनोटाइप हासिल की ।

प्रक्रिया के दौरान केवल कुछ महत्वपूर्ण कदम हैं जिनसे जोड़तोड़ को सावधान रहना चाहिए। मोतियों (नी-एनटीए या एंटी-फ्लैग युग्मित) के पाइपिंग पर, उन्हें अच्छी तरह से निलंबित करना महत्वपूर्ण है, विशेष रूप से विरोधी ध्वज मोतियों के बाद से एक चिपचिपा ग्लाइसेरोल आधारित बफर में निलंबित कर दिया जाता है, और अनुभाग को बढ़ाने के लिए टिप के अंत में थोड़ा कटौती करने के लिए। मोतियों के ढेर से बचने के लिए धीरे-धीरे पिपेट करना एक और सावधानी बरतनी चाहिए। अतिरिक्त महत्वपूर्ण कदम इमिडाजोल के साथ और फिर फ्लैग पेप्टाइड के साथ एल्यूशन हैं। एक साफ हैमिल्टन सिरिंज से बचने के लिए elution के बाद supernatant ठीक करने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए, जितना मोतियों पर गैर विशिष्ट प्रोटीन रहते है की संभव पाइपिंग के रूप में ज्यादा ।

सेल प्रकार और बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री के लिए आवश्यक अंतिम सामग्री की मात्रा के आधार पर, प्रारंभिक सामग्री को तदनुसार बढ़ाया या घटाया जा सकता है। फिर, केवल महत्वपूर्ण समायोजन निकल मोतियों की मात्रा में रहता है क्योंकि यह लाइसेट में प्रति 1 मिलीग्राम प्रोटीन 2 μL का होना चाहिए। ऐसा हो सकता है कि शुद्ध प्रोटीन की मात्रा बहुत कम हो। टैग यूबी/यूबीएल के अभिव्यक्ति स्तर को नियंत्रित किया जाना चाहिए और, यदि यह बहुत कम है, तो कोशिकाओं को एक ही लेंटिवायरस का उपयोग करके फिर से स्थानांतरित किया जा सकता है । वैकल्पिक रूप से, शुरू की गई सामग्री की मात्रा में वृद्धि संभव है। कभी-कभी, जीएफपी या माता-पिता की कोशिकाओं में गैर-विशिष्ट शुद्ध सामग्री की मात्रा बहुत अधिक होती है। इस समस्या को दूर करने के लिए एक समाधान दोनों नी-एनटीए और ध्वज शुद्धिकरण कदम ों पर मात्रा और वॉश की संख्या में वृद्धि हो रही है । ग्वानिडीन बफर के साथ वॉश में इमिडाजोल की एकाग्रता को 20 एमएम तक बढ़ाना भी संभव है। उलटा, अंतिम एल्यूशन चरण में फ्लैग पेप्टाइड की एकाग्रता बढ़ाना आवश्यक नहीं है क्योंकि इससे एल्यूशन नहीं बढ़ेगा। समय के साथ ताजा पेप्टाइड का उपयोग करना अधिक महत्वपूर्ण है, भले ही -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया गया हो, पेप्टाइड की प्रभावकारिता कम हो सकती है।

इस प्रोटोकॉल की मुख्य सीमा यह है कि यह केवल सुसंस्कृत कोशिकाओं के लिए उपयुक्त है क्योंकि उन्हें वांछित टैग यूबीएल को व्यक्त करने के लिए ट्रांसड्यू किया जाना चाहिए। इसलिए, ऊतकों या ट्यूमर के नमूनों पर किसी भी अध्ययन के लिए इस तरह के ट्राइप्सिन पाचन11के बाद diGly पेप्टाइड्स संवर्धनके रूप में वैकल्पिक दृष्टिकोण का उपयोग कर प्रदर्शन किया जाना है, Ub के लिए विशिष्ट एंटीबॉडी के साथ इम्यूनोप्रिसिपेटेशन/ TUBEs6। ये सभी वैकल्पिक तरीके सुसंस्कृत कोशिकाओं में अपने आवेदन के लिए भी उपयुक्त हैं। उन्हें एंडोजेनियस यूबी/यूबीएलएस मशीनरी का इस्तेमाल करने का फायदा मिलता है । हालांकि, कई कमियां मौजूद हैं। इम्यूनोप्रिसिप्रिशन कम पृष्ठभूमि के साथ किया जाना मुश्किल है और, जैसे TUBEs दृष्टिकोण, संशोधित प्रोटीन के साथ बातचीत प्रोटीन, और यहां तक कि संशोधक ही, समाप्त नहीं किया जा सकता है, भले ही व्यावहारिक सुधार का उपयोग कर प्राप्त किया गया है अधिक कठोर शर्तें। डिग्ली पेप्टाइड्स संवर्धन एक बहुत शक्तिशाली टेक्नीक है लेकिन विभिन्न प्रकार के पीटीएमएस के अनुरूप हो सकता है। उदाहरण के लिए, ट्राइप्सिन डाइजेस्ट लाइसेट से डिग्ली संवर्धन मुख्य रूप से सर्वव्यापी प्रोटीन की पहचान करेगा, लेकिन यह भी नकारा हुआ है, क्योंकि नेड8 एक ही अवशेष डिग्गी हस्ताक्षर छोड़ देता है जैसा कि सर्वव्यापी11करता है।

इस प्रोटोकॉल की एक और सीमा यह है कि 6His-Flag टैग की उपस्थिति Ub/Ubl के सामांय समारोह में परिवर्तन कर सकते है और अपने आप में अतिअभिव्यक्ति मशीनरी बदल सकता है । उदाहरण के लिए यह पॉलीयूबीक्विटिन चेन की पीढ़ी को बाधित कर सकता है और मोनोयूब्किटिनेशन के पक्ष में हो सकता है। हालांकि, चूंकि इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके मोनो मल्टी और पॉलीयूबीक्विटिन दोनों श्रृंखलाओं की पहचान की गई है, ऐसा लगता है कि यह7मामला नहीं है। एन-टर्मिनस पर टैग की उपस्थिति रैखिक सर्वव्यापकता के गठन को भी रोकती है, जहां सर्वव्यापकता मोइकेट्स को सर्वव्यापकता के एन-टर्मिनल मेथियानोइन के माध्यम से एक साथ जोड़ा जाता है। हालांकि, भले ही 6HF-udiquitin अपनी पहली मुलाकात अवशेषों पर सर्वव्यापी नहीं किया जा सकता है, यह अभी भी श्रृंखला के इस तरह के अंत करने की क्षमता है ।

इसके अलावा, जबकि लेंटिवायरस का उपयोग करना एक पर्याप्त लाभ है जो एक या दो सप्ताह में स्थिर कोशिकाओं लाइनों के निर्माण को सक्षम बनाता है, यह संभव है कि सभी कोशिकाएं वांछित निर्माण को व्यक्त नहीं करेंगी। यह शुद्धिकरण प्रक्रिया के लिए एक वास्तविक समस्या नहीं हो सकती है जब तक कि पर्याप्त कोशिकाएं बहिर्जात यूबी/यूबीएल को व्यक्त करती हैं, लेकिन समस्या दीर्घकालिक संस्कृति के साथ आ सकती है क्योंकि कई मार्गों पर कम या नहीं के साथ कोशिकाओं में संवर्धन के साथ एक क्लोनल भिन्नता हो सकती है अभिव्यक्ति. हालांकि, इस दोष को आसानी से एक प्रतिरोध चयन जीन या फ्लोरोसेंट प्रोटीन युक्त लेंटिवायरस का उपयोग करके नजरअंदाज किया जा सकता है जिसका उपयोग केवल सकारात्मक कोशिकाओं का चयन करने के लिए प्रवाह साइटोमेट्री में किया जा सकता है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस काम को ला लिग कॉन्ट्रे ले कैंसर द्वारा एचवी और एमएस को समर्थन दिया गया था, और एआरसी (एसोसिएशन पीएना ला रेचेचे सुर ले कैंसर) पीएस, आईएनसीए (इंस्टीट्यूट नेशनल ड्यू कैंसर) और कैंसरपोल पीएसीए को जीआई। आईबीआईएसए (इंफ्रास्ट्रक्चर्स बायोलॉजी सैंटे एट एग्रोनोमी), प्लेटफोर्म टेक्नोलोजिसिक एक्स-मार्सिले, कैनेरोपोले पैका, प्रोवेंस-आल्प्स-कोटे डी अज़ूर द्वारा समर्थित मार्सिले प्रोटेओमिक्स (marseille-proteomique.univ-amu.fr) की द्रव्यमान स्पेक्ट्रोमेट्री सुविधा रेगिओन, इंस्टीट्यूट पाओली-लेसेट्स और सेंटर डी रेचेचे एन कैनसेरोलोजी डी मार्सिले।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ANTI-FLAG M2 Affinity Gel Sigma-Aldrich A2220-5ML binds all Flag tagged proteins
anti-Flag M2 antibody Sigma-Aldrich F3165 to detect 6His-Flag tagged expression of ub/ubl
Cell strainer 40 µm Falcon 352350 to remove floating pellet from guanidine lysed cells
Flag peptide Sigma-Aldrich F3290 elute flag tagged proteins from anti-flag beads
Guanidine hydrochloride Sigma-Aldrich 50933 chaotropic agent used to denature all proteins in cell lysate
Imidazole Sigma-Aldrich I5513 eluates 6His bond proteins from Ni-NTA beads
Lipofectamine 3000 ThermoFisher L3000015 to transfect HEK-293T cells to produce lentiviruses
Lobind tubes Sigma-Aldrich Z666491 avoids absorption of precious material
Membrane Filter, 0.45 µm Millipore HAWP04700F1 to filter the lentiviral supernantant
Ni-NTA Qiagen 30210 purification of the 6His tag

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References

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