分析泛性基质和泛性基质样的依从性转化后修饰和重大改变的识别

Biochemistry

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Summary

该协议旨在建立泛素 (Ub) 和泛素样 (Ubls) 特定蛋白酶,以便识别与特定条件(如治疗或表型)相关的此类翻译后修饰 (PTM) 的更改。

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Swayden, M., Dobric, A., Berthois, Y., Villalba, H., Audebert, S., Camoin, L., Iovanna, J., Soubeyran, P. Profiling Ubiquitin and Ubiquitin-like Dependent Post-translational Modifications and Identification of Significant Alterations. J. Vis. Exp. (153), e60402, doi:10.3791/60402 (2019).

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Abstract

蛋白质的泛素(ub)和泛素样(ubl)依赖性转化后修饰通过控制蛋白质稳定性、活性、相互作用和细胞内定位,在细胞内发挥基本的生物调节作用。它们使细胞能够响应信号并适应其环境的变化。这些机制内的改变可能导致严重的病理情况,如神经退行性疾病和癌症。此处描述的技术的目的是从培养的细胞系快速准确地建立 ub/ubls 依赖型 PTM 配置文件。比较从不同条件下获得的不同轮廓,可以识别特定的改变,例如治疗引起的改变。Lentiviral介导细胞转导用于创建稳定的细胞系,表达修饰剂的双标记(6His和Flag)版本(泛素或ubl,如SUMO1或Nedd8)。这些标签允许从细胞中纯化泛基蛋白,因此也允许泛泛蛋白。这通过两步纯化过程完成:第一个在变性条件下使用 6His 标记执行,第二个在本机条件下使用 Flag 标记执行。这导致对修饰蛋白进行高度特异性和纯分离,随后通过液相色谱技术进行识别和半量化,然后采用串联质谱法(LC-MS/MS)技术。使用 Excel 软件对 MS 数据进行轻松的信息化分析,通过消除背景信号,可以建立 PTM 配置文件。这些配置文件在每个条件之间进行比较,以便确定具体的变化,然后更具体地研究,从标准生物化学技术验证开始。

Introduction

这里提出的方法致力于研究由培养的哺乳动物细胞中泛素家族成员介导的PTM,以便识别与特定条件(治疗、分化等)相关的潜在变化。PTM代表蛋白质功能调节的最后一步1。事实上,一旦由翻译机制产生,大多数(如果不是全部)蛋白质会经历不同类型的PTM,调节其活性、分子相互作用和细胞内位置1。在过多的PTM中,由无素蛋白家族、泛素本身和所有泛素样子介导,具有调节所有细胞内或部分细胞质蛋白2的潜力。因为它们本身是蛋白质,它们可以相互结合,形成不同拓扑的同质和异质链,每个与特定的调控函数2相关。需要工具来尝试破译和理解这个复杂的机器。世界各地的许多方法都是开发的,各有优缺点,在这里,我们提出了一种适合培养细胞的高性能方法。

该方法的主要优点是精度高。事实上,通过组合使用两个标记(6His和Flag)和两个步骤过程,分离修饰蛋白的纯度大大提高,因此它比单个标记融合Ub/Ubl3,4更具选择性。6His 标签的存在使纯化在完全变性条件下迈出了第一步,从而避免了任何含有泛素结合域的蛋白质或与泛素结合的其他蛋白质结合。这是一个技术问题,其他几个方法基于亲和纯化泛化蛋白酶使用特定抗体5或串联泛性结合元素(TUBEs)6。重要的是,这种技术没有偏向于对某种泛化的纯化,因为其他一些方法可能如此,因为单体和不同种类的多聚体被识别7。因此,一旦发现,泛化的变化将不得不更详细地研究标准生化方法,以确定所涉及的完全化的确切类型。

最后,该协议的另一个技术优势是使用慢病毒,它可以轻松快速地创建稳定的表达细胞系,具有合理的标记修饰剂表达水平,而不会干扰正常的细胞行为。

虽然泛化的一个重要作用是靶向蛋白进行蛋白体降解,但现在已知它具有许多其他调节特性,可能大多数细胞内或部分细胞内蛋白质1。这些功能的数量进一步增加与许多泛素像蛋白质的存在,形成一个蛋白质家族调节几乎每一个细胞机制1。它们的改变会对细胞生物学产生剧烈的影响,并可能导致或参与病理情况8,癌症9。因此,需要工具来探索这一广阔的景观,并确定与病理学疾病相关的改变,可以作为新的治疗目标。

该协议专用于培养中的细胞,因为它们需要转导以表达外源标记 Ub/Ubl。一旦创建,这些稳定的细胞系可用于从 2D 或 3D 或异种移植培养物中生成 Ubl 轮廓,从而扩展可用于研究 PTM 轮廓的不同实验模型的视野。

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Protocol

1. 生成表示 6His-Flag-Ubl 的稳定细胞系

注:用pCCL-6HF-Ubl、pVSVG和增量帮助器联合转染HEK-293T细胞。

  1. 第0天:种子293T细胞在6孔板获得50-70%汇合后天。
  2. 第1天:联合转染50-70%的转染细胞,混合1μgpCL-6HF-Ubl或pCCL-GFP,1μgpVSVG和1μg的增量-帮助剂载体,使用转染试剂和试剂生产慢病毒。转染6小时后,将培养基改为与要转导的细胞对应的新鲜介质。将细胞分在6孔盘中,以便在后天(开始转导的当天)获得10-20%的汇合。
  3. 第2天:转染后24小时,使用0.45 μm过滤器回收含有慢病毒颗粒的培养基和过滤器。如果需要,此时添加新的培养基,以便产生第二批慢病毒。用含有慢病毒的细胞取代转导细胞的培养基(10-20%汇合)。
    注:伦蒂病毒介质可在转导前在+4°C下保存数天,或在-80°C下储存数月。
  4. 在标准培养箱(37°C,CO2)中孵育24小时至72小时之间的慢病毒细胞,然后改变培养基,用于新的标准培养基。如果可能,使用倒置荧光显微镜检查GFP表达,以评估转导效率:表达细胞的百分比和每个细胞的相对表达水平。如果未检测到荧光,则等待额外的 2-3 天,因为表达可能需要更长的时间,具体取决于要转导的细胞类型。
  5. 如果GFP控制为阳性,则生长所有细胞,直到有足够的功能,通过免疫荧光和西方斑点使用抗旗抗体执行6HF-Ubl的表达控制。

2. 改性蛋白质的双重纯化

注: 缓冲液1:6 M关尼迪-HCl,0.1M Na2HPO4/NaH2PO4,pH 8.0,0.5% Triton X-100。
缓冲液 2: 50 mM NaH2PO4, 150 mM NaCl, 1% Tween20, 5% 甘油, pH 8.0.
缓冲液3:100 mM NH4HCO3,pH 8.0。

  1. 细胞莱沙:一旦准备就绪,在室温(RT)下至少用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗一次培养皿,然后进行细胞变干,或者,在液体N2中闪冷冷冻,并储存在-80°C。对于莱沙,在RT处每15厘米的培养皿中加入2 mL的缓冲液1。使用细胞刮刀在50 mL圆锥形离心管中回收所有液分物(最终体积约为20 mL)。
  2. 以1分钟的停顿将分时三次,以30秒分开。
  3. 在15,000 x g下将声波莱沙离心15分钟。
  4. 使用细胞过滤器(40 μm)将上清液转移到新管中。
  5. 确定样品的浓度,并在必要时进行调整,以获得相同量的蛋白质和相同的体积。使用总含量在50至100毫克的蛋白质(10个直径为15厘米的MiaPaCa-2细胞)。
  6. 加入Ni2+-NTA珠子,使用每1毫克蛋白质2μL的珠子。
  7. 在 RT 处的 2.5 小时内以 30 rpm 转速旋转。
  8. 在 500 x g下将珠子颗粒 5 分钟。
  9. 用缓冲器1的1 mL清洗珠子,将样品转移到1.5 mL微离心管中,然后将管转移到冰上。在冰上或 4°C 处执行所有后续步骤。
  10. 用含有10 mM imidazole的1 mL冰冷缓冲液2洗涤两次。
  11. 要洗去结合蛋白,加入含有250 mM imidazole的缓冲液2600μL,并在4°C下旋转2小时。
  12. 在500 x g下离心将珠子离心1分钟,将上生子转移到新的预冷却1.5 mL管中,并加入50μL的抗Flag M2抗体偶联珠。
  13. 在 4°C 下以 30 rpm 旋转 2.5 小时,然后用 500 μL 的缓冲液 2 洗涤 2 次,然后用 500 μL 的缓冲液 3 洗涤 2 次。
  14. 对于最终洗脱,加入100 μL的缓冲液3,在0.1 μg/μL处加入含有标记肽的缓冲液3,并在4°C下旋转1.5小时。
  15. 在 500 x g下离心 1 分钟,并将上生子转移到新的预冷却管中。
  16. 在 SDS-PAGE 上加载 10% (10 μL),对凝胶进行银染色,以控制纯化质量。如果纯化看起来良好,则分析 LC-MS/MS 留下的 90%。

3. 处理质谱数据,生成 Ub/Ubls PtM 的配置文件,并确定它们之间的显著差异

注:MS分析的结果包含许多信息,包括肽的总数以及每个样本中标识的每个蛋白质的峰值面积值(TOP 3肽面积10的平均值)。这些数据可以使用肽计数数或峰值面积值处理,或两者兼而有之。对于峰值区域的计算,由于这些值通常位于 106的范围内,因此在应用与下面的相同公式之前,有必要按此顺序将它们除以。两种计数方法获得的结果应表现出与通常相同的很强的相关性。对于每个已识别的蛋白质,请使用以下公式:
v1未处理泛性青基辛样品中的肽值(例如Ub - 药物)
v2在 Gemcitabine 处理的泛性基辛样品中的肽值(例如 Ub + 药物)
k1未处理对照 GFP 样品中的 k1 肽值(例如,GFP - 药物)
k2肽值在Gemcitabine处理控制GFP样品(例如,GFP + 药物)。

  1. 规范化:使用以下公式使多宝他金和GFP的药物治疗细胞和未处理细胞之间的值正常化。规范化 v = V 和规范化 k = K。
    V1_v1。([v1] [v2) / (2. [v1) ;V2_v2。([v1] [v2] / (2. [v2) ]
    K1_k1.([k1] [k2) / (2. [k1) ;K2_k2.([k1] [k2] / (2. [k2)
  2. 去除背景:使用以下公式,从泛化蛋白样本中的值中减去对照样本 (GFP) 中的值,以获得两种情况下每个已识别蛋白质的特定值 (V'1 和 V'2)。
    如果 V1-K1=0,则 V'1=V1-K1;如果 V1-K1_lt;0,V'1=0
    如果 V2-K2=0 ,则 V'2=V2-K2;如果 V2-K2_lt;0,V'2 =0
  3. 泛化的变异(Var)。要获得药物引起的 PTM 正差和负变化的分数(介于 -100 和 +100 之间),请使用以下公式,其中处理过的样本和未经处理的样本的特定值之间的差值除以所有值的总和,包括控制(惩罚在控制GFP中也识别的蛋白质),并乘以100。
    Var = (V'2-V'1)/(V1_K1_V2_K2)=100 ;-100低于 -50(PTM 的抑制)或高于 50(PTM 的感应)的变异通常被认为是显著的。
  4. 信心(信任)。使用以下公式获取介于 0 和 100% 之间的置信值:
    Conf = ((V1+V2)2/(1+V1_V2_K1+K2)2)=100 - 100/(1+V'1+V'2);如果 <0
    高于 50 的值通常被认为是自信的。
  5. 为了获得归纳/抑制值的更好分布,并考虑变异和置信参数,请使用以下公式将 Var 和 Conf 值相乘,其中 V Var 和 C Conf
    [SI(V2>0;((V2+C2)+2)/(10+6);-((V2+C2)2)/(10+6))
    注:由于峰值面积值通常比肽计数更准确,因此可以使用专用于解释此类数据的特定软件,如 Perseus (https://www.biochem.mpg.de/5111810/perseus),以下使用建议。

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Representative Results

培养哺乳动物细胞的转导,以创建GFP和6HF-Ub表达细胞
为了产生以后用于转导MiaPaCa-2细胞的慢病毒,70%的转化HEK-293T细胞与三种载体(pCCL-6HF-Ubiquitin或GFP/Delta-Helper/pvSvG)的等量共同转染。生产24小时后,回收并过滤含有慢病毒颗粒的介质。此时,通过检查在倒置显微镜上表达 293T 细胞的 GFP 的绿色荧光,可以控制转染效率。它应该接近100%的细胞。MiaPaCa-2细胞用慢病毒上清液孵育1至3天。慢病毒转导的疗效首先通过观察GFP转导细胞的GFP荧光(图1A上面板)加以控制。GFP表达水平可能因细胞而异,但其中100%应该是荧光的。一旦完成此控制,也必将控制标志泛基丁的表达。这是通过使用抗旗抗体(通常是M2单克隆)的免疫荧光染色来实现的(图1A面板)。这将显示转导细胞的百分比,这应该是100%,以保证细胞培养的未来通道的稳定表达。为了控制外源标志-泛基的表达水平,通过SDS-PAGE分析来自转导细胞的解结物,然后用抗旗抗体分析西方斑点(图1B)。两个细胞系都可以冻结。

SDS PAGE 和银染色两步净化和控制
一旦稳定表达细胞系得到验证,GFP和6HF-泛素细胞被扩增,直到获得足够的材料,以便进行两步纯化。建议将这些细胞系作为冷冻库存在液氮中保存,以便在需要时将其解冻。处理前36小时,一半的细胞(一半GFP和一半6HF-Ubiquitin)用10μM的Gemcitabine处理。准备好后,使用两步纯化方案(图2A),从6HF-泛基蛋白和GFP对照细胞中纯化泛化蛋白。最终洗脱的10%用于通过SDS-PAGE和凝胶的银染色来控制纯化材料的数量和完整性(图2B)。分子量标记带可用于估计纯化泛化蛋白质的量。或者,已知数量的BSA或任何其他蛋白质可以加载到凝胶的一行,以帮助量化纯化的蛋白质。一旦完成此验证,其余 90% 的样品通过液相色谱与串联质谱相结合进行分析,以便对纯化蛋白质进行识别和半定量。

通过背景(GFP样本)减法识别泛化蛋白
来自样品的LC-MS/MS分析数据给出了GFP和6HF-Ub样品中每个已识别蛋白质的名称和定量(峰值区域和观察到的肽数)。与GFP样本相比,在泛素样品中定量最高的蛋白质最有可能是真正无泛化的蛋白质,应用上述方法中描述的公式,通过给出从0到100%的置信度分数来进行分类.得分超过50%的蛋白质被认为是无泛的(图3A)。

这一步骤,基本上去除背景蛋白(GFP)从泛化蛋白样品导致识别364蛋白质显着泛化(图3B)7。请注意,识别得分最高的蛋白质大多已被称为泛化的主要靶点,这证明了这种纯化方法的有效性。

然后,可以对这些泛化蛋白质进行基因集扩增分析(GSEA),以突出它们所涉及的生物过程(图3C),其分子功能,细胞隔间,或任何其他基因本体分类。有趣的是,将这个无处不在的蛋白酶与细胞的完整蛋白酶进行比较(如果可能的话)。事实上,这种分析揭示了这些泛化蛋白在特定过程中(例如翻译或蛋白解)中的实际贡献(图3C)。

这种实验的主要目的是识别由一种治疗引起的泛泛蛋白酶内的改变,例如,这里Gemcitabine。通过比较使用特定配方处理和未处理细胞中的泛化蛋白酶(泛化特异性蛋白酶)的值从-100(抑制泛化)到+100(诱导泛化)。只考虑低于 -50 或高于 +50 值为显著值,共确定了 73 种诱导性泛化和 29 种抑制性泛化(图 4A)。GSEA对这些泛化变化的分析揭示了DNA修复过程或细胞周期中的具体富集,以及翻译和RNA代谢过程的重要变化(图4B)。这一结果非常合乎逻辑,因为Gemcitabine是一种基础模拟物,可以阻断DNA合成并引发DNA损伤。

更进一步,使用相互作用的蛋白质数据库来探索和验证由Gemcitabine诱导的泛化改变形成的潜在相互作用网络也很有趣(图5)。这导致识别功能相互作用网络受到相关蛋白质的增或减少的普遍性的严重影响。

最后,在改变的泛化中,有些可能涉及最高感兴趣的蛋白质,因为根据文献,它们已知或潜在的功能。因此,一个重要的步骤是验证质谱所观察到的是否真实可信。PCNA是质谱分析检测到的Gemcitabine处理中超泛化的蛋白质之一(图4A)。为了验证Gemcitabine确实诱导PCNA的泛化,MiaPaCa-2细胞表达6HF-Ub和GFP的细胞被生长、处理或不,并在变性条件下接受Ni-NTA纯化或抗Flag免疫沉淀,然后旗肽在原生条件下洗脱,在SDS PAGE上解析,然后用相应的抗体解决西部斑点。图6所示的结果证实,在MiaPaCa-2细胞中,PCNA确实具有很强的泛化反应。

Figure 1
图1:建立表示6His-Flag-Ubl的稳定细胞系。(A)利用抗旗(M2)抗体作为原发抗体和alexa-567抗小鼠二级抗体,通过免疫荧光控制GFP转导细胞(上面板)和6His-Flag-Ubiquitin的GFP表达。DAPI被用来染色核。刻度条:50 μm.(B)在左侧使用抗Flag抗体(或者,可以使用抗6-6的抗体)控制细胞裂解物中的6His-Flag-泛素表达,并在右侧比较该表达6His-Flag-Ubiquitin (6HF-Ubiq) 与内源性泛基质 (Endo.乌比克)。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 2
图2:泛化蛋白的两步纯化。(A)程序的原理表示。(B)最终洗脱的10%被SDS PAGE,然后是凝胶的银染色,以估计分离蛋白的数量和纯度(与GFP相比)。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 3
图3:泛化蛋白的鉴定(改编自博纳契等人)。7(A)每种已识别蛋白质的特异性(泛基蛋白样品)和非特异性(GFP样本)肽的相对量绘制在其自信分数的函数中。如图所示,非特异性蛋白质的比例在低于50分时变得过于重要。因此,只有得分高于50的蛋白质才被认为重要。(B)显示已确定的364种蛋白质中20种最佳泛化蛋白的表。(C)在生物过程中对MiaPaCa-2细胞的泛化蛋白质和总蛋白进行再分区(仅考虑价值>1.5%)。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 4
图4:Gemcitabine诱导的PTM轮廓改变(改编自博纳奇等人。7(A)列出20种蛋白质在宝石治疗时增加最多(共73种)或减少(共29种)的普遍性(Conf:信心;内:感应;代表:镇压)。(B)在生物过程中诱导的Gemcitabine诱导的变通量的再分区,并与未经处理的比较。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 5
图5:宝石诱导改变的泛化功能相互作用。使用蛋白质-蛋白质相互作用数据库(STRING:string-db.org)识别所有与Gemcitabine诱导的泛化改变的蛋白质之间的潜在相互作用。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 6
图6:有趣的宝石化基丁的生物化学验证诱导泛化改变。为了验证Gemcitabin治疗后PCNA的普遍性增加,对表达6HF-泛基丁的细胞的赖萨莱斯进行分解,无论是否使用Gemcitabine,都进行镍下拉(Ni-NTA),然后是抗PCNA西斑。请点击此处查看此图的较大版本。

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Discussion

我们已经开发出一种强大而可靠的方法,用于生成由主要泛性家族成员修饰的蛋白质的配置文件。事实上,我们已经成功地应用了该协议,通过泛素、SUMO和Nedd8生成PTM的配置文件,并检测与治疗7相关的改变,以回应特定基因的过度表达或敲除(数据不显示)和在细胞中获得对各种化疗药物的耐药表型。

在操作程序过程中,操作者应小心的只是几个关键步骤。移液珠子(Ni-NTA 或抗旗耦合)时,必须彻底重新悬浮它们,尤其是抗旗珠,因为悬浮在粘稠的甘油缓冲液中,并稍微切一点尖端末端以增加部分。另一个预防措施是慢慢移液,以避免珠子堆叠。其他关键步骤是用imidazole洗脱,然后用Flag肽洗脱。清洁的汉密尔顿注射器必须用于在洗脱后回收上清液,以避免尽可能移液非特异性蛋白质的珠子。

根据质谱所需的细胞类型和所需最终材料的数量,起始材料可能会相应增加或减少。然后,唯一重要的调整在于镍珠的体积,因为它应该是2 μL每1毫克的赖萨特蛋白质。可能发生在纯化蛋白质的量太低。标记 Ub/Ubl 的表达水平应得到控制,如果过低,可以使用相同的慢病毒重新转导细胞。或者,可以增加起始材料的数量。有时,GFP 或亲细胞中非特异性纯化物质的含量过高。克服此问题的一个解决方案是增加 Ni-NTA 和 Flag 纯化步骤的处理量和次数。在用瓜尼丁缓冲液的乳液中增加伊米达索的浓度,高达20 mM。反之,没有必要在最后洗脱步骤中增加Flag肽的浓度,因为它不会增加洗脱。随着时间的推移,使用新鲜肽更为重要,即使储存在-20°C,肽的疗效也可能降低。

该协议的主要限制是,它只适用于培养的细胞,因为它们必须转导以表示所需的标记Ubl。因此,任何对组织或肿瘤样本的研究都必须使用替代方法进行,如胰蛋白酶消化后二G利肽富集11、免疫沉淀与感兴趣的Ub/Ubl5特有的抗体,或使用图特斯6.所有这些替代方法也适用于其在培养细胞中的应用。它们具有使用内源性 Ub/Ubls 机械的优势。但是,存在一些缺点。免疫沉淀很难在低背景下进行,而且,像TUBEs方法一样,与修饰的蛋白质相互作用的蛋白质,甚至修饰剂本身,都无法消除,即使使用已经得到实际改进更严格的条件。二Gly肽浓缩是一种非常强大的技术,但可能对应于不同类型的PTM。例如,从胰蛋白酶消化的利沙中扩能将识别主要无泛化的蛋白质,但也识别内氨酸蛋白,因为Nedd8留下与泛素相同的残余二Gly签名11。

该协议的另一个限制是,6His-Flag 标记的存在可能会改变 Ub/Ubl 的正常功能,而过度表达本身可能改变机械。例如,这可能阻碍多聚酰金链的产生,并倾向于单一二体化。然而,由于单数多链和多聚二苯基金链已被识别使用该协议,它似乎不是这种情况7。在N端的标签的存在也防止了线性泛化的形成,其中泛素通过泛素的N端蛋氨酸连接在一起。然而,即使6HF-udiquitin不能在其第一个Met残留物上被泛化,它仍然有能力结束这种链。

此外,虽然使用慢病毒能够在一两周内创建稳定的细胞线是一个显著的优势,但并非所有细胞都表达出所需的结构。对于纯化过程来说,这可能不是真正的问题,只要有足够的细胞表达外源性Ub/ubl,但问题可能来自长期培养,因为在几个段落中,在具有较少或没有的细胞中,富集的克隆变异可能存在。表达。然而,通过使用含有抗性选择基因或荧光蛋白的慢病毒,这种缺点很容易被绕过,这种病毒可用于流式细胞测定,只选择正细胞。

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Disclosures

作者没有什么可透露的。

Acknowledgments

这项工作得到了癌症癌症与HV和MS的La Ligue Contre le,以及ARC(癌症再癌症协会)到PS、INCa(国家癌症研究所)和癌症PACA到JI的支持。马赛蛋白质组学(marseille-proteomique.univ-amu.fr)的质谱设施,由IBISA(基础设施生物学圣特和阿格罗诺米)、Plateforme技术系统艾克斯-马赛、坎塞罗佩莱PACA、普罗旺斯-阿尔卑斯-阿尔特斯-阿祖尔大学支持格雷戈里翁、保利-卡尔梅特研究所和马赛研究中心。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ANTI-FLAG M2 Affinity Gel Sigma-Aldrich A2220-5ML binds all Flag tagged proteins
anti-Flag M2 antibody Sigma-Aldrich F3165 to detect 6His-Flag tagged expression of ub/ubl
Cell strainer 40 µm Falcon 352350 to remove floating pellet from guanidine lysed cells
Flag peptide Sigma-Aldrich F3290 elute flag tagged proteins from anti-flag beads
Guanidine hydrochloride Sigma-Aldrich 50933 chaotropic agent used to denature all proteins in cell lysate
Imidazole Sigma-Aldrich I5513 eluates 6His bond proteins from Ni-NTA beads
Lipofectamine 3000 ThermoFisher L3000015 to transfect HEK-293T cells to produce lentiviruses
Lobind tubes Sigma-Aldrich Z666491 avoids absorption of precious material
Membrane Filter, 0.45 µm Millipore HAWP04700F1 to filter the lentiviral supernantant
Ni-NTA Qiagen 30210 purification of the 6His tag

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References

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