ユビキチンおよびユビキチン様依存性翻訳後修飾のプロファイリングと有意な変化の同定

Biochemistry

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Summary

このプロトコルは、治療または表現型などの特定の状態に関連するこれらの種類の翻訳後修飾(PTM)の変化を同定するために、ユビキチン(Ub)およびユビキチン様(Ubls)特異的プロテオームを確立することを目的としています。

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Swayden, M., Dobric, A., Berthois, Y., Villalba, H., Audebert, S., Camoin, L., Iovanna, J., Soubeyran, P. Profiling Ubiquitin and Ubiquitin-like Dependent Post-translational Modifications and Identification of Significant Alterations. J. Vis. Exp. (153), e60402, doi:10.3791/60402 (2019).

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Abstract

ユビキチン(ub)およびユビキチン様(ubl)依存性タンパク質の翻訳後修飾は、タンパク質の安定性、活性、相互作用、および細胞内局在を制御することにより、細胞内の基本的な生物学的調節的役割を果たします。それらは細胞が信号に応答し、環境の変化に適応することを可能にする。これらのメカニズム内の変更は、神経変性疾患や癌などの深刻な病理学的状況につながることができます。ここで説明する技術の目的は、培養細胞株からub/ubls依存PTMプロファイルを迅速かつ正確に確立することです。異なる条件から得られた異なるプロファイルの比較は、例えば治療によって誘発されるような特定の変化の同定を可能にする。レンチウイルス媒介細胞伝達は、修飾剤(ユビキチンまたはSUMO1またはNedd8のようなubl)の2タグ(6HisおよびFlag)バージョンを発現する安定な細胞株を作成するために行われる。これらのタグは、ユビキチンの精製を可能にし、したがって、細胞からのユビキチン化タンパク質の。これは 2 段階の精製プロセスを通じて行われます: 最初の 1 つは 6His タグを使用して変性状態で実行され、2 番目のタグは Flag タグを使用してネイティブ状態で実行されます。これは、その後、液体クロマトグラフィーによって同定され、半定量され、タンデム質量分析(LC-MS/MS)技術が続く、非常に特異的かつ純粋な修飾タンパク質の単離につながります。Excelソフトウェアを使用したMSデータの容易な情報分析により、バックグラウンド信号を排除することでPTMプロファイルの確立が可能になります。これらのプロファイルは、標準的な生化学技術による検証から始めて、より具体的に研究される特定の変化を識別するために、各条件間で比較されます。

Introduction

ここで提案される方法は、特定の状態(治療、分化など)に関連する潜在的な変化を同定するために、培養哺乳動物細胞からユビキチンファミリーメンバーによって媒介されるPTMを研究することに専念している。PTMはタンパク質の機能の調節の最後のステップを表す 1.実際、一度翻訳機械によって製造されると、ほとんどのタンパク質は、その活性、分子相互作用、および細胞内位置1を調節する異なる種類のPTMを受けるわけではない。PTMの多くは、タンパク質のユビキチンファミリーによって媒介されるもの、ユビキチン自体およびすべてのユビキチン様、細胞内または部分的に細胞質タンパク質2を調節する可能性を有する。それらはそれ自体がタンパク質であるため、互いに共役することができ、多様なトポロジの均質および異種鎖を形成し、それぞれが特定の調節機能に関連する2。この複雑な機械を解読し、理解するためには、ツールが必要です。多くのアプローチは、独自の長所と短所を持って、世界中で開発され、ここでは培養細胞に適した高性能なものを提案します。

この方法の主な利点は、その精度です。実際、単離された修飾タンパク質の純度は、2つのタグ(6HisとFlag)と2つのステップ手順の組み合わせ使用によって高度に改善され、したがって、単一のタグ融合Ub/Ubl3、4よりもはるかに選択的である。6Hisタグの存在は、完全変性状態での精製の第一段階を可能にし、それによってユビキチン結合ドメインまたはユビキチン化されたものに結合する他のタンパク質を含むタンパク質の共精製を回避する。これは、特異的抗体5またはタンデムユビキチン結合要素(TUBEs)6のいずれかを用いたユビキチン化プロテオームの親和性精製に基づく他のいくつかのアプローチによって遭遇する技術的問題である。重要なことに、この技術は、モノおよび異なる種類の多言語の両方が7を同定したので、いくつかの他のアプローチの場合と同様に、特定のタイプのユビキチン化の精製を支持するバイアスではない。したがって、いったん発見されると、ユビキチン化の変化は、関連するユビキチン化の正確な種類を特定するために、標準的な生化学的アプローチによってより詳細に検討されなければなりません。

最後に、このプロトコルのもう一つの技術的な利点は、レンチウイルスの使用であり、それは容易かつ迅速に、正常な細胞挙動を妨げることなく、タグ付き修飾剤の妥当なレベルの発現を有する安定した発現細胞株を作成する。

ユビキチン化の重要な役割の1つはプロテアソーム分解のためのタンパク質を標的とすることであるのに対し、潜在的に最も細胞内または部分的に細胞内タンパク質1に対する他の多くの調節特性を有することが知られている。これらの機能の数は、タンパク質のような多くのユビキチンの存在によってさらに増強され、ほぼすべての細胞機構を調節するタンパク質のファミリーを形成する1.彼らの改変は、細胞生物学に大きな影響を与える可能性があり、癌9のような病理学的状況8を導いたり、参加したりすることができる。したがって、ツールは、この広大な風景を探索し、新しい治療目標として役立つことができる病理学的状態に関連する変化を識別するために必要とされます。

このプロトコルは、励起タグ付き Ub/Ubl を発現するために伝達する必要があるため、培養中の細胞専用です。これらの安定した細胞株を作成すると、2Dまたは3Dまたは異種移植片の培養物からUblプロファイルを生成し、PTMプロファイルの研究に適用できるさまざまな実験モデルの地平線を拡張することができます。

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Protocol

1. 6His-Flag-Ublを発現する安定細胞株の生成

注:pCCL-6HF-Ubl、pVSVGおよびデルタヘルパーを用いたHEK-293T細胞の共トランスフェクション。

  1. 0日目:6ウェルプレート中の種子293T細胞は、翌日に50〜70%の合流を得た。
  2. 1日目:pCCL-6HF-UblまたはpCCL-GFPの1μg、pVSVGの1μgおよびデルタヘルパーベクターの1μgを組み合わせた50〜70%のコンフルエントセルを、レンチウイルス製造のためのトランスフェクション試薬およびプロトコルを使用する。トランスフェクションの6時間後、培地を形質転換する細胞に対応する新鮮なものに変える。6ウェルプレートに形質導入される細胞を播種し、翌日(転起開始日)に10〜20%の合流を得た。
  3. 2日目:トランスフェクション後24時間、レンチウイルス粒子を含む培地を回収し、0.45μmフィルターを用いてフィルターをろ過する。必要に応じて、この時点で新鮮な培地を追加して、レンチウイルスの2番目のバッチを生成します。トランスフェクトされる細胞の培地(10~20%合流)をレンチウイルスを含むものに置き換えます。
    注:レンチウイルス培地は、転移前に数日間+4°Cに保つか、または-80°Cで数ヶ月間保存することができます。
  4. 標準インキュベーター(37°、5%CO2)で24時間~72時間の間にレンチウイルスを含む細胞をインキュベートし、新鮮な標準のものの培地を交換します。可能であれば、反転蛍光顕微鏡を用いてGFP発現をチェックし、伝達の効率を評価する:発現細胞の割合と細胞当たりの相対的な発現レベル。蛍光が検出されない場合は、形質転換される細胞の種類に応じて発現に時間がかかる場合があるため、さらに2〜3日待ちます。
  5. GFP対照が陽性の場合、抗Flag抗体を用いて免疫蛍光およびウェスタンブロットによる6HF-Ublの発現制御を行うのに十分な量を有するまで、すべての細胞を増殖させる。

2. 修飾タンパク質の二重精製

注: バッファー 1: 6 M グアニジニウム HCl, 0.1 M Na2HPO4/NaH2PO4, pH 8.0, 0.5% トリトン X-100.
バッファー 2: 50 mM NaH2PO4,150 mM NaCl, 1% Tween20, 5% グリセロール, pH 8.0.
バッファ 3: 100 mM NH4HCO3, pH 8.0.

  1. 細胞リシス:準備ができたら、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)を室温(RT)で少なくとも1回洗浄し、細胞リシスに進むか、または、液体N2でフラッシュ凍結し、-80°Cで保存する。リシスの場合は、RTで15cm皿あたり2mLのバッファー1を追加し、細胞スクレーパーを使用して50 mL円錐遠心管(最終体積約20mL)ですべてのリサートを回収します。
  2. 1分間の休止で分離した30sのリサートを3回超音波処理します。
  3. 超音波処理されたリザースを15分間15,000 x gで遠心分離します。
  4. 細胞ストレーナー(40μm)を使用して新しいチューブに上清を移します。
  5. サンプルの濃度を決定し、必要に応じて調整して、同じ量のタンパク質と同じ体積を得ます。50~100mg(MiaPaCa-2細胞の直径15cmの10品)の間のタンパク質の総量を使用してください。
  6. タンパク質1mgあたり2μLのビーズを使用して、Ni2+-NTAビーズを追加します。
  7. RTで2.5時間の間に30 rpmで回転させます。
  8. 5分間500×gでビーズをペレット。
  9. バッファー1の1 mLでビーズを洗浄し、サンプルを1.5 mLマイクロ遠心管に移し、氷上でチューブを移します。氷または4°Cですべての次のステップを実行します。
  10. 10 mM イミダゾールを含む氷冷バッファー 2 の 1 mL で 2 回洗浄します。
  11. 結合タンパク質を溶出するには、250 mM イミダゾールを含むバッファー 2 の 600 μL を追加し、4 °C で 2 時間回転します。
  12. 500 x gで遠心分離してビーズをペレット化し、新しい予冷された 1.5 mL チューブに上清を移し、50 μL の抗フラグ M2 抗体コンジュゲートビーズを追加します。
  13. 30 rpmで4°Cで2.5時間回転させ、バッファ2の500 μLで2回洗浄し、次いでバッファ3の500 μLで2回洗浄します。
  14. 最終的な溶出には、0.1μg/μLのフラグペプチドを含むバッファ3を100μL加え、4°Cで1.5時間回転させます。
  15. 500 x gで1分間遠心分離し、新しい予冷チューブに上清を移します。
  16. SDS-PAGEに10%(10°L)を取り、ゲルの銀染色を行い、精製品質を制御します。精製が良好に見える場合は、LC-MS/MSが残した90%を分析します。

3. 質量分析データの処理により、Ub/Ubls PTM のプロファイルを生成し、それらの間の有意な相違点を特定する

注:MS分析の結果には、各サンプルで同定された各タンパク質の合計数のペプチドとピーク面積値(TOP 3ペプチド領域10の平均)を含む多くの情報が含まれています。これらのデータは、ペプチド数数またはピーク面積値、あるいはその両方を用いて処理することができる。ピーク面積を使用した計算では、これらの値は通常106の範囲にあるため、以下と同じ式を適用する前に、この順序で除算する必要があります。カウントの両方の方法論で得られた結果は、通常と同様に強い相関関係を示す必要があります。同定されたタンパク質ごとに、次の式を使用します。
非処理ユビキチン試料中のv1ペプチド値(例えば、Ub - 薬物)
ゲムシタビン処理ユビキチン試料中のv2ペプチド値(例えば、Ub+薬物)
非処理対照GFP試料中のk1ペプチド値(例えば、GFP - 薬物)
ゲムシタビン処理コントロールGFP試料中のk2ペプチド値(例えば、GFP+薬物)。

  1. 正規化: 次の式を使用して、ユビキチンと GFP の薬物処理細胞と未処理細胞の間の値を正規化します。正規化 v = V および正規化された k = K.
    V1=v1.(≥v1+ ≥v2) / (2. v1) ;V2=v2.(≥v1+ ≥v2) / (2. ≥v2)
    K1=k1.(≥k1+ ≥k2) / (2. ≥k1) ;K2=k2.(≥k1+ ≥k2) / (2.
  2. 背景の除去:次の式を使用して、ユビキチンサンプルの値から対照サンプル(GFP)の値を減算し、両方の条件で同定されたタンパク質ごとに特定の値(V'1およびV'2)を得る。
    V'1=V1-K1 の場合 V1-K1≥0;V'1=0 (V1-K1<0 の場合)
    V'2=V2-K2 の場合 V2-K2≥0;V'2 =0 の場合 V2-Lt;0
  3. ユビキチンの変動(Var)。薬物によって誘導されるPTMの正と負の変動のスコア(-100と+100の間)を得るために、処理されたサンプルと未処理サンプルの特定の値の差を、以下のものを含むすべての値の合計で除算する次の式を使用します。制御(コントロールGFPでも同定されたタンパク質を罰する)を、100を掛ける。
    Var = (V'2-V'1)/(V1+K1+V2+K2)*100 ;-100-50 (PTM の抑圧) または 50 を超えるバリエーション (PTM の誘導) は、通常、有意と見なされます。
  4. 自信(Conf)。0 ~ 100% の信頼度値を取得するには、次の式を使用します。
    Conf = ((V1+V2)2/(1+V1+V2+K1+K2)2(*100 - 100/(1+V'1+V'2) ;値 0 (<0)
    50 を超える値は、通常、自信を持っていると見なされます。
  5. 誘導/抑圧値のより良い分布を取得し、変動パラメータと信頼パラメータの両方を考慮するには、V VarとC Confの次の式を使用してVarとConfの値を乗算します。
    =SI(V2>0;((V2*C2)^2)/(10^6);-(V2*C2)^2)/(10^6))
    注:ピーク面積の値は通常、ペプチドカウントよりも正確であるため、ペルセウス(https://www.biochem.mpg.de/5111810/perseus)のようなこの種のデータの解釈に特化した特定のソフトウェアを使用することが可能です。使用の推奨事項。

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Representative Results

培養哺乳動物細胞の伝達は、GFPおよび6HF-Ub発現細胞を作成する
MiaPaCa-2細胞をトランスデュースするために後で使用されるレンチウイルスを産生するために、70%コンフルエントHEK-293T細胞は、pCCL-6HF-ユビキチンまたはGFP/デルタヘルパー/pvSvGの3つのベクターの等量で共トランスフェクされる。24時間の製造後、レンチウイルス粒子を含む培地を回収し、濾過する。この時点で、反転顕微鏡で293T細胞を発現するGFPの緑色蛍光をチェックすることによりトランスフェクションの効率を制御することができる。これは、細胞の100%近くである必要があります。MiaPaCa-2細胞は、レンチウイルス上清を1〜3日間インキュベートする。レンチウイルス導入の有効性は、まずGFP形質細胞のGFP蛍光を見ることによって制御される(図1A上部パネル)。GFP発現量は細胞によって異なるが、その100%は蛍光でなければならない。この制御が完了すると、Flag-ubiquitin の式も制御する必要があります。これは、抗Flag抗体(通常M2モノクローナル)を用いた免疫蛍光染色によって行われる(図1A下部パネル)。これは、細胞培養の将来の通路上で安定した発現を保証するために100%であるべき形で、形質転換された細胞のパーセンテージを示す。発芽性Flag-ubiquitinの発現レベルを制御するために、トランスデュード細胞からの溶解物は、SDS-PAGEによって分析され、続いて抗Flag抗体を用いたウェスタンブロットが続く(図1B)。両方の細胞株を凍結することができる。

SDS PAGEおよび銀染色による2つのステップの精製および制御
安定発現細胞株が検証されると、GFPおよび6HF-ユビキチン細胞の両方が、2段階の精製を進めるために十分な材料が得られるまで増幅される。必要に応じて解凍できるように、液体窒素中の凍結ストックとしてこれらの細胞株のバックアップを維持することをお勧めします。処理前に36時間、細胞の半分(半分GFPおよび半分6HF-ユビキチン)は、10μMのゲムシタビンで処理される。準備ができたら、ユビキチン化タンパク質は、6HF-ユビキチンおよびGFP対照細胞から、2段階精製プロトコルを用いて精製される(図2A)。最終溶出の10%は、ゲルのSDS-PAGEおよび銀染色による精製材料の量および完全性を制御するために使用される(図2B)。分子量マーカーバンドは、精製されたユビキチン化タンパク質の量を推定するために使用することができる。あるいは、既知の量のBSAまたは他のタンパク質をゲルのラインにロードして、精製されたタンパク質を定量するのに役立つことができる。この検証が完了すると、残りの90%のサンプルが液体クロマトグラフィーによってタンデム質量分析法に結合され、精製タンパク質の同定と半定量を可能にします。

背景によるユビキチン化タンパク質の同定(GFPサンプル)減算
サンプルのLC-MS/MS分析からのデータは、GFPおよび6HF-Ubサンプル中の各同定タンパク質の名前と定量(ピーク領域および観察されたペプチドの数)を与える。GFPサンプルと比較してユビキチン試料中で最も高い定量を有するタンパク質は、実際にユビキチン化されたものである可能性が最も高く、上記の方法で説明した式を適用すると、0〜100%の信頼度スコアを与えることによって分類が可能になる.50%を超えるスコアで同定されたタンパク質は、ユビキチン化されたものと考えられています(図3A)。

基本的にユビキチン試料からバックグラウンドタンパク質(GFP)を除去するこのステップは、364個のタンパク質の同定に著しくユビキチン化することにつながった(図3B)7.ここで、最も高いスコアで同定されたタンパク質は、この精製方法の有効性を証明するユビキチン化の主な標的として既に知られていることに注意してください。

次に、これらのユビキチン化タンパク質の遺伝子セット濃縮解析(GSEA)を行い、それらが関与している生物学的プロセスを強調することができる(図3C)、その分子機能、その細胞コンパートメント、または他の遺伝子オントロジー分類。可能であれば、このユビキチン化プロテオームと細胞の完全なプロテオームを比較することは興味深い。実際、この分析は、例えば翻訳やタンパク質分解などの特定のプロセスにおけるこれらのユビキチン化タンパク質の本当の寄与を明らかにする(図3C)。

この種の実験の主な目的は、例えばここでゲムシタビンの治療によって誘導されるユビキチン化プロテオーム内の変化を同定することです。特定の式を用いた処理細胞および未処理細胞におけるユビキチノム(ユビキチン化特異的プロテオーム)を比較することにより、-100(ユビキチン化の抑制)から+100(ユビキチン化誘導)までの値が得られます。-50 以下の値または+50 を超える値のみを有意と考えると、合計 73 個の誘導的なユビキションと 29 の抑圧されたユビキションが同定されています (図 4A)。これらのユビキチン化の変化に関するGSEA分析は、DNA修復プロセスまたは細胞周期における特異的な濃縮、および翻訳およびRNA代謝過程における重要な変動を明らかにした(図4B)。ゲムシタビンはDNA合成をブロックし、DNA損傷を引き起こす塩基類似体であるため、この結果は非常に論理的です。

さらに、ゲムシタビン誘導性ユビキチン化の変化によって形成される潜在的な相互作用ネットワークを探索し、検証するために相互作用タンパク質のデータベースを使用することも興味深い(図5)。これは、関与するタンパク質のユビキチン化の増加または減少によって強く影響を受ける機能的相互作用ネットワークの同定につながった。

最後に、変化したユビキチン化の中で、文献に従って既知または潜在的な機能のために、最も関心の高いタンパク質を含むものもある。したがって、質量分析によって観察されるものが現実的で信頼できることを検証する重要なステップの 1 つです。PCNAは、質量分析分析によって検出されたゲムシタビン処理時に最も過剰にユビキチン化されたタンパク質の1つであった(図4A)。ゲムシタビンが実際にPCNAのユビキチン化を誘導することを確認するために、6HF-UbおよびGFPを発現するMiaPaCa-2細胞は増殖し、治療されるか、または未成熟状態でNi-NTA精製されるか、またはフラグに続く抗フラグ免疫沈降の対象となる天然条件でのペプチド溶出は、SDS PAGE上で解決され、続いて対応する抗体を有するウェスタンブロットを有する。図6に示す結果は、ミアパCa-2細胞におけるゲムシタビン治療に応答して、実際にPCNAが強くユビキチン化されることを確認した。

Figure 1
図1:6His-Flag-Ublを発現する安定細胞株の確立(A)GFP形質細胞におけるGFP発現の制御(上部パネル)および6His-Flag-Ubiquitinの抗フラグ(M2)抗体を原発性およびalexa-567抗マウス二次抗体として用いた免疫蛍光による。DAPIは核を染色するために使用された。スケールバー:50μm.(B)抗フラグ抗体を用いたウェスタンブロットによる細胞溶解における6His-Flag-Ubiquitin発現の制御(代わりに、抗6his抗体を使用することができます)、右側に抗ユビキチン抗体、式を比較する内因性ユビキチン(エンド.)ユビク)。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 2
図2:ユビキチン化タンパク質の2段階精製(A)プロシージャの概略表現。(B)最終溶出の10%をSDS PAGEに供し、続いてゲルの銀染色を行い、単離されたタンパク質の量および純度(GFPと比較して)を推定した。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 3
図3:ユビキチン化タンパク質の同定(ボナッチらから適応した。7)。(A)同定されたタンパク質ごとに対する特異的(ユビキチン試料)および非特異的(GFPサンプル)ペプチドの相対量は、その自信度の高いスコアの関数でプロットされた。図に示すように、ユビキチン化タンパク質に対する非特異的な割合は、スコア50を下回りすぎて重要になります。したがって、50より優れたスコアで同定されたタンパク質のみが有意であると考えられる。(B)同定された364の中で20の最高のユビキチン化タンパク質を示す表。(C)生物学的過程におけるMiaPaCa-2細胞のユビキチン化タンパク質および総タンパク質の再パーティション化(値>1.5%のみと考えられた)。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 4
図4:PTMプロファイルのゲムシタビン誘導変化(ボナッチらから適応した。7)。(A)ゲムシタビン治療時に最も高い増加(合計73)または減少(合計29)ユビキチン化を有する20個のタンパク質のリスト(Conf: 自信;Ind: 誘導;担当者: 抑圧)。(B)ゲムシタビンの再パーティションは、生物学的プロセス内の変化したユビキチン化および非処理との比較を誘導した。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 5
図5:ゲムシタビンの機能的相互作用は、変化したユビキチン化を誘発した。ユビキチン化のゲムシタビン誘導変化を有するすべてのタンパク質間の潜在的な相互作用は、タンパク質間相互作用データベース(STRING:string-db.org)を使用して同定される。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 6
図6:興味深いゲムシタビンの生化学的検証は、ユビキチン化の変化を誘発した。ゲムシタビン処理後のPCNAのユビキチン化の増加を検証するために、6HF-ユビキチンを発現する細胞の溶解物を、ゲムシタビンで処理するかまたはしないか、ニッケルプルダウン(Ni-NTA)に続いて抗PCNAウェスタンブロットを行った。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

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Discussion

私たちは、主要なユビキチンファミリーメンバーによって修飾されたタンパク質のプロファイルを生成するための堅牢で信頼性の高い方法論を開発しました。実際、このプロトコルを適用して、ユビキチン、およびSUMOとNedd8によってPTMのプロファイルを生成し、特定の遺伝子の過剰発現またはノックダウンに応じて治療7に関連する変更を検出することに成功しました(データはそうではありません)示されている)、および多様な化学療法薬に対する耐性表現型を獲得した細胞において。

マニピュレータが注意する必要がある手順中の重要な手順はごくわずかです。ビーズ(Ni-NTAまたはアンチフラッグ結合)のピペットの場合、粘性グリセロールベースのバッファーに懸濁されているので、特にアンチフラグビーズを徹底的に再サスペンドし、先端の端部を少しカットしてセクションを増やすことが重要です。もう一つの予防措置は、ビーズの積み重ねを避けるためにゆっくりとピペットすることです。追加の重要なステップは、イミダゾールとフラグペプチドとの溶出です。きれいなハミルトン注射器は、非特異的タンパク質が残っているビーズのピペットをできるだけ避けるために、溶出後に上清を回収するために使用する必要があります。

質量分析に必要な最終材料のセルタイプと量に応じて、開始材料はそれに応じて増減する場合があります。次いで、唯一の重要な調整は、リサート中のタンパク質の1mg当たり2μLでなければならないので、ニッケルビーズの体積に存在する。精製タンパク質の量が少なすぎることがあります。タグ付きUb/Ublの発現レベルを制御し、低すぎる場合は、同じレンチウイルスを使用して細胞を再感染させることができます。あるいは、出発物質の量を増やすることができる。場合によっては、GFPまたは親細胞における非特異的精製材料の量が多すぎる。この問題を解決する 1 つの解決策は、Ni-NTA とフラグの両方の精製手順で、体積とワッシュの数を増やすことです。また、グアニジン緩衝液を有するワッシュ中のイミダゾールの濃度を20mMまで増加させることもできる。逆に、溶出を増加させないほど、最終溶出工程でFlagペプチドの濃度を上げる必要はない。新鮮なペプチドを時間の経過とともに使用することがより重要であり、-20°Cで保存しても、ペプチドの有効性が低下する可能性がある。

このプロトコルの主な制限は、所望のタグ付きUblを発現するために形質化されなければならないので、培養細胞にのみ適しているということです。したがって、組織または腫瘍サンプルに関する研究は、トリプシン消化11後のdiGlyペプチド濃縮、目的のUb/Ublに特異的な抗体による免疫沈降、またはの使用などの代替アプローチを使用して行う必要があります。チューブス6.これらすべての代替方法は、培養細胞におけるその適用にも適している。彼らは内因性Ub /Ubls機械を使用する利点があります。ただし、いくつかの欠点があります。免疫沈降は低い背景で行うのが難しく、TUBEsのアプローチのように、修飾されたタンパク質と相互作用するタンパク質、さらには修飾剤自体を使用して実用的な改善が得られたとしても、排除することはできません。より厳しい条件。DiGlyペプチド濃縮は非常に強力な技術ですが、異なる種類のPTMに対応する可能性があります。例えば、トリプシン消化リサートからのdiGly濃縮は、主にユビキチン化タンパク質だけでなく、ネディ化されたタンパク質を同定し、Nedd8はユビキチンと同じ残骸のジグリー署名を残すので11である。

このプロトコルのもう一つの制限は、6His-Flagタグの存在がUb/Ublの通常の機能を変更し、過剰表現自体が機械を変更する可能性が高いことです。これは、例えば、ポリウビキチン鎖の生成を妨げ、モノユビキチン化を支持する可能性があります。しかし、このプロトコルを用いてモノマルチ鎖とポリウビキチン鎖の両方が同定されているため、ケース7ではないようです。N末端にタグが存在すると、ユビキチンのN末端メチオニンを介してユビキチン部分が一緒に連結される線形ユビキチンの形成も防止される。しかし、6HF-udiquitinは、その最初のMet残基でユビキチン化することはできませんが、それはまだこの種の鎖を終了する能力を持っています。

また、1~2週間で安定な細胞株の作成を可能にするレンチウイルスを用いることは実質的な利点であるのに対し、全ての細胞が所望の構成体を発現するとは限らない。十分な細胞が外部性Ub/ublを発現する限り、これは精製手順にとって本当の問題ではないかもしれませんが、いくつかの通路にわたるクローンの変化が少ないか、またはまったくない細胞でクローンの変動が生じる可能性があるため、長期的な培養が問題になる可能性があります。式。しかしながら、この欠点は、抵抗選択遺伝子または蛍光タンパク質を含むレンチウイルスを用いて、陽性細胞のみを選択するフローサイトメトリーに使用することができることで容易に迂回することができる。

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Disclosures

著者たちは何も開示する必要はない。

Acknowledgments

この研究は、HVとMSにラ・リーグ・コントル・ル・ガン、ARC(協会はPS、INCa(国立デュガン研究所)とJIへのガノポールPACAに対して支援されました。IBISA(インフラ生物学サンテ・エ・アグロノミー)が支援するマルセイユ・プロテオミクス(marseille-proteomique.univ-amu.fr)、プレートフォルム・テクノロジー・エクス=マルセイユ、カンセロポールPACA、プロヴァンス=アルプ=コート・ダジュールレギオン、パオリ・カルメッテス美術館、レシェルシュ・アン・カンセロロジー・ド・マルセイユ美術館。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ANTI-FLAG M2 Affinity Gel Sigma-Aldrich A2220-5ML binds all Flag tagged proteins
anti-Flag M2 antibody Sigma-Aldrich F3165 to detect 6His-Flag tagged expression of ub/ubl
Cell strainer 40 µm Falcon 352350 to remove floating pellet from guanidine lysed cells
Flag peptide Sigma-Aldrich F3290 elute flag tagged proteins from anti-flag beads
Guanidine hydrochloride Sigma-Aldrich 50933 chaotropic agent used to denature all proteins in cell lysate
Imidazole Sigma-Aldrich I5513 eluates 6His bond proteins from Ni-NTA beads
Lipofectamine 3000 ThermoFisher L3000015 to transfect HEK-293T cells to produce lentiviruses
Lobind tubes Sigma-Aldrich Z666491 avoids absorption of precious material
Membrane Filter, 0.45 µm Millipore HAWP04700F1 to filter the lentiviral supernantant
Ni-NTA Qiagen 30210 purification of the 6His tag

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References

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