Integrering av bioinformatikmetoder och experimentella valideringar för att förstå rollen av notch signalering i äggstocks cancer

Cancer Research

Your institution must subscribe to JoVE's Cancer Research section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Bioinformatik är ett användbart sätt att bearbeta storskaliga datauppsättningar. Genom att genomföra bioinformatikmetoder kan forskarna snabbt, tillförlitligt och effektivt erhålla insiktsfulla tillämpningar och vetenskapliga upptäckter. Denna artikel visar utnyttjandet av bioinformatik i äggstockscancer forskning. Det också framgångsrikt validerar bioinformatik resultat genom experiment.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Defreitas, S., Rowe, M., Paculis, L., Jia, D. Integration of Bioinformatics Approaches and Experimental Validations to Understand the Role of Notch Signaling in Ovarian Cancer. J. Vis. Exp. (155), e60502, doi:10.3791/60502 (2020).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Notch signalering är en mycket bevarad reglerings väg inblandade i många cellulära processer. Dysreglering av denna signalering väg leder ofta till störningar med rätt utveckling och kan även resultera i initiering eller progression av cancer i vissa fall. Eftersom denna väg tjänar komplexa och mångsidiga funktioner, det kan studeras utförligt genom många olika metoder. Av dessa ger bioinformatik en onekligen kostnadseffektiv, lättillgänglig och användarvänlig metod för studier. Bioinformatik är ett användbart sätt att extrahera mindre bitar av information från storskaliga datauppsättningar. Genom att genomföra olika bioinformatikmetoder kan forskarna snabbt, tillförlitligt och effektivt tolka dessa stora dataset, vilket ger insiktsfulla tillämpningar och vetenskapliga upptäckter. Här presenteras ett protokoll för integration av bioinformatik metoder för att undersöka rollen av notch signalering i äggstockscancer. Dessutom är bioinformatikfynd validerade genom experiment.

Introduction

Den notch signalering vägen är en mycket bevarad väg som är viktig för många utvecklingsprocesser inom biologiska organismer. Notch signalering har visat sig spela en viktig roll i cell spridning och självförnyelse, och defekter i notch signalering vägen kan leda till många typer av cancer1,2,3,4,5,6. I vissa fall, den notch signalering vägen har kopplats till både vävnad tillväxt och cancer samt celldöd och tumör dämpning7. Flera notch receptorer (NOTCH 1 − 4) och co\u2012activator Mastermind (MAML 1 − 3), alla med olika funktioner, lägga till en ytterligare nivå av komplexitet. Medan notch signalvägen är sofistikerad när det gäller funktioner, är dess kärna väg enkel på molekylär basis8. Notch receptorer fungerar som transmembrana proteiner består av extracellulära och intracellulära regioner9. En ligand bindning till den extracellulära regionen av notch receptorer underlättar proteolytiska klyvning, vilket gör att notch intracellulära domän (NiCd) att släppas ut i kärnan. NICD binder sedan till co\u2012activator Mastermind att aktivera nedströms genuttryck10.

Under de senaste åren har notch signalering visat sig spela en mängd olika roller i initiering och progression av flera typer av cancer mellan olika arter6,11. Till exempel, notch signalering har kopplats till uppkomst involverar Human NOTCH1 Gene12. Nyligen, den NOTCH2, NOTCH3, delta-liknande 3 (DLL3), mastermind\u2012like protein 1 (MAML1), och en avskräckande och metalloproteinas domain\u2012innehåller protein 17 (ADAM17) gener visade sig vara starkt förknippad med äggstockscancer, särskilt med den fattiga totala överlevnaden av patienter13.

Eftersom mängden experimentella och patient-associerade data ökar kontinuerligt, ökar även efterfrågan på analys av tillgängliga data. Tillgängliga data är spridda över publikationer, och de kan leverera inkonsekvent eller till och med motsägelsefulla fynd. Med utvecklingen av ny teknik under de senaste decennierna, såsom nästa generations sekvensering, har mängden tillgängliga data ökat exponentiellt. Även om detta är snabba framsteg inom vetenskap och möjligheter för fortsatt biologisk forskning, att bedöma innebörden av allmänt tillgängliga data för att lösa forskningsfrågor är en stor utmaning14. Vi tror att bioinformatik är ett användbart sätt att extrahera mindre delar av information från storskaliga datauppsättningar. Genom att genomföra olika bioinformatikmetoder kan forskarna snabbt, tillförlitligt och effektivt tolka dessa stora dataset, vilket ger insiktsfulla upptäckter. Dessa upptäckter kan variera från identifiering av potentiella nya läkemedels behandlingsmål eller sjukdoms biomarkörer till individanpassade patientbehandlingar15,16.

Själva bioinformatiken utvecklas snabbt, och tillvägagångssätten förändras ständigt när teknologiska framsteg sveper medicinsk och biologisk vetenskap. För närvarande omfattar gemensamma bioinformatikmetoder utnyttjandet av allmänt tillgängliga databaser och program för att analysera DNA-eller proteinsekvenser, identifiera gener av särskild relevans eller betydelse och fastställa relevansen av gener och genprodukter genom funktionsgenomik16. Även om bioinformatikområdet visserligen inte är begränsat till dessa metoder är dessa viktiga för att hjälpa kliniker och forskare att hantera biologiska data till gagn för patienterna som helhet.

Denna studie syftar till att belysa flera viktiga databaser och deras användning för forskning om notch signalvägen. NOTCH2, NOTCH3, och deras Co\u2012activator MAML1 användes som exempel för databasstudien. Dessa gener användes eftersom vikten av notch signalering väg i äggstockscancer har validerats. Systematiska analyser av hämtade data bekräftade vikten av notch signalering i äggstockscancer. Dessutom, eftersom notch signalering är väl bevarad över arter, bekräftades det att överuttryck av Drosophila MELANOGASTER NiCd och Mastermind tillsammans kan inducera tumörer i Drosophila äggstockar, stödja databasen fynd och betydande och bevarade roll notch signalering i äggstockscancer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Prediktion av kliniska resultat från genomiska profiler (PRECOG)

Obs: PRECOG-portalen (precog.stanford.edu) har åtkomst till offentligt tillgängliga data från 165 cancer uttrycks datamängder, inklusive gen uttrycks nivåer och kliniska patient utfall17. Det ger specifikt Meta\u2012Z analys, som innehåller stora datauppsättningar för att ge Z\u2012scores av olika gener i 39 cancertyper för att indikera patientens totala överlevnad. Fattiga och bra överlevnad anges med positiva och negativa Z\u2012score värden, respektive.

  1. Skapa ett konto med en akademisk ansluten e-post för att komma åt denna databas. Ange e-postadressen och lösenordet som är kopplat till kontot.
  2. Klicka på knappen Visa detaljer som finns under rubriken meta-Z-analys .
  3. Mata in genen av intresse i Sök fältet.
  4. Använd rullningslisten som finns längst ned på skärmen för att få överlevnad Z-Poäng för specifika cancertyp av intresse.

2. CSIOVDB

Obs: CSIOVDB (csibio.nus.edu.SG/CSIOVDB/CSIOVDB.html) är en microarray databas som utvecklats av cancer Science Institute of Singapore för att studera äggstocks cancer18. Denna databas innehåller uppgifter om karcinom från olika tumör platser samt normala äggstock vävnad data. Dessutom ger CSIOVDB Kaplan\u2012Meier överlevnads planer för att bedöma patientens överlevnad med differential gen uttrycks nivåer. CSIOVDB kan tillämpas för att undersöka sambandet mellan gen uttrycks nivåer och äggstockscancer stadier/kvaliteter.

  1. Mata in gen av intresse, klicka sedan på Sök knappen.
  2. Klicka på fliken sjukdomstillstånd .
    ANMÄRKNINGAR: den här fliken ger sammanfattande statistik över genuttryck av målgenen av intresse i äggstockscancer sjukdomstillstånd.
  3. Klicka på fliken histologi .
    ANMÄRKNINGAR: den här fliken ger sammanfattande statistik över genuttryck för målgenen av intresse för större ovarialcancerhistologier.
  4. Klicka på fliken Clinico-patologiska parametrar .
    ANMÄRKNINGAR: den här fliken ger en jämförelse av gen uttrycks nivåer bland olika äggstockscancer stadier, betyg och kliniska svar med Mann-Whitney tester.
  5. Klicka på fliken överlevnad .
    Obs: denna flik ger Kaplan-Meier tomter i samband med total överlevnad och Sjukdomsfri överlevnad. För denna databas, Sjukdomsfri överlevnad anses progression-och recidiv-fri överlevnad18. Multivariat analyser för överlevnad och Sjukdomsfri överlevnad återfinns också under denna flik. De multivariat analyser jämför funktioner som relaterar till äggstockscancer prognoser (skede, grad, kirurgiska desammanslagningar, histologi, ålder) och genen av intresse.
  6. Klicka på fliken undertyp .
    ANMÄRKNINGAR: den här fliken ger sammanfattande statistik och Mann-Whitney tester för uttrycksnivån av genen av intresse för molekylära subtyper av äggstockscancer. Denna flik ger också Kaplan-Meier tomter i samband med total överlevnad och Sjukdomsfri överlevnad av genen av intresse för molekylära subtyper av äggstockscancer.

3. genuttryck över normal och tumör vävnad (GENT)

Obs: den GENT portal (Medical \ u2012genome. kribb. re. kr/GENT) utvecklas och upprätthålls av Korea Research Institute of Bioscience och bioteknik (KRIBB)19. Den samlar in 16 400 (U133A; 241 dataset) och 24 300 (U133plus2; 306 datauppsättningar) allmänt tillgängliga prover. Efter standardisering, GENT erbjuder genuttryck data över olika vävnader, som är ytterligare indelade i tumör och normala vävnader.

  1. Klicka på fliken Sök längst upp på skärmen.
  2. I avsnittet märkt 1. Nyckelord, Välj gen symbol för termerna från rullgardinsmenyn, mata in gen symbolen för genen av intresse i det tomma området i nyckelords sektionen och välj vävnad för typ alternativet.
  3. Klicka på knappen Sök längst ner på 1. Nyckelords avsnittet. Det visar sammanfattande grafer av genuttryck i normala och tumör vävnader av olika cancertyper baserade på U133A och U122Plus2 plattformar.
    ANMÄRKNINGAR: det är valfritt att välja alternativet för data filtrering överst i sammanfattnings diagrammet för att ta fram en viss databas för att studera.
  4. Klicka på länken bredvid resultatdata hämtning för att få tillgång till detaljerad information om gen uttrycksvärden, vävnadstyper och data källor.

4. Broad Institute cancer cell linje Encyclopedia (CCLE)

Obs: ccle (Portals.broadinstitute.org/ccle) skapades av det breda Institutet och ger genomisk profiler och mutationer av 947 Human cancer cellinjer20.

  1. Mata in önskade gener i sökfältet och klicka sedan på Sök knappen.
  2. Klicka på alternativet mRNA-uttryck (RNAseq) i den nedrullningsbara menyn i avsnittet Välj datauppsättning.
    ANMÄRKNINGAR: andra alternativ inkluderar mRNA-uttryck (Affy), Achilles shRNA knockdownoch kopierings nummer.
  3. Klicka på knappen Växla alla spår . Välj den vävnadstyp av intresse från den grå rutan till höger. Rulla ned till skärmens nederkant och klicka på knappen Hämta mRNA-uttryck .
  4. Öppna det hämtade textdokumentet. Kopiera och klistra in all text i blad 1. Kopiera all text i arket 1.
  5. Klicka på arket på fliken kalkylbladsprogram blad 2 längst ned i kalkylarket. Rätt klick på det en kolonn, välja pasta speciell, och då välja den införliva valen i ark 2.
  6. När texten har transponerats i två kolumner på blad 2klickar du på den nedrullningsbara pilen för rubriken Sortera & filter alternativ och väljer sedan alternativet filter . En pil visas i rubrikområdet med etiketten Gene. Klicka på pilen och skriv in den vävnadstyp av intresse.
    Anmärkning: detta steg kommer att filtrera alla data och endast Visa gen uttrycks nivåer för vävnadstyp av intresse.

5. cBioPortal

Obs: cbioportal (www.cioportal.org) utvecklades vid Memorial Sloan Kettering Cancer Center (msk), och åtkomster, analyserar och visualiserar storskaliga cancer genomiska data21,22. Denna portal gör det särskilt möjligt för forskare att söka efter genetiska förändringar och signal nätverk.

  1. Med hjälp av frågan på landningssidan, klicka på organ/vävnader av intresse under det avsnitt som heter Välj studier. Välj den särskilda studie av intresse, tryck sedan på frågan genom gen knappen.
  2. I det avsnitt som heter Välj Genomic-profilerväljer du bland de tre alternativen: mutationer, förruttativa kopior-nummer ändringar från Gistic, eller mRNA-uttryck. Välj ytterligare motsvarande data från rullgardinsmenyn för Välj patient/Case-uppsättning.
  3. Ange mål gen symbolen/-symbolerna i rutan fråga om Ange gener. Klicka på knappen skicka fråga .
  4. Klicka på fliken nätverk överst på sidan för att hämta önskat gen nätverk.
    Anmärkning: signal nätet är färgkodad. De inmatade generna indikeras av frönoder med en tjock kant. Varje gen representeras av en röd cirkel, och den röda cirkelns färgintensitet återspeglar dess mutationsfrekvens. Gener förbinds av olikt färgade fodrar. Bruna linjer betyder "i samma komponent", vilket indikerar inblandning i samma biologiska komponent. Blå linjer betyder "reagerar med" och indikerar gen reaktioner. Gröna linjer betyder "tillståndsförändring", vilket tyder på att en gen kan orsaka en statlig förändring av en annan gen.
  5. Klicka på fliken Arkiv överst i bilden för att välja Spara som bild (png) för hämtning av nätverks bilder.

6. dissektion av Drosophila med önskade genotyper och DAPI-färgning

Obs: samla den kvinnliga Drosophila med önskad genotyper, sedan dissekera flyga äggstockarna att genomgå förfarandena för DAPI färgning för avbildning.

  1. Förbered flug bestånd tj-Gal4, Gal80ts/CyO; UAS-NICD-GFP/TM6B, w *; UAS-Mam. A; och w [1118] för att skapa flugor med NiCd-Overexpression (tj-Gal4, Gal80ts/+; UAS-NICD-GFP/+) och NiCd och Mam-Overexpression (tj-Gal4, Gal80ts/UAS-Mam. A; UAS-NICD-GFP/+) kapacitet.
  2. Tillämpa den temporala och regionala gen uttrycks inriktning (TARGET) teknik för att kontrollera spatiotemporal genuttryck23. Höj flugor vid 18 ° c tills vuxen ålder, sedan flytta till 29 ° c för 48 h med jäst före dissektion.
    Obs: tj-Gal4 kan bara köra UAS uttryck under högre temperaturer, när hämning av Gal80ts är lättad. Tillsatsen av jäst före dissektion förstorar äggstockarna för skörd.
  3. Placera 3 mL 1x fosfatbuffrad saltlösning (PBS) (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM na2HPO4, 1,8 mm KH2Po4) i en embryosamlingsskål. Använd en co2 pad för att söva flugorna.
  4. Välj en kvinnlig fluga, sedan försiktigt ta den nedre bröstkorgen i farten med hjälp av ett par dissekera tång och dränka den i 1x PBS lösning i en embryosamling skålen. Använd ett andra par tång för att nypa den nedre delen av buken och dra försiktigt för att frigöra de inre organen.
  5. Identifiera och lossa par äggstockarna från fluga kroppen. Bryt muskulös slida ligger vid den bakre änden av äggstockarna och separera ovarioles.
    Anmärkning: separera ovarioles och bryta muskel slida krävs för att uppnå högre kvalitet färgning resultat.
  6. Placera äggstockarna i ett 1,5 mL centrifugerör som innehåller 500 μL 1x PBS. Röret ska sitta kvar på isen tills alla äggstockar samlas in.
  7. Ta bort 1x PBS och placera 0,5 mL fix lösning (4% formaldehyd) i röret. Placera röret på nutator i 10 min.
  8. Ta bort Fix lösningen från röret och kassera den i en lämplig avfallsbehållare. Använd 1 mL 1x PBT (1x PBS kompletterad med 0,4% Triton™ X-100) för att tvätta äggstockarna 3x i 15 min.
  9. Kassera den slutliga PBT-tvätten och tillsätt 1 mL PBTG (0,2% bovint serumalbumin, 5% normalt get serum i 1x PBT) för att förhindra icke-specifik bindning.
    Obs: det här steget kan hoppas över för DAPI-färgning, men det är viktigt för antikropps färgning. Detaljerad immunohistokemi färgning kan hittas i Jia et al.24.
  10. Placera 150 μL DAPI (10 μg/mL) i röret i 10 − 15 minuters Nutation. Kassera DAPI och tvätta äggstockarna 1x i 10 minuter med 1 mL 1x PBT. Ta bort PBT och tvätta 2x i 10 min med 1x PBS.
  11. Avlägsna överflödig PBS tills cirka 300 μL PBS finns kvar i röret med äggstockarna. Pipet äggstockarna upp och ner flera gånger med hjälp av en 200 μL pipett, för att frigöra ägg kamrarna.
  12. Snurra försiktigt ner röret och ta försiktigt bort så mycket 1x PBS-lösning som möjligt utan att ta bort äggstockarna. Placera 120 μL monteringslösning (1 g n-propylgallat, 5 ml 10X PBS, 40 ml glycerol och 5 ml dH2O) i röret.
    Obs: monterings lösningen är kladdig, så det är svårt att överföra exakt 120 μL monteringslösning i ett rör. För att lindra detta problem kan en 1 000 μL pipett spets användas för att lägga till tre droppar monteringslösning i röret.
  13. Ta bort ca 0,33 mm från en 200 μL pipett spets och Använd den nyligen skurna pipettspetsen för att placera monterings lösningen på ett Mikroskop glas bild.
  14. Placera försiktigt täckglasglas på monterings lösningen och täta kanterna på täckglaset med genomskinligt nagellack.
    Anmärkning: tätning av täckglasets kanter behövs för att förhindra att ägg kamrarna rinner in i monterings lösningen när de tar konfokala bilder.
  15. Hämta bilder med ett konfokalmikroskop med hjälp av följande inställningar: objektiv objektiv = 10X förstoring; numerisk bländare = 0,8; DAPI emission våglängd = 410 − 513 nm.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Med hjälp av det förfarande som nämns i steg 1 med PRECOG portalen, Z-poäng av NOTCH2, NOTCH3, och MAML1 i äggstockscancer erhölls (1,3, 2,32, 1,62, respektive). De negativa Z\u2012score värdena indikerar den dåliga totala överlevnaden för patienter med höga uttrycks nivåer av de tre generna. Med hjälp av villkorlig formatering av kalkylbladsprogram varan, den Z\u2012score värden visas i ett färgat stapeldiagram i figur 1.

CSIOVDB-databasen användes för att bekräfta resultaten. Med hjälp av instruktionerna i steg 2, NOTCH2, NOTCH3och MAML1 var sekventiellt inmatade i csiovdb databas Sök området, och patientens överlevnad data som finns under fliken överlevnad hämtades. Förutom den totala överlevnads data, CSIOVDB ger Sjukdomsfri överlevnad. CSIOVDB separerar patienter för att presentera överlevnadsdata baserat på Q1 jämfört med Q4 (nedre kvartil jämfört med övre kvartil) av gen uttrycks nivåer. I överensstämmelse med tidigare fynd, hög uttryck för NOTCH2, NOTCH3, och MAML1 korrelerar med dålig total överlevnad och Sjukdomsfri överlevnad (figur 2A, B). Under tiden, den Clinico-patologiska parametrar fliken CSIOVDB ger också en jämförelse av gen uttrycks nivåer bland olika äggstockscancer stadier, betyg, och kliniska svar med Mann-Whitney tester. Resultaten visar att högre uttrycks nivåer av NOTCH2, NOTCH3och MAML1 är förknippade med avancerade äggstockscancer stadier (figur 2C).

Eftersom NOTCH2, NOTCH3, och MAML1 är avgörande för den totala patientens överlevnad, de gen uttrycks nivåer i äggstockstumörer och cancer cellinjer undersöktes ytterligare. Uttrycket data av NOTCH2, NOTCH3, och MAML1 i normala och tumör äggstocksvävnad hämtades från U133A plattform med hjälp av steg 3 instruktioner för Gent. Forskarna kan bearbeta de nedladdade uppgifterna enligt deras specifika forskningssyfte. Här utnyttjade vi data för att producera lådan och morrhår tomter med GraphPad Prism (version 8). Ytterligare permutation tester föreslog att NOTCH2, NOTCH3, och MAML1 är mycket uttrycks i tumör vävnad (figur 3A). Nästa, uttrycket data för NOTCH2, NOTCH3, och MAML1 i äggstockscancer cellinjer laddades ner enligt protokoll steg 4, med hjälp av ccle. Gen uttrycks nivåer i cancer cellinjer visas av rutan och morrhår tomter (figur 3B). Även om uttrycks nivåer för NOTCH2, NOTCH3och MAML1 är höga i cancer cellinjer kan slutsatser inte dras på grund av avsaknaden av normala cellinjer i ccle-databasen. Emellertid, forskare kan identifiera ursprunget av cancer cellinjer, och jämföra uttrycks nivåer baserat på olika kvaliteter, stadier, och andra clinicopathological parametrar.

När betydelsen av NOTCH2, NOTCH3, och MAML1 i äggstockscancer bekräftades, cbioportal utnyttjades för att studera deras tillhörande signal nätverk. Använda protokoll steg 5, äggstock/ägg ledaren valdes för utvalda studier, sedan den ovariella serös cystadenocarcinom (TCGA, Nature 2011) dataset valdes för analys. För det avsnitt som heter Välj Genomic profiler, mRNA uttryck valdes, och slutligen dess profil mRNA uttryck Z-Poäng (alla gener). För avsnittet Välj patient/fall set, de prover med mRNA data (Agilent microarray) (489) alternativet valdes från rullgardinsmenyn. I slutet valdes gener NOTCH2, NOTCH3och MAML1 för att skicka frågan. Baserat på de tre kärngenerna skapades ett signal nätverk för att ge de 50 vanligast förändrade granngenerna, som också befinner sig på samma väg med den högsta mutationsfrekvensen (figur 4).

Eftersom notch signalering är väl bevarad över arter, det undersöktes i Drosophila äggstockscancer. Notch signalering har tidigare rapporterats för att reglera spridning av follikelceller25, differentiering26,27, och cell cykel förordning28,29. Överuttryck av NICD ensamt inducerade inte tumörer i Drosophila (figur 5A), som epitelet i Drosophila ägg kammare förblev intakt med ett enda skikt. Emellertid, överuttryck av NICD och MAM tillsammans inducerade tumörer i Drosophila (figur 5B), som demonstreras av flera epitelskikt och ackumulerade celler.

Figure 1
Figur 1: uttryck för NOTCH2, NOTCH3, och MAML1 i äggstockscancer är förknippad med dålig total överlevnad. Överlevnad Z-poäng av NOTCH2, NOTCH3, och MAML1 i äggstockscancer patienter presenteras. Dålig överlevnad indikeras av negativa Z\u2012score värden. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: höga halter av NOTCH2, NOTCH3, och MAML1 i äggstockscancer är förknippade med dålig total överlevnad, dålig Sjukdomsfri överlevnad, och avancerade cancer stadier. Den microarray databasen CSIOVDB ger Kaplan-Meier total överlevnad och Sjukdomsfri överlevnad tomter av NOTCH2, NOTCH3, och MAML1 i äggstockscancer patienter, och gen uttrycks nivåer i olika cancer stadier. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: NOTCH2, NOTCH3, och MAML1 är mycket uttrycks i äggstockstumörer och cancer cellinjer. P-värden är indikerade att jämföra genuttryck i normala äggstockar och motsvarande äggstockstumörer. (Förkortningar: äggstock-N = normala äggstocks vävnader; Äggstockarna-C = ovariella cancer vävnader). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: NOTCH2/NOTCH3/MAML1 gener och tillhörande signal nätverk med 50 vanligast förändrade granngener. Signal nätet är färgkodad. De inmatade generna indikeras av frönoder med en tjock kant. Varje gen representeras av en röd cirkel, och den röda cirkelns färgintensitet återspeglar dess mutationsfrekvens. Gener förbinds av olikt färgade fodrar. Bruna linjer betyder "i samma komponent", vilket indikerar inblandning i samma biologiska komponent. Blå linjer betyder "reagerar med" och indikerar gen reaktioner. Gröna linjer betyder "tillståndsförändring", vilket tyder på att en gen kan orsaka en statlig förändring av en annan gen. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5: NiCd och Mam i Drosophila inducerar också äggstockstumörer. A. överuttryck av NiCd ensamt inducerar inte tumör bildning i Drosophila. B. överuttryck av NiCd och Mam inducerar tillsammans tumörer i Drosophila. Scale bar = 50 μm vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Eftersom det finns otaliga metoder och metoder för utnyttjande av bioinformatik, det finns många databaser tillgängliga online för allmänheten. Ett överflöd av information kan extraheras från var och en av dessa databaser, men vissa är bäst lämpade för särskilda ändamål, såsom bedömning av patientens överlevnad baserat på vissa insatser. Systematiska analyser av hämtade data från olika enskilda databaser kan på ett övertygande sätt ge viktiga vetenskapliga rön.

Den nuvarande analysen fokuserar på den roll som notch signalering i äggstockscancer genom utnyttjande av bioinformatik metoder. Till exempel användes meta-Z-analysen på PRECOG-portaldatabasen för att få Z-Poäng som indikerar patientens överlevnads resultat i kliniska cancer studier. CSIOVDB är en annan meta-analysdatabas som användes för att studera överlevnad resultat av äggstockscancer patienter. CSIOVDB data validerade framgångsrikt resultaten från PRECOG portal som NOTCH2, NOTCH3, och MAML1 är avgörande för den totala patientens överlevnad. Senare, ansökningarna av GENT och CCLE databaser ytterligare visat att NOTCH2, NOTCH3, och MAML1 är mycket uttrycks i äggstockstumörer och cancer cellinjer. Kombinationen av dessa databaser avslöjade systematiskt de betydande rollerna av NOTCH2, NOTCH3, och MAML1 i äggstockscancer. Denna användning av bioinformatikmetoder gav ett effektivt sätt att göra cancerforskningen kostnadseffektivt och visar hur den kan ge viktiga fynd för framtida experimentella och kliniska tillämpningar.

Bioinformatik ger allmänheten möjlighet att få tillgång till resultat från tusentals experiment på en gång. Den information som härrör från offentliga databaser ger ett kostnadseffektivt och effektivt sätt att skapa en experimentell design innan experiment utförs. Dessutom är det viktigt att notera att allmänt tillgängliga data kan spridas över publikationer och kan ge motstridiga eller till och med motsägelsefulla resultat, vilket kräver att metaanalyser utförs genom bioinformatikmetoder. Forskare kan utforma och utföra experiment baserade på data som hittats genom stora bioinformatiska databaser för att validera specifika vetenskapliga hypoteser. Resultat från Drosophila experiment bekräftade resultaten från bioinformatik databaser och ytterligare stödde idén att notch väg komponenter bör fortsätta att undersökas som potentiella terapeutiska läkemedel mål. En lyckad validering av bioinformatikfynd genom experiment tyder också på betydelsen av bioinformatikmetoder för vetenskapliga upptäckter.

Det kan finnas vissa begränsningar av bioinformatik. Först kan vissa webbplatser/verktyg inte uppdatera sina resultat på grund av tid ansträngningar eller kostnader i samband med underhåll. För det andra, vissa webbplatser/verktyg uppdateras ständigt, men uppdateringen med ytterligare indata kan förändra tidigare erhållna resultat. För det tredje, utvecklare av vissa webbplatser/verktyg reservera upphovsrätt och begränsa användningen av deras innehåll. För det fjärde kan analyser eller algoritmer för vissa webbplatser/verktyg inte alltid vara korrekta.

För att övervinna dessa begränsningar föreslås några steg eller modifieringar och felsökning för bättre framtida tillämpningar. För det första tillåter vissa webbplatser/verktyg forskare att manuellt läsa in nya data för analys. Om inte, kan forskarna Ladda ner och analysera de senaste uppgifterna på egen hand. För det andra måste forskarna upprepade gånger köra sina analyser och föra register över datumen. Om resultaten ändras väsentligt kan forskarna behöva använda den ytterligare datainmatningen för att ta reda på orsakerna. För det tredje, forskare kan hitta en alternativ webbplats/verktyg för att köra sina analyser för att undvika potentiella upphovsrättsliga frågor. För det fjärde kan forskare få ytterligare webbplatser/verktyg för att validera sina viktiga resultat. Om det finns några problem med analyser eller algoritmer, forskare kan ladda ner och omanalysera data för att rätta till misstag eller använda andra webbplatser/verktyg med lämpliga inställningar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Detta arbete stöddes av start-up finansiering, College of Science och matematik forskning Grant, Summer Research session Award, och Research Seed finansiering Award från Georgia Southern University.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) Invitrogen D1306 1:1000 Dilution
PBS, Phosphate Buffered Saline, 10X Powder, pH 7.4 ThermoFisher FLBP6651 Dissolved with ddH2O to make 1X PBS
Goat serum Gibco 16210064 Serum
Embryo dish Electron Microscopy Sciences 70543-45 Dissection Dish
Nutating mixers Fisherbrand 88861041 Nutator
tj-Gal4, Gal80ts/ CyO; UAS-NICD-GFP/ TM6B Dr. Wu-Min Deng at Florida State University N/A Fly stock
w*; UAS-mam.A Bloomington Drosophila Stock Center #27743 Fly stock
w[1118] Bloomington Drosophila Stock Center #5905 Fly stock
The PRECOG portal Stanford University precog.stanford.edu Publicly accessible database of cancer expression datasets
CSIOVDB Cancer Science Institute of Singapore csibio.nus.edu.sg/CSIOVDB/CSIOVDB.html Microarray database used to study ovarian cancer
The Gene Expression across Normal and Tumor tissue (GENT) Portal Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology (KRIBB) medical–genome.kribb.re.kr/GENT Publicly accessible database of gene expression data across diverse tissues, divided into tumor and normal tissues.
Broad Institute Cancer Cell Line Encyclopedia (CCLE) Broad Institute and The Novartis Institutes for BioMedical Research portals.broadinstitute.org/ccle Provides genomic profiles and mutations of human cancer cell lines
cBioPortal Memorial Sloan Kettering Cancer Center (MSK) cioportal.org Portal that allows researchers to search for genetic alterations and signaling networks
Zeiss 710 Inverted confocal microscope Carl Zeiss ID #M 210491 Examination and image collection of fluorescently labeled specimens

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bocchicchio, S., Tesone, M., Irusta, G. Convergence of Wnt and Notch signaling controls ovarian cancer cell survival. Journal of Cellular Physiology. (2019).
  2. Hibdon, E. S., et al. Notch and mTOR Signaling Pathways Promote Human Gastric Cancer Cell Proliferation. Neoplasia. 21, (7), 702-712 (2019).
  3. Kucukkose, C., Yalcin Ozuysal, O. Effects of Notch signalling on the expression of SEMA3C, HMGA2, CXCL14, CXCR7, and CCL20 in breast cancer. Turkish Journal of Biology. 43, (1), 70-76 (2019).
  4. Lan, G., et al. Notch pathway is involved in the suppression of colorectal cancer by embryonic stem cell microenvironment. OncoTargets and Therapy. 12, 2869-2878 (2019).
  5. Lian, H., et al. Notch signaling promotes serrated neoplasia pathway in colorectal cancer through epigenetic modification of EPHB2 and EPHB4. Cancer Management and Research. 10, 6129-6141 (2018).
  6. Salazar, J. L., Yamamoto, S. Integration of Drosophila and Human Genetics to Understand Notch Signaling Related Diseases. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1066, 141-185 (2018).
  7. Bray, S. J. Notch signalling in context. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17, (11), 722-735 (2016).
  8. Andersson, E. R., Sandberg, R., Lendahl, U. Notch signaling: simplicity in design, versatility in function. Development. 138, (17), 3593-3612 (2011).
  9. Brou, C., et al. A novel proteolytic cleavage involved in Notch signaling: the role of the disintegrin-metalloprotease TACE. Molecular Cell. 5, (2), 207-216 (2000).
  10. Oswald, F., et al. p300 acts as a transcriptional coactivator for mammalian Notch-1. Molecular and Cellular Biology. 21, (22), 7761-7774 (2001).
  11. Xiu, M. X., Liu, Y. M. The role of oncogenic Notch2 signaling in cancer: a novel therapeutic target. American Journal of Cancer Research. 9, (5), 837-854 (2019).
  12. Allenspach, E. J., Maillard, I., Aster, J. C., Pear, W. S. Notch signaling in cancer. Cancer Biololgy & Therapy. 1, (5), 466-476 (2002).
  13. Jia, D., Underwood, J., Xu, Q., Xie, Q. NOTCH2/NOTCH3/DLL3/MAML1/ADAM17 signaling network is associated with ovarian cancer. Oncology Letters. 17, (6), 4914-4920 (2019).
  14. Weng, J. T., et al. Novel bioinformatics approaches for analysis of high-throughput biological data. Biomed Research International. 2014, 814092 (2014).
  15. Readhead, B., Dudley, J. Translational Bioinformatics Approaches to Drug Development. Advances in Wound Care (New Rochelle). 2, (9), 470-489 (2013).
  16. Bayat, A. Science, medicine, and the future: Bioinformatics. BMJ. 324, (7344), 1018-1022 (2002).
  17. Gentles, A. J., et al. The prognostic landscape of genes and infiltrating immune cells across human cancers. Nature Medicine. 21, (8), 938-945 (2015).
  18. Tan, T. Z., et al. CSIOVDB: a microarray gene expression database of epithelial ovarian cancer subtype. Oncotarget. 6, (41), 43843-43852 (2015).
  19. Shin, G., et al. GENT: gene expression database of normal and tumor tissues. Cancer Informatics. 10, 149-157 (2011).
  20. Barretina, J., et al. The Cancer Cell Line Encyclopedia enables predictive modelling of anticancer drug sensitivity. Nature. 483, (7391), 603-607 (2012).
  21. Gao, J. J., et al. Integrative Analysis of Complex Cancer Genomics and Clinical Profiles Using the cBioPortal. Science Signaling. 6, (269), (2013).
  22. Cerami, E., et al. The cBio Cancer Genomics Portal: An Open Platform for Exploring Multidimensional Cancer Genomics Data. Cancer Discovery. 2, (5), 401-404 (2012).
  23. McGuire, S. E., Mao, Z., Davis, R. L. Spatiotemporal gene expression targeting with the TARGET and gene-switch systems in Drosophila. Science's STKE. 2004, (220), 6 (2004).
  24. Jia, D., Huang, Y. C., Deng, W. M. Analysis of Cell Cycle Switches in Drosophila Oogenesis. Methods in Molecular Biology. 1328, 207-216 (2015).
  25. Lo, P. K., Huang, Y. C., Corcoran, D., Jiao, R., Deng, W. M. Inhibition of Notch signaling by the p105 and p180 subunits of Drosophila chromatin assembly factor 1 is required for follicle cell proliferation. Journal of Cell Science. 132, (2), (2019).
  26. Keller Larkin, M., et al. Role of Notch pathway in terminal follicle cell differentiation during Drosophila oogenesis. Development Genes and Evolution. 209, (5), 301-311 (1999).
  27. Sun, J., Deng, W. M. Notch-dependent downregulation of the homeodomain gene cut is required for the mitotic cycle/endocycle switch and cell differentiation in Drosophila follicle cells. Development. 132, (19), 4299-4308 (2005).
  28. Jia, D., et al. A large-scale in vivo RNAi screen to identify genes involved in Notch-mediated follicle cell differentiation and cell cycle switches. Scientific Reports. 5, 12328 (2015).
  29. Shcherbata, H. R., Althauser, C., Findley, S. D., Ruohola-Baker, H. The mitotic-to-endocycle switch in Drosophila follicle cells is executed by Notch-dependent regulation of G1/S, G2/M and M/G1 cell-cycle transitions. Development. 131, (13), 3169-3181 (2004).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics