Quantificação da adesão celular tumoral em crioseções de nó linfático

Cancer Research

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Summary

Aqui, descrevemos um método simples e barato que permite a quantificação de células tumorais adesivos para genimosgenas de nódulos linfáticos (LN). As células tumorais aderentes de LN são prontamente identificadas pela microscopia leve e confirmadas por um método baseado em fluorescência, dando um índice de adesão que revela a afinidade de ligação celular tumoral ao parenchyma lN.

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Jandrey, E. H. F., Kuroki, M. A., Camargo, A. A., Costa, E. T. Quantification of Tumor Cell Adhesion in Lymph Node Cryosections. J. Vis. Exp. (156), e60531, doi:10.3791/60531 (2020).

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Abstract

Os linfonodos drenantes de tumores (LNs) não são apenas filtros de resíduos produzidos pelo tumor. São um dos locais regionais mais comuns de residência provisória de células tumorais disseminadas em pacientes com diferentes tipos de câncer. A detecção dessas células tumorais residentes em LN é um importante biomarcador associado ao mau prognóstico e decisões de terapia adjuvante. Modelos recentes de camundongos indicaram que as células tumorais residentes em LN podem ser uma fonte substancial de células malignas para metástases distantes. A capacidade de quantificar a adesividade das células tumorais para o parenchyma lN é um indicador crítico em pesquisas experimentais que se concentra na identificação de genes ou sinalizando caminhos relevantes para a disseminação linfática/metastática. Como as LNs são estruturas 3D complexas com uma variedade de aparências e composições em seções teciduais dependendo do plano de seção, suas matrizes são difíceis de replicar experimentalmente in vitro de forma totalmente controlada. Aqui, descrevemos um método simples e barato que permite a quantificação de células tumorais adesivos para crioseções LN. Usando seções serial da mesma LN, adaptamos o método clássico desenvolvido pela Brodt para usar rótulos não radioativos e contar diretamente o número de células tumorais aderente por área de superfície LN. As células tumorais aderentes de LN são prontamente identificadas pela microscopia leve e confirmadas por um método baseado em fluorescência, dando um índice de adesão que revela a afinidade de ligação celular ao parenchyma lN, que é evidência sugestiva de alterações moleculares na ligação de afinidade dos integrins aos seus ln-ligands correlacionados.

Introduction

A metástase do câncer é a principal razão para a falha no tratamento e o aspecto dominante de risco de vida do câncer. Como postulou há 130 anos, a disseminação metastática resulta quando uma elite das células tumorais disseminadas (DTCs, as "sementes") adquirem habilidades biológicas específicas que lhes permitem escapar dos locais primários e estabelecer crescimento maligno em locais distantes (o "solo")1. Recentemente, surgiram diversos conceitos novos sobre as relações "sementes e solo", como a indução de nichos pré-metastáticos (conceitualizado como um "solo fértil" necessário para que "sementes" prosperassem), a auto-semeagem de tumores primários por DTCs, a dormência da "semente" em órgãos secundários e o modelo de progressão paralela da metástase2.

Para a maioria das malignidades sólidas, os DTCs podem residir e serem detectados em muitos órgãos mesenquitais, como medula óssea e linfonodos (LNs) em pacientes com ou sem evidências de metástase clínica. Como as LNs drenantes de tumores são o primeiro local da disseminação regional de DTCs, o status de LN é um indicador prognóstico importante e muitas vezes está associado às decisões de terapia adjuvante3. Para alguns tipos de tumores, a correlação entre o estado de LN e os piores desfechos é forte, incluindo câncer de cabeça e pescoço4,5, mama6,próstata7,pulmão8,gástrico9,colorretal10,11 e câncer de tireoide12.

As LNs são pequenos órgãos ovoids do sistema linfático, que são cobertos com células reticulares e fechados com vasos linfáticos. Esses órgãos são absolutamente necessários para o funcionamento do sistema imunológico13. As LNs atuam como plataformas de atraidores para células de circulação imunológicas, unindo os linfócitos e células presentes a antígenos14. No entanto, as LNs também atraem células tumorais circulantes. Ao longo de décadas, as LNs foram retratadas como rotas passivas de transporte para células tumorais metastáticas. No entanto, estudos recentes indicaram que as células tumorais também podem ser guiadas para AsLs por causa de sugestões quimiotática (quimiotática) e/ou haptotática (elementos de matriz extracelular) secretadas pelo endotelo linfático15. Como exemplos, a superexpressão do receptor CCR7 em células tumorais facilita a orientação de células de melanoma metastático para lNs16. Além disso, as proteínas de LN extracelulares fornecem um andaime adesivo para o recrutamento e sobrevivência das células tumorais circulantes17. De fato, as LNs que drenam tumores fornecem solo fértil para a semeagem de DTCs, que podem ser mantidos em estados proliferativos ou adormecidos por sinais microambientais ln específicos18. O destino final desses DTCs residentes em LN é controverso; alguns trabalhos sugerem que essas células são indicadores passivos de progressão metastática19, enquanto outras propõem que são mais prováveis fundadores de resistência (por locais primários de auto-semeaduras) e/ou agem como reservatórios celulares para metástases (espalhando "sementes" para o crescimento do câncer terciário)20,21. Recentemente, usando modelos pré-clínicos, foi demonstrado que uma fração desses DTCs residentes em LN invadiu ativamente os vasos sanguíneos, entrou na circulação sanguínea e colonizou os pulmões21.

Considerando que a presença de células cancerígenas em LNs é um marcador para a agressividade e a intrusividade do câncer, neste estudo, otimizamos um método clássico desenvolvido pela Brodt22 para medir quantitativamente a adesão celular tumoral a LNs in vitro. O uso de um ensaio baseado em fluorescência nos permitiu desenvolver um protocolo de baixo custo, rápido, sensível e ambientalmente amigável (não radioativo) para a detecção de alterações adesivos entre células tumorais e crioseções de LN. Usando as células cancerígenas de mama MCF-7 expressando diferentes níveis de expressão genética NDRG4 e seções congeladas de ratos LN para exemplificar o método, mostramos que este protocolo permitiu uma boa correlação entre a adesão celular tumoral a LNs in vitro e metástase LN observada em pacientes com câncer de mama24.

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Protocol

As LNs foram recuperadas de carcaças frescas de ratos Wistar adultos saudáveis sacrificados pela luxação cervical. Seguimos as Diretrizes do NIH para dor e angústia em animais de laboratório e todos os procedimentos foram aprovados pelo Comitê de Ética e Pesquisa Animal do Instituto de Pesquisa e Educação do Hospital Sírio-Libanês (CEUA P 2016-04).

NOTA: Todos os tecidos congelados frescos são considerados bioperigosos e devem ser manuseados usando precauções adequadas de biossegurança.

1. Linfêndenectomia e Criosecção

  1. Coloque carcaças frescas de ratos Wistar adultos (180-220 g) deitados em recumbency dorsal em uma placa de dissecação limpa à temperatura ambiente.
    NOTA: As LNs devem ser coletadas até 30 min pós-eutanásia.
  2. Pulverize a carcaça do rato com 70% de álcool isopropílico e use instrumentos esterilizados para colheita de LN.
  3. Levante a pele abdominal com o auxílio das pinças e abra uma cavidade com uma incisão medial sem danificar o tecido subjacente, expondo as vísceras abdominais. Retire o intestino e as LNs torácicas e abdominais tornam-se visíveis(Figura 1).
  4. Excir cuidadosamente as LNs de cada rato com o uso de uma tesoura de ponta contundente para evitar ferir a artéria mesentérica superior deitada atrás.
    NOTA: Dependendo da localização do linfonodo ressecado, é necessário limpar outros tecidos aderidos a ele, como tecido mesentérico.
  5. Colher LNs em tubos cônicos de 15 mL contendo 5 mL de soro soro tampão de fosfato estéril (PBS).
  6. Descarte corretamente as carcaças dos ratos.
  7. Remova as LNs frescas do PBS, role e seque o nó em um papel de filtro seco. Coloque-o em uma pequena placa de Petri e adicione a solução de incorporação para espécimes congelados de tecido (O.C.T.) por 2 min.
  8. Transferir e orientar o LN de frente para baixo em uma posição desejada na base de um criomold, com apenas o suficiente O.C.T para cobri-lo. Evite bolhas perto do tecido. A superfície seccional é o fundo do criomold.
  9. Imediatamente congele o criomold em um refrigerador de isopor com gelo seco. Quando ainda há uma pequena parte de O.C.T. descongelado (~20-35 s), transfira a amostra para papel alumínio e coloque-a em um refrigerador com gelo seco enquanto continua a congelar outras amostras. No final, guarde todas as amostras a -80 °C até a secção.
  10. Seque a LN com uma espessura de seção de ajuste criostatado para 5-8 μm. Transfira crigenses em slides de microscópio.
    NOTA: Antes de seção, remova as amostras congeladas do congelador -80 °C e deixe-as equilibrar até a temperatura na câmara de microtome criostatato a -22 °C por aproximadamente 30 min. Deslizamentos contendo LN podem ser armazenados a -80 °C por até um mês.

2. Rotulagem celular com corantes fluorescentes

NOTA: Corantes fluorescentes são amplamente utilizados na biologia celular. Preferimos usar a rotulagem dialkylcarbocyanines de cadeia longa (DiI(C18),excitação de 549 nm, Emissão 565 nm) porque são brilhantes, estáveis e podem ser adicionadas diretamente à mídia cultural, não afeta a viabilidade celular ou propriedades adesivos de células25,26.

  1. As células dissociadas crescem em condições ideais (ou seja, em meio completo) e resuspendem em meio soro livre a uma densidade de 106 células/mL.
  2. Adicione 1 mL de suspensão celular (106 células) ao tubo cônico de 15 mL e rótulo com Dil (C18) (2 μg/mL) por 10 min a 37 °C.
    NOTA: Após 5 min, agita suavemente os tubos para evitar a sedimentação celular e a submanchação de células sedimentadas. Densidades maiores requerem tempos de incubação mais longos para coloração uniforme. Um tempo ideal de incubação para coloração celular varia de acordo com a linha celular. Pode ser melhor quantificado usando o canal convencional de detecção de citometria de fluxo FL2(Figura 2A).
  3. Centrífuga os tubos de suspensão rotulados a 300 x g por 4 min.
  4. Remova o supernatant e lave duas vezes em 10 mL de meio soro. Recupere as células como pelotas vermelhas. Resuspender as células a 106 células/mL em meio soro livre de soro com albumina de soro bovino de 0,1% (BSA).

3. Pratos de pré-revestimento com solução poli-l-lysina ou BSA como controle de sementes (Opcional)

NOTA: Usamos pratos de cultura celular pré-revestidos com PLL como superfícies positivas de controle de carregamento para garantir que diferentes grupos experimentais de células tumorais fossem semeados no mesmo número, bem como superfícies revestidas de BSA como controles negativos.

  1. Em condições estéreis, para preparar poços revestidos de PLL ou BSA, adicione 300 μL de PLL (0,1% w/v em H2O) ou BSA (diluído a 2,5% w/v em H2O) diretamente à placa de 24 poços e incubar durante a noite a 4 °C.
  2. Remova a solução por aspiração, enxágue suavemente a superfície com PBS estéril e seca rastamento da placa à temperatura ambiente na capa da cultura tecidual antes da semeadura celular.
    NOTA: Os volumes finais de PLL ou BSA devem ser ajustados de acordo com a área de diferentes placas de poço.

4. Seeding Células tumorais com rótulo fluorescente em crioseções de LN ou Poços revestidos pLL/BSA

NOTA: Como controles experimentais, usamos (1) pratos de cultura celular pré-revestidos com PLL ou BSA e (2) seções consecutivas da mesma LN por experimento (veja este detalhe na Figura 2D), onde este sumirá variações regionais na composição de matriz extracelular (ECM) de cada seção LN, que por sua vez pode ditar a taxa de adesão celular. Para o seguinte ensaio de adesão de células tumorais, selecione crioseções LN de alta qualidade e sequencial.

  1. Lave delicadamente as crioseções duas vezes com PBS e reidrate com PBS por 15 min à temperatura ambiente.
  2. Bloqueie a adesão inespecífica às crioseções com 2,5% de BSA por 30 min a 37 °C. Use câmaras de lavagem de imunohistoquímica e berços de lamina para garantir que todo o O.C.T tenha sido removido durante lavagens e incubações.
  3. Escorra o excesso de BSA em uma toalha de papel seco, seque o contorno das seções de LN com um cotonete de algodão e circule as seções usando uma caneta PAP.
  4. Para o ensaio de adesão da célula tumoral, adicione 100 μL de suspensão celular (a partir da etapa 2.4) a cada seção LN cercada ou bem nas placas revestidas de PLL de 24 poços e coloque-a em um rack de câmara umidificado por 1-2 h a 37 °C na incubadora convencional de cultura celular.
    NOTA: O volume final de suspensão celular precisa ser ajustado de acordo com a área de diferentes LNs circundadas.
  5. Lave delicadamente células não aderentes quatro vezes com PBS. Conserte as células fluorescentes aderentes restantes com 3,7% de formaldeído na PBS por 15 minutos de temperatura ambiente.

5. Quantificação Manual do Índice Adesivo

NOTA: O índice adesivo (ou seja, células tumorais/LN mm2) foi alcançado utilizando um objetivo de 10X e contando manualmente o número de células tumorais, prontamente identificadas pela microscopia leve e confirmada por uma microscopia de fluorescência (Figura 2D), por áreas de linfonodos de vários campos independentes (obtidas utilizando o software ImageJ/FIJI do Instituto Nacional de Saúde).

  1. Use um microscópio fluorescente com um objetivo de 10x para tirar imagens TIFF separadas em dois canais correspondentes aos campos brilhantes e vermelho-fluorescentes(Figura 2D). Nomee e salve essas imagens sistematicamente.
  2. Inicie imageJ/FIJI, abra as imagens e defina a escala. É necessário usar uma escala de calibração (por exemplo, uma régua micrométrica 1 mm) (Figura 2C).
  3. Abra a foto da régua micrométrica (ou um micrometro de palco), selecione a ferramenta linha reta e desenhe uma linha reta que define uma distância conhecida.
  4. No menu Analisar, selecione Definir Escala. A Distância em pixels será preenchida com base no comprimento (em pixels) da linha desenhada na etapa 5.3. A distância conhecida será preenchida com a distância real (neste caso, em milímetros) e a unidade de comprimento na Unidade de campo de comprimento (neste caso, em milímetros).
  5. Clique em Global (esta calibração se aplica a todas as imagens abertas nesta sessão ImageJ/FIJI) e pressione OK.
  6. Quantificação da área do nó linfático: Selecione a ferramenta Wand e clique duas vezes, abra as configurações da ferramenta Wand. Definir o modo para 8 conectados. Clique na foto e configure a tolerância até selecionar todos os linfonodos na foto e pressione OK. Para medir a área, abra análise | Medida (CTRL + M). A área é expressa nas unidades definidas mais cedo.
  7. Quantificação celular tumoral: Abra as imagens de microscopia/fluorescência de luz no software FIJI. Selecione Plugins | Análise | Contador de Células | Contador de células. Clique na foto para ser quantificado e pressione o botão Inicializar na janela do balcão da célula. Selecione o contra-tipo (1-8) e clique nas células da foto. Para inicializar a próxima foto, pressione o botão Reset na janela do balcão da cela, abra a nova foto e repita todas as etapas.
    NOTA: O índice de adesão lN é expresso como o número de células tumorais aderentes por área coberta de LN (células/mm2).

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Representative Results

Ilustramos o ensaio avaliando o potencial adesivo de LN de células vermelhas fluorescentes MCF-7 de câncer de mama que expressam diferentes níveis do gene NDRG4 (referido sem células dndrg4-positivas e ndrg4-negativas), um modulador negativo de agrupamento beta1-integrin na superfície celular24, examinando as frações das células tumorais aderidas por ratos LN. Exemplos das imagens brutas deste protocolo são mostrados na Figura 2. Como observado na Figura 2B,a morfologia das células aderentes é arredondada em forma, e elas são heterogeneosamente dispersas por toda a LN. O índice de adesivos LN é 2 vezes maior em células MCF-7 ndrg4-negativas (877 ± 124 células/mm2 de LN) em comparação com o correspondente NDRG4-positivo células MCF-7 (412 ± 76 células/mm2 de LN, p = 0,03) (Figura 2D).

Figure 1
Figura 1: Procedimento stepwise para o isolamento do rato mesentérico LNs. (A)Incisião da pele midline ventral: ratos eutanizados foram colocados em posição de recumbency dorsal e uma incisão midline de 30-50 mm foi feita na pele sobrepondo o abdômen médio, expondo as vísceras abdominais (fígado, intestino delgado, cecum e bexiga). (B)O intestino delgado foi suavemente retirado da cavidade abdominal expondo lNs mesentéricos de rato embutidos em tecido adiposo visceral. (C)Anatomia bruta do trato gastrointestinal dissecado após a remoção. (D)Linfonodos mesentéricos dissecados do tecido adiposo conectado. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.

Figure 2
Figura 2: Resultados representativos da adesão celular tumoral às seções de linfonodos de ratos. (A) Análise ilustrativa de citometria de fluxo mostrando a intensidade da rotulagem DiI(C18)(quadrante superior) em comparação com células não rotuladas (quadrante inferior). (B) Imagens de microscopia leve (esquerda) e fluorescente (direita) de células MCF-7 etiquetadas em vermelho aderem às seções LN após a etapa de lavagem. (C) Após o ensaio de adesão, as células anexadas em coverslips são quantificadas manualmente usando uma escala de calibração para estimar a área do nódulo linfático e a microscopia fluorescente para a contagem direta de células. (D)A derrubada do NDRG4 nas células tumorais mamários MCF-7 aumenta a adesão ao nódulo linfático. Imagens representativas de células MCF-7 fluorescentes vermelhas (células rotuladas como DIIC18 d'ndrg4-positivo ou NDRG4-negativo) 30 minutos após a semeada em seções de linfonodos de 5 μm. O índice adesivo LN é expresso como o número de células tumorais aderentes por área coberta de LN (células/mm2). Barra de escala = 200 μm. *p < 0,05. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.

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Discussion

A disseminação do sistema linfático de células cancerosas requer uma variedade de eventos complexos orientados por células. Eles iniciam com o desprendimento celular do tumor primário e a remodelação da arquitetura de matriz extracelular (ECM), e são apoiados por quimotáxis persistentes e migração ativa através da linfática afetiva a caminho das LNs sentinelas. Se as células cancerígenas aderirem e sobreviverem em LNs, elas podem facilmente se espalhar para outros órgãos secundários. Aqui descrevemos um método fácil para análise funcional rápida e de baixo custo de interações adesivos específicas entre células tumorais e LNs congeladas.

Estruturalmente, as LNs são massas discretas semelhantes a esponjas de redes densas e extensas de fibras ECM, frequentemente referidas como "fibras reticulares", que atuam como caminhos para a migração celular e como conduítes para a rápida entrega de fatores solúveis (antígenos e/ou quiminas) dentro da parenchyma27da LN . As fibras reticulares preservadas das LNs congeladas do suporte de ensaio sinais haptotáticos e fornecem andaimes para adesão celular tumoral in vitro. Essas fibras são compostas principalmente de proteínas estruturais, como colásias I e III, e por elementos secundários de ECM, como fibronectina, tenascina, laminina, vitronectina e sulfato de heparan proteoglicanos28,29. Após a adesão celular, a maioria desses fatores de ECM derivados da LN fornecem pistas moleculares que determinam a sobrevivência celular (estados proliferativos ou dormentes) ou a morte celular (anoikis) através de sinais mediados por integrin.

Aqui, demonstramos o ensaio usando LNs de ratos xenogênicos e uma linha celular tumoral humano. Alternativamente, outras fontes de LNs poderiam ser usadas. A composição de rat, rato ou LNs humanas inclui as mesmas proteínas estruturais e funcionais que fazem parte do ECM mamífero nativo, tudo preservando locais de ligação semelhantes que são necessários para a adesão celular23. É importante ressaltar que o único passo crítico é usar fatias consecutivas da mesma LN por experimento para minimizar as variações regionais na composição do ECM de cada seção LN, que por sua vez poderia ditar a taxa de adesão celular.

Uma desvantagem do ensaio é que ele não recapitula os primeiros passos da disseminação linfática, refletindo apenas a força adesivo das células tumorais para As LNs. Por exemplo, semeadura de células tumorais de mama menos agressivas em seções de LN, como o MCF-7 (Figura 2) ou as linhas de células tumorais T47D24, levam a uma forte adesão às seções de LN in vitro, em níveis semelhantes aos observados para as células tumorais MDA-MB-231 agressivas (dados não mostrados). No entanto, é sabido que tumores de xenoenxerto MCF-7 ortotópicos não podem atingir as LNs sentinelas, enquanto tumores MDA-MB-231 espontaneamente metástases para eles30. Claramente, o principal gargalo para a formação de células MCF-7 LN-metástase ocorre em etapas antes de chegar e aderir às LNs, como a incapacidade das células MCF-7 escapar eficientemente dos tumores primários. Assim, a força do ensaio descrito aqui não é estabelecer correlações diretas com o potencial ln-metastático, mas é um método simples para quantificar as propriedades adesivos de uma célula tumoral em um ECM in vitro mais realista. Usando tecidos congelados, as crioseções representam a complexidade natural das LNs em termos de estrutura e composição, o que seria impossível de recriar usando técnicas sintéticas, particularmente aquelas que usam proteínas ECM purificadas.

Limitações adicionais do método são (1) que não permite a avaliação do potencial quimiotático de fatores secretados pelas LNs e que (2) não informa se a adesão específica da célula às seções de LN é resultado de ligação preferencial às proteínas, células ou quaisquer outras estruturas presentes nas seções de LN. No entanto, consideramos que essa abordagem poderia ser relevante e deve ser seriamente considerada para aplicações particulares, mas estavam além do escopo deste manuscrito em particular. Por exemplo, em um estudo recente, identificamos o gene 4 (NDGR4) regulado pelo n-Myc como um biomarcador mecanicista de metástase LN em tumores de mama24. Mecanicicamente, as células tumorais sem expressão NDRG4 aumentam a adesão às crioseções das LNs, favorecendo a montagem de receptores β1-integrin na borda líder das células tumorais de mama. Além disso, usando controles adicionais, como pratos revestidos com proteínas ECM purificadas, descobrimos que a adesão diferencial às seções LN é resultado de associação seletiva com vitronectina24.

Por fim, vale ressaltar que esse método não está restrito a seções de LNs e pode ser configurado para avaliar a adesão celular a diferentes órgãos vivos, como crioseções de baço ou pulmões. Células metastáticas exibem organotropismo e medições de força adesivo em seções congeladas de diferentes órgãos in vitro, podem ser uma média útil para prever a disseminação específica do câncer de órgãos.

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Disclosures

Os autores não têm nada para divulgar.

Acknowledgments

Agradecemos à Dra. Este trabalho contou com o apoio de bolsas da FAPESP - Fundação de Amparo à Pesquisa de São Paulo (2016/07463-4) e do Instituto Ludwig de Pesquisa do Câncer (LICR).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
15 mL Conical Tubes Corning 352096
2-propanol Merck 109634
Benchtop Laminar Flow Esco Cell Culture
Bin for Disc Leica 14020139126
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A9647-100
Cell culture flask T-25 cm2 Corning 430372
Cryostat Leica CM1860 UV
Cryostat-Brush with magnet Leica 14018340426
DiIC18 Cell Traker Dye Molecular Probes V-22885
Fetal Bovine Serum (FBS) Life Technologies 12657-029
Fluorescence microscope Nikon Eclipse 80
Forma Series II CO2 incubator Thermo Scientific
Formaldehyde Sigma-Aldrich 252549
High Profile Disposable Razor Leica 14035838926
Incubation Cube (IHC) KASVI K560030
Inverted microscope Olympus CKX31
Isofluran 100 mL Cristália
Liquid Bloquer Super Pap Pen Abcam, Life Science Reagents ab2601
Optimal Cutting Temperature "OCT" compound Sakura 4583
Phosphate-buffered Saline (PBS) Life Technologies 70011-044
Poly-L-lysine Sigma-Aldrich P8920
RPMI Gibco 31800-022
Serological Pipettes 1 mL Jet Biofil GSP010001
Serological Pipettes 10 mL Jet Biofil GSP010010
Serological Pipettes 2 mL Jet Biofil GSP010002
Serological Pipettes 5 mL Jet Biofil GSP010005
Serological Pipettes 50 mL Jet Biofil GSP010050
Serological Pipettor Easypet 3 Eppendorf
Tissue-Tek cryomold Sakura 4557
Trypan Blue 0.4% Invitrogen T10282
Trypsin Instituto Adolfo Lutz ATV

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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