Gebruik van capillaire elektrofoforese immunoassay om te zoeken naar potentiële biomarkers van amyotrofische laterale sclerose in menselijke bloedplaatjes

Neuroscience
 

Summary

Op bloed gebaseerde biomarkers voor neurodegeneratieve ziekten zijn essentieel voor de uitvoering van grootschalige klinische studies. Een betrouwbare en gevalideerde bloedtest moet een klein monstervolume vereisen en een minder invasieve bemonsteringsmethode zijn, betaalbaar en reproduceerbaar. Dit document toont aan dat hoog-doorvoer capillaire elektroforese immunoassay voldoet aan criteria voor mogelijke biomarker ontwikkeling.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Sage, J. M., Hall, L., McVey, A., Barohn, R. J., Statland, J. M., Jawdat, O., Dimachkie, M. M., Agbas, A. Use of Capillary Electrophoresis Immunoassay to Search for Potential Biomarkers of Amyotrophic Lateral Sclerosis in Human Platelets. J. Vis. Exp. (156), e60638, doi:10.3791/60638 (2020).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Capillaire elektroforese immunoassay (CEI), ook wel capillaire westerse technologie genoemd, wordt een keuzemethode voor het screenen van relevante eiwitten en geneesmiddelen in klinische studies. Reproduceerbaarheid, gevoeligheid, kleine monstervolumebehoefte, multiplexing antilichamen voor meerdere eiwitetikettering in hetzelfde monster, geautomatiseerde hoge doorvoercapaciteit om tot 24 individuele monsters te analyseren en een korte tijdseis maken CEI voordelig over de klassieke westelijke vlek immunoassay. Er zijn enkele beperkingen van deze methode, zoals het onvermogen om een gradiëntgel (4%–20%) te gebruiken matrix, hoge achtergrond met ongeraffineerde biologische monsters en commerciële onbeschikbaarheid van individuele reagentia. Dit document beschrijft een efficiënte methode voor het uitvoeren van CEI in een meervoudige testinstelling, het optimaliseren van eiwitconcentratie en primaire antilichaamtitratie in één testplaat en het verstrekken van gebruiksvriendelijke sjablonen voor monstervoorbereiding. Ook beschreven zijn methoden voor het meten van pan TDP-43 en fosforylated TDP-43 derivaat in bloedplaatjes lysaat cytosol als onderdeel van het initiatief in bloedgebaseerde biomarker ontwikkeling voor neurodegeneratieve ziekten.

Introduction

Het algemene doel van CEI zoals hier beschreven is om een bijgewerkt stapsgewijs protocol te bieden voor het analyseren van doeleiwitten in menselijke bloedplaatjes. Toewijzing van een op bloed gebaseerd signatuurmolecuul is een van de belangrijkste taken op het gebied van biomarkerontwikkeling bij menselijke neurodegeneratieve ziekten, zoals de ziekte van Alzheimer (AD), amyotrofische laterale sclerose (ALS), frontotemporale kwab degeneratie (FTLD), de ziekte van Parkinson (PD), inclusion body myositis (IBM) en andere eiwitaggregatie relevante pathologische aandoeningen. De detectie van minieme hoeveelheden van dergelijke kenmerkende eiwitten in grote hoeveelheden bloed met veel storende middelen is een uitdaging. Daarom zijn de specificiteit, gevoeligheid, het vermogen om een groot aantal monsters te verwerken en reproduceerbaarheid van de geselecteerde methode van cruciaal belang.

Menselijke bloedplaatjes kunnen dienen als een milieu te identificeren en toe te wijzen potentiële biomarker eiwitten voor neurodegeneratieve ziekte. Bloedplaatjes bieden de mogelijkheid om te dienen als een surrogaat primaire cel model, die een aantal kenmerken van neuronale cellenweerspiegelen 1,2,3. Er zijn bepaalde kenmerken die bloedplaatjes een van de gewenste middelen om biomarker kandidaat-eiwitten en hun chemische derivaten te analyseren. Ten eerste kunnen bloedplaatjes gemakkelijk worden verkregen met behulp van een minder invasieve aanpak door het verzamelen van bloed van donoren (d.w.z. venipunctie) of in grote hoeveelheden van communautaire bloedbanken. Ten tweede kunnen bloedplaatjes gemakkelijk uit het hele bloed worden geïsoleerd met minimale voorbereidende werkzaamheden in minimaal uitgeruste laboratoria4,5. Ten derde hebben bloedplaatjes geen kernen; daarom zijn ze een goede modelcel om veranderingen in de stofwisseling te bestuderen zonder transcriptieregulatie. Ten vierde is het biomolecuulgehalte van bloedplaatjes ingekapseld; daarom beschermt de bloedplaatjesmicromilieu de inhoud ervan tegen serumverstorende stoffen (d.w.z. proteasen). Ten vijfde kan met bloedplaatjes verrijkt plasma 7-8 dagen bij kamertemperatuur worden opgeslagen zonder de metabolische activiteit te verliezen. Daarom bieden bloedplaatjes een werkend model waarin externe factoren worden geminimaliseerd en gecontroleerd.

Traditionele immunoassaytechnieken zoals immunoblotting (bijvoorbeeld westerse vlekken) en enzymgebonden immunosorbenttest (ELISA) worden vaker gebruikt in specifieke eiwitanalyse. Deze twee methoden hebben echter verschillende nadelen, waaronder meerdere teststappen, vereiste van gevaarlijke chemische stoffen en reagentia, grote steekproefgrootte, problemen met de reproduceerbaarheid van de test en interrun-gegevensvariabiliteit. Deze leidden tot de ontwikkeling van een methode die eenvoudiger is met minder stappen en haalbaar in een relatief korte periode. Hoewel de klassieke westerse vlektechniek een populaire laboratoriummethode zal blijven, worden de procedure in meerdere stappen, leveringen, giftig afval (d.w.z. acrylamide, methanol, enz.) en testtijd minder wenselijk bij het uitvoeren van kwantitatieve eiwitanalyse.

Een geautomatiseerde CEI-aanpak wordt geleidelijk een keuzemethode voor laboratoria die eiwittesten met een hoge doorvoer uitvoeren6. CEI elimineert de noodzaak van gels, gel elektroforese apparaten, membranen, elektroforese en elektro-overdracht apparaten, en meer fysieke behandeling betrokkenheid. Indien goed ontworpen, moet een CEI-test binnen ongeveer 3,5 uur worden voltooid, inclusief kwantitatieve gegevensanalyse, elektropherogram van publicatiekwaliteit en grafieken met statistische analyse. Een andere superioriteit van het CEI-systeem is de eis van 10x-20x minder eiwitconcentratie, waardoor het ideaal is voor gebruik in menselijke monsters die worden gebruikt in klinische studies7,8.

Het meest kritische deel van CEI is het optimaliseren van de testomstandigheden voor elk antilichaam dat bij verschillende leveranciers is gekocht, type antilichaam (monoklonale versus polyklonale), optimale eiwitconcentraties, monstervoorbereiding, monsterdenaturatietemperatuur en elektroforesespanning toegepast op de haarvaten. We hebben een single-assay formaat optimalisatie methode voor de CEI die moet worden geïmplementeerd voordat een nieuwe testen, die tijd en middelen zal besparen. Deze optimalisatiestap wordt gevolgd door een geautomatiseerde kwantitatieve beoordeling van zowel totale als fosforgelatedededededevan transactivatierespons DNA/RNA bindend eiwit (TARDP). Vanwege de grootte (43 kDa) zal het acroniem TDP-43 in dit artikel worden gebruikt. Hier worden TDP-43-eiwit in menselijk bloedplaatjeslysaat verkregen van ALS-patiënten beoordeeld om te helpen bij de ontwikkeling van voorspellende fosforylatiewaarde (PPV) als een potentiële prognostische biomarker.

TDP-43 is een nieuwe potentiële kandidaat voor ALS. TDP-43 is een alomtegenwoordig eiwit in alle nucleated cellen; daarom zijn de functies van TDP-43 tijdens verschillende normale cellulaire voorvallen en bij neurodegeneratieve ziekte onderzocht9,10,11,12,13,14. Hoewel TDP-43 een nucleair eiwitis 15, heeft het de mogelijkheid om in en uit te pendelen tussen de kern en het cytoplasma als gevolg van de aanwezigheid van nucleaire lokalisatie en nucleaire exportsequenties16,17,18,19. Cytoplasmatische TDP-43 is betrokken bij verschillende cellulaire gebeurtenissen, zoals mRNA stabiliteit en transport, de stress respons, mitochondriale functie, autofaag20. Er is echter niet veel bekend over de rol van fosforderivaten van TDP-43, behalve hun betrokkenheid bij de pathogenese van neurodegeneratieve ziekte21.

Dit protocol illustreert hoe de testomstandigheden te optimaliseren om de inhoud van TDP-43 en de fosforgezuurderivaat in bloedplaatjes te analyseren met behulp van de CEI-benadering. Aangezien fosfortdp-43 niet commercieel beschikbaar is, wordt voorgesteld om een voorspellende fosforylatiewaarde (PPV) te gebruiken om TDP-43-profielen bij ALS-patiënten te beoordelen. Dit CEI-systeem maakt gebruik van een klein volume monstermengsel (2,5–3,0 μL per capillaire). De totale set-up van het totale testvolume is 8,0 μL per capillaire op basis van het protocol van de fabrikant; vandaar, onderzoekers kunnen gebruik maken van een monster mengsel voorbereiding voor twee afzonderlijke runs. De fabrikant ontwierp het testprotocol zodat eventuele pipetterfouten worden geminimaliseerd, zo niet volledig geëlimineerd. De 24 afzonderlijke menselijke bloedplaatjes lysaat monster mengsels zijn verdeeld in halve volumes (dat wil zeggen, 2,5-3,0 μL per monster) en achtereenvolgens geanalyseerd die door twee verschillende antilichamen binnen ~ 7 h. Het HIER beschreven CEI-systeem biedt een wenselijke testmodaliteit met hoge doorvoer. Gebruikers moeten antilichamen van verschillende leveranciers en monstervoorbereidingsmodaliteiten voor het doeleiwit testen voordat ze grootschalige screening uitvoeren.

Protocol

Alle protocollen met betrekking tot de verwerking van menselijke bloedplaatjes volgen de richtlijnen van zowel de Universiteit van Kansas Medical Center en Kansas City University of Medicine and Biosciences IRB commissies.

1. Opstelling van buffers en reagentia

OPMERKING: Bereid alle monsters volgens de richtlijnen van de fabrikant. Draag persoonlijke beschermingsmiddelen (labjassen, handschoenen en brillen) tijdens deze procedure.

  1. Bereid de citrate wash buffer voor door 0,941 g sacharose (11 mM eindconcentratie), 6,4 mL van 5 M NaCl (128 mM def.), 5,4 mL van 0,2 M NaH2PO4 (4,3 m M-finale), 9,4 mL van 0,2 M Na2PHO4 (7,5 mM def.), 0,352 g natriumcitraat (4,8 mM-finale) en 0,115 g citroenzuur (2,4 mM-finale). Pas het totale volume aan op 250 mL met ddH2O. Filter door een filterschijf van 0,45 μm en pas de pH aan op 6,5. Bewaar tot 1 jaar bij 4 °C. Breng de oplossing kamertemperatuur (RT) voor gebruik22.
  2. Bereid de breukbuffer voor door 250 mM sucrose, 1 mM EDTA en 10 mM Tris-Cl (pH 7.4) te combineren in een eindvolume van 100 mL. Bewaar tot 1 jaar bij 4 °C. Voeg 2 μL fosfataatremmers cocktail (1:1000 def.) en 1 μL proteaseremmers cocktail (1:2000 def.) toe in 2 mL breukbuffer. Blijf op ijs tot het gebruik. Gooi de ongebruikte breukbuffer weg.

2. Bloedplaatjesisolatie

  1. Verzamel 8-10 mL menselijk bloed in gele-cap bloedafnamebuis met zuur-citrate-dextrose (ACD) oplossing (75 mM trinatriumcitraat, 124 mM dextrose en 38 mM citroenzuur, pH = 7.4; ACD:bloed = 1:9). Meng de buisinhoud 5x-6x voorzichtig met de hand.
  2. Centrifugeer de buizen op 200 x g in een swingende emmerrotor gedurende 20 min bij RT.
  3. Verzamel bloedplaatjesrijk plasma (PRP) (~3-4 mL) in een conische bodembuis van 15 mL en laat ongeveer 0,5 mL van de PRP van de buffy-laag (wazig uitziende fractie) achter om besmetting te voorkomen. Als er een rode bloedcelbesmetting optreedt, herhaal deze stap.
  4. Centrifugeer de PRP-monsters op 1.200 x g voor 15 min bij RT.
  5. Was de bloedplaatjespellets (P1) door zachte resuspensie in 1 mL citrate wasbuffer en pellet door centrifugeren op 1.200 x g voor 15 min bij RT.
  6. Bewaar de zuivere bloedplaatjespellet. Gooi de supernatant weg.
  7. Resuspend de bloedplaatjespellets in 600 μL van de breukbuffer met remmercocktails.
  8. Sonicate de bloedplaatjes vering met behulp van een sonicator. Plaats het monster in een mini-ijsemmer. Stel de sonicator in op instelling 3 voor 20 s in continue modus.
    LET OP: Zorg ervoor dat de sonde schoon met 10% bleekmiddel, gevolgd door gedestilleerd water.
  9. Centrifugeer de gesoniceerde monsters met 20.000 x g gedurende 30 min bij 4 °C om membranous fracties te verwijderen. Aliquot supernatants in 60 μL en opslaan bij -80 °C. Vermijd herhaalde ontdooien / bevriezing cycli voor de bloedplaatjes cytosolic fracties.

3. Voorbereiding op het CEI

OPMERKING: 100 μL menselijk bloedplaatjeslysaat werd gecombineerd van ALS-patiënten (n = 8–10), en gezonde proefpersonen (n = 8–10) werden afzonderlijk samengevoegd en gebruikt voor de testoptimalisatie.

  1. Vul in-house gegenereerde sjablonen in voor de CEI-lay-out(tabel 1) en monstervoorbereiding(tabel 2). De voorbereidingstabel voor het monstermengsel is dynamisch en berekent automatisch hoeveel volume uit de bron moet worden verwijderd.
    OPMERKING: Indien nodig bronvolume ingevoerd in dynamische tabel-2, wordt het buffervolume van 0,1 X automatisch berekend.
  2. Pre-label 25 0,2 mL PCR buizen met haarvaten #1-#25 en plaats ze in een PCR-rack. Op ijs.
  3. Pre-label 0,6 mL microcentrifuge buizen: een voor elk primaire antilichaam en verdunning (indien nodig) te gebruiken, een voor de 0,1x monster buffer, een voor de luminol-S / peroxide, en een voor elk monster te verdunnen (indien nodig). Leg ze op ijs in buizenrek.
  4. Haal de monsterbuffer, wasbuffer, één plaat en een cartridge in de CEI-scheidingsmodule 12-230 kDa master kit.
  5. Neem uit de 4 °C koelkast de verdunningsbuffer voor antilichamen, primaire antilichamen, secundaire antilichamen, luminol, waterstofperoxide en standaardverpakking. Plaats alle reagentia op ijs, behalve de standaard verpakking, die bij RT blijft.
    LET OP: De reagentia uit de standaardverpakkingen zijn lyofhilized en verzegeld met een foliedeksel. Deze moeten kort worden afgebroken met behulp van een minicentrifuge voordat u opent om productverlies te verminderen. Om te openen, kunnen de reagensbuizen doorboord worden door een pipettip of uit de hoek worden getrokken.
  6. Voeg 40 μL gedeïoniseerd water toe aan de heldere buis met de DTT om de 400 mM DTT voor te bereiden.
  7. Voeg 20 μL van de 10x monsterbuffer en 20 μL van de bereide 400 mM DTT-oplossing toe aan de roze buis in de kit.
  8. Voeg om de biotinylated ladder voor te bereiden 16 μL gedeïoniseerd water, 2 μL van 10x monsterbuffer en 2 μL van de bereide 400 mM DTT-oplossing toe aan de witte buis in de kit. Meng voorzichtig en breng over in een 0,2 mL PCR-buis voor denaturering.
  9. Bereid een monsterbuffer van 0,1 x voor door 1,5 μL van 10x monsterbuffer en 148,5 μL gedeïoniseerd water toe te voegen aan een microcentrifugebuis van 0,6 mL. Vortex te mengen en plaats op ijs.
  10. Bereid de gewenste antilichaamverdunningen voor. Voeg het verdunningsmiddel van antilichamen toe in volumes die zijn aangewezen aan elke vooraf gelabelde microcentrifugebuis. Als de volumes identiek zijn, gebruik dan reverse pipettertechniek23; zo niet, voorspoel de pipettip voor het uitdelen.
    OPMERKING: In deze test werden aDP-43 panantilichaam en a-p(S409/410-2) TDP-43 antilichaam gebruikt. Anti-ERK antilichaam werd gebruikt voor een interne controle om ervoor te zorgen dat testcomponenten werken.
  11. Voer de omgekeerde pipetters voor antilichaam verdunning zoals hieronder beschreven. Als alternatief is aanvullende informatie te vinden in de literatuur24.
    OPMERKING: Reverse pipetting techniek heeft de voorkeur bij het verstrekken van kleine sequentiële volumes van oplossingen23. Deze techniek biedt enkele voordelen: (i) het leveren van een nauwkeurig volume, (ii) het elimineren van het reagens schuimen in de tipopening, en (iii) ideaal voor kleine volume (<5 μL) reagentia, viskeuze oplossingen, oppervlakteactieve oplossingen en oplossingen met hoge dampdruk.
    1. Doe een goede tip in een pipet en druk de zuiger naar beneden naar de tweede halte (Stap-2). Dompel de pipettip een paar millimeter onder in de oplossing. Laat de zuiger langzaam los om de pipettip met de oplossing te vullen, terwijl de tip nog steeds in de oplossing wordt ondergedompeld. Verwijder de punt van de oplossing en raak voorzichtig tegen de rand van het reagensreservoir aan, zodat overtollige vloeistof die aan de buitenkant van de punt blijft, wordt verwijderd.
    2. Doseer de oplossing door de zuiger naar beneden te drukken om eerst te stoppen (Stap-1). Geef de resterende oplossing niet uit in de punt.
    3. Leeg de resterende oplossing in de punt naar het reagensreservoir door de zuiger naar de tweede halte te drukken (Stap-2). Laat de zuiger los op de klaarpositie voor de volgende pipetterstap.
    4. Voeg het vereiste antilichaam toe in volumes die zijn aangewezen aan elke voorgelabelde microcentrifugebuis(tabel 1) Spoel de pipettip niet voor: voeg deze direct toe aan het verdunningsmiddel en spoel de punt meerdere keren door om het antilichaam te verwijderen. Leg de buizen op ijs.
  12. Voer de onderstaande stappen uit voor PCR-buizen met het label cap#2 tot en met 25: Dit is in dezelfde volgorde als in tabel 1.
    1. Open alle buizen, voeg 1,6 μL aliquots fluorescerende 5x monsterbuffer toe aan elke buis met behulp van een omgekeerde pipettertechniek en sluit vervolgens elke PCR-buis bij toevoeging van de 5x-buffer om monsterverlies te minimaliseren.
    2. Open alle buizen, voeg 0,1x monsterbuffer toe in volumes die zijn aangeduid in tabel 2 aan elke buis en sluit onmiddellijk daarna. Als de volumes identiek zijn, gebruik dan een omgekeerde pipettertechniek. Zo niet, voorspoel pipet tip voor het afgeven van 0,1x monster buffer.
    3. Open alle buizen, voeg eiwitmonster toe in volumes die in tabel 2 zijn aangewezen, aan elke buis en sluit onmiddellijk daarna. Als de volumes identiek zijn, gebruik dan reverse pipetting techniek. Zo niet, voorspoel pipet tip voor het afgeven van 0,1x monster buffer.
    4. Centrifugeer kort alle PCR-buizen in een benchtopcentrifuge (13.000 x g voor 30 s), flick/vortex PCR-buizen om te mengen en herhaal vervolgens de centrifuge.
    5. Breng alle PCR-buizen over in thermocycler met een verwarmd deksel. Denatureren monsters bij bepaalde temperatuur en duur (d.w.z. 95 °C gedurende 5 min; 70 °C gedurende 10 min).
      OPMERKING: De denaturatietemperatuur en -duur moeten worden geoptimaliseerd voor doeleiwit.
    6. Herhaal stap 3.12.4.
    7. Breng alle PCR-buizen terug naar buizenrek en plaats op ijs.
    8. Bereid tijdens de denatureringstap de ontwikkelingsoplossing voor (1:1 luminol-S:peroxide oplossing), voeg vervolgens 200 μL luminol-S en 200 μL peroxide toe. Zet op ijs.
    9. Als u een vooraf gevulde CEI-plaat met het hierboven bereide monster wilt laden, moet u reagentia en monsters in de testplaat afgeven die in de testindeling wordt weergegeven (figuur 1). Vermijd de invoering van luchtbellen.
      OPMERKING: Als volumes en oplossing identiek zijn, gebruik dan een omgekeerde pipettertechniek. Zo niet, pre-spoel de pipet tip voor het delen en niet verdrijven de rest in de plaat goed met behulp van de tweede tab stop op de pipet. Een scheidingsmodule van 12-230 kDa kan een kleurgecodeerde plaatbeladingsgeleider bevatten. Plaats deze gids onder de plaat terwijl het toevoegen van reagentia en monsters aan de put, die visueel helpt bij het laden van monsters. De plaat-loading gids kan worden gedownload van het bedrijf website, ook.
      1. Voeg in rij E 15 μL luminol:peroxidemix toe aan elke put.
        LET OP: Idealiter, bereid dit reagens net voor gebruik en toe te voegen aan elke put. Als dit niet handig is, mag dit mengsel niet meer dan 30 minuten vóór het laden van de plaat worden bereid.
      2. Voeg in rij D, te goed D1, 10 μL streptavidin-HRP toe.
      3. Voeg in rij D, naar putten D2–D25, 10 μL aangewezen secundaire antilichaam toe.
      4. Voeg in rij B aan elke put 10 μL antilichaamverdunning.
      5. Voeg in rij C, tot goed C1, 10 μL antilichaamverdunning.
      6. Voeg in rij C, naar putten C2–C25, 10 μL aangewezen primaire antilichaam toe.
      7. Voeg in rij A, te goed a1, 5 μL biotinylated ladder toe van PCR-buis #1.
      8. Voeg in rij A, om A2–A25 te putten, 3 μL van het monster toe, PCR-buizen #2-#25 in overeenkomstige putten #2-#25.
      9. Voeg 500 μL wasbuffer toe aan elke aangewezen wasbuffer.
      10. Centrifugeer de plaat gedurende 5 min bij 1.000 x g bij RT.

Figure 1
Figuur 1: Assay lay-out. Zowel primaire antilichaam en doel eiwit monster optimalisatie kan worden uitgevoerd in een test. Haarvaten 2–7, 8–13, 14–19 en 20–24 vertegenwoordigen verschillende eiwitconcentratie en primaire antilichaambereik. Capillair 25 staat voor een positieve controle. Anti-ERK antilichaam werd gebruikt; elke passende positieve controle kan echter worden opgenomen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

4. Het CEI uitvoeren op plaat 1

  1. Schakel eerst de CEI(Table of Materials)analyzer in en schakel vervolgens de computer in. Open de software (Tabel met materialen)
  2. Sluit de analyzer aan op het online systeem(Tabel met materialen). Dit is een noodzakelijke stap om de run data te verzamelen voor problemen met het maken van problemen en het herstel van gegevens.
  3. Klik op Instrument in het menu linksboven en klik vervolgens op Verbinding maken. Selecteer het serienummer van het instrument dat wordt weergegeven als pop-upmenu. Klik op Verbinding maken.
  4. Selecteer het tabblad 'Assay'en selecteer Nieuwe test of selecteer een opgeslagen sjabloon.
  5. Insteltestparameters(tabel 1)of wijzig de sjabloon op dit moment. Sla de bestandsnaam en -locatie op.
  6. Zorg ervoor dat de knipperende blauwe kleurindicator in de analyzer effen blauw blijft.
  7. Raak de zilveren metalen knop op de top van de oranje deur te openen.
  8. Verwijder voorzichtig de capillaire cartridge uit de verpakking. Plaats de capillaire cartridge zoals beschreven door het protocol van de fabrikant. Als het licht correct is geïnstalleerd, wordt het "blauw".
  9. Haal de beschermafdichting van de testplaat. Bekijk de voorgevulde putten voor luchtbellen visueel. Indien waargenomen, pop ze met een kleine pipet tip (Long-shaft P10 pipet tip werkt goed).
  10. Laad de plaathouder door de testplaat te plaatsen en sluit de deur. Klik op de computer op de knop Start.
    1. Plaats de ijslade met temperatuurgevoelige reagentia en monsters in het donker bij 4 °C tot u klaar bent om de tweede voorgevulde plaat voor te bereiden.
    2. Laat reagentia/benodigdheden op kamertemperatuur voor de tweede plaat.

5. Het CEI uitvoeren op plaat 2

LET OP: Deze plaat is ingesteld voor het analyseren van fosforgehaltes TDP-43.

  1. Verwijder de ijslade die bij 4 °C wordt opgeslagen en plaats deze op de bank, 1 uur voor de geschatte voltooiingstijd van de eerste plaat. Haal een tweede plaat en cartridge op.
  2. Bereid alle antilichaam verdunningen die nodig zijn voor de tweede run en bewaar ze op ijs. Bereid verse 1:1 luminol-S:peroxide oplossing (stap 3.12.8 hierboven).
  3. Remix en re-centrifugeer kort de monstermix en reagentia die nodig zijn voor het laden van de vooraf gevulde plaat. Laad de tweede plaat volgens figuur 1. Laad a-p(S409-410-2) TDP-43 antilichaamoplossing in rij C putten.
  4. Wanneer de eerste run is voltooid, gooi de eerste plaat en cartridge weg. Verwijder de cartridge en plaats in de container van een scherpe voor verwijdering. Bewaar de stickers van de plaat en cartridge voor referentiedoeleinden.
  5. Sluit het softwarebestand en selecteer dezelfde sjabloon opnieuw. De software onthoudt de instellingen van de vorige run. Breng eventuele wijzigingen aan in de annotatie indien nodig (d.w.z. het veranderen van het primaire antilichaam).
  6. Herhaal stap 4.8–4.10. Alle 12-230 kDa master kit scheidingsmodule reagentia en benodigdheden wegzetten
  7. Gooi overgebleven CEI monster-mix, antilichaam verdunningen, 0,1x monster buffer en luminol-S: peroxide mengsels in overeenstemming met de universitaire regelgeving.

6. Gegevensanalyse

  1. Zodra de run is voltooid, moet u ervoor zorgen dat de volgende kwaliteitscontroles worden uitgevoerd.
    1. Selecteer in software het pictogram Standaarden weergeven en het tabblad Grafiekweergave. Controleer alle 25 haarvaten op de piekuitlijningen op interne fluorescerende markeringsgroottes. Corrigeer de verkeerde uitlijningen door Force Standard te selecteren of met de rechtermuisknop op de onjuiste piek te klikken en vervolgens Niet een standaard teselecteren. Voer deze controle uit voor elke nieuwe capillaire.
    2. Klik op Samples en het pictogram Single View. Selecteer capillaire #1 (biotinylated ladder) in het tabblad experiment. Bekijk de piekuitlijningen op moleculaire gewichtsmarkeringen. Klik op de piek in de grafiekweergave en selecteer Piek verwijderenals de software een onjuiste selectie van de piek maakt.
      OPMERKING: Als voorbeeld, de 12-230 KDa biotinylated ladder zal tonen grootte pieken op 12 kDa, 40 kDa, 66 kDa, 116 kDa, 180 kDa, en 230 kDa. De grootte van de monsterpieken is onjuist als deze stap niet wordt uitgevoerd en onjuiste resultaten oplevert.
    3. Bekijk de elektroforetische film en noteer of er een abnormale migratie is opgetreden tijdens de run.
    4. Ontlenen gegevens (bijvoorbeeld pieken tabel, met inbegrip van moleculair gewicht, piekgebied, piekhoogte, en signaal-to-noise [S / N]) als dat nodig is voor verdere berekeningen. Er zijn grafiekannotatietools in de rechterbovenhoek van het grafiekvenster voor het verstrekken van meer informatie over de grafiek.

Representative Results

Optimalisatie van bloedplaatjescytosolic eiwitconcentratie en primaire antilichaamtitratie
Het is belangrijk om een lineair dynamisch bereik van bloedplaatjes cytosolic eiwitten in de test vast te stellen, omdat veranderingen in het signaal direct evenredig zijn met veranderingen in eiwit in de bloedplaatjescytosol. Het gebruik van het gehele bloedplaatjeslysaatmengsel in de test kan de signaalintensiteit van de doeleiwitten verminderen (TDP-43 en P(S409-412) TDP-43) en bijdragen aan een hoog achtergrondsignaal. Daarom werd in deze test de heldere supernatant gebruikt (cytosolic fractie) na het scheuren van bloedplaatjes(figuur 2).

Figure 2
Figuur 2: Signaalhelderheid is afhankelijk van de monsterkwaliteit. (A) Geheel bloedplaatjeslysaathomogenaat interfereert met anti-TDP-43 antilichaambinding; daarom werd een luidruchtig elektropherogram waargenomen. (B) Bloedplaatjescytosolfractie werd verkregen uit het onderwerpen van het hele lysaat aan centrifugering (16.000 x g voor 30 min). De meeste membranous proteïnen werden verwijderd; vandaar dat anti-TDP-43 antilichaambinding aan TDP-43 eiwit werd verbeterd (blauwe lijntracering). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Een lineair dynamisch bereik voor bloedplaatjes cytosoleiwitconcentratie werd vastgesteld op 0,2–0,8 mg/mL. Er werd een testsjabloon aangenomen, zodat zowel de eiwitconcentratie als de primaire antilichaamtitratie in één test konden worden uitgevoerd (figuur 3).

Figure 3
Figuur 3: Lineair dynamisch bereik voor bloedplaatjescytosoleiwitconcentratie. (A) Zowel eiwitconcentraties als antilichaamtitraties werden tijdens dezelfde run in één plaat geoptimaliseerd. (B) Het lineaire werkbereik (0,2–0,8 mg/mL) voor eiwitten werd vastgesteld. Een eiwitbelasting van 0,5 mg/mL werd door a-ERK-antilichaam bestempeld als de positieve controle (capillair 25). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Opgemerkt moet worden dat het glycerolgehalte in de monsterbereidingsbuis minder dan 20% (definitief) moet zijn, anders zal de hoge glycerolconcentratie de primaire antilichaambinding negatief beïnvloeden.

Optimale belichtingstijd bepalen
In de oudere versie van de software moest de optimale belichtingstijd worden bepaald door het piekgebied tegen de eiwitconcentratie (mg/mL) in kaart te brengen. De nieuwe versie biedt een nieuwe tool genaamd het hdr-detectieprofiel (High Dynamic Range)(Figuur 4). Met behulp van het beeldpaneel op voorwaarde dat de optie om alle belichtingstijden (dat wil zeggen, 5 s, 15 s, 30 s, 60 s, 120 s, 240 s, 480 s) samen te bekijken. Computersoftware analyseerde alle belichtingstijden en identificeerde automatisch de beste belichtingstijd (HDR). HDR-detectieprofiel leverde een aanzienlijk breder dynamisch bereik dankzij de grotere gevoeligheid van CEI, wat een betere detectie en kwantificering betekent over een groter monsterconcentratiebereik. Gebruikers hebben echter nog steeds de mogelijkheid om elke belichtingstijd te kiezen die voldoet aan het experimentele doel. Met behulp van deze functie werd optimale belichtingstijd gevonden voor TDP-43-eiwit. De piek vertegenwoordigt de optimale belichtingstijd (figuur 4A). Voor dit antilichaam werd één blootstellingstijd (4 s) gedefinieerd na het bekijken van alle negen blootstellingstijden variërend tussen 1-512 s (figuur 4B).

Figure 4
Figuur 4: HDR-detectieprofiel (high dynamic range) voor een doeleiwit. (A) TDP-43 eiwitpiek vertegenwoordigt de optimale blootstellingstijd voor het doeleiwit. a-TDP-43 Ab titratie was 1:300, en bloedplaatjes cytosol eiwitconcentratie was 0,5 mg/mL. De softwaregedefinieerde blauwe lijn geeft de optimale belichtingstijd aan. (B) Dit cijfer vertegenwoordigt een door de gebruiker gedefinieerde enkele belichtingstijd (4 s) na het bekijken van alle negen belichtingstijden variërend tussen 1-512 s. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

TDP-43 niveaus bij menselijke bloedplaatjescytosol van ALS-patiënten
Een bloedbasis biomarker ontwikkeling werd uitgevoerd. Aan de hand van geoptimaliseerde testomstandigheden werden bloedplaatjes lystolische fracties van ALS-patiënten geanalyseerd met behulp van twee sets antilichamen (d.w.z. anti-TDP-43 [Pan] antilichaam, een antilichaam dat fosforderivaten van TDP-43-eiwit herkent; hier werd a-P [S409/410-2] TDP-43 gebruikt). In deze demonstratie worden ziektespecifieke TDP-43 en zijn fosforgezuurderivaat gepresenteerd (figuur 5).

Figure 5
Figuur 5: Een weergave van voorspellende fosforylatiewaarde (PPV) van TDP-43. Absolute hoeveelheid fosfortdp-43 en pan TDP-43 alleen niet laten zien veel verschil tussen de ALS en controlegroepen. PPV wees echter op een lichte stijging van het ALS-cohort, hoewel er geen statistisch verschil was tussen de twee groepen als gevolg van onvoldoende aantal proefpersonen (ALS = 25, controle = 27). Een lage Cohen's d waarde tussen de middelen van ALS en controle groep toonde een laag effect grootte tussen de twee groepen als gevolg van kleine steekproef grootte (controle = 25, ALS = 27). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Totaal TDP-43 werd gekwantificeerd met behulp van de kalibratiecurve (figuur 6)

Figure 6
Figuur 6: Standaardkalibratiecurve. Commercieel gekochte recombinant TDP-43 eiwitconcentraties werden gebruikt om een standaardcurve te construeren. Elke gegevens vertegenwoordigen het gemiddelde van drievouden. De eiwitbandintensiteiten waren afhankelijk van concentratie (Inset). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

De kwantificering van fosfortdp-43 eiwit was niet mogelijk als gevolg van commercieel onbeschikbaarheid van dit eiwit. In plaats daarvan werd een voorspelde fosforylatiewaarde (PPV) vastgesteld die het percentage van de fosforachtige soorten TDP-43 definieert. PPV werd bepaald uit twee opeenvolgende CEI-testen voor hetzelfde monster met behulp van de volgende vergelijking.

Equation 1

Intra- en interrun assay variabiliteit werden getest in gepoolde menselijke ALS bloedplaatjes cytosolic fracties (figuur 7)

Figure 7
Figuur 7: Assay variaties. (A) Twee haarvaten geladen met hetzelfde monster werden geanalyseerd door CEI, en intra-run test variatie werd berekend als CV% = 14,9. (B) Hetzelfde monster werd geanalyseerd op drie verschillende testdagen en in drie verschillende testruns. Inter-run test variatie werd berekend als CV% = 18,7. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Hoewel de coëfficiëntenvariatiewaarden binnen de run (capillaire variatie) in het aanvaardbare bereik daalden (CV% = 14,9), was de interrun-testwaarde relatief hoog (CV% = 18,7). Er wordt uitgelegd dat deze variatie kan worden te wijten aan het gebruik van capillaire cartridges en monster platen van verschillende partijen. Het wordt aanbevolen dat reproduceerbaarheidsstudies worden uitgevoerd in CEI-componenten met hetzelfde lotnummer.

Tabel 1: CEI-testplaatladingsjabloon. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Tabel 2: Sjabloon voor de voorbereiding van interactieve monstersmengsels. Na het invoeren van de voorraad eiwitconcentratie van onbekende monsters, interactieve cellen zal automatisch berekenen hoeveel volume moet worden gebruikt voor de voorbereiding van de monster mix. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Discussion

De capillaire elektroforetische immunoassay is nu de methode van keuze voor hoge doorvoer monsteranalyse en drug screenings25. Kleine steekproefvolumes, goed geoptimaliseerde testcomponenten, gebruiksvriendelijk testplatform en instrumentatie, reagensuitgaven en een laag CV-percentage zijn primaire voordelen26,27. Hoewel er verschillende methoden zijn om eiwitten te scheiden in verschillende testmodaliteiten, kan het hier beschreven op antilichamen gebaseerde CEI worden aangepast door kleine laboratoria die zich bezighouden met bloedgebaseerde biomarkerontwikkeling. De HIER gebruikte CEI-testtechnologie biedt betrouwbare, reproduceerbare en gevoelige metingen voor TDP-4328 en zijn fosforgederivaat5.

Het CEI-systeem biedt ook een multiplexing keuze van het analyseren van TDP-43 en de fosforderivaten tegelijkertijd en het verstrekken van de directe kwantificering van het doeleiwit, indien gezuiverd of recombinant doeleiwit beschikbaar is. Full-length recombinant TDP-43 eiwit is commercieel beschikbaar; echter, recombinant fosforylated TDP-43 derivaat is niet. Aangezien fosfortdp-43 niet commercieel beschikbaar is, werd een voorspellende fosforylatiewaarde (PPV) geïmplementeerd om het TDP-43-profiel bij ALS-patiënten te beoordelen. Pan TDP-43 en fosforhoudende TDP-43-hoeveelheden waren permanent voorzien van een fluorophore; daarom blijft het TDP-43-profiel hetzelfde met of zonder kwantitatieve eenheid (d.w.z. ng/mL, pg/mL, enz.). Hoewel het bepalen van de absolute hoeveelheid TDP-43 en de fosforderivaten (d.w.z. P [S409-410-12] TDP-43) een meer kwantitatieve meting biedt, elimineert de berekening van PPV de noodzaak van de recombinant fosforylated TDP-43 voor standaardisatie, aangezien deze niet commercieel beschikbaar is.

CEI biedt verschillende controlepunten in het testplatform om het probleem nauwkeurig te identificeren in het geval dat een test mislukt. Dit elimineert obstakels en zorgt voor een beter experimenteel ontwerp. De testprocedure is volledig geautomatiseerd, behalve voor het vullen van de monsterplaat. Dit is een belangrijke functie in vergelijking met standaard westerse blotting analyse. Deze functie biedt consistentie van run-to-run. Hoewel elk laboratorium heeft unieke standaard operationele procedures, is het belangrijk om zich te houden aan praktijken die menselijke fouten te minimaliseren. Het is bijvoorbeeld van cruciaal belang om het luminol-S/peroxidemengsel vlak voor het laden van de plaat voor te bereiden, omdat het toevoegen van peroxide in luminol de enzymatische reactie begint en het luminolsubstraat verbruikt. Het laden van monsters en primaire/secundaire antilichamen in plaatputten zonder luchtbellen zijn ook uiterst belangrijke stappen.

Bovendien, aangezien de plaatputten klein in volume zijn en er geen ruimte tussen putten is, zouden de gebruikers voorzichtigheid tijdens het piaaiden moeten gebruiken, die de belangrijkste stap is aangezien al het andere geautomatiseerd is. De laadvolgorde van de monsters, antilichamen en andere reagentia is belangrijk voor de consistentie van de test (figuur 1). Het proces van plaatvoorbereiding duurt ongeveer 40-45 min. Daarom wordt aanbevolen om eerst de plaat te laden met de vereiste testcomponenten en het luminol-S/peroxidemengsel vlak voor het beaien voor te bereiden. Op deze manier is er een consistente opeenvolging van reagens toevoegen, en consistente luminescentie signaal sterkte zal worden bereikt. Het wordt afgeraden om een verlopen luminol-S/peroxide reagens te gebruiken, omdat het voornamelijk de sterkte van de peroxide beïnvloedt. De recente vooruitgang bij de invoering van het splitbuffersysteem en met inbegrip van het compatibiliteitsbereik voor chemische en wasmiddelen heeft de testkwaliteit verbeterd en meer reproduceerbare en voorspelbare resultaten opgeleverd. Nu, een nieuwe combo-analyzer van dezelfde fabrikant beschikt over een functie voor het analyseren van de monsters gelabeld met chemiluminescentie en fluorescentie vervoegde antilichamen in dezelfde run. Deze nieuwe functie elimineert de noodzaak om achtereenvolgens twee afzonderlijke platen uit te voeren en elimineert run-to-run variatie.

De testplaten moeten worden opgeslagen in omgevingstemperatuur. Als wordt gekozen om de testplaten in een koelkast van 4 °C te houden, moeten de platen de nacht voor de test worden verwijderd en op omgevingstemperatuur worden gebracht. Verkeerd geladen monsterputten moeten uitgebreid (4-5 keer) worden gewassen met buffer in de kit voordat u het juiste monster toevoegt. Elk primair antilichaam en biologische monsters zijn uniek; daarom moet de antilichaam/eiwitoptimalisatie worden uitgevoerd voordat de monsters voor doeleiwitten in biologische vloeistoffen worden geanalyseerd.

Hier werd de primaire incubatietijd van het antilichaam standaard ingesteld op 30 min. Als het signaal zwak is, moeten gebruikers overwegen om de primaire incubatietijd van het antilichaam te verhogen totdat ze de gewenste signaalsterkte bereiken zonder een burn-out van het fluorescentiesignaal. Voor menselijke bloedplaatjes werden gepoolde monsters van patiënten voorbereid en gebruikt voor een optimalisatietest. De steekproef bundeling vertegenwoordigt beter de variatie tussen doelbiomoleculen. Het wordt aanbevolen om duidelijke supernatants te gebruiken in plaats van totale lysaat of totale homogenaat voor de CEI.

De hoge concentratie eiwit in het gehele bloedplaatjeslysaatmengsel kan de signaal-ruisverhouding(figuur 2) verminderen. Herhaalde vriesdooicycli van monsters moeten worden vermeden, omdat dit een negatieve invloed heeft op de primaire antilichaambinding. De ingrediënten van de lysaatbuffer zijn belangrijk, omdat sommige reagentia niet compatibel zijn met CEI29. Het wordt aangeraden de lijst van compatibele reagentia die op de website van de fabrikant is verstrekt, vóór de voorbereiding van het monster te controleren. Dit is een beperking van het systeem dat geen hoge stringentievoorwaarden voor monstervoorbereiding tolereert. Het wordt aanbevolen om de testrunparameters (d.w.z. primaire verdunning van antilichamen, eiwitconcentratie, primaire incubatietijd van antilichamen, enz.) te optimaliseren met behulp van gepoolde monsters om vervolgens de individuele monsters te analyseren.

Disclosures

De auteurs verklaren geen concurrerend financieel belang behalve ProteinSimple, Inc. behandelde de publicatiekosten van dit manuscript.

Acknowledgments

Dit onderzoek werd gesponsord door een intramurale subsidie toegekend voor A.A. Dit werk werd ondersteund door een CTSA subsidie van NCATS toegekend aan de Universiteit van Kansas Medical Center for Frontiers: The Heartland Institute for Clinical and Translational Research (#UL1TR606381). De inhoud valt uitsluitend onder de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijkerwijs de officiële standpunten van het NIH of NCATS. We zijn dankbaar voor de Universiteit van Kansas Medical Center ALS kliniek persoonlijk voor het verkrijgen van IRB goedkeuring voor bloedmonster smeting van gezonde vrijwilliger en ALS patiënten. De auteurs bedanken Emre Agbas voor het proeflezen van het manuscript.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
12-230 kDa Separation kit ProteinSimple SM-W004 Contains pre-filled assay plate and 25-channel capillary cartridge
3000G Thermocycler Techne FTC3G/02 We used this thermocylcer for heating the sample mix
Anti-Mouse detection kit ProteinSimple 042-205 Includes HRP-conjugated secondary antibody, buffer, luminol reagent, molecular weight marker
Anti-P(S409-410) TDP-43 antibody ProteinTech 22309-1-AP Primary antibody that recognizes phosphorylated TDP-43
Anti-P(S409-412) TDP-43 antibody CosmoBio-USA TIP-PTD-P02 Primary antibody that recognizes phosphorylated TDP-43
Anti-Rabbit detection kit ProteinSimple DM-001 Includes HRP-conjugated secondary antibody, buffer, luminol reagent, molecular weight marker
Anti-TDP-43 (pan) antibody ProteinTech 10782-2-AP Primary antibody that recognizes whole TDP-43 protein
Compass for SimpleWestern (SW) ProteinSimple Ver.4.0.0. Compass for SW is the control and data analysis application for SimpleWestern instruments
Sonic Dismembrator; Model100 Fisher Scientific Sonicator. Used to rupture the cell membrane. This model is discontinued (Model XL2000-350)
Table top centrifuge Eppendorf 22625004 Model# 5810 with swinging plate bucket
Wes analyzer ProteinSimple 55892-WS-2203 Performs the capillary gel electrophoresis

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Blair, P., Flaumenhaft, R. Platelet alpha-granules: basic biology and clinical correlates. Blood Reviews. 23, (4), 177-189 (2009).
  2. Mercado, C. P., Kilic, F. Molecular mechanisms of SERT in platelets: regulation of plasma serotonin levels. Molecular Interventions. 10, (4), 231-241 (2010).
  3. Goubau, C., et al. Regulated granule trafficking in platelets and neurons: a common molecular machinery. European Journal of Paediatric Neurology. 17, (2), 117-125 (2013).
  4. Basu, S. S., et al. Human platelets as a platform to monitor metabolic biomarkers using stable isotopes and LC-MS. Bioanalysis. 5, (24), 3009-3021 (2013).
  5. Wilhite, R., et al. Platelet phosphorylated TDP-43: an exploratory study for a peripheral surrogate biomarker development for Alzheimer's disease. Future Science OA. 3, (4), 238 (2017).
  6. Worth, A. J., et al. LC-MS Analysis of Human Platelets as a Platform for Studying Mitochondrial Metabolism. Journal of Visualized Experiments. (110), e53941 (2016).
  7. Statland, J. M., et al. Rasagiline for amyotrophic lateral sclerosis: A randomized, controlled trial. Muscle and Nerve. 59, (2), 201-207 (2019).
  8. Charytan, D. M., et al. Safety and cardiovascular efficacy of spironolactone in dialysis-dependent ESRD (SPin-D): a randomized, placebo-controlled, multiple dosage trial. Kidney International. 95, (4), 973-982 (2019).
  9. Ugras, S. E., Shorter, J. RNA-Binding Proteins in Amyotrophic Lateral Sclerosis and Neurodegeneration. Neurology Research International. 432780 (2012).
  10. Amador-Ortiz, C., et al. TDP-43 immunoreactivity in hippocampal sclerosis and Alzheimer's disease. Annal of Neurology. 61, (5), 435-445 (2007).
  11. Baloh, R. H. TDP-43: the relationship between protein aggregation and neurodegeneration in amyotrophic lateral sclerosis and frontotemporal lobar degeneration. FEBS Journal. 278, (19), 3539-3549 (2011).
  12. Buratti, E., Baralle, F. E. The molecular links between TDP-43 dysfunction and neurodegeneration. Advances in Genetics. 66, 1-34 (2009).
  13. Guo, W., et al. An ALS-associated mutation affecting TDP-43 enhances protein aggregation, fibril formation and neurotoxicity. Nature Structural Molecular Biology. 18, (7), 822-830 (2011).
  14. Geser, F., et al. Motor neuron disease clinically limited to the lower motor neuron is a diffuse TDP-43 proteinopathy. Acta Neuropathologica. 121, (4), 509-517 (2011).
  15. Neumann, M., et al. Ubiquitinated TDP-43 in frontotemporal lobar degeneration and amyotrophic lateral sclerosis. Science. 314, (5796), 130-133 (2006).
  16. Buratti, E., Baralle, F. E. TDP-43: gumming up neurons through protein-protein and protein-RNA interactions. Trends in Biochemical Sciences. 37, (6), 237-247 (2012).
  17. Fallini, C., Bassell, G. J., Rossoll, W. The ALS disease protein TDP-43 is actively transported in motor neuron axons and regulates axon outgrowth. Human Molecular Genetics. 21, (16), 3703-3718 (2012).
  18. Ayala, Y. M., et al. Structural determinants of the cellular localization and shuttling of TDP-43. Journal of Cell Sciences. 121, Pt 22 3778-3785 (2008).
  19. Fiesel, F. C., Kahle, P. J. TDP-43 and FUS/TLS: cellular functions and implications for neurodegeneration. FEBS Journal. 278, (19), 3550-3568 (2011).
  20. Birsa, N., Bentham, M. P., Fratta, P. Cytoplasmic functions of TDP-43 and FUS and their role in ALS. Seminars in Cell and Development Biology. (2019).
  21. Liachko, N. F., et al. CDC7 inhibition blocks pathological TDP-43 phosphorylation and neurodegeneration. Annals of Neurology. 74, (1), 39-52 (2013).
  22. Qureshi, A. H., et al. Proteomic and phospho-proteomic profile of human platelets in basal, resting state: insights into integrin signaling. PLoS One. 4, (10), 7627 (2009).
  23. Suominen, I., Koivisto, S. Increasing Precision When Pipetting Protein Samples: Assessing Reliability of the Reverse Pipetting Technique. American Laboratory. (2011).
  24. Pipetting tool box for life sciences. https://www.mt.com/us/en/home/library/guides/laboratory-division/life-science/pipetting-toolbox-for-life-sciences.html (2019).
  25. Hale, L. J., et al. 3D organoid-derived human glomeruli for personalised podocyte disease modelling and drug screening. Nature Communication. 9, (1), 5167 (2018).
  26. Chen, J. Q., Wakefield, L. M., Goldstein, D. J. Capillary nano-immunoassays: advancing quantitative proteomics analysis, biomarker assessment, and molecular diagnostics. Journal of Translational Medicine. 13, 182 (2015).
  27. Moser, A. C., Hage, D. S. Capillary electrophoresis-based immunoassays: principles and quantitative applications. Electrophoresis. 29, (16), 3279-3295 (2008).
  28. Fourier, A., et al. Development of an automated capillary nano-immunoassay-Simple Western assay-to quantify total TDP43 protein in human platelet samples. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 411, (1), 267-275 (2019).
  29. Compatibility, S.W.S.A.B. https://www.proteinsimple.com/technical_library.html (2017).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics