Utilisation de l’immuno-astrophoresis capillaire immunossay à la recherche de biomarqueurs potentiels de la sclérose latérale amyotrophique dans les plaquettes humaines

Neuroscience
 

Summary

Les biomarqueurs à base de sang pour les maladies neurodégénératives sont essentiels à la mise en œuvre d’études cliniques à grande échelle. Un test sanguin fiable et validé devrait nécessiter un petit volume d’échantillon ainsi qu’une méthode d’échantillonnage moins invasive, abordable et reproductible. Cet article démontre que l’immuno-analyse d’électrophoresis capillaire à haut débit satisfait aux critères de développement potentiel de biomarqueurs.

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Sage, J. M., Hall, L., McVey, A., Barohn, R. J., Statland, J. M., Jawdat, O., Dimachkie, M. M., Agbas, A. Use of Capillary Electrophoresis Immunoassay to Search for Potential Biomarkers of Amyotrophic Lateral Sclerosis in Human Platelets. J. Vis. Exp. (156), e60638, doi:10.3791/60638 (2020).

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Abstract

L’immuno-analyse de l’électrophorèse capillaire (CEI), également connue sous le nom de technologie occidentale capillaire, devient une méthode de choix pour le dépistage des protéines et des médicaments pertinents pour les maladies dans les essais cliniques. Reproductibilité, sensibilité, petit besoin de volume d’échantillon, anticorps multiplexants pour l’étiquetage des protéines multiples dans le même échantillon, capacité automatisée à haut débit d’analyser jusqu’à 24 échantillons individuels, et exigence de temps court font de ceI avantageuse sur l’immuno-aïdsay occidental classique de blot. Il y a quelques limites de cette méthode, telles que l’incapacité d’utiliser un gel de gradient (4% -20%) matrice, arrière-plan élevé avec des échantillons biologiques non raffinés, et indisponibilité commerciale des réactifs individuels. Cet article décrit une méthode efficace pour exécuter CEI dans un réglage d’essai multiple, optimisant la concentration de protéine et la titration primaire d’anticorps dans une plaque d’essai, et fournissant des modèles faciles à utiliser pour la préparation d’échantillon. On décrit également des méthodes de mesure du pan TDP-43 et du dérivé TDP-43 phosphorylé dans le cytosol de lysate plaquettaire dans le cadre de l’initiative dans le développement de biomarqueurs à base de sang pour les maladies neurodégénératives.

Introduction

L’objectif global de ceI tel que décrit ici est de fournir un protocole mis à jour en sens inverse de l’analyse des protéines cibles dans les plaquettes humaines. L’affectation d’une molécule de signature à base de sang est l’une des tâches les plus importantes dans le domaine du développement de biomarqueurs dans les maladies neurodégénératives humaines, telles que la maladie d’Alzheimer (MA), la sclérose latérale amyotrophique (SLA), lobar frontotemporal dégénérescence (FTLD), la maladie de Parkinson (PD), la myosite de corps d’inclusion (IBM), et d’autres conditions pathologiques pertinentes de protéine-agrégation. La détection de quantités infimes de ces protéines de signature dans de grands volumes de sang avec de nombreux agents interférants est un défi. Par conséquent, la spécificité, la sensibilité, la capacité de traiter un grand nombre d’échantillons, et la reproductibilité de la méthode sélectionnée sont cruciales.

Les plaquettes humaines peuvent servir de milieu pour identifier et attribuer des protéines biomarqueurs potentielles pour les maladies neurodégénératives. Les plaquettes offrent la possibilité de servir de modèle de cellules primaires de substitution, qui reflètent certaines caractéristiques des cellules neuronales1,2,3. Il y a certaines caractéristiques qui font des plaquettes l’un des moyens privilégiés d’analyser les protéines candidates aux biomarqueurs et leurs dérivés chimiques. Tout d’abord, les plaquettes peuvent être facilement acquises en utilisant une approche moins invasive en recueillant du sang auprès des donneurs (c.-à-d. la venipuncture) ou en grand nombre auprès des banques de sang communautaires. Deuxièmement, les plaquettes peuvent être facilement isolées du sang entier avec un minimum de travail préparatoire dans les laboratoires mini-équipés4,5. Troisièmement, les plaquettes n’ont pas de noyaux; par conséquent, ils sont une bonne cellule modèle pour étudier les altérations du métabolisme sans régulation transcriptionnelle. Quatrièmement, la teneur en biomolécule des plaquettes est encapsulée; par conséquent, le microenvironnement plaquettaire protège son contenu contre les substances interférantes au sérum (c.-à-d. les protéases). Cinquièmement, le plasma enrichi en plaquette peut être stocké à température ambiante pendant 7 à 8 jours sans perdre d’activité métabolique. Par conséquent, les plaquettes fournissent un modèle de travail dans lequel les facteurs externes sont réduits au minimum et contrôlés.

Les techniques traditionnelles d’immuno-analyse telles que l’immunoblotting (p. ex., le ballonnement occidental) et l’analyse immunosorbent liée aux enzymes (ELISA) sont plus largement utilisées dans l’analyse spécifique des protéines. Cependant, ces deux méthodes présentent plusieurs inconvénients, y compris plusieurs étapes d’essai, l’exigence de produits chimiques dangereux et de réactifs, la grande taille de l’échantillon, les problèmes de reproductibilité des analyses et les variations de données inter-run. Celles-ci ont incité à l’élaboration d’une méthode plus simple avec moins d’étapes et réalisable dans une période relativement courte. Bien que la technique classique de la tache occidentale demeure une méthode de laboratoire populaire, sa procédure en plusieurs étapes, ses approvisionnements, ses déchets toxiques (c.-à-d. acrylamide, méthanol, etc.) et le temps d’analyse deviennent moins souhaitables lorsqu’il s’agit d’effectuer des mesures quantitatives à haut débit. l’analyse des protéines.

Une approche automatisée de l’ICe devient progressivement une méthode de choix pour les laboratoires qui effectuent des analyses de protéines à haut débit6. CEI élimine le besoin de gels, appareils d’électrophorèse gel, membranes, électrophorèse et dispositifs d’électro-transfert, et plus d’implications de manipulation physique. S’il est bien conçu, un test de l’IEI devrait être effectué dans un délai d’environ 3,5 h, y compris l’analyse quantitative des données, l’électrophétoyographie de qualité de publication et les graphiques avec analyse statistique. Une autre supériorité du système CEI est son exigence de 10x -20x moins de concentration de protéines, ce qui le rend idéal pour une utilisation dans les échantillons humains utilisés dans les essais cliniques7,8.

La partie la plus critique de ceI est d’optimiser les conditions d’analyse pour chaque anticorps acheté auprès de différents fournisseurs, le type d’anticorps (monoclonal vs polyclonal), les concentrations optimales de protéines, la préparation de l’échantillon, la température de dénaturation de l’échantillon, et la tension d’électrophorèse appliquée sur les capillaires. Nous avons développé une méthode d’optimisation du format à simple analyse pour la CEI qui devrait être mise en œuvre avant tout nouvel essais, ce qui permettra d’économiser du temps et des ressources. Cette étape d’optimisation est suivie d’une évaluation quantitative automatisée du dérivé total et phosphorylé de la protéine de liaison de réponse de transactivation (TARDP). En raison de sa taille (43 kDa), l’acronyme TDP-43 sera utilisé tout au long de ce document. Ici, la protéine TDP-43 dans le lysate humain de plaquette obtenu des patients de SAL sont évaluées pour aider à développer la valeur prédictive de phosphorylation (PPV) comme biomarqueur pronostique potentiel.

TDP-43 est un nouveau candidat potentiel de biomarqueur de la maladie pour la SLA. TDP-43 est une protéine omniprésente dans toutes les cellules nucléées; par conséquent, les fonctions de TDP-43 pendant divers événements cellulaires normaux et dans la maladie neurodegenerative ont été étudiées9,10,11,12,13,14. Bien que TDP-43 est une protéine nucléaire15, il a la capacité de navette entre le noyau et le cytoplasme en raison de la présence de localisation nucléaire et des séquences d’exportation nucléaire16,17,18,19. Cytoplasmique TDP-43 est impliqué dans divers événements cellulaires, tels que la stabilité de l’ARNm et le transport, la réponse au stress, la fonction mitochondriale, autophagosome20. Cependant, on ne sait pas grand-chose sur le rôle des dérivés phosphorylés de TDP-43 autres que leur implication dans la pathogénie de la maladie neurodégénérative21.

Ce protocole illustre comment optimiser les conditions d’analyse pour analyser le contenu du TDP-43 et de son dérivé phosphorylé dans les plaquettes à l’aide de l’approche CEI. Étant donné que le TDP-43 phosphorylé n’est pas disponible dans le commerce, il est proposé d’utiliser une valeur prédictive de phosphorylation (VPP) pour évaluer les profils TDP-43 chez les patients atteints de SLA. Ce système CEI utilise un petit volume de mélange d’échantillons (2,5 à 3,0 L par capillaire). La configuration totale du volume d’assay est de 8,0 L par capillaire selon le protocole du fabricant; par conséquent, les chercheurs peuvent utiliser une préparation de mélange d’échantillon pour deux courses séparées. Le fabricant a conçu le protocole d’asthèse de sorte que toutes les erreurs de tuyauterie soient réduites au minimum, sinon entièrement éliminées. Les 24 mélanges individuels de lysate de plaquettes humaines sont divisés en demi-volumes (c.-à-d. 2,5 à 3,0 L par échantillon) et analysés consécutivement par deux anticorps différents dans un délai de 7 h. Le système CEI décrit ici fournit une modalité souhaitable d’assay à haut débit. Les utilisateurs doivent tester les anticorps de différents fournisseurs et échantillonner les modalités de préparation de la protéine cible avant d’effectuer un dépistage à grande échelle.

Protocol

Tous les protocoles concernant le traitement des plaquettes humaines suivent les directives du Centre médical de l’Université du Kansas et des comités de la CISR de l’Université de médecine et des biosciences de Kansas City.

1. Préparation des tampons et des réactifs

REMARQUE : Préparer tous les échantillons selon les directives du fabricant. Portez de l’équipement de protection individuelle (manteaux de laboratoire, gants et lunettes) pendant cette procédure.

  1. Préparer le tampon de lavage de citrate en combinant 0,941 g de saccharose (11 mM de concentration finale), 6,4 mL de 5 M NaCl (128 mM finale), 5,4 mL de 0,2 M NaH2PO4 (4,3 mM final), 9,4 mL de 0,2 M Na2PHO4 (7,5 mM final), 0,352 g de citrate de sodium (4,8 mM final) et 0,115 g d’acide citrique (2,4 mM final). Ajustez le volume total à 250 ml avec ddH2O. Filtrez à travers un disque de filtre de 0,45 m et ajustez le pH à 6,5. Conserver jusqu’à 1 an à 4 oC. Apportez la température ambiante solution (RT) avant d’utiliser22.
  2. Préparer le tampon de rupture en combinant 250 mM de saccharose, 1 mM EDTA et 10 mM Tris-Cl (pH 7,4) dans un volume final de 100 ml. Conserver jusqu’à 1 an à 4 oC. Ajouter 2 ll de cocktail d’inhibiteurs de la phosphatase (1:1000 finale) et 1 l de cocktail d’inhibiteurs de protéase (1:2000 finale) dans 2 ml de tampon de rupture. Conserver sur la glace jusqu’à utilisation. Jetez le tampon de rupture inutilisé.

2. Isolement plaquettaire

  1. Recueillir 8 à 10 ml de sang humain dans le tube de collecte de sang à capuchon jaune contenant une solution acide-citrate-dextrose (ACD) (75 mM de citrate trisodique, 124 mM de dextrose et 38 mM d’acide citrique, pH à 7,4; ACD: sang 1:9). Mélanger délicatement la teneur en tube 5x-6x inversant à la main.
  2. Centrifugeles les tubes à 200 x g dans un rotor de seau oscillant pendant 20 min à RT.
  3. Recueillir le plasma riche en plaquettes (PRP) (3 à 4 ml) dans un tube conique de 15 ml et laisser environ 0,5 ml de PRP du PEL de la couche bouffie (fraction d’apparence brumeuse) pour éviter la contamination. Si une contamination par les globules rouges se produit, répétez cette étape.
  4. Centrifuger les échantillons de PRP à 1200 x g pendant 15 min à RT.
  5. Laver les granulés de plaquette (P1) par une resuspension douce dans 1 ml de tampon de lavage de citrate et granulé par centrifugation à 1 200 x g pendant 15 min à RT.
  6. Enregistrer la boulette de plaquette pure. Jetez le supernatant.
  7. Suspendre les granulés de plaquette dans 600 l du tampon de rupture contenant des cocktails inhibiteurs.
  8. Sonicate la suspension plaquette à l’aide d’un sonicator. Placer l’échantillon dans un mini seau à glace. Régler le sonicator au réglage 3 pour 20 s en mode continu.
    REMARQUE : Assurez-vous de nettoyer la sonde avec 10 % d’eau de Javel suivie d’eau distillée.
  9. Centrifuger les échantillons sonicated à 20.000 x g pendant 30 min à 4 oC pour enlever les fractions membranaires. Les supernatants Aliquot dans 60 L et les stocker à -80 oC. Évitez les cycles répétés de décongélation/congélation pour les fractions cytosoliques plaquettaires.

3. Préparation pour la CEI

REMARQUE : 100 L de lysate de plaquette humain ont été combinés des patients de SAL (n - 8-10), et les sujets sains (n - 8-10) ont été séparés mis en commun et utilisés pour l’optimisation d’assay.

  1. Remplissez les modèles générés à l’interne pour la disposition de la CEI (tableau 1) et la préparation de l’échantillon (tableau 2). Le tableau de préparation du mélange d’échantillons est dynamique et calculera automatiquement la quantité de volume à retirer de la source.
    REMARQUE : Lorsque le volume source requis est entré dans la table-2 dynamique, le volume tampon de l’échantillon 0,1 X sera automatiquement calculé.
  2. Préétiquement étiqueté 25 tubes PCR de 0,2 ml avec des capillaires #1 #25 et placez-les dans un support PCR. Mis sur la glace.
  3. Préétiquedes à 0,6 mL de tubes microcentrifugeurs : un pour chaque anticorps primaire et dilution (si nécessaire) à utiliser, un pour le tampon de l’échantillon de 0,1x, un pour le luminol-S/peroxyde, et un pour chaque échantillon à diluer (si nécessaire). Placez-les sur la glace dans un support à tubes.
  4. Sortez le tampon d’échantillon, tampon de lavage, une plaque, et une cartouche fournie dans le module de séparation CEI 12-230 kDa maître kit de séparation.
  5. À partir du réfrigérateur à 4 oC, retirez le tampon de dilution des anticorps, les anticorps primaires, les anticorps secondaires, le luminol, le peroxyde d’hydrogène et le paquet standard. Placez tous les réactifs sur la glace, à l’exception du pack standard, qui reste à RT.
    REMARQUE : Les réactifs des emballages standard sont lyophilisés et scellés à l’abri d’une couverture de papier d’aluminium. Ceux-ci doivent être filés brièvement à l’aide d’une mini centrifugeuse avant de s’ouvrir pour réduire la perte de produit. Pour s’ouvrir, les tubes de réactif peuvent être percés par une pointe de pipette ou tirés vers l’arrière du coin.
  6. Pour préparer le DTT de 400 mM, ajouter 40 l d’eau déionisée au tube transparent contenant la TNT.
  7. Pour préparer 40 L de mélange de maître fluorescent 5x, ajouter 20 l de la mémoire tampon de l’échantillon 10x et 20 l de la solution DTT préparée de 400 mM au tube rose fourni en kit.
  8. Pour préparer l’échelle biotinylated, ajouter 16 L d’eau déionisée, 2 L de tampon d’échantillon de 10x, et 2 L de la solution DTT préparée de 400 mM au tube blanc fourni en kit. Mélanger délicatement et transférer dans un tube PCR de 0,2 ml pour dénaturer.
  9. Préparer le tampon de l’échantillon de 0,1x en ajoutant 1,5 l de tampon d’échantillon de 10x et 148,5 l d’eau déionisée à un tube de micro centrifugeuse de 0,6 ml. Vortex à mélanger et placer sur la glace.
  10. Préparer les dilutions d’anticorps désirées. Ajouter le diluant d’anticorps dans les volumes désignés à chaque tube de micro centrifugeuse préétiqueté. Si les volumes sont identiques, utilisez la technique de tuyauterie inversée23; sinon, pré-rincer la pointe de pipette avant de la distribuer.
    REMARQUE : Dans cet exemple, un anticorps pan a-TDP-43 et un anticorps TDP-43 ont été utilisés. L’anticorps anti-ERK a été utilisé pour un contrôle interne pour s’assurer que les composants d’assay fonctionnent.
  11. Effectuer le tuyauterie inversée pour la dilution des anticorps comme décrit ci-dessous. Alternativement, des informations supplémentaires peuvent être trouvées dans la littérature24.
    REMARQUE : La technique de pipetage inversée est préférée lors de la distribution de petits volumes séquentiels de solutions23. Cette technique offre quelques avantages : (i) fournissant un volume précis, (ii) éliminant l’écume de réactif dans l’orifice de pointe, et (iii) idéal pour le petit volume (lt;5 l) réagents, solutions visqueux, solutions de surfactant, et solutions avec la pression de vapeur élevée.
    1. Placez une astuce appropriée dans une pipette et appuyez sur le piston jusqu’au deuxième arrêt (Étape-2). Immerger la pointe de la tuyauterie quelques millimètres dans la solution. Relâchez lentement le piston pour remplir la pointe de la tuyauterie avec la solution pendant que la pointe est toujours immergée dans la solution. Retirez la pointe de la solution et touchez doucement le bord du réservoir du réactif afin que l’excédent de liquide restant à l’extérieur de la pointe soit enlevé.
    2. Distribuez la solution en appuyant sur le piston jusqu’au premier arrêt (Étape-1). Ne distribuez pas la solution restante dans la pointe.
    3. Videz la solution restante dans la pointe du réservoir de réactif en appuyant sur le piston au deuxième arrêt (étape-2). Relâchez le piston à la position prête pour l’étape suivante de pipetting.
    4. Ajouter l’anticorps requis dans les volumes désignés à chaque tube microcentrifuge pré-étiqueté (tableau 1) Ne pas pré-rincer la pointe de pipet: l’ajouter directement au diluant et rincer la pointe plusieurs fois pour enlever l’anticorps. Placer les tubes sur la glace.
  12. Pour préparer le mélange d’échantillons CEI, effectuez les étapes énumérées ci-dessous pour les tubes PCR étiquetés cap 2 à 25 : C’est dans le même ordre qu’il apparaît dans le tableau 1.
    1. Ouvrez tous les tubes, ajoutez 1,6 aliquots ll de tampon d’échantillon fluorescent 5x à chaque tube à l’aide d’une technique de tuyauterie inversée, puis fermez chaque tube PCR à l’ajout du tampon 5x pour minimiser la perte d’échantillon.
    2. Ouvrez tous les tubes, ajoutez un tampon d’échantillon de 0,1x dans les volumes désignés dans le tableau 2 à chaque tube, puis fermez immédiatement après. Si les volumes sont identiques, utilisez une technique de tuyauterie inversée. Si ce n’est pas le cas, prérincer la pointe de la tuyauterie avant de distribuer un tampon d’échantillon de 0,1x.
    3. Ouvrez tous les tubes, ajoutez l’échantillon de protéines en volumes désignés dans le tableau 2 à chaque tube, puis fermez immédiatement après. Si les volumes sont identiques, utilisez la technique de tuyauterie inversée. Si ce n’est pas le cas, prérincer la pointe de la tuyauterie avant de distribuer un tampon d’échantillon de 0,1x.
    4. Centrifuger brièvement tous les tubes PCR dans une centrifugeuse de banc (13 000 x g pour 30 s), les tubes PCR de flick/vortex pour mélanger, puis répéter la centrifugation.
    5. Transférer tous les tubes PCR dans le thermocycler avec un couvercle chauffé. Échantillons de dénature à température et durée définies (c.-à-d. 95 oC pour 5 min; 70 oC pour 10 min).
      REMARQUE : La température et la durée de dénaturation doivent être optimisées pour les protéines cibles.
    6. Répétez l’étape 3.12.4.
    7. Remettre tous les tubes PCR sur le support à tubes et les placer sur la glace.
    8. Au cours de l’étape de dénaturation, préparez la solution de développement (1:1 luminol-S:peroxide solution), puis ajoutez 200 L de luminol-S et 200 l de peroxyde. Placer sur la glace.
    9. Pour charger une plaque préremplie CEI avec l’échantillon préparé ci-dessus, distribuez des réactifs et des échantillons dans la plaque d’analyse indiquée dans la disposition de l’analyse (figure 1). Évitez d’introduire des bulles d’air.
      REMARQUE : Si les volumes et la solution sont identiques, utilisez une technique de tuyauterie inversée. Si ce n’est pas le cas, rincez la pointe de la tuyauterie avant de la distribuer et n’expulsez pas le reste dans le puits de plaque en utilisant le deuxième arrêt de l’onglet sur la pipette. Un module de séparation de 12 à 230 kDa peut contenir un guide de chargement de plaques codé en couleur. Placez ce guide sous la plaque tout en ajoutant des réactifs et des échantillons au puits, ce qui aide visuellement lors du chargement de l’échantillon. Le guide de chargement des plaques peut également être téléchargé sur le site Web de l’entreprise.
      1. Dans la rangée E, ajouter 15 l de mélange luminol:peroxyde à chaque puits.
        REMARQUE : Idéalement, préparez ce réactif juste avant d’être utilisé et ajoutez à chaque puits. Si ce n’est pas pratique, ce mélange peut être préparé pas plus de 30 minutes avant le chargement de la plaque.
      2. Dans la rangée D, pour bien D1, ajouter 10 L de streptavidin-HRP.
      3. Dans la rangée D, aux puits D2-D25, ajoutez 10 l d’anticorps secondaires désignés.
      4. Dans la rangée B, à chaque puits, ajouter 10 l de diluant d’anticorps.
      5. Dans la rangée C, pour bien C1, ajouter 10 l de diluant d’anticorps.
      6. Dans la rangée C, aux puits C2-C25, ajouter 10 l d’anticorps primaires désignés.
      7. Dans la rangée A, pour bien A1, ajouter 5 L d’échelle biotinylated de la #1 de tube DE PCR.
      8. Dans la rangée A, pour les puits A2-A25, ajouter 3 l l de l’échantillon, tubes PCR #2 #25 dans les puits correspondants #2-#25.
      9. Ajouter 500 lde de tampon de lavage à chaque puits de tampon de lavage désigné.
      10. Centrifuger la plaque pendant 5 min à 1 000 x g à RT.

Figure 1
Figure 1 : Mise en page d’astodonte. L’optimisation des échantillons d’anticorps primaires et des protéines cibles peut être effectuée en un seul analyse. Les capillaires 2-7, 8-13, 14-19 et 20-24 représentent diverses concentrations protéiques et une gamme d’anticorps primaires. Le capillaire 25 représente un contrôle positif. L’anticorps anti-ERK a été utilisé; cependant, tout contrôle positif approprié peut être inclus. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

4. Exécution de la CEI sur la plaque 1

  1. Tout d’abord, allumez l’analyseur CEI(Tableau des matériaux),puis allumez l’ordinateur. Ouvrez le logiciel (Table des Matériaux)
  2. Connectez l’analyseur au système en ligne (Tableau des matériaux). Il s’agit d’une étape nécessaire pour collecter les données d’exécution à des fins de prise de vue de difficulté et de récupération de données.
  3. Cliquez sur Instrument à partir du menu en haut à gauche, puis cliquez sur Connect. Sélectionnez le numéro de série d’instruments qui apparaît comme un menu pop-up. Cliquez sur Connect.
  4. Sélectionnez l’onglet «Assay» et sélectionnez Nouveau résultat ou sélectionnez un modèle enregistré.
  5. Paramètres d’évaluation d’entrée (tableau 1) ou modification du modèle actuellement. Enregistrez le nom et l’emplacement du fichier.
  6. Assurez-vous que l’indicateur de couleur bleu clignotant dans l’analyseur reste bleu solide.
  7. Touchez le bouton en métal argenté sur le dessus de la porte orange pour s’ouvrir.
  8. Retirez soigneusement la cartouche capillaire de son emballage. Insérez la cartouche capillaire telle que décrite par le protocole du fabricant. Si correctement installé, la lumière intérieure se transforme en "bleu".
  9. Retirez le joint protecteur de la plaque d’astodonte. Observez visuellement les puits préremplis pour les bulles d’air. S’il est observé, faites-les sauter avec une petite pointe de pipet (la pointe de pipet P10 à long arbre fonctionne bien).
  10. Chargez le porte-plaque en plaçant la plaque d’astodonte et fermez la porte. Dans l’ordinateur, cliquez sur le bouton Démarrer.
    1. Placez le plateau de glace contenant des réactifs et des échantillons sensibles à la température dans l’obscurité à 4 oC jusqu’à ce qu’ils soient prêts à préparer une deuxième plaque préremplie.
    2. Laisser les réactifs/fournitures à température ambiante pour la deuxième plaque.

5. Exécution de la CEI sur la plaque 2

REMARQUE : Cette plaque est fixée pour analyser les niveaux de TDP-43 phosphorylés.

  1. Retirez le plateau de glace entreposé à 4 oC et placez-le sur le banc, 1 h avant la durée d’achèvement estimée de la première plaque. Récupérer une deuxième plaque et une cartouche.
  2. Préparer les dilutions d’anticorps nécessaires pour la deuxième manche et les conserver sur de la glace. Préparer la solution fraîche 1:1 luminol-S:peroxide (étape 3.12.8 ci-dessus).
  3. Remixer et re-centrifuger brièvement le mélange d’échantillons et les réactifs nécessaires au chargement de la plaque préremplie. Chargez la deuxième plaque selon la figure 1. Chargez a-p(S409-410-2) solution d’anticorps TDP-43 dans les puits de rangée C.
  4. Lorsque la première exécution est terminée, jetez la première plaque et la première cartouche. Retirez la cartouche et placez-la dans le contenant d’un pointu pour être éliminée. Gardez les autocollants de la plaque et de la cartouche à des fins de référence.
  5. Fermez le fichier logiciel et sélectionnez le même modèle. Le logiciel se souviendra des paramètres de l’exécution précédente. Apporter des modifications à l’annotation au besoin (c.-à-d. changer l’anticorps primaire).
  6. Répétez les étapes 4.8-4.10. Rangez tous les réactifs et les fournitures du module de séparation du kit maître 12 à 230 kDa
  7. Jeter les restes sur le mélange d’échantillons CEI, les dilutions d’anticorps, le tampon d’échantillon 0,1x et les mélanges de luminol-S:peroxyde conformément à la réglementation universitaire.

6. Analyse des données

  1. Une fois la course terminée, assurez-vous que les vérifications de qualité suivantes sont effectuées.
    1. Dans le logiciel, sélectionnez l’icône Afficher les normes et l’onglet Graphique View. Vérifiez les 25 capillaires pour les alignements de pointe des tailles de marqueurs fluorescents internes. Corriger les désalignements en sélectionnant Force Standard ou en cliquant à droite sur le pic incorrect, puis en sélectionnant Not a Standard. Effectuez cette vérification pour chaque nouveau capillaire.
    2. Cliquez sur Les échantillons et l’icône Vue unique. Sélectionnez les #1 capillaires (échelle biotinylated) dans l’onglet expérience. Examiner les alignements de pointe sur les marqueurs de poids moléculaires. Cliquez sur le pic dans Graph View et sélectionnez Supprimer Pic, si une sélection incorrecte du pic est effectuée par le logiciel.
      REMARQUE : À titre d’exemple, l’échelle biotinylated de 12 à 230 KDa affichera des pics de dimensionnement à 12 kDa, 40 kDa, 66 kDa, 116 kDa, 180 kDa et 230 kDa. Le dimensionnement des pics d’échantillon sera incorrect si cette étape n’est pas effectuée et générera des résultats inexacts.
    3. Voir le film électrophoretique et noter si une migration anormale s’est produite pendant la course.
    4. Dériver des données (p. ex., tableau des pics, y compris le poids moléculaire, la zone de pointe, la hauteur de pointe et le signal au bruit [S/N]) au besoin pour d’autres calculs. Il existe des outils d’annotation graphique situés dans le coin supérieur droit de la fenêtre Graphique pour fournir plus d’informations sur le graphique.

Representative Results

Optimisation de la concentration cytosolique de protéine de plaquette et de la titration primaire d’anticorps
Il est important d’établir une gamme dynamique linéaire de protéines cytosoliques plaquettaires dans l’analyse, puisque les changements de signal sont directement proportionnels aux changements de protéines dans le cytosol plaquettaire. L’utilisation du mélange de lysate plaquettaire entier dans l’analyse peut réduire l’intensité du signal des protéines cibles (TDP-43 et P(S409-412) TDP-43) et contribuer à un signal de fond élevé. Par conséquent, dans cet analyse, le supernatant clair a été utilisé (fraction cytosolique) après la rupture des plaquettes (Figure 2).

Figure 2
Figure 2 : La clarté du signal dépend de la qualité de l’échantillon. (A) Le lysate de plaquette entière d’homogénéise interfère avec la liaison d’anticorps anti-TDP-43 ; par conséquent, un électrophétoygramme bruyant a été observé. (B) La fraction cytosolique de plaquette a été obtenue en soumettant le lysat entier à la centrifugation (16.000 x g pendant 30 min). La plupart des protéines membranaires ont été enlevées; par conséquent, l’anticorps anti-TDP-43 liant à la protéine TDP-43 a été amélioré (trace de ligne bleue). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Une gamme dynamique linéaire pour la concentration de protéine de cytosol de plaquette a été établie à 0.2-0.8 mg/mL. Un modèle d’évaluation a été adopté afin que la concentration en protéines et la titration des anticorps primaires puissent être effectuées en un seul point de suite (figure 3).

Figure 3
Figure 3 : Gamme dynamique linéaire pour la concentration de protéines de cytosol plaquettaire. (A) Les concentrations de protéines et les titrations d’anticorps ont été optimisées dans une assiette au cours de la même course. (B) La gamme de travail linéaire (0,2 à 0,8 mg/mL) pour les protéines a été établie. Une charge protéique de 0,5 mg/mL a été étiquetée par un anticorps a-ERK comme le contrôle positif (capillaire 25). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Il convient de noter que la teneur en glycérol dans le tube de préparation de l’échantillon devrait être inférieure à 20% (finale), sinon la concentration élevée de glycérol aura une incidence négative sur la liaison des anticorps primaires.

Détermination du temps d’exposition optimal
Dans l’ancienne version du logiciel, le temps d’exposition optimal devait être déterminé en traçant la zone de pointe contre la concentration en protéines (mg/mL). La nouvelle version fournit un nouvel outil nommé le profil de détection de la gamme dynamique élevée (HDR) (Figure 4). L’utilisation du panneau d’image offrait la possibilité de visualiser tous les temps d’exposition (c.-à-d. 5 s, 15 s, 30 s, 60 s, 120 s, 240 s, 480 s) ensemble. Le logiciel a analysé tous les temps d’exposition et a automatiquement identifié le meilleur temps d’exposition (HDR). Le profil de détection hDR a fourni une plage dynamique significativement plus large en raison de la plus grande sensibilité de CEI, ce qui signifie une meilleure détection et quantitation sur une plus grande plage de concentration d’échantillon. Cependant, les utilisateurs ont toujours la possibilité de choisir n’importe quel temps d’exposition qui satisfait à l’objectif expérimental. En utilisant cette fonctionnalité, un temps d’exposition optimal a été trouvé pour la protéine TDP-43. Le pic représente le temps d’exposition optimal (Figure 4A). Un temps d’exposition unique (4 s) a été défini pour cet anticorps après avoir examiné les neuf temps d’exposition allant de 1 à 512 s (figure 4B).

Figure 4
Figure 4 : Profil de détection de la plage dynamique élevée (HDR) pour une protéine cible. (A) le pic de protéines TDP-43 représente le temps d’exposition optimal pour la protéine cible. a-TDP-43 Ab titration était 1:300, et la concentration de protéine de cytosol plaquettaire était 0.5 mg/mL. La ligne bleue définie par le logiciel indique le temps d’exposition optimal. (B) Ce chiffre représente un temps d’exposition unique défini par l’utilisateur (4 s) après avoir examiné les neuf temps d’exposition allant de 1 à 512 s. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

TDP-43 niveaux dans le cytosol de plaquette humain des patients de SAL
Un développement de biomarqueur de base de sang a été exécuté. À l’aide d’un anticorps optimisé, des fractions cytosoliques de lysate plaquettaire obtenues auprès de patients atteints de SLA ont été analysées à l’aide de deux ensembles d’anticorps (c.-à-d. anticorps anti-TDP-43[Pan], un anticorps qui reconnaît les dérivés phosphorylés de la protéine TDP-43; ici, a-P [S409/410-2] TDP-43 a été utilisé). Dans cette démonstration, le TDP-43 spécifique à la maladie et son dérivé phosphorylé sont présentés (figure 5).

Figure 5
Figure 5 : Représentation de la valeur prédictive de la phosphorylation (VPP) du TDP-43. La quantité absolue de TDP-43 phosphorylé et de pan TDP-43 à elle seule n’a pas montré beaucoup de différence entre la SLA et les groupes témoins. Cependant, le VPP a indiqué une légère augmentation de la cohorte de la SLA, bien qu’il n’y ait eu aucune différence statistique entre les deux groupes en raison du nombre insuffisant de sujets (SLA no 25, contrôle - 27). La faible valeur d’un Cohen entre les moyens de la SLA et le groupe témoin a montré une faible taille d’effet entre les deux groupes en raison de la petite taille de l’échantillon (contrôle 25, SLA et 27). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Le TDP-43 total a été quantifié à l’aide de la courbe d’étalonnage (figure 6)

Figure 6
Figure 6 : Courbe d’étalonnage standard. Des concentrations de protéines TDP-43 recombinantes achetées commercialement ont été utilisées pour construire une courbe standard. Chaque donnée représente la moyenne des tripliciats. Les intensités de bande de protéine étaient dépendantes de concentration (Inset). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

La quantification de la protéine TDP-43 phosphorylated n’était pas possible en raison de l’indisponibilité commerciale de cette protéine. Au lieu de cela, une valeur de phosphorylation prévue (VPP) a été établie qui définit le pourcentage des espèces phosphorylées de TDP-43. Le VPP a été déterminé à partir de deux tests CEI séquentiels pour le même échantillon à l’aide de l’équation suivante.

Equation 1

La variabilité des tests intra-run et inter-run a été testée dans des fractions cytosoliques cytosoliques de plaquettes de SAL humaines mises en commun (figure 7)

Figure 7
Figure 7 : Variations d’assay. (A) Deux capillaires chargés du même échantillon ont été analysés par l’IEC, et la variation des résultats intra-exécutés a été calculée comme CV % - 14,9. (B) Le même échantillon a été analysé sur trois jours d’analyse différents et en trois séries d’analyse différentes. La variation des points de travail inter-run a été calculée comme CV % à 18,7. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Bien que les valeurs de variation du coefficient intra-run (variation capillaire à capillaire) aient diminué dans la fourchette acceptable (CV % - 14,9), la valeur d’analyse intermanche était relativement élevée (CV % - 18,7). Il est interprété que cette variation peut être due à l’utilisation de cartouches capillaires et des plaques d’échantillon de différents lots. Il est recommandé d’effectuer des études de reproductibilité dans des composants de l’IC qui ont le même numéro de lot.

Tableau 1 : Modèle de chargement de plaque d’assay CEI. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Tableau 2 : Modèle interactif de préparation du mélange d’échantillons. Après avoir pénétré dans la concentration de protéines de stock à partir d’échantillons inconnus, les cellules interactives calculeront automatiquement la quantité de volume à utiliser pour la préparation du mélange d’échantillons. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Discussion

L’immuno-analyse électrophorétique capillaire est maintenant la méthode de choix pour l’analyse d’échantillons à haut débit et le dépistage des médicaments25. Les petits volumes d’échantillons, les composants d’analyse bien optimisés, la plate-forme d’analyse et l’instrumentation conviviales, les dépenses de réactif et le faible pourcentage de CV sont les principaux avantages26,27. Bien qu’il existe plusieurs méthodes pour séparer les protéines dans différentes modalités d’analyse, le CEI à base d’anticorps décrit ici peut être adapté par de petits laboratoires qui sont engagés dans le développement de biomarqueurs à base de sang. La technologie d’analyse CEI utilisée ici fournit des mesures fiables, reproductibles et sensibles pour TDP-4328 et son dérivé phosphorylé5.

Le système CEI offre également un choix multiplexant d’analyser TDP-43 et ses dérivés phosphorylés simultanément et de fournir la quantification directe de la protéine cible, si la protéine cible purifiée ou recombinante est disponible. La protéine TDP-43 recombinante pleine longueur est disponible dans le commerce; cependant, le dérivé tDP-43 phosphorylé recombinant ne l’est pas. Étant donné que le TDP-43 phosphorylé n’est pas disponible dans le commerce, une valeur prédictive de phosphorylation (VPP) a été mise en œuvre pour évaluer le profil TDP-43 chez les patients atteints de SLA. Les quantités de Pan TDP-43 et de TDP-43 phosphoryléont ont été étiquetées de façon permanente avec un fluorophore; par conséquent, le profil TDP-43 reste le même avec ou sans unité quantitative (c.-à-d. ng/mL, pg/mL, etc.). Bien que la détermination de la quantité absolue de TDP-43 et de ses dérivés phosphorylés (c.-à-d. P [S409-410-12] TDP-43) fournit une mesure plus quantitative, le calcul du VPP élimine la nécessité du TDP-43 recombinant phosphorylé pour la normalisation, puisqu’il n’est pas disponible sur le marché.

CEI fournit plusieurs points de contrôle dans la plate-forme d’analyse pour identifier avec précision le problème dans le cas où un test échoue. Cela élimine les obstacles et fournit une meilleure conception expérimentale. La procédure d’analyse est entièrement automatisée, sauf pour remplir la plaque d’échantillon. Il s’agit d’une caractéristique importante par rapport à l’analyse standard de l’Ouest de ballonnement. Cette fonctionnalité offre une cohérence de run-to-run. Bien que chaque laboratoire possède des procédures d’exploitation standard uniques, il est important d’adhérer à des pratiques qui minimisent les erreurs humaines. Par exemple, il est essentiel de préparer le mélange luminol-S/peroxyde juste avant le chargement de la plaque, car l’ajout de peroxyde dans le luminol déclenche la réaction enzymatique et consomme le substrat luminol. Le chargement d’échantillons et d’anticorps primaires/secondaires dans des puits de plaque sans bulles d’air est également une étape cruciale.

En outre, puisque les puits de plaque sont petits en volume et il n’y a pas d’espace entre les puits, les utilisateurs doivent faire preuve de prudence lors de la pipetage, qui est l’étape la plus importante puisque tout le reste est automatisé. L’ordre de chargement des échantillons, des anticorps et d’autres réactifs est important pour la cohérence de l’analyse (figure 1). Le processus de préparation des plaques prend environ 40 à 45 min. Par conséquent, il est recommandé de charger d’abord la plaque avec les composants d’assay requis et de préparer le mélange luminol-S/peroxyde juste avant le tuyauterie. De cette façon, il y a une séquence cohérente d’ajout de réactif, et la force constante de signal de luminescence sera atteinte. Il n’est pas recommandé d’utiliser un réactif périmé luminol-S/peroxyde, car il affecte principalement la force du peroxyde. Les progrès récents dans l’introduction du système de tampon scindée et l’inclusion de la gamme de compatibilité chimique et détergent ont amélioré la qualité de l’analyse et produit des résultats plus reproductibles et prévisibles. Maintenant, un nouveau combo-analyseur du même fabricant possède une caractéristique pour analyser les échantillons étiquetés avec des anticorps conjugués de chemiluminescence et de fluorescence dans la même course. Cette nouvelle fonctionnalité élimine la nécessité d’exécuter consécutivement deux plaques individuelles et élimine les variations de run-to-run.

Les plaques d’avertissement doivent être stockées à température ambiante. S’il est choisi pour conserver les plaques d’avertissement dans un réfrigérateur de 4 oC, les assiettes doivent être retirées la veille de l’avertissement et ramenées à la température ambiante. Les puits d’échantillons mal chargés doivent être largement lavés (4 à 5 fois) avec un tampon fourni dans le kit avant d’ajouter l’échantillon correct. Chaque anticorps primaire et les échantillons biologiques sont uniques; par conséquent, l’optimisation d’anticorps/protéines devrait être exécutée avant d’analyser les échantillons pour les protéines cibles dans les fluides biologiques.

Ici, le temps d’incubation des anticorps primaires a été fixé à 30 min par défaut. Si le signal est faible, les utilisateurs devraient envisager d’augmenter le temps d’incubation des anticorps primaires jusqu’à atteindre la force du signal souhaité sans épuisement du signal de fluorescence. Pour les plaquettes humaines, des échantillons mis en commun de patients ont été préparés et utilisés pour un analyse d’optimisation. La mise en commun de l’échantillon représente mieux la variation entre les biomolécules cibles. Il est recommandé d’utiliser des supernatants clairs plutôt que du lysate total ou de l’homogénéité totale pour l’IC.

La forte concentration de protéines dans le mélange de lysate plaquettaire entier peut diminuer le rapport signal-bruit (figure 2). Il faut éviter les cycles répétés de gel et de dégel des échantillons, car cela affecte négativement la liaison des anticorps primaires. Les ingrédients du tampon de lysate sont importants, car certains réactifs ne sont pas compatibles avec CEI29. Il est conseillé de recouper la liste des réactifs compatibles fournies sur le site Web du fabricant avant la préparation de l’échantillon. Il s’agit d’une limitation du système qui ne tolère pas les conditions de rigueur élevées pour la préparation de l’échantillon. Il est recommandé d’optimiser les paramètres d’essai (c.-à-d. dilution primaire des anticorps, concentration en protéines, temps d’incubation primaire des anticorps, etc.) à l’aide d’échantillons mis en commun pour analyser ultérieurement les échantillons individuels.

Disclosures

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt financier concurrent, à l’exception de ProteinSimple, Inc. qui a couvert le coût de publication de ce manuscrit.

Acknowledgments

Cette recherche a été parrainée par une subvention intra-muros accordée aux AA. Ce travail a été soutenu par une subvention de la CTSA du NCATS accordée au Centre médical pour les frontières de l’Université du Kansas : Le Heartland Institute for Clinical and Translational Research (#UL1TR606381). Le contenu est uniquement de la responsabilité des auteurs et ne représente pas nécessairement les vues officielles des NIH ou du NCATS. Nous sommes reconnaissants pour l’Université du Kansas Medical Center ALS clinique personnelle pour obtenir l’approbation de la CISR pour la collecte d’échantillons de sang de volontaires en bonne santé et les patients atteints de salane. Les auteurs remercient Emre Agbas pour la relecture du manuscrit.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
12-230 kDa Separation kit ProteinSimple SM-W004 Contains pre-filled assay plate and 25-channel capillary cartridge
3000G Thermocycler Techne FTC3G/02 We used this thermocylcer for heating the sample mix
Anti-Mouse detection kit ProteinSimple 042-205 Includes HRP-conjugated secondary antibody, buffer, luminol reagent, molecular weight marker
Anti-P(S409-410) TDP-43 antibody ProteinTech 22309-1-AP Primary antibody that recognizes phosphorylated TDP-43
Anti-P(S409-412) TDP-43 antibody CosmoBio-USA TIP-PTD-P02 Primary antibody that recognizes phosphorylated TDP-43
Anti-Rabbit detection kit ProteinSimple DM-001 Includes HRP-conjugated secondary antibody, buffer, luminol reagent, molecular weight marker
Anti-TDP-43 (pan) antibody ProteinTech 10782-2-AP Primary antibody that recognizes whole TDP-43 protein
Compass for SimpleWestern (SW) ProteinSimple Ver.4.0.0. Compass for SW is the control and data analysis application for SimpleWestern instruments
Sonic Dismembrator; Model100 Fisher Scientific Sonicator. Used to rupture the cell membrane. This model is discontinued (Model XL2000-350)
Table top centrifuge Eppendorf 22625004 Model# 5810 with swinging plate bucket
Wes analyzer ProteinSimple 55892-WS-2203 Performs the capillary gel electrophoresis

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