2',7'-ジクロロジドロフルオレセイン・ジアセテート染色による接着性細胞中の全活性酸素種の検出

JoVE Journal
Biochemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Biochemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

ここでは、2',7'-ジクロロジヒドロフルオレセインジアセインジアセテート(DCFH-DA)を用いて全細胞活性酸素種(ROS)を検出するプロトコルを提示する。この方法は、蛍光顕微鏡で接着細胞における細胞ROS局在を可視化し、蛍光プレートリーダーでROS強度を定量化することができる。このプロトコルは、シンプルで効率的で費用対効果が高いプロトコルです。

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Kim, H., Xue, X. Detection of Total Reactive Oxygen Species in Adherent Cells by 2',7'-Dichlorodihydrofluorescein Diacetate Staining. J. Vis. Exp. (160), e60682, doi:10.3791/60682 (2020).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

酸化ストレスは、生理学的および病理学的条件下で重要な事象である。本研究では、2',7'ジクロロジヒドロフルオレセインジアセテート(DCFH-DA)を用いて全活性酸素種(ROS)を測定し、大腸癌細胞系で染色を行い、酸化ストレスを定量する方法を例に示す。このプロトコルはDCFH-DA溶液の調製、DCFH-DA溶液による細胞のインキュベーション、および正規化された強度の測定を含む詳細なステップを記述する。DCFH-DA染色は、細胞内のROSを検出するためのシンプルで費用対効果の高い方法です。これは、化学処理または遺伝子改変後のROS生成を測定するために使用することができる。そのため、環境ストレス時の細胞酸化ストレスを決定するのに有用であり、機械学的研究の手がかりを提供する。

Introduction

生理的意味を持つ細胞代謝によって産生される3つの主要な活性酸素種(ROS)は、スーパーオキシドアニオン、ヒドロキシルラジカル、及び過酸化水素1である。低濃度では、それらは生理学的細胞プロセスに関与するが、高濃度では細胞シグナル伝達経路1に悪影響を及ぼす。私たちの体は、過剰なROSに対して有効である抗酸化システムを開発しました。しかし、酸化ストレスは、炎症、癌、および神経変性疾患,,2、3、4を含む多くの病的状態に寄与する、ROSが私たちの体の解毒能力を圧倒2するときに発生する可能性があります。この方法の目的は、2',7'-ジクロロジヒドロフルオレセインジアセインジアセテート(DCFH-DA)染色を使用して、接着細胞における総細胞ROSを決定することです。その根拠は、DCFH-DAから2'-7'ジクロロフルオレセイン(DCF)への酸化が、ヒドロキシルラジカル(•OH)および二酸化窒素(•NO2)を含む総ROS検出のために広く使用されてきたということです。機械学的に、DCFH-DAは、細胞エステラーゼがアセチル基を切断する細胞によって取り込まれるため、DCFHが得られます。ROSによるDCFHの酸化は、分子をDCFに変換し、励起波長485nmで緑色蛍光を放出し、発光波長は530nmです。フローサイトメトリーと他の代替方法5で蛍光の検出と比較すると、この方法の利点は、蛍光顕微鏡とプレートリーダーを用いて、それが明確に目に見える蛍光画像を生成し、かつ、効率的かつ費用対効果が高く、実行が容易である。この方法は、様々,な条件6、7、87を研究6するための細胞ROSを検出するために広く使用されている。8このプロトコルは、接着細胞の総ROSを検出するために使用されます。この方法を使用して懸濁液細胞のROSを検出するには、いくつかの変更が必要な場合があります。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. 細胞の播種

  1. 種子2 x 105 HCT116大腸癌細胞は24ウェルプレートでウェルあたり、37°Cで一晩ダルベックの修飾イーグル培地(DMEM)の細胞を維持します。
  2. 培地を含む100μMの硫酸第一鉄(FS)または10μMドキソルビシン(DOX)を含む培地とインキュベートを24時間使用するか、または含まない培地を交換してください。

2. DCFH-DA溶液の調製

  1. DCFH-DAの4.85mgをジメチルスルホキシド(DMSO)の1 mLに溶解し、10mMストック溶液を作ります。
  2. あらかじめ温めたDMEMでストック溶液を10 μMの作業ソリューションに希釈してから、ウェルに追加します。
  3. 10 sのための働く解決を渦。

3. DCFH-DA染色

  1. 培地を含む薬物を取り除き、DMEMで一度洗います。
  2. DCFH-DAの各井戸に500 μLのDCFH-DA作業溶液を加え、37°Cで30分間インキュベートします。
  3. DCFH-DA の動作ソリューションを削除します。DMEMで1回、1倍のリン酸緩衝生理食塩(PBS)で2倍洗います。
  4. 各ウェルに500 μLの1x PBSを加えます。

4. 画像収集と強度測定

  1. 蛍光顕微鏡で緑色蛍光タンパク質(GFP)チャネルを使用して、各ウェルの代表的な蛍光画像を撮影します。
  2. 画像を撮った後、PBSを取り除き、各ウェルに200μLの放射性免疫沈降アッセイ(RIPA)バッファーを加えます。
  3. 氷上で5分間インキュベートし、1.5mLチューブに細胞ライセートを集める。
  4. 遠心分離機 21,130 x gで 4 °C で 10 分間
  5. 上清の100μLを黒い96ウェルプレートに移し、485nmの励起波長と530nmの発光波長でマイクロプレートリーダーの蛍光を使用して蛍光強度を測定します。
  6. 1xタンパク質アッセイ溶液の100μLを含む透明な96ウェルプレートに上清の1μLを移し、ブラッドフォードアッセイ9を用いてタンパク質濃度を測定する。
  7. タンパク質濃度で蛍光強度を正規化します。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

HCT116大腸癌細胞を100 μM FSまたは10 μM DOXで処理し、酸化ストレス7を誘導した。図1に示すように、期待通りFSとDOXの両方により緑色蛍光が劇的に増加した。相対的な強度変化を定量化するために、細胞を画像を撮った後にリセドし、タンパク質濃度で正規化した。定量された蛍光強度は、HCT116細胞におけるFSまたはDOXによって有意に増加した。

Figure 1
図1:鉄治療は大腸癌細胞のROSを増加させる。蛍光顕微鏡で撮影した代表的な蛍光像と、HCTにおける2',7'ジクロロジヒドロフルオレセインジアセテート(DCFH-DA)染色用蛍光マイクロプレートリーダーによる強度定量 未処理のコントロール(Ctrl)、(A)100μMの硫酸第一A鉄(FS)または(B)10μMドキソルビBシン(DOX)24時間分の116個の細胞。スケールバー=400μm。 * = p < 0.05;= p < 0.001。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ここで説明する実験プロトコルは、細胞総ROSを測定するために容易に再現可能である。重要なステップには、DCFH-DA溶液を新鮮にし、光暴露を回避し、細胞状態障害を最小限に抑え、画像を撮る直前に広範なPBS洗浄を行う必要があります。DCFH-DA作業ソリューションの調製のために、ストック溶液は24ウェルプレートに追加する前に、事前に温められたDMEMに追加する必要があります。その理由は、高いバックグラウンド蛍光や光暴露を生成する古いソリューションが光の漂白につながることである。ほとんどの研究では、DCFH-DAを希釈し、反応バッファー10として使用するために1x PBSまたは1xハンクスのバランス塩溶液(HBSS)を使用します。しかし、HCT116およびRKOを用いた場合、PBSおよび胎児ウシ血清遊離DMEMを用いたDCFH-DAストック溶液の希釈は、未処理の細胞においても高いバックグラウンドシグナルを生じさせた。これは、細胞の状態障害が原因である可能性があります。さらに、DCFH-DA作業ソリューションは、井戸壁に沿ってゆっくりと追加する必要があります。細胞状態の乱れは、近傍の邪魔にならない領域に比べて高い蛍光シグナルを生成する。また、DMEMを含むフェノールの自動蛍光を低減するために画像を撮る前に、PBSで少なくとも2回洗浄することが重要です。フェノールフリーDMEMは、より良い選択かもしれないが、我々は、PBS洗浄が自動蛍光を最小限に抑えるのに十分だったことをここに示す。図1に示すように、未処理のコントロールグループでも、2つの異なる実験バッチが異なる代表的な画像を生じる可能性があります。実験的な変動を制御するために、細胞に直接ストック溶液を追加するのではなく、希釈されたDCFH-DA作業溶液(プロトコルのように)で細胞を処理することをお勧めします。また、画像は、同様の細胞密度と同じ露光時間を持つフィールドで撮影する必要があります。最後に、すべての比較群に対して同時に実験を行うことが重要です。

ROSの重要性により、特異的ROS検出は、総ROS検出に加えて、また開発された。例えば、スーパーオキシドの細胞産生はジヒドロエチジウムによって検出することができ、これは酸化の際に2位でヒドロキシル化をもたらし、2-ヒドロキセチジウムを形成する。2-ヒドロキイェチジウムが細胞DNAにインターカレートする場合、それぞれ535nmおよび635nmの励起波長および発光波長を有する赤色蛍光が観察できる。ミトコンドリアスーパーオキシドは、生細胞に入り込み、特にミトコンドリアを標的とするジヒドロエチジウムのカチオン誘導体であるミトソックス試薬で視覚化することができます。赤い蛍光を生成するミトソックスの酸化生成物は、ミトコンドリアDNAに補間することができる。H2O2検出11用に化学選択的蛍光ナフチリミド2プローブが開発された。また、蛍光分光光度測定を用いたヒドロキシルラジカルの検出も12.12報告された。

ここでは、コスト効率の良いDCFH-DA染色を使用して細胞総ROSを検出するためのシンプルで最適化されたプロトコルについて説明しました。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

著者らは開示するものは何もない。

Acknowledgments

この研究の一部は、米国癌学会(RSG-18-050-01-NEC)の研究奨学生助成金である国立衛生研究所(K01DK114390)によって支えられ、研究パイロットプロジェクト助成金を受け取りました。 ニューメキシコ大学環境衛生署名プログラムとスーパーファンド(P42 ES025589)、共有資源パイロットプロジェクト賞、UNM総合がんセンターの研究プログラム支援パイロットプロジェクト賞(P30CA118100)ニューメキシコ大学医学部の健康研究基金の新しい研究者賞を受賞。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2',7'-Dichlorofluorescein diacetate Cayman Chemical, Ann Arbor, MI 20656
Doxorubicin hydrochloride TCI America, Portland, OR D4193-25MG
Dulbecco's Modified Eagle Medium Corning, Corning, NY 45000-304
Ferrous Sulfate Heptahydrate VWR, Radnor, PA 97061-542
Invitrogen EVOS FL Auto Imaging System Thermo Fisher Scientific Waltham, MA AMAFD1000 or any other fluorescence microscope
Protein assay Bradford solution Bio-Rad, Hercules, CA 5000001
SpectraMax M2 Microplate Reader Molecular Devices, Radnor, PA 89429-532 or any other fluorescence microplate reader

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Birben, E., et al. Oxidative stress and antioxidant defense. World Allergy Organization Journal. 5, (1), 9-19 (2012).
  2. Kim, G. H., et al. The Role of Oxidative Stress in Neurodegenerative Diseases. Experimental Neurobiology. 24, (4), 325-340 (2015).
  3. Sullivan, L. B., Chandel, N. S. Mitochondrial reactive oxygen species and cancer. Cancer & Metabolism. 2, 17 (2014).
  4. Formentini, L., et al. Mitochondrial ROS Production Protects the Intestine from Inflammation through Functional M2 Macrophage Polarization. Cell Reports. 19, (6), 1202-1213 (2017).
  5. Rakotoarisoa, M., et al. Curcumin- and Fish Oil-Loaded Spongosome and Cubosome Nanoparticles with Neuroprotective Potential against H2O2-Induced Oxidative Stress in Differentiated Human SH-SY5Y Cells. ACS Omega. 4, (2), 3061-3073 (2019).
  6. Mateen, S., et al. Increased Reactive Oxygen Species Formation and Oxidative Stress in Rheumatoid Arthritis. PLoS One. 11, (4), (2016).
  7. Kim, H., et al. The interaction of Hemin and Sestrin2 modulates oxidative stress and colon tumor growth. Toxicology and Applied Pharmacology. 374, 77-85 (2019).
  8. Wang, S. H., et al. Sotetsuflavone inhibits proliferation and induces apoptosis of A549 cells through ROS-mediated mitochondrial-dependent pathway. BMC Complementary and Alternative Medicine. 18, 235 (2018).
  9. Kruger, N. J. The Bradford Method For Protein Quantitation. The Protein Protocols Handbook. Walker, J. M. Humana Press. Totowa, NJ. 17-24 (2009).
  10. Tetz, L. M., et al. Troubleshooting the dichlorofluorescein assay to avoid artifacts in measurement of toxicant-stimulated cellular production of reactive oxidant species. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 67, (2), 56-60 (2013).
  11. Rong, L., et al. Hydrogen peroxide detection with high specificity in living cells and inflamed tissues. Regenerative Biomaterials. 3, (4), 217-222 (2016).
  12. Liu, L. Z., et al. Quantitative detection of hydroxyl radical generated in quartz powder/phosphate buffer solution system by fluorescence spectrophotometry. Guang Pu Xue Yu Guang Pu Fen Xi. 34, (7), 1886-1889 (2014).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please sign in or create an account.

    Usage Statistics