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मेसेनचिमल स्टेम सेल में लाइन-1 मिथाइलेशन विश्लेषण ऑस्टियोसारकोमा-व्युत्पन्न एक्स्ट्रासेलुलर वेसिकल्स के साथ इलाज किया गया

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Genetics

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Summary

यहां वर्णित एक मिथाइलेशन-विशिष्ट जांच प्रवर्धन विधि का उपयोग किया गया है ताकि ऑस्टियोसारकोमा-व्युत्पन्न एक्स्सेलुलर वेसिकल्स के साथ इलाज किए जाने वाले मेसेंचिमल स्टेम कोशिकाओं में लाइन-1 तत्वों के मिथाइलेशन स्तर का विश्लेषण किया जा सके। अल्ट्रासेंट्रोइफेशन, भ्रूण गोजातीय सीरम से बाह्य वेसिकल्स को अलग करने के लिए एक लोकप्रिय प्रक्रिया भी प्रदर्शित की जाती है।

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Sinha, S., Mannerström, B., Seppänen-Kaijansinkko, R., Kaur, S. LINE-1 Methylation Analysis in Mesenchymal Stem Cells Treated with Osteosarcoma-Derived Extracellular Vesicles. J. Vis. Exp. (156), e60705, doi:10.3791/60705 (2020).

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Abstract

मिथाइलेशन-विशिष्ट जांच प्रवर्धन (एमएसपीए) एक सरल और मजबूत तकनीक है जिसका उपयोग डीएनए नमूनों के मिथाइलेशन स्तर में सापेक्ष अंतर का पता लगाने के लिए किया जा सकता है। यह साधन संपन्न है, डीएनए की छोटी मात्रा की आवश्यकता है, और हाथ पर काम के 4-5 घंटे के आसपास लेता है । प्रस्तुत तकनीक में, डीएनए नमूनों को पहले विकृत किया जाता है, फिर जांच के लिए संक्षेप किया जाता है जो नियंत्रण के रूप में या तो मेथाइलेटेड या संदर्भ स्थलों पर डीएनए को लक्षित करते हैं। संक्षेप में डीएनए समानांतर प्रतिक्रियाओं में अलग हो जाता है, एक केवल लिगेशन के दौर से गुजर रहा है और दूसरा लिगेशन के दौर से गुजर रहा है जिसके बाद अमेथिलेटेड जीसीजीसी दृश्यों में एचएआई-मध्यस्थता पाचन है। परिणामी डीएनए टुकड़ों को पीसीआर द्वारा परिलक्षित किया जाता है और केशिका इलेक्ट्रोफोरेसिस द्वारा अलग किया जाता है। मेथिलेटेड जीसीजीसी साइटें एचएचएआई द्वारा पचा नहीं पाती हैं और पीक सिग्नल का उत्पादन करती हैं, जबकि अनमेथिलेटेड जीसीजीसी साइटें पचा जाती हैं और कोई पीक सिग्नल उत्पन्न नहीं होते हैं। प्रत्येक नमूने के पचाने और पचाने वाले संस्करणों के नियंत्रण-सामान्यीकृत चोटियों की तुलना डीएनए नमूने का मिथाइलेशन खुराक अनुपात प्रदान करता है। यहां, एमएसपीए का उपयोग मेसेंचिमल स्टेम सेल में लंबे अंतराल वाले परमाणु तत्व-1 (लाइन-1) के मिथाइलेशन स्थिति पर ऑस्टियोसारकोमा-व्युत्पन्न एक्स्सेल्युलर वेसिकल्स (ईवीएस) के प्रभावों का पता लगाने के लिए किया जाता है। लाइन-1s दोहराव वाले डीएनए तत्व हैं जो आमतौर पर कैंसर में हाइपोमेथिलेशन से गुजरते हैं और इस क्षमता में, बायोमार्कर के रूप में काम कर सकते हैं। अल्ट्रासेन्स्ट्रियूगेशन का उपयोग जैविक तरल पदार्थों (यानी ईवी-समाप्त भ्रूण गोजातीय सीरम [एफबीएस] से एक्सपेरिमेंटल वेसिकल्स को अलग करने और ऑस्टियोसारकोमा वातानुकूलित मीडिया [अंतर केंद्रीकरण] से ईवीएस को अलग करने के लिए एक लागत प्रभावी विधि के रूप में भी किया जाता है। मिथाइलेशन विश्लेषण के लिए, कस्टम लाइन-1 जांच लाइन-1 प्रमोटर अनुक्रम और सात नियंत्रण साइटों में तीन मिथाइलेशन साइटों को लक्षित करने के लिए डिज़ाइन की गई है। यह प्रोटोकॉल लाइन-1 मिथाइलेशन विश्लेषण के लिए एमएसपीए के उपयोग को दर्शाता है और अल्ट्रासेंट्रोइफिगेनेशन द्वारा ईवी-समाप्त एफबीएस की तैयारी का वर्णन करता है।

Introduction

डीएनए मिथाइलेशन मानव कोशिकाओं में होने वाला एक प्रमुख एपिजेनेटिक संशोधन है। डीएनए मिथाइलेशन सीपीजी डिन्यूक्लियोटाइड में साइटोसाइन अवशेषों के लिए मिथाइल समूहों के लिंकेज को संदर्भित करता है। इस तरह के डिन्यूक्लियोटाइड्स आमतौर पर जीन1के 5 ' क्षेत्र में समूहों (सीपीजी द्वीपों) में पाए जाते हैं । सामान्य कोशिकाओं में, इनमें से अधिकांश डिन्यूक्लियोटाइड्स एक अमिथीटेड स्थिति में मौजूद हैं, जो डीएनए ट्रांसक्रिप्शन की अनुमति देता है। संयोग से, कई कैंसर हाइपरमेथिलेटेड सीपीजी द्वीपों और ट्रांसक्रिप्टोमिक सिलेक्टिंग2से जुड़े होते हैं, विशेष रूप से ट्यूमर दमन जीन में, जो बदले में कैंसर3की विभिन्न पहचान में योगदान देते हैं।

दूसरी ओर, लंबे समय से interspersed परमाणु तत्वों-1 (लाइन-1एस या L1s) दोहराव, ट्रांसपोसेबल डीएनए तत्व है कि आम तौर पर CpG द्वीपों पर मिथाइलेशन के उच्च स्तर है । लाइन-1 का मिथाइलेशन स्थानांतरण को रोकता है और जीनोम अखंडता को बनाए रखने में मदद करता है। कई प्रकार के कैंसर में, लाइन-1 हाइपोमेथिलेटेड है, जिसके परिणामस्वरूप सक्रियण और बाद में रेट्रोट्रांसपोजिशन-मध्यस्थीय गुणसूत्र अस्थिरता4होती है। लाइन -1 मानव जीनोम5के लगभग 17% के लिए खातों, और इसकी मिथाइलेशन स्थिति वैश्विक जीनोमिक मिथाइलेशन स्तर6के एक संकेतक के रूप में काम कर सकते हैं । ग्लोबल लाइन-1 हाइपोमेथिलेशन को कोशिकाओं के संक्रमण से पहले ट्यूमर फेनोटाइप7में माना जाता है; इसलिए, यह जल्दी कैंसर शुरुआत के लिए एक संभावित मार्कर के रूप में वादा रखती है ।

वर्तमान में, मिथाइलेशन विश्लेषण के लिए कई तरीके हैं, जिनमें पायरोसेक्वेनसिंग, मिथाइलेशन-विशिष्ट पीसीआर, माइक्रोरेवे, और क्रोमेटिन इम्यूनोप्रिसिप्रिसिप्रिशन1 शामिलहैं। अगली पीढ़ी के अनुक्रमण के उपयोग ने डीएनए मिथाइलेशन का पता लगाने के लिए जीनोम-व्यापी दृष्टिकोणों को शामिल करना भी संभव बना दिया है । इनमें से कई विधियां बाइसुल्फेट-इलाज डीएनए पर भरोसा करती हैं, जिसमें अमेथेलेटेड साइटोसिन को यूरासिल में परिवर्तित कर दिया जाता है और मिथाइलेटेड साइटोसिन अपरिवर्तित रहते हैं। हालांकि, bisulfite-इलाज डीएनए के साथ काम करने से कई नुकसान होते हैं, जैसे कि यूरासिल के लिए अमेथीटेड साइटोसिन के अधूरे रूपांतरण, दृश्यों के पक्षपातपूर्ण प्रवर्धन, और अनुक्रमण त्रुटियों8

मिथाइलेशन-विशिष्ट जांच प्रवर्धन (एमएसपीए) में, दो ओलिगोन्यूक्लियोटाइड्स से बनी जांच मिथाइलेशन-सेंसिटिव प्रतिबंध एंजाइम एचएआई9के लिए प्रतिबंध स्थल (जीसीजीसी) युक्त डीएनए दृश्यों को लक्षित करती है। जांच डीएनए के लिए संकरण के बाद, प्रत्येक नमूना दो सेट में विभाजित है । पहले सेट में जांच लिगेशन से गुजरना, जबकि दूसरे सेट में जांच लिगेशन से गुजरना पड़ता है और उसके बाद अमेथिलेटेड सीजीसीजी साइटों पर एचएआई-मध्यस्थता पाचन होता है । नमूनों के दोनों सेट तो पीसीआर द्वारा परिलक्षित कर रहे हैं, और उत्पादों केशिका इलेक्ट्रोफोरेसिस द्वारा अलग कर रहे हैं । अमेथाइल साइटों पर जांच एचएचएआई द्वारा पचाई जाती है और पीसीआर के दौरान परिलक्षित नहीं होती है, जिसके परिणामस्वरूप कोई चोटी संकेत नहीं होते हैं। इसके विपरीत, मेथिलेटेड साइटों पर जांच पाचन से संरक्षित होती है और इसलिए पीसीआर के दौरान परिलक्षित होती है, बाद में पीक सिग्नल10उत्पन्न होती है।

एमएसपीए वैकल्पिक तरीकों पर कई फायदे हैं। सबसे पहले, इसके लिए डीएनए (50-100 एनजी) की कम मात्रा की आवश्यकता होती है और फॉर्मलिन-फिक्स्ड पैराफिन एम्बेडेड नमूनों से डीएनए के विश्लेषण के लिए अच्छी तरह से अनुकूल है10। इसके लिए बिसुल्फेट-इलाज डीएनए की आवश्यकता नहीं है; वास्तव में, यह डीएनए के लिए अनुपयुक्त है जिसे इस तरह से संशोधित किया जाता है। कई नमूनों को एक ही समय में विश्लेषण किया जा सकता है, और MSPA जांच ऐसे डिजाइन किया जा सकता है कि वे एक साथ कई जीन या दृश्यों को लक्षित करते हैं । इसके अतिरिक्त, जांच विशिष्ट और मेथिलेटेड डीएनए के लिए संवेदनशील है के रूप में Hhaमैं प्रतिबंध साइट एक अनुक्रम है कि सीपीजी द्वीप10की खासियत है से मेल खाती है ।

इस अध्ययन में ऑस्टियोसारकोमा (ओएस) के प्रभावों की जांच की गई- व्युत्पन्न एक्सट्रासेलुलर वेसिकल्स (ईवीएस) लाइन-1 मिथाइलेशन पर एडीपोज ऊतक-व्युत्पन्न मेसेंचिमल स्टेम सेल (एटी-एमएससी; चित्रा 1)। ईवीएस नैनोस्केल, झिल्ली से बंधे वेसिकल्स हैं जो अधिकांश सेल प्रकारों द्वारा स्रावित होते हैं। वे11,12,माता-पिता की कोशिकाओं से प्रोटीन, लिपिड, एमआरएनए, माइक्रोआरएनए और अतिरिक्त अणुओं को ले जाते हैं। ईवीएस मध्यस्थता अंतरकोशिकीय संचार और कई रोगविज्ञानी परिस्थितियों में महत्वपूर्ण भूमिका निभातेहैं 13,14. हाल ही में हुए एक अध्ययन से पता चला है कि कैंसर से व्युत्पन्न ईवीएस15प्राप्तकर्ता कोशिकाओं को सक्रिय लाइन-1 स्थानांतरित कर सकता है । पहले यह बताया गया है कि एचएएस-143बी सेल लाइन से ईवीएस अन्य आनुवंशिकप्रभाव16के अलावा एमएससी में लाइन-1 के मिथाइलेशन स्थिति को बदल सकता है ।

जब ईवी अलगाव के लिए कोशिकाओं को बढ़ाते हैं, तो विकास माध्यम में ईवी-समाप्त भ्रूण गोजातीय सीरम [एफबीएस] का उपयोग करना महत्वपूर्ण है, क्योंकि एफबीएस-व्युत्पन्न ईवीएस अन्य स्रोतों से ईवीएस के साथ हस्तक्षेप कर सकता है औरपरिणाम 17,18में बाधा डाल सकता है। अल्ट्रासेंट्रिजन एफबीएस से ईवीएस को कम करने के लिए सबसे आम तरीकों में से एक है। यह अल्ट्राफिल्ट्रेशन और वाणिज्यिक ईवी-समाप्त एफबीएस19जैसे विकल्पों की तुलना में अपेक्षाकृत सरल और लागत प्रभावी प्रक्रिया है। यहां, प्रोटोकॉल यह भी दर्शाता है कि अल्ट्रासेंट्रोइफिगेनेशन द्वारा ईवी-समाप्त एफबीएस को कैसे तैयार किया जाए।

यह लेख उपरोक्त तकनीकों के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है, ओएस सेल लाइन से ईवीएस के अलगाव से ओएस-ईवी में लाइन-1 के मिथाइलेशन विश्लेषण तक एमएससी(चित्रा 1)का इलाज किया गया है।

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Protocol

इस अध्ययन को हेलसिंकी और उशिमा अस्पताल जिले की आचार समिति (नैतिक अनुमोदन डी नंबर 217/13/03/02/2015) द्वारा अनुमोदित किया गया था ।

1. अल्ट्रासेंट्रोइफिगेनाइजेशन द्वारा ईवी-समाप्त एफबीएस की तैयारी

  1. एफबीएस इन (अल्ट्रा) सेंट्रलाइज ट्यूब लें और उन्हें अल्ट्रासेंट्रोफ्यूज बाल्टी में रखें। यह सुनिश्चित करने के लिए कि अल्ट्रासेंट्रोयूजेशन सुचारू रूप से और सुरक्षित रूप से चलता है, बाल्टी को एक दूसरे के 10 मिलीग्राम के भीतर संतुलित करें।
  2. एक झूलते रोटर (प्रकार SW28, कश्मीर फैक्टर 246) पर बाल्टी लोड करें। रोटर को अल्ट्रासेंट्रिकफ्यूज में रखें और 4 डिग्री सेल्सियस पर 19 घंटे के लिए 100,000 x ग्राम पर चलाएं।
  3. ध्यान से सुपरनेटेंट (लगभग नौ-दसवें) की हल्के रंग की ऊपरी परत एकत्र करें और 50 मीटर ट्यूब पर स्थानांतरित करें। डार्क ब्राउन पैलेट को परेशान या पिपेट न करें, क्योंकि इसमें एफबीएस से ईवीएस शामिल हैं।
  4. 0.22 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से एक नया 50 मीटर ट्यूब में सुपरनेट पास करें।
  5. EV अलगाव के लिए कोशिकाओं को बढ़ाते समय सेल संस्कृति मीडिया के लिए फिल्टर-निष्फल, EV-समाप्त एफबीएस जोड़ें।

2. ऑस्टियोसारकोमा-व्युत्पन्न ईवीएस का अलगाव

  1. प्लेट ओएस कोशिकाओं (HOS-143B सेल लाइन) RPMI १६४० माध्यम के साथ एक टी-१७५ फ्लास्क में, 10% सामांय FBS और 1% एंटीबायोटिक दवाओं (१०० U/mL पेनिसिलिन, ०.१ मिलीग्राम/mL streptomycin) के साथ पूरक । फ्लास्क को इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2पर रखें ।
  2. जब फ्लास्क 70%-80% जलप्रवाह है, तो कोशिकाओं को फॉस्फेट-बफर्ड लवण (पीबीएस) से धोएं फिर उन्हें मीडिया में विकसित करें जिसमें 10% ईवी-समाप्त एफबीएस (इसके बाद EV-समाप्त मीडिया के रूप में जाना जाता है)।
    नोट: 1 x 106 HOS-143B कोशिकाओं को एक T175 फ्लास्क में चढ़ाया लगभग 60 घंटे के बाद 70% प्रवाह तक पहुंचता है।
  3. अगले 48 एच के दौरान, हर 24 घंटे के बाद ऑस्टियोसारकोमा कोशिकाओं से वातानुकूलित मीडिया एकत्र करें और ताजा ईवी समाप्त हो गया मीडिया जोड़ें।
  4. कोशिकाओं और सेल मलबे को हटाने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिन के लिए 2500 x ग्राम पर वातानुकूलित मीडिया को केंद्रित करें। एक नई ट्यूब के लिए supernatant हस्तांतरण, नीचे मीडिया के लगभग 2 mL जा रहा है ।
    नोट: यदि इस स्तर पर सीधे ईवी अलगाव के साथ आगे नहीं बढ़ रहा है, तो सुपरनेटेंट को -80 ओसी पर संग्रहीत किया जा सकता है।
  5. अधिनेत को अल्ट्रासेंट्रोफ्यूज ट्यूबमें डालें और उन्हें पहले की तरह संतुलित करें। 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए 100,000 x ग्राम पर ट्यूबों को सेंट्रलाइज करें।
  6. ध्यान से अतिशयोक्ति त्यागें, नीचे 1 mL के आसपास जा रहा है । ईवी गोली को धोने और फिर से निलंबित करने के लिए ट्यूब और पिपेट में पीबीएस (0.1 माइक्रोन फ़िल्टर) के लगभग 20 मिलील जोड़ें।
  7. ट्यूबों को संतुलित करें और एक ही सेटिंग्स के साथ अल्ट्रासेंट्रियूजेशन का एक और दौर करें।
  8. ध्यान से अतिशयोक्ति को हटा दें और कोमल पाइपटिंग द्वारा पीबीएस के 200 माइक्रोन में ईवी पैलेट को फिर से निलंबित करें। ईवीएस को कम बाध्यकारी ट्यूबों में स्टोर करें।
    नोट: ईवीएस का उपयोग सीधे या अन्य -80 डिग्री सेल्सियस में संग्रहीत किया जा सकता है जब तक कि उनकी आवश्यकता न हो जाए।

3. ओएस-ईवीएस का लक्षण वर्णन

नोट: शुद्ध ईवीएस को वेस्टर्न ब्लॉटिंग (डब्ल्यूबी), नैनोपार्टिकल ट्रैकिंग एनालिसिस (एनटीए), और ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (टीईएम)16की विशेषता हो सकती है ।

  1. ईवी मार्कर CD63, TSG101, और Hsp70 के साथ मानक प्रोटोकॉल16 के अनुसार डब्ल्यूबी प्रदर्शन करें, और ईवी नमूना20की शुद्धता को इंगित करने के लिए नकारात्मक नियंत्रण के रूप में कैल्नेक्सिन के साथ।
  2. एनटीए के लिए, पहले 0.1 माइक्रोन फ़िल्टर डल्बेकको के पीबीएस में ईवी नमूने को पतला करने के लिए (आदर्श) प्रति फ्रेम 30-100 कणों को प्राप्त करने के लिए।
    1. नमूने के लगभग 500 माइक्रोन को 1 मिलीग्राम सिरिंज में लें और इसे एनटीए उपकरण के इनलेट पोर्ट में लोड करें। जांच करें कि सटीक माप के लिए प्रति फ्रेम पर्याप्त कण हैं।
    2. एनटीए सॉफ्टवेयर खोलें और परिवेश के तापमान पर कैमरा स्तर 13 का उपयोग करते हुए 60 एस अवधि के पांच वीडियो रिकॉर्ड करें। विश्लेषण के दौरान, पता लगाने की सीमा = 5 का उपयोग करें और लाभ = 10।
  3. TEM द्वारा EV नमूनों का विश्लेषण के रूप में पहले21वर्णित है ।

4. एटी-एमएससी संस्कृति

नोट: मेसेंचिमल स्टेम सेल अलगाव के लिए मानव एडीपोज ऊतक लिपोसक्शन एस्पिरेट (प्लास्टिक सर्जरी विभाग, लेजर तिलकका लिमिटेड, फिनलैंड) के रूप में प्रदान किया गया था। लिखित सूचित सहमति लिपोएस्पिरेट दाताओं से ली गई थी, जो ऐच्छिक लिपोसक्शन प्रक्रियाओं से गुजर रहे थे ।

  1. मानक यांत्रिक और एंजाइमैटिक अलगाव विधियों22का उपयोग करके लिपोसक्शन aspirates से एटी-एमएससी को अलग करें।
    नोट: अन्य स्रोतों (वाणिज्यिक सेल लाइनों सहित) से एमएससी का भी उपयोग किया जा सकता है।
  2. DMEM/F-12 मीडिया में संस्कृति कोशिकाओं 10% FBS और 1% एंटीबायोटिक दवाओं के साथ पूरक ।

5. ओएस-ईवीएस के साथ एमएससी का उपचार

  1. प्लेट 15,000 एटी-एमएससी प्रति अच्छी तरह से एक 24 अच्छी तरह से थाली में।
  2. 24 घंटे के बाद, पुराने मीडिया को हटा दें, पीबीएस के साथ कोशिकाओं को धोएं, और EV-समाप्त मीडिया में बदलें।
  3. ओएस-ईवीएस के साथ कोशिकाओं का इलाज करें (1 x 106 EVs प्रति सेल) के कण एकाग्रता पर 1 दिन (सेल आसंजन के बाद 24 घंटे), दिन 3 (1 दिन के बाद 48 घंटे), और दिन 5 (96 घंटे के बाद 1 दिन)।
    1. टाइमपॉइंट के लिए ओएस-EV उपचार बंद करो (टीपी) 1 दिन पर 0 नमूने, 3 दिन पर टीपी 3 नमूने और 7 दिन पर टीपी 7 नमूने (5 दिन के बाद ४८ घंटे) ।
      नोट: प्रायोगिक योजनाओं के अनुसार अन्य टाइमपॉइंट शेड्यूल का भी पालन किया जा सकता है।
  4. एक उपयुक्त विधि का उपयोग करएमएस से डीएनए निकालें। डेटा विश्लेषण के लिए सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण नमूने शामिल करें।

6. लाइन-1 मिथाइलेशन परख

  1. अनुकूलित लाइन-1 जांच प्राइमर डिजाइन, जैसा कि पहले पाविसिक एट अल23द्वारा किया गया था। मिथाइलेशन जांच के लिए, लाइन-1 के प्रमोटर क्षेत्र के भीतर एचएआई प्रतिबंध साइट वाले तीन दृश्यों का चयन करें। नियंत्रण जांच के लिए, लाइन-1 अनुक्रम के बाकी हिस्सों से एचएआई प्रतिबंध साइट की कमी वाले सात दृश्यों का चयन करें।
    नोट: लाइन-1 अनुक्रम जेनबैंक डाटाबेस24 (L1.2, परिग्रहण नहीं) पर उपलब्ध है । AH005269.2. जांच25डिजाइन करने के लिए MSPA निर्माता के निर्देशों का उपयोग करें ।
  2. टीई बफर में डीएनए सैंपल के 70 एनजी को 5 माइक्रोन वॉल्यूम में पतला करें।
  3. टेबल 1में उल्लिखित बाद के थर्मोसाइक्लिंग और पीसीआर चरणों को पूरा करें । 10 मिन के लिए 98 डिग्री सेल्सियस पर सैंपल गर्म करें, फिर 25 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा करें।
  4. प्रत्येक नमूने में जांच संकरण मिश्रण के 3 μL जोड़ें और जांच डीएनए को संकरण करने की अनुमति देने के लिए थर्मोसाइकिलर चलाते हैं।
  5. कमरे के तापमान (आरटी) पर, प्रत्येक नमूने में पोस्ट-हाइब्रिडाइजेशन मिश्रण के 13 माइक्रोन जोड़ें। 10 माइक्रोन को दूसरी ट्यूब पर ट्रांसफर करें।
  6. ट्यूब के दोनों सेट को थर्मोसाइकिलर में रखें और कम से कम 1 मिन के लिए 48 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    1. जबकि नमूने 48 डिग्री सेल्सियस पर होते हैं, ट्यूबों के पहले सेट (अपाच्य श्रृंखला) में लिगेशन मिश्रण के 10 माइक्रोन और ट्यूबों के दूसरे सेट (पचाने वाली श्रृंखला) में लिगेशन-पाचन मिश्रण के 10 माइक्रोन जोड़ें। अगला थर्मोसाइकिलर कार्यक्रम चलाएं।
  7. ट्यूबों को नीचे स्पिन करें और साथ ही थर्मोसाइकिलर को 72 डिग्री सेल्सियस तक सेट करें।
  8. प्रत्येक ट्यूब में पॉलीमरेज मिक्स के 5 माइक्रोन जोड़ें और ट्यूबों को थर्मोसाइकिलर में रखें। पीसीआर प्रोग्राम चलाते हैं।
  9. जबकि पीसीआर प्रोग्राम चल रहा है, 1 मिलील फॉर्मामाइड का समाधान तैयार करें जिसमें आकार मानक का 2.5 माइक्रोन हो। एक ऑप्टिकल 96 अच्छी तरह से प्लेट (बारकोड के साथ) के प्रत्येक कुएं के लिए इस समाधान के पिपेट 10 μL।
  10. पीसीआर के बाद, अल्ट्राप्योर पानी में क्रमशः 1:100 और 1:200 तक पचाए गए और पचाने वाले नमूनों को पतला करें। 96 अच्छी प्लेट में पतला पीसीआर उत्पाद के 2 μL जोड़ें। हवा के बुलबुले को हटाने के लिए 15-20 एस के लिए 200 x ग्राम पर प्लेट को अपकेंद्रित करें।
  11. केशिका इलेक्ट्रोफोरेसिस द्वारा नमूनों का खंड विश्लेषण करें।
    नोट: विश्लेषण तक प्लेट को अंधेरे में 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जाना चाहिए।

7. खंड डेटा विश्लेषण

  1. केशिका इलेक्ट्रोफोरेसिस खोलें जिसके परिणामस्वरूप इलेक्ट्रोप्रोग्राम विश्लेषण सॉफ्टवेयर होता है।
    1. पैनल कॉलम के तहत, नमूनों में से एक के लिए, मेनू से MLPA चुनें। सभी नमूनों पर एमएलपीए लागू करने के लिए पैनल हेडर और प्रेस Ctrl + D पर क्लिक करें।
    2. इसी तरह, सभी नमूनों के लिए माइक्रोसेटेलाइट डिफ़ॉल्ट करने के लिए विश्लेषण विधि निर्धारित करें।
    3. सभी नमूनों का चयन करें और चुनी हुई सेटिंग्स के अनुसार नमूनों का विश्लेषण करने के लिए ग्रीन प्ले बटन पर क्लिक करें।
    4. सभी नमूनों का चयन करें और जांच चोटियों की कल्पना करने के लिए ग्राफ बटन पर क्लिक करें।
    5. व्यक्तिगत जांच चोटियों के उच्च संकल्प के लिए चोटी क्षेत्र पर ज़ूम इन करें। सुनिश्चित करें कि सभी 10 लाइन-1 जांच मिश्रण से जांच के अनुरूप चोटियों लेबल हैं । अतिरिक्त चोटियों (<95 बीपी और >160 बीपी) को त्यागें।
    6. जीनोटाइप टैब में, अल्पविराम-अलग-मूल्यों (सीएसवी) प्रारूप में परिणामों का निर्यात करें।
  2. सीएसवी फ़ाइल को डेटा विश्लेषण सॉफ्टवेयर में खोलें और डेटा को कॉलम में सॉर्ट करें।
    1. तीन मिथाइलेशन साइट चोटियों उनके अनुमानित आकार के आधार पर लेबल (L1-1m पर १५३ बीपी, L1-2m पर ११९ बीपी, L1-3m पर १३३ बीपी पर) । शेष सात चोटियों नियंत्रण जांच के अनुरूप है ।
      नोट: यहां, L1-2m जांच चोटियों के मूल्यों का उपयोग किया जाता है, जो ११७ बीपी का आकार है, क्योंकि उस क्षेत्र में सबसे लाइन-1 मिथाइलेशन परख23में इस्तेमाल किया गया है ।
    2. प्रत्येक नमूने (पचाऔर पचाने के लिए), सभी सात नियंत्रण चोटियों के योग शिखर क्षेत्र की गणना करें। इस राशि से प्रत्येक लाइन-1 जांच के शिखर क्षेत्र को विभाजित करें।
    3. प्रत्येक डीएनए नमूने के लिए, निम्नलिखित समीकरण का उपयोग करके मिथाइलेशन खुराक अनुपात (डीएम)प्राप्त करने के लिए पचाने वाले नमूने के मूल्य को पचाने वाले नमूने के मूल्य को विभाजित करें:
      Equation 1
      कहां: डीएम मिथाइलेशन खुराक अनुपात है, एकएक्स पीक एक्स (जैसे, L1-2m चोटी) के तहत क्षेत्र है, और एकसीटीआरएल सभी सात नियंत्रण जांच का योग पीक क्षेत्र है ।

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Representative Results

इस अध्ययन का मुख्य लक्ष्य एमएससी पर ओएस-ईवीएस के एपिजेनेटिक प्रभावों का मूल्यांकन करना था । ओएस-ईवीएस मानक अंतर केंद्रीकरण विधि का उपयोग कर HOS-143B कोशिकाओं से अलग थे । पश्चिमी दाग द्वारा ठेठ EV मार्कर CD63, Hsp70, और TSG101 की अभिव्यक्ति ओएस-EVs की उपस्थिति की पुष्टि की । (चित्रा 2ए)। कैल्नेक्सिन सिग्नल की अनुपस्थिति ने ओएस-ईवी अलग-थलग पड़ने की शुद्धता का संकेत दिया। टीईएम के साथ शुद्धता का अतिरिक्त संकेत देखा गया, जिसमें विभिन्न आकारों के अक्षुण्ण वेसिकल्स मौजूद थे(चित्रा 2बी)। औसत ओएस-EV कण एकाग्रता 7.63x1011/mL(चित्रा 2सी)था । ईवीएस का आकार वितरण 50-500 एनएम से लेकर हुआ, जिसमें लगभग 80% कण 50-200 एनएम रेंज(चित्रा 2डी)के भीतर गिरते हैं।

एटी-एमएससी का ओएस-ईवीएस के साथ इलाज किया गया और एमएससी से अलग-अलग टाइमपॉइंट पर डीएनए निकाला गया। लाइन-1 मिथाइलेशन का विश्लेषण एमएस-एमएलपीए द्वारा किया गया था और मिथाइलेशन खुराक अनुपात के संदर्भ में गणना की गई थी। टीपी 0 से परिणाम बेसलाइन मिथाइलेशन स्तर (धराशायी लाइन)(चित्रा 3)निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया गया । टीपी 3 (हरे कॉलम) में, एमएससी में औसत लाइन-1 मिथाइलेशन खुराक अनुपात में कमी देखी गई, जब ओएस-ईवीएस के साथ इलाज किया गया, बेसलाइन मिथाइलेशन स्तर के तहत गिररहा था। यह हाइपोमेथिलाइजेशन घटना टीपी 7 (नीले कॉलम) में अधिक सूक्ष्म थी, और बेसलाइन की तुलना में अनुपचारित और ईवी-उपचारित एमएससी दोनों में औसत मिथाइलेशन खुराक अनुपात थोड़ा अधिक था।

Figure 1
चित्रा 1: प्रायोगिक कार्यप्रवाह। ईवीएस को होस-143B कोशिकाओं से अंतर केंद्रीकरण द्वारा अलग किया गया था और पश्चिमी दाग, टीएम और एनटीए की विशेषता थी। एटी-एमएससी का विभिन्न समय बिंदुओं (टीपी 0, 3, एक 7) पर ओएस-ईवीएस के साथ इलाज किया गया। डीएनए एमएससी से निकाला गया था और एमएसपीए द्वारा लाइन-1 मिथाइलेशन का विश्लेषण किया गया था । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: ईवीएस का लक्षण वर्णन। (क) ईवी मार्कर सीडी63, एचएस70 और टीएसजी101 की उपस्थिति ने पश्चिमी ब्लॉटिंग द्वारा ईवीएस की उपस्थिति की पुष्टि की, जबकि कैल्नेक्सिन के लिए कोई बैंड नहीं देखा गया, जो ईवी आइसोलेट की शुद्धता का संकेत है । होस-143B प्रोटीन और ओएस-ईवीएस दोनों के लिए 10 माइक्रोन प्रोटीन लोड किया गया था । (ख) टीएम ने अलग-थलग में विभिन्न आकारों के अक्षुण्ण ईवीएस की उपस्थिति की पुष्टि की। (ग) ओएस-ईवीएस के कण एकाग्रता और (डी) आकार वितरण एनटीए मापन द्वारा निर्धारित किए गए थे । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: एमएससी से लाइन-1 के मिथाइलेशन खुराक अनुपात या तो अनुपचारित या ओएस-ईवीएस के साथ इलाज किया जाता है। धराशायी ग्रे लाइन बेसलाइन मिथाइलेशन वैल्यू का प्रतिनिधित्व करती है, जो टीपी 0 वैल्यूज के अनुरूप है । ग्रीन कॉलम टीपी 3 नमूनों के लिए ओएस-ईवी उपचार के बिना और साथ औसत मिथाइलेशन खुराक अनुपात का प्रतिनिधित्व करते हैं, जबकि नीले कॉलम टीपी 7 नमूनों के लिए समान प्रतिनिधित्व करते हैं। दोनों टीपी 3 और टीपी 7 नमूनों ओएस-EVs के साथ उपचार के बाद मिथाइलेशन के स्तर में कमी दिखाई । हालांकि, टीपी 3 नमूनों में अंतर अधिक था, जहां ईवी उपचार के बाद मिथाइलेशन स्तर भी बेसलाइन मूल्य से कम था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

तालिका 1: MSPA अभिकर्मक मिश्रण व्यंजनों और थर्मोसाइकिलर/पीसीआर कार्यक्रम । उल्लिखित मात्रा एक डीएनए नमूने का प्रतिनिधित्व करती है । यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि पॉलीमरेज मिश्रण को पिछले घोला जा सकता है के रूप में कई नमूनों के लिए तैयार किया जाना चाहिए, क्योंकि इस स्तर पर ट्यूबों के दो सेट हैं। बाद के थर्मोसाइक्लिंग या पीसीआर कार्यक्रम का विवरण सही करने के लिए प्रदान किया जाता है।

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Discussion

इस अध्ययन से पता चलता है कि कैसे MSPA का उपयोग एक विशिष्ट आनुवंशिक तत्व की मिथाइलेशन स्थिति का पता लगाने और मात्रा निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है । लाइन-1 यहां ध्यान केंद्रित किया गया था, लेकिन जांच जीन और दृश्यों की एक श्रृंखला को लक्षित करने के लिए डिजाइन किया जा सकता है । इसके अलावा, विभिन्न अनुप्रयोगों के लिए उपलब्ध जांच घोला जा सकता है की एक बढ़ती सूची है । एमएसपीए डीएनए मिथाइलेशन एनालिसिस के लिए एक सरल और मजबूत तकनीक है जिसमें बाइसुल्फेट रूपांतरण10की आवश्यकता नहीं है । नमूना तैयारी से डेटा विश्लेषण के लिए पूरी प्रक्रिया में लगभग 2 दिन लगते हैं, लेकिन केवल वास्तविक हाथ पर काम के 4-5 घंटे शामिल है । यह डीएनए की छोटी मात्रा (70 एनजी जितना कम) के लिए लागू होता है, जैसा कि यहां प्रदर्शित किया गया है।

मिथाइलेशन एनालिसिस प्रोटोकॉल का सबसे अहम हिस्सा कस्टम प्रोब-मिक्स की तैयारी है, जैसे इस स्टडी में लाइन-1 प्रोब-मिक्स। उनकी अलग-अलग लंबाई के कारण, लाइन-1 जांच ओलिगोन्यूक्लियोटाइड्स को 4-40 एनएम की सीमा में संश्लेषित किया गया था, इसलिए निर्माता के निर्देशों के अनुसारविघटनकदम और बाद में कमजोर होना सावधानी से किया जाना था। पीसीआर और प्रोटोकॉल के कई थर्मोसाइक्लिंग कार्यक्रम जैसा कि यहां उपयोग किया जाता है, मूल निर्माता के संस्करण में उन लोगों से अलग होता है।

एचएएचएआई एंजाइम से संबंधित कुछ सावधानियां हैं। सबसे पहले, लिगेशन-पाचन मिश्रण में उपयोग किए जाने वाले एंजाइम की मात्रा निर्माता पर निर्भर करती है, और एंजाइम के संस्करण जो गर्मी-निष्क्रियता के लिए प्रतिरोधी हैं, एमएसपीए के लिए उपयुक्त नहीं हैं। कुछ एंजाइमों के साथ, अधूरे पाचन के उदाहरण हो सकते हैं, जिसके परिणामस्वरूप दोषपूर्ण पीसीआर उत्पादों और अपभ्रंश पीक सिग्नल ों का गठन होगा। अंत में, केशिका इलेक्ट्रोफोरेसिस के लिए अंतिम पीसीआर उत्पादों को किस हद तक पतला किया जाता है, यह जांच पर निर्भर करता है। प्रारंभिक रन में अनुकूलन शामिल होने की संभावना है, जिसके लिए कई कमजोर पड़ने का परीक्षण करने की सिफारिश की जाती है।

एमएसपीए की कुछ सीमाएं हैं, जैसे एचएचएआई-मध्यस्थता डीएनए पाचन की चयनात्मक प्रकृति। हाहा मैं केवल अनमेथिलेटेड जीसीजीसी दृश्यों पर डीएनए को छोड़ देता हूं और सीपीजी डिन्यूक्लियोटाइड्स के अन्य उदाहरणों को अस्वीकार करता है जो जी और सी द्वारा संलग्न नहीं हैं, भले ही वे सीपीजी द्वीपों के भीतर स्थित हों। नतीजतन, इस तरह के डिन्यूक्लियोटाइड्स (और जो जांच के लक्ष्य अनुक्रम के बाहर स्थित हैं) की मिथाइलेशन स्थिति निर्धारित नहीं की जा सकती है। लाइन-1 जांच-मिश्रण में प्रमोटर क्षेत्र24से अतिरिक्त जीसीजीसी दृश्यों वाली अधिक जांच शामिल हो सकती है, जिससे मिथाइलेशन साइटों की अधिक संख्या का प्रतिनिधित्व होता है ।

वैकल्पिक रूप से, सैकII और एमलूआई जैसे अन्य मिथाइलेशन-विशिष्ट प्रतिबंध एंजाइम, जिनमें एचएएकी तुलना में एक अलग प्रतिबंध साइट है, जिसे इसके अतिरिक्त एमएसपीए में उपयोग किया जा सकता है, जो वैश्विक मिथाइलेशन स्तर26का व्यापक प्रतिनिधित्व प्रदान कर सकता है। दूसरे, जैसा कि टीपी 7 नमूनों के साथ देखा गया है, मिथाइलेशन खुराक अनुपात में अंतर काफी सूक्ष्म हो सकता है। यह जीनोम5में लाइन-1एस की उच्च प्रति संख्या के कारण हो सकता है, जिसमें सामान्य परिस्थितियों में वैश्विक मिथाइलेशन का उच्च स्तर होता है और यह केवल कुछ सीपीजी साइटों में क्षणिक हाइपोमेथिलेशन की घटनाओं से काफी हद तक अप्रभावित होगा। इसके अलावा, एमएससी भेदभाव के चरण और सेल चक्र के संदर्भ में विषम हैं, जो बेसलाइन मिथाइलेशन मूल्य को प्रभावित कर सकते हैं। अंत में, MSPA केवल डीएनए मिथाइलेशन में सापेक्ष मतभेदों का पता लगा सकता है और इस कारण के लिए संदर्भ नमूनों की आवश्यकता होती है। ऐसे उदाहरणों में, स्थानीय मिथाइलेशन का सीधे पता लगाने वाले तरीके अधिक उपयुक्त हो सकते हैं, हालांकि उन्हें बाइसुल्फेट रूपांतरण चरण27की आवश्यकता हो सकती है।

चूंकि इस अध्ययन में बाह्य वेसिकल्स का उपयोग शामिल था, इसलिए हमने ईवी-समाप्त एफबीएस की तैयारी का भी प्रदर्शन किया, जो ईवी अलगाव के लिए सेल संस्कृति मीडिया का एक अनिवार्य घटक है। अल्ट्रासेंटरिफ्यूजेशन एक सस्ती प्रक्रिया है जो एफबीएस के बाकी हिस्सों से प्रभावी रूप से ईवीएस को अलग कर सकती है। हालांकि, केंद्रीकरण के 19 घंटे यह इस तरह के अल्ट्राफिल्ट्रेशन और वाणिज्यिकसंस्करण19के रूप में विकल्प की तुलना में एक अधिक समय लेने वाली विधि बनाता है । अल्ट्रासेंटरिफ्यूजेशन के लिए नमूने की सावधानीपूर्वक हैंडलिंग की भी आवश्यकता होती है, जैसे कि केंद्रीकरण से पहले ट्यूबों को संतुलित करते समय और बाद में अधिनेत एकत्र करना। इन चुनौतियों के बावजूद, यह जैविक तरल पदार्थ से ईवीएस को अलग करने के लिए एक लोकप्रिय तरीका है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस काम को हेलसिंकी परियोजना वित्तपोषण विश्वविद्यालय (WBS490302, WBS73714112) हेलसिंकी विश्वविद्यालय अस्पताल विश्वविद्यालय स्तर के स्वास्थ्य अनुसंधान के लिए राज्य वित्त पोषण (Y1014SUL05, TYH2016130), फिनिश-नार्वे मेडिकल फाउंडेशन, और सेल्मा और सेल्मा द्वारा वित्त पोषित किया गया था माजा-लिसा सेलैंडर फंड (मिनर्वा फाउंडेशन) । हम संशोधित एमएसपीए प्रोटोकॉल प्रदान करने और संबंधित तकनीकी सहायता के लिए वाल्टर पाविक िक को धन्यवाद देते हैं। हम वीडियो उत्पादन के साथ हमारी मदद करने के लिए टेमू Masalin (हेलसिंकी विश्वविद्यालय) के आभारी हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 mL syringe Terumo SS+01T1 for NTA
24-well plate Corning 3524 MSC cell culture
3730xl DNA Analyzer Applied Biosystems, ThermoFisher Scientific 3730XL
50 mL centrifuge tube Corning 430829
Beckman Optima LE-80K Ultracentrifuge Beckman
BlueStar Prestained Protein Marker Nippon Genetics MWP03 WB: protein marker
Calnexin (clone C5C9) Cell Signaling Technology 2679 WB, dilution 1:800
CD63 (clone H5C6) BD Biosciences 556019 WB, dilution 1:1000
Centrifuge 5702 R Eppendorf 5703000010 For conditioned media and cells
Centrifuge 5810 Eppendorf 5810000010 For spinning down 96-well plate
Centrifuge tube (polyallomer, 14x95 mm) Beckman 331374 Ultracentrifugation
DMEM/F-12 + GlutaMAX medium Gibco, Life Technologies 31331-028 For AT-MSC culture
Fetal bovine serum Gibco, Life Technologies 10270-106
GeneScan 500 LIZ size standard Applied Biosystems, Life Technologies 4322682 for capillary electrophoresis
GenomePlex Complete Whole Genome Amplification (WGA) Kit Sigma WGA2-10RXN for MSPA negative control
Hi-Di formamide Applied Biosystems, Life Technologies 4311320 for capillary electrophoresis
HOS-143B cell line ATCC CRL-8303
Hsp70 (clone 5G10) BD Biosciences 554243 WB, dilution 1:1000
IRDye 800CW Goat anti-mouse Li-Cor 926-32210 WB: secondary
IRDye 800CW Goat anti-rabbit Li-Cor 926-32211 WB: secondary
LINE-1 probe-mix primers IDT Sequences in Table 1
MicroAmp Optical 96-well reaction plate with barcode Applied Biosystems, Life Technologies 4306737 also requires sealing film
Micro BCA Protein Assay kit ThermoFisher Scientific 23235 measure protein concentration
MiniProtean TGX 10% gels Bio-Rad 456-1034 WB: gel electrophoresis
NanoSight LM14C Malvern Instruments for NTA
Nitrocellulose membrane 0.2 µm Bio-Rad 1620112 WB: protein transfer
NucleoSpin Tissue XS Macherey-Nagel 740901.50 for DNA extraction
Odyssey Blocking Buffer Li-Cor 927-40000 WB: blocking, antibodies
PBS, 1X Corning 21-040-CVR
Penicillin-streptomycin Gibco, Life Technologies DE17-602E Antibiotics for culture media
Protein LoBind tube, 0.5 mL Eppendorf 22431064 For storing Evs
REVERT Total Protein Stain and Wash Solution Kit Li-Cor 926-11015 WB: total protein staining
RKO cell line ATCC CRL-2577 for MSPA positive control
RPMI medium 1640 + GlutaMAX Gibco, Life Technologies 61870-010 For HOS-143B cell culture
SALSA MLPA HhaI enzyme MRC-Holland SMR50
SALSA MLPA reagent kit MRC-Holland EK1-FAM
SALSA MLPA P300 probe-mix MRC-Holland P300-100R
Swinging rotor SW-28 Beckman Coulter 342207 Ultracentrifugation
Syringe filter, 0.22 µm Jet Biofil FPE-204-030 sterile filtering FBS
Tecnai 12 FEI Company equipped with Gatan Orius SC
1000B CCD-camera
(Gatan Inc., USA); for TEM
TBS, 1X tablets Medicago 09-7500-100 WB: buffer
Trans-Blot Turbo Bio-Rad WB: transfer
Thermal cycler ThermoFisher Scientific TCA0096
TrypLE Express Gibco 12604-021 for trypsinization of cells
TSG101 (clone 4A10) Sigma SAB2702167 WB, dilution 1:500

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References

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